Micro-ondes, ultrasons et plastiques : un mariage délicat

Micro-ondes, ultrasons et plastiques : un mariage délicat
Emmanuelle DEMEY, Emie DURIGHELLO, Marie COUZINIÉ, Séga NDIAYE et Joëlle VINH
ESPCI ParisTech CNRS USR3149 - SMBP: 10 rue Vauquelin 75231 Paris cedex 05
L’identification des protéines [1, 2] a connu ces dernières années une avancée importante par sa combinaison avec la spectrométrie de masse. Cependant la préparation des échantillons reste un facteur limitant dans l’identification à grande échelle, lors de la gestion de
grandes quantités d’échantillons sensibles, notamment dans les études de quantification ou d’interaction protéique.
Une des étapes clé de la protéomique bottom-up est la digestion protéique. Klimek [3] utilise pour la préparation d’un mélange standard de 18 protéines, la digestion conventionnelle (incubation à 37°C entre 2 et 16h), et la digestion par ultrasons [2], à l’aide d’un sonicateur.
La technologie du micro-ondes, existe depuis plus de trente ans. Depuis quelques années, de nouvelles techniques de digestion impliquant les micro-ondes ont fait leur apparition, allant du séquençage par hydrolyse [4] à la digestion enzymatique [5]. Ainsi, l’énergie des
micro-ondes induit un processus de rotation des molécules, basé sur leur moment dipolaire [6] ; l’échauffement ainsi généré induit une accélération des réactions chimiques et une efficacité accrue. Cependant de nombreuses mises au point sont nécessaires pour
déterminer les conditions les plus adaptées.
MATERIEL & METHODES
Matériel biologique / Enzymes :
-Mise au point des conditions de travail réalisée sur différentes concentrations
de protéine standard BSA (Sigma A3059)
Tubes : 3 lots à disposition
(spécificité : faible taux de
rétention de peptides)
Treff lab 1.5ml
Lot 2
Epp. Lobind 1.5ml
Lot 3
Axygen 1.5ml
40
30
30
20
20
10
10
0
699.0
1361.8
2024.6
2687.4
3350.2
4013.0
0
699.0
1361.8
3350.2
4013.0
=> Nous avons finalement sélectionné le lot 1 comme étant plus proche de nos conditions habituelles (TX). Des tests ont également
été réalisés avec une sonde ultrasons, avec les mêmes résultats: dans ce cas il faut éviter le contact entre la sonde et la paroi du
tube.
1439.7583
1639.8828
70
2687.4
2873.2651
2529.1643
2612.1079
1880.8663
1724.7860
1463.5344
1479.7458
1567.6893
847.4583
1305.6636
80
3350.2
4013.0
d) Trypsine 2 TX
947
0.04
2024.6
2687.4
4013.0
0.10
0.06
MO TX
MO
0.02
0
1361.8
MO TX
TX
MO
TX
MO TX
Peptide BSA m/z=1639
0.08
0.06
0.04
2024.6
MO TX
MO TX
MO TX
T
Trypsine
i 3
T
Trypsine
i 2
T
Trypsine
i 4
2611.9011
1880.7294
1724.6592
2044.8130
0
699.0
MO TX
MO TX
0.14
0
1532.6207
3052.3330
10
3350.2
MO TX
MO TX
Peptide BSA m/z=1439
0.02
30
20
MO TX
MO TX
0
0.18
0.10
50
40
1361.8
990.5247
1083.5482
1163.5823
1195.5468
720.3703
90
2024.6
0.08
60
2342.7437
20
MO
1067
2501.0059
2583.9443
30
1361.8
1567.5865
c) Trypsine 2
2872.1077
40
4013.0
100
80
50
3350.2
1419.5459
90
2687.4
1439.669
1639.721
100
2024.6
0
699.0
Fig 3 : Intensité
normalisées des
moyennes
(3 dépôts) pour
les 2 modes de
digestion:
Micro-ondes (MO)
vs Thermomixer
(TX)
BSA 5fmol/µl lots de trypsine
2-3-4
Intensité normailsée
1639.7690
1361.8
2210.8342
0
699.0
60
1001.5433
1001.4781
817.3892
706.0198
1195.4579
721.3324
20
10
70
b) Trypsine 1 TX
1416
30
10
10
90
40
876.9435
20
0
699.0
2687.4
80
1357.5819
1439.6641
2530.3538
2612.3042
30
807.3273
1640.0060
1881.0031
2024.6
40
17
Peptide BSA m/z=927
0.12
50
927.4088
3592.8198
3383.7783
2529.3110
2612.2583
2872.4126
3000.5122
2277.2227
1880.9712
1724.8823
2019.9993
2148.1189
1479.8328
1567.7843
1083.6184
1195.6239
1305.7278
1446.7950
1439.8654
f) Lot Tubes 3 TX
Test 2: Comparaison de trois trypsines d’origine
porcine par suivi de l’intensité relative de 3 peptides
majoritaires issus de la digestion de la BSA.
