Nouveaux motifs peptidiques de reconnaissance des néo

UNIVERSITE MONTPELLIER II
SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE MONTPELLIER II
Discipline : Chimie-Biologie
Ecole Doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la santé
présentée et soutenue publiquement
par
SCHMIDT Julien
le 19 Décembre 2008
Nouveaux motifs peptidiques de reconnaissance des néovaisseaux : synthèse et évaluation pour le diagnostic et la
thérapie des cancers
JURY
Mme BAUDY-FLOCH Michèle, Directeur de Recherche
M BOUDOUSQ Vincent, Praticien Hospitalier
M DUMY Pascal, Professeur
M MANGEAT Paul, Professeur
M PELEGRIN André, Directeur de Recherche
M VIVES Eric, Maître de Conférences des Universités
Rapporteur
Rapporteur
Directeur de thèse
Préambule
Le cancer est un problème de santé publique dans le monde entier. Il est la première cause de
mortalité chez les hommes et la seconde chez les femmes après les maladies
cardiovasculaires. Il est caractérisé par la prolifération incontrôlée de cellules au sein d'un
tissu normal de l'organisme. Les moyens de diagnostic disponibles à l’heure actuelle ne
permettent pas, dans un trop grand nombre de cas, de dépister précocement l’apparition des
tumeurs. Sur le plan thérapeutique, les traitements conventionnels n’ont qu’une sélectivité
imparfaite vis-à-vis des cellules tumorales, entraînant des effets secondaires, parfois sévères,
qui limitent leur efficacité.
Pour se développer une tumeur doit se constituer un réseau de vaisseaux sanguins capables
d’apporter des nutriments et de l’oxygène, c’est ce que l’on appelle la néo-angiogénèse.
Agir sur la néo-angiogénèse tumorale constitue une stratégie de choix pour limiter le
développement de la tumeur et prévenir la formation de métastases. Les néo-vaisseaux
tumoraux sur-expriment l’intégrine V3, présente également sur de nombreuses lignées
tumorales humaines, en faisant une cible majeure pour des agents anti-angiogéniques. Comme
plus de la moitié des récepteurs de la famille intégrine, V3 va reconnaître la séquence
tripeptidique RGD (Arg-Gly-Asp). L’utilisation de vecteurs synthétiques présentant le motif
de ciblage RGD dans une conformation contrainte et véhiculant des agents thérapeutiques est
aujourd’hui exploitée pour cibler spécifiquement les zones de néo-angiogénèse et concentrer
l’action de la drogue vectorisée à la tumeur.
Dans ce contexte, nous avons consacré nos travaux à la conception de nouveaux motifs
peptidiques RGD dirigés spécifiquement contre l’intégrine V3 et capables de véhiculer
divers agents effecteurs dans un but diagnostique ou thérapeutique.
1
INTRODUCTION
2
I) L’angiogénèse tumorale : une cible pour la thérapie des cancers
I-1. Définition
Pour se développer, une tumeur a besoin d’oxygène et de nutriments. Si pour les petites
tumeurs (1-2 mm3) leur diffusion à travers les tissus avoisinants suffit à cet apport, celles
dépassant 2 mm3 doivent se constituer un réseau de vaisseaux sanguins pour subvenir à leurs
besoins. Ainsi, la cellule cancéreuse va libérer différentes molécules angiogéniques,
principalement le FGF (Fibroblast Growth Factor) et le VEGF (Vascular Endothelial Growth
Factor) en direction des vaisseaux sanguins proximaux du tissu hôte. Ces molécules vont
stimuler la production de collagénases et de l’activateur du plasminogène par les cellules
endothéliales, permettant une dégradation de la membrane basale entourant les vaisseaux. Les
cellules endothéliales peuvent alors migrer et amorcer le bourgeonnement de vaisseaux
parentéraux conduisant à la formation d’un nouveau réseau vasculaire, c’est le phénomène
d’angiogénèse. Dans des conditions physiologiques normales, ce phénomène est régulé par
une balance entre des facteurs pro et anti-angiogéniques. Les cellules malignes sont capables
de faire basculer celle-ci dans le sens d’une sur-expression des facteurs pro-angiogéniques
tout en inhibant les facteurs anti-angiogéniques. La formation des ramifications permet la
croissance des cellules tumorales non seulement par l’apport de composés énergétiques, mais
également par la sécrétion de divers facteurs de croissance. La tumeur peut par la suite
diffuser et coloniser d’autres tissus par la formation de métastases pouvant gagner la
circulation sanguine grâce au réseau vasculaire développé. Ces nouveaux vaisseaux tumoraux
diffèrent en de nombreux points des vaisseaux « normaux ». Outre un aspect dilaté,
désordonné, avec une forte tortuosité, ils ne présentent pas de hiérarchisation et sont d’une
fragilité peu commune (hémorragies fréquentes).