BSA
0.16
60
1707.5983
1798.8221
60
4013.0
36.2
70
50
3350.2
50
a) Trypsine 1 MO
100
70
1993.7729
2096.7581
90
80
10
1697.0377
720.4319
100
2687.4
60
1391.6321
1493.5864
e) Lot Tubes 3 MO
2024.6
70
1064.5071
4013.0
1361.8
80
842.4296
3350.2
0
699.0
90
720.3511
741.4311
40
4013.0
1812.9102
2687.4
935.5499
1046.5962
50
3350.2
1630
952.5918
2024.6
847.5226
952.6222
10
935.5731
1464.7438
721.3944
906.4684
1017.5477
20
70
60
721.3985
820.4603
906.4969
40
743.3969 708.3656
80
1001.6298
50
893.0424
1001.6119
90
721.4026
100
1361.8
2687.4
d) Lot Tubes 2 TX
70
30
0
699.0
2024.6
60
952.5684
10
90
L’aspect visuel des tubes montre également
une différence d’opacité (lot1 translucide/ lot2
légèrement opaque) et d’épaisseur (lot1 plus
fin). La nature du plastique peut influer sur la
passage des ondes électromagnétiques et
donc modifier la qualité de la digestion.
Le traitement même du tube et sa nature peuvent jouer
un rôle non négligeable sur les phénomènes
d’adsorption des peptides à la surface du tube.
Cependant pour les lots 1 et 2 l’intensité des peptides
des spectres n’est jamais équivalente aux spectres
témoins TX.
L’autre
L
autre paramètre qu
qu’ilil nous reste à tester est donc la
trypsine elle-même qui pourrait être altérée par les
ondes, réduisant ainsi sa capacité enzymatique.
PARTIE 2 :
ETUDE DE LA STABILITE ENZYMATIQUE
Fig 2 : Comparaison digestion Micro-ondes (MO) vs Thermomixer (TX)
BSA 5fmol/µl pour les lots de trypsine 1 et 2
975.4477
311
30
20
1361.8
100
1479.8601
1567.8124
40
0
699.0
4013.0
1443.6746
1532.8247
1639.9913
50
3350.2
80
817.4745
60
2687.4
1083.6359
1163.6359 1195.6407
1305.7484
70
10
c) Lot Tubes 2 MO
1195.5690
80
2439.4001
1880.8965
2024.6
1001.5701
90
20
1195.6307
1361.8
100
2025.1577
1567.7245
1138.4871
0
699.0
30
1724.8132
10
40
MICROSON Ultrasonic Cell disruptor (model XL2007)
Test 1: Les conditions de digestion par défaut: en solution, protocole du
laboratoire (thermomixer TX), et pour la digestion au micro-ondes, protocole
constructeur (micro-ondes
(micro ondes MO).
MO) Il ss’agit
agit de comparer les enzymes employées.
employées
100
50
1305.6655
1419.6483 1439.7875
20
1639.9071
30
de ttype
pe réacte
réacteurr ouvert,
o ert température
températ re contrôlée par une
ne sonde fibre optique
optiq e et régulée
rég lée par air comprimé
L’incidence des micro-ondes/ultrasons sur la qualité de digestion (en fonction de l’origine et/ou des ses modifications...) est un
paramètre crucial. Les digestions sont analysées par MALDI-TOFTOF.
4759
60
720.3937
799.4559
817.4785
906.4575 927.4839
1017.5657
40
70
Founisseurs
1234.5580
80
60
50
927.5178
90
616
1639.9769
100
1639.9127
1001.5751
1195.5782
80
70
1439.8401
La résistance des tubes (relargage de polymères, perte de matériel...) doit être testée vis à vis des ultrasons et des micro-ondes.
Nous avons testé 3 types de microtubes en polypropylene dédiés à l’analyse des protéines (moindre rétention), sur un volume de
travail de 100µl, puis 20ul, pour reproduire les conditions de digestions fréquemment rencontrées au laboratoire. Les digestions sont
analysées par MALDI-TOFTOF.
Les résultats des spectres e) et f) nous conduisent à
Fig 1 : Comparaison digestion Micro-ondes (MO) vs Thermomixer
abandonner le lot3.
lot3 La faible intensité des peptides de
(TX) BSA 25fmol/µl sur 3 lots de tubes
BSA retrouvés pour tous les modes de digestion peut
b) Lot Tubes 1 TX
a) Lot Tubes 1 MO
être dûe à une perte de peptides accentuée par la
nébullisation engendrée par les micro-ondes..
90
MICRO-ONDE DISCOVERTM System Single-Mode (CEM )
Code Etude
Lot 1
PARAMETRES MATERIEL
PARTIE 1 :
CHOIX DES CONSOMMABLES
100
Cartographies peptidiques : GPS ExplorerTM (Applied Biosystems)/ Mascot DistillerTM (Matrix Science)
Recherches : MASCOT, 2 MC, précision MS: TOF 50ppm/ Orbi 2ppm
Modifications partielles: Carbamidométhylation (C), oxydation (M
927.4095
Digestion : Précédée par une étape
de réduction/alkylation réalisée manuellement (DTT 5mM final, 30min, 56°C /
Iodoacétamide 25mM final 20min)
Conventionnel Micro-ondes
Ultrasons
MO
US
th
thermomixer
i
TX
2h / 37°C
15min / 55°C
30s / 4°C
sous agitation puissance par
Puissance
douce
défaut de 50W
75W
Espèce
Bovine
Porcine
Porcine
Porcine
MALDI LTQ Orbitrap (Orbitrap XL,
ThermoFisher Scientific., USA)
-Dépôt CHCA 4mg/ml
-FTMS Full scan 815-4000 Da / Energie laser 20µJ /
AGC on (Automatic Gain Control)
-Resolution 60000 / 5 Microscans /CPS on (Détection
automatique des cristaux de matrice)
-ASF off (Filtre Automatique des spectres)
842.4304
Désignation (Code étude)
Roche (1)
Promega (2)
Promega Gold (3)
Sigma (4)
MALDI-TOF/TOF 4800
(Applera Applied )
Dépôt CHCA 4mg/ml et calibration externe de la plaque
(standard - Proteomix Peptide mix4 Laserbiolab)
-Acquisition automatique (mode positif / réflectron / tirs
4000/ laser 2500/ 700-4000 Da)
-Cartographies peptidiques : GPS ExplorerTM (Applied
Biosystems
720.3481
-Trypsines utilisées :
1193.4872
1277.5847
•Tester des trypsines d’origine différentes
(porcine, bovine..) en digestion liquide,
pour connaitre leur efficacité et fixer
certains paramètres opératoires.
•Evaluer
l’influence
du
choix
des
consommables employés qui peut avoir
une répercussion non négligeable sur les
résultats.
•Optimiser les conditions opératoires afin
de reproduire un résultat de digestion au
moins équivalent au contrôle manuel et ce,
pour des quantités très faibles de matériel
biologique dans des temps réduits.
984.4186
1001.496
63
1083.4926
1163.5140
1249.4983
But de l’étude
2687.4
3350.2
4013.0
=> La digestion micro-ondes (fig2-a) avec trypsine 1, ne donne que 5 des peptides les plus intenses de la BSA (voir spectre fig2-b
TX contrôle), pour des temps de digestion de 15, 25, 30 ou 40min. La trypsine bovine modifiée n’est pas adaptée à la digestion par
micro-ondes dans les conditions fixées ici. L’expérience est étendue à 2 autres enzymes (porcine, test 2) à disposition au
laboratoire, en conservant le lot2 pour comparaison. La trypsine 3 est conservée pour la suite.