Décrite dès le début du 20ème siècle, c’est en 1971 que l’angiogénèse est désignée comme
cible thérapeutique par Folkman et al. (1). Ce processus est intimement lié à la prolifération et
la migration des cellules endothéliales (CE). Celles-ci sont particulièrement actives durant le
développement embryonnaire et chez l’adulte, leur renouvellement est très lent et limité à
quelques phénomènes physiologiques particuliers (cicatrisation, cycle menstruel,…) (1). Sous
l’action de différents stimuli, comme l’hypoxie par exemple, il va s’opérer un déséquilibre de
la régulation angiogénique (switch angiogénique) où les cellules vont passer d’une phase de
latence à une phase de prolifération (2, 3). Toute cellule normale requiert des signaux de
3
croissance mitogènes pour passer d’un état quiescent à un état de prolifération active. Ces
signaux sont transmis dans la cellule par des récepteurs transmembranaires qui se lient à des
facteurs de croissance, des composants de la matrice extracellulaire et autres molécules
d’adhésion. Aucun type cellulaire normal ne peut proliférer sans ces facteurs mitogéniques, au
contraire des cellules tumorales. Cela aboutit à ce que les cellules cancéreuses génèrent ellesmêmes leurs propres signaux de croissance (stimulation autocrine). De plus, elles surexpriment les récepteurs à ces signaux provoquant leur hypersensibilité à de faibles taux
ambiants en facteur de croissance, taux qui ne permettraient normalement aucune
prolifération. Par exemple, EGFR (Endothelial Growth Factor Receptor) est sur-régulé dans
les cancers du poumon, du cerveau et de l’estomac, alors que HER2 (Human Epidermal
Growth Factor Receptor 2) l’est dans les carcinomes mammaires.
Tableau 1 : Principaux régulateurs endogènes de l’angiogénèse (source : (4))
4
Cette auto-suffisance fut la première capacité à être décrite, surtout grâce à la découverte de
nombreux oncogènes impliqués dans sa modulation (5). A cela s’ajoute la dérégulation de
contrôles physiologiques du cycle cellulaire ou l’inactivation de récepteurs anti-prolifératifs.
La prédominance de facteurs pro-angiogéniques est associée aux cancers, psoriasis, arthrite
rhumatoïde par exemple. A l’inverse, un surplus de facteurs anti-angiogéniques est à la base
des maladies coronariennes ou des ischémies (tableau 1).
La progression tumorale passe par l’envahissement ganglionnaire puis par l’extension
métastatique suite au passage des cellules dans la circulation sanguine. La cause avancée est
la perte de molécules d’adhésion intercellulaire et la sur-expression de molécules d’adhésion
cellule/tissu interstitiel, comme les intégrines. Les cellules malignes peuvent alors migrer et
une fois dans la circulation sanguine sont capables d’envahir des régions éloignées de
l’organisme, le plus souvent les poumons, le foie, les os et le cerveau. Dépisté trop
tardivement, un cancer généralisé est synonyme de mauvais pronostic (figure 1).
Figure 1 : Illustration du processus d’angiogénèse tumorale A) Sécrétion de facteurs pro-angiogéniques en
direction des vaisseaux proximaux. B) Dégradation de la membrane basale. C) Formation de bourgeons en
direction de la tumeur. D) Création de néo-vaisseaux.
(Source : http://www.unilim.fr/theses/2005/sante/2005limo0100f/html/TH.2.html)
5
I-2. Les intégrines : structure, mécanisme et ligands
Comme nous venons de le voir, la néo-angiogénèse requiert la migration et l’adhésion des
CE. Les choisir comme cible anti-cancéreuse présente de nombreux avantages :
-
Elles sont génétiquement stables à l’inverse des cellules cancéreuses qui mutent
facilement pour acquérir de multiples résistances aux traitements.
-
Elles se divisent 70 fois plus vite que les CE normales, ce qui peut en faire un
critère de sélectivité.
-
L’angiogénèse chez l’adulte est limitée (peu d’effets secondaires sur l’angiogénèse
physiologique).
-
Elles sont plus facilement accessibles que les cellules tumorales. La demie-vie de
molécules thérapeutiques étant souvent un enjeu clé dans leur réussite, on
comprend qu’atteindre des cibles le plus rapidement possible est favorable.
-
Activité potentielle dans tous les types tumoraux. Toutes les tumeurs solides
nécessitent un phénomène angiogénique pour se développer.
-
Association possible avec d’autres approches comme par exemple la
chimiothérapie ou la radioimmunothérapie (RIT). Cela sera développé par la suite.
Parmi les protéines sur-exprimées à la surface des CE, l’intégrine DVE3 est une cible
attrayante pour les thérapies anti-angiogéniques (6).
Les intégrines sont des récepteurs de la surface cellulaire responsables des interactions
cellule-cellule et cellule-matrice-extracellulaire (7)et jouent un rôle important dans l’adhésion,
la migration et la prolifération cellulaire. Ce sont des hétérodimères contenant deux chaînes
distinctes, appelées sous-unité D et E et associées de façon non covalente. On recense à ce
jour dix-neuf sous-unités D et huit sous-unités E. Ces sous-unités D et E sont sujettes à des
modifications post-traductionnelles, notamment avec des modifications par glycosylation, ce
qui enrichit leur diversité structurelle. Des variations des domaines cytoplasmique et
extracellulaire entraînent des modulations de l’activité des intégrines et de l’affinité pour leurs
ligands. Parmi les différentes combinaisons possibles, seulement 24 hétérodimères sont
recensés (figure 2). Les intégrines lient des ligands de la matrice-extracellulaire comme la
vitronectine, la fibronectine, le collagène ou encore les facteurs de Von Willebrand. Une
grande partie des intégrines reconnaît spécifiquement la séquence tripeptidique RGD.
6
Figure 2 : Schéma des différentes associations entre les sous-unités D et E pour la formation des
hétérodimères (Source : (8))
Chaque sous-unité D et E de l’hétérodimère possède un large domaine extracellulaire, un seul
domaine transmembranaire et un court domaine cytoplasmique (20-70 acides aminés). Tous
les dimères sont dissociés par l’action de détergents ioniques confirmant que les sous-unités
sont liées de façon non covalente. (9)
La structure cristalline de l’intégrine DVE3 obtenue par diffraction aux rayons X a permis de
mettre en évidence quelques éléments structuraux. (10) Les deux sous-unités des intégrines
s’assemblent en un large domaine extracellulaire formé d’une « tête globulaire » siégeant sur
deux « jambes », une pour chaque sous-unité. Elles peuvent être repliées sur leurs « jambes »
ce qui est décrit comme un état inactif ou « debout » ce qui est décrit comme un état actif
(figure 3).