PARAMETRES OPERATOIRES
PARTIE 4 : DIGESTION AUX ULTRASONS
Fig 4: Intensités normalisées par rapport à l’intensité
totale de 3 peptides tryptiques de la BSA (moy. de 2
tubes, dépôts en triplicate) Temps de digestion : t =15 min
0.25
927
1001
1639
TX
T=55°C
T=60°C
TX
T=55°C
T=60°C
0.2
0.15
0.25
HCA
0.20
0.15
0.10
0.05
0.15
0.00
0.1
927
1439
0.05
0
Fig 5: Intensités normalisées par rapport à
l’intensité totale, de 3
peptides tryptiques de la
BSA (moy. de 2 tubes,
dépôts en triplicate).
Puissance : W = 50w
TX
50w 60w 70w 50w 60w 70w 100w
=> Avec un temps de digestion réduit de 15min, aucune
amélioration n’est observée après augmentation des valeurs
par défaut de la température ou la puissance du micro-onde.
1567
TX
t=15min
t=30min
DHB
0 10
0.10
0.00
TX
40°c 50°c 55°c 40°c 50°c 55°c
Test 3 : Les échantillons des analyses précédentes sont analysés sur MALDI LTQ Orbitrap. Cet appareil nous permet d’obtenir des
cartographies peptidiques avec une tolérance de masse de 2ppm, ce qui lève certaines ambiguités sur l’attribution de peptides.
=> Même si tous les peptides de la BSA n’ont pas pu être pointés sur ces
spectres,
t
cependant,
d t l’analyse
l’
l
manuelle
ll des
d
spectres
t
suggère
è
que la
l
digestion au micro-ondes permet d’obtenir des spectres plus riches en
peptides tryptique.
Peptides tryptiques de la BSA
MO
Une étude plus approfondie montre que les peptides qui “apparaissent” lors des digestions aux micro-ondes, sont essentiellement des
espèces à 1 “miss-cleavage” (MC). Cette augmentation de la proportion de peptides à 1 MC, ne réduit pas pour autant le nombre
d’espèces à 0 MC (à l’exception de 1 à 2 peptides). La réduction du temps de digestion présente donc un double avantage, puisque
l’on combine gain de temps et augmentation de la couverture de séquence, résultant des peptides supplémentaires à 1MC qui sont
détectés.
Références bibliographiques :
[1] Electrophoresis. 1995 Jul;16(7):1090-4. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Wasinger VC. et al.
[2] Electrophoresis. 1999 Aug;20(11):2149-59. Diagnosis of cellular states of microbial organisms using proteomics. VanBogelen RA. et al.
[3]The Journal of Proteome Research 2008, 7, 96–103, ] J. Klimek et al
[4] Nat Biotechnol. 2004 Oct;22(10):1291-6. Protein sequencing by mass analysis of polypeptide ladders after controlled protein hydrolysis. Zhong H. et al.
[5] Mol Cell Proteomics. 2006 Apr;5(4):769-76. Microwave-assisted protein preparation and enzymatic digestion in proteomics. Sun W. et al.
[6] CEM Publishing: Matthews, NC, 2002; 11. In Microwave Synthesis. Hayes BL (ed). Collins MJ.
Couverture de séquence
90
90
80
80
70
70
Méthodes
60
60
50
50
40
40
79.47
79.47
30
30
US
70.93
70.93
61.57
77.68
TX
20
20
22.90
10
10
19.13
00
1
1 pmol/µl
2
100 fmol/µl
3
10 fmol/µl
Fig 8: Comparaison du nombre de peptides en
fonction de la méthode et de la concentration
Nombres de peptides de BSA en fonction de la méthode et de la concentration
50
50
45
45
40
40
Méthodes
0.05
=> Le temps de digestion doit être au minimum de 15min (pas de
signal observé à 5 et 10min) sans dépasser 30min (perte de signal
et de l’avantage de la digestion aux micro-ondes: gain de temps)
Fig 6 : Cartographies peptidiques sur MALDI
LTQ Orbitrap Digest BSA 10fmol/µl
(cond. op: t=15min / T=40°c / W=50w)
=> Lorsque la concentration en protéine diminue (100 fmol/µl), le taux
de couverture de séquence est plus important avec la méthode
conventionnelle. Lorsque la concentration diminue encore (10 fmol/µl)
on obtient un taux de couverture de séquence équivalent avec les deux
méthodes. On peut attribuer la différence de résultats entre les fortes et
les faibles concentrations en protéines au phénomène de « collage »
des peptides sur les parois des tubes qui pourraient être accentué avec
la méthode des ultrasons.