7
Figure 3 : Structure en ruban de l’intégrine V3 dans ces états actifs (gauche) et inactifs (droite) (Source :
(10))
La sous-unité est composée d’environ 1100 résidus. La face supérieure du domaine extracellulaire est en étroite association avec une région de la sous-unité E (appelée EA). Cette
région contient un « metal-ion dependent adhesion site (MIDAS) » capable de lier des métaux
divalents et très important pour la fixation, la coordination et la stabilisation des ligands.
La sous-unité E contient une région riche en cystéine et un domaine A contenant le site de
fixation des ligands et émergeant sur sa boucle supérieure (10)). EA (appelé aussi domaine I)
contient un feuillet E central entouré par 7 hélices D. (11). Son domaine intracellulaire peut
lier les filaments d’actine, permettant la liaison du récepteur au cytosquelette. La région clé
impliquée dans la reconnaissance des ligands est constituée de boucles sur la face supérieure
de la sous-unité et de EA.
Le mécanisme d’action de ces récepteurs est encore aujourd’hui très mal connu. Il est
néanmoins acquis qu’ils agissent de manière bidirectionnelle à travers la membrane
plasmique, propageant des signaux de l’intérieur de la cellule vers l’extérieur et inversement.
La structure cristalline d’V3 (10)a révélé une structure repliée, en forme de V. Des études
ont montré que cette conformation correspond à un état de faible affinité pour les ligands,
probablement dû à une difficulté à accéder au site de fixation. Par contre, la fixation de
protéines effectrices, notamment les talines, aux domaines cytoplasmiques (activation
8
« inside-out ») résultent en une propagation de signaux de l’intérieur vers l’extérieur de la
cellule se traduisant par un changement conformationnel de l’intégrine. Celle-ci se déploie
alors sur ses deux « jambes », augmentant son état d’affinité pour les ligands. Ce déploiement
s’accompagne d’un éloignement des domaines cytoplasmiques de l’intégrine (figure 4). Cette
conformation correspond à un état de forte affinité et c’est pour cela que ce changement
conformationnel est décrit comme une activation du récepteur. Ceci expliquera plus tard
l’existence de plusieurs « états d’affinité » pour un même ligand dont nous reparlerons. Les
mécanismes de cette activation restent encore énigmatiques. La fixation de ligands
multivalents peut même entraîner la formation de « cluster » d’intégrines. Cette fixation,
justement, induit un signal de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule (« outside-in » signal)
qui par diverses voies de signalisation conduira à la migration et la prolifération cellulaire.
Figure 4 : Illustration schématique de l’intégrine V3 dans ces états inactifs et actifs (Source : (12))
En 2003, Xiong et al. ont proposé le modèle « deadbolt », ou « verrou » pour expliquer
l’activation « inside-out » de l’hétérodimère. (13) Ils ont constaté qu’une région, appelée,
F/D7, faisant partie du domaine EA, subissait de nombreux changements conformationnels
lors de la fixation des ligands. Il a alors été suggéré que cette région agissait comme un verrou
bloquant le récepteur dans sa conformation inactive. Par exemple, la lovastatine, une drogue
se fixant sur cette région F/D7, a montré le blocage d’V3 dans son état inactif. Gupta et al.
ont montré que cette région interagissait fortement avec un domaine TD situé à proximité du
domaine transmembranaire de la sous-unité . Ainsi les contacts entre F/7 et TD
maintiennent l’intégrine dans sa conformation repliée. « L’inside-out activation » induirait le
9
déblocage de ce domaine, mais le mécanisme de ce processus reste encore à déterminer
(14)(Figure 5).
Figure 5 : Illustration du modèle « deadbolt » A) intégrine dans son état inactif. B) la liaison de molécules aux
domaines cytoplasmiques produit des changements dans la région F/7 du domaine A et « débloque » le
récepteur. C) liaison des ligands. D) écartement des domaines transmembranaires, le récepteur se retrouve dans
son état actif. (Source : (14))
Parce que les intégrines sont des cibles thérapeutiques de premier plan, il est nécessaire de
comprendre leur mécanisme d’action afin de cibler leur forme moléculaire la plus appropriée.