Fi 7:
Fig
7 Comparaison
C
i
d
des
t
taux
d couverture
de
t
d
de
séquence en fonction des méthodes et des
concentrations en protéines
Couvertures de séquence (Fig 9)
De meilleures couvertures de
séquence sont obtenues par
ultrasons. Il y a plus de MC avec la
méthode des ultrasons. Ce
nombre plus important de MC
permet d’avoir accès à des
séquences de peptides de masses
inférieures à la limite de détection
fixée sur le MALDI-TOF/TOF. Par
conséquent, un meilleur taux de
couverture de séquence peut être
atteint.
35
35
US
30
30
TX
25
25
20
20
45
45
43
43
42
42
40
40
15
15
10
10
55
10
10
00
1
1 pmol/µl
2
100 fmol/µl
13
13
3
10 fmol/µl
Fig 9: Comparaison des couvertures de séquence de
la méthode conventionnelle et de la méthode par
ultrasons
Couverture de séquence BSA 1 pmol/µl
84
82
Couverture de séquence %
Test 1 : Intensités de 3 peptides tryptiques de la BSA, selon Test 2 : Influence de la température pour des temps de 15 et 30min
différentes valeurs de puissance et de température, pour un (pour les temps de 5 et 10min, il n’y a pas de signal observé et au
delà des 30min, on perd l’intérêt du procédé, c’est à dire le gain de
temps de digestion de 15min.
temps). Les digestions sont déposés avec 2 matrices différentes
(HCCA-DHB).
Tests de sensibilité ((Fig
g 7 et 8))
Les concentrations étudiées sont 1 pmol/µl, 100 fmol/µl et 10 fmol/µl.
Pour chaque concentration, 3 échantillons sont préparés de manière
conventionnelle, et 3 échantillons sont préparés avec la digestion par
ultrasons. Les dépôts sont analysés avec le MALDI– TOF/TOF. Sont
comparés: les taux de couverture de séquence, le nombre de peptides
obtenus en fonction des méthodes et des concentrations. Pour les
concentrations de 100 fmol/µl et 10 fmol/µl une étape de dessalage
est ajoutée avant le dépôt sur la plaque MALDI.
Nombre de peptides
Les p
paramètres consommables et enzymes
y
étant p
posés,, une série d’analyses
y
croisées est réalisée en faisant varier les p
paramètres
intrinsèques de la digestion (température T, temps de digestion t, puissance W). Des peptides spécifiques de la digestion tryptique de
la BSA sont sélectionnés comme marqueurs de digestion, après analyse des digestions par MALDI-TOFTOF.
couverture de séquence %
PARTIE 3 : PARAMETRES DE DIGESTION
US
80
78
TX
76
74
72
70
68
66
79,46%
70,93%
64
62
Méthode
Conclusion & perspectives :
L’introduction de nouvelles techniques de digestion dans le domaine protéomique est prometteuse. Il est ainsi
possible de diminuer les temps de traitement des échantillons tout en augmentant les couvertures de séquence.
La propriété de certains matériaux comme le téflon par exemple, d’être transparent aux micro-ondes et d’avoir
une bonne résistance chimique a permis de développer de nouveaux réacteurs qui, placés dans un carrousel à
plusieurs positions permettent de traiter de nombreux échantillons simultanément et plus rapidement que lors
des digestions conventionnelles.
Les ultrasons permettent d’envisager des extractions et protéolyses combinées sur des échantillons bruts ou
non solubles.
L’application à ce type d’échantillon complexe et non solubilisé est en cours au laboratoire.
Le choix des réactifs et tubes est toutefois particulier et peut totalement compromettre l’analyse si une étude de
validation n’est pas menée en préliminaire.