Le modèle « deadbolt » prédit donc un état inactif (ou de faible affinité) où l’intégrine est
repliée sur elle-même et bloquée dans cette configuration. Comme l’envisagent Xiong et al.,
la capacité à reconnaître et cibler chaque état des intégrines pourrait être une nouvelle
approche dans la thérapie anti-angiogénique (13). L’inhibition des ces récepteurs pourrait
alors se faire en empêchant leur activation. Ce modèle « deadbolt » a récemment été remis en
question par Zhu et al. (15). Les auteurs ont muté l’intégrine V3 afin de la bloquer dans son
état replié. Dans cet état, l’intégrine est restée capable d’induire une activation « inside-out ».
Par contre les auteurs ont confirmé que l’extension du récepteur était bien nécessaire pour la
fixation des ligands.
10
I-3. L’intégrine DVE3 comme cible anti-angiogénique
Le rôle et le mécanisme d’action des intégrines et plus particulièrement celui d’DVE3 ne sont
pas totalement élucidés aujourd’hui. Plusieurs voies d’action ont été proposées pour expliquer
le rôle de ce récepteur dans l’angiogénèse tumorale (16-18). Des études ont montré que
l’inhibition d’DVE3 sur des cellules endothéliales en prolifération les rendaient apoptotiques
et qu’il en résultait une régression des vaisseaux sanguins (19). Le mécanisme décrit est que
des antagonistes de ce récepteur (par exemple l’anticorps anti-V3 LM609) activent le
suppresseur de tumeurs p53. Ce dernier active l’inhibiteur du cycle cellulaire p21WAF1/CIP1
et induit ainsi l’apoptose. Plusieurs autres études in vitro et in vivo utilisant des anticorps ou
des peptides RGD bloquant le site de fixation aux ligands corroborent le rôle clé de ce
récepteur dans la néo-angiogénèse tumorale (20, 21). De plus, des antagonistes ont montré
leur contribution dans la régression de tumeurs humaines chez l’animal (22). Des cellules de
carcinomes du colon ont également montré une régression suite à un traitement au
Cilengitide, un cyclopentapeptide présentant la séquence RGD dont nous reparlerons plus
longuement (23).
Pourtant, l’ablation génétique des sous-unités DV ou E3 chez des souris nues ne conduit pas à
l’abolition de l’angiogénèse. Ceci met en lumière le rôle complémentaire d’autres récepteurs
modulant ce phénomène (24). Bien des questions restent encore sans réponse concernant le
rôle et le mode de fonctionnement d’DVE3 mais son implication dans l’angiogénèse tumorale
n’est plus à prouver, ce qui en fait une des cibles de prédilection des stratégies antiangiogéniques (16).
Plusieurs intégrines reconnaissent la séquence tripeptidique RGD, qui est présentée à
l’extrémité d’une boucle dans leurs ligands respectifs de la matrice extracellulaire.
Suivant la conformation spatiale de la séquence RGD et la séquence des résidus adjacents, les
affinités pour les multiples intégrines seront différentes. Ainsi, le ligand endogène privilégié
de l’intégrine DVE3 est la vitronectine. Ce récepteur fixe également d’autres protéines de la
matrice extracellulaire avec des affinités plus faibles comme la fibronectine, le fibrinogène, le
collagène, la thrombospondine, la thrombine, l’ostéopontine, la tenascine ou le facteur de Von
Willebrand (25).
11
II. La séquence RGD : de la découverte à la synthèse du
Cilengitide
II-1. Découverte et propriétés de la séquence RGD
S’il y a un nom à citer pour l’ensemble de ses contributions à la découverte de la séquence
RGD, c’est bien celui de Ruoslahti. Parmi les pionniers dans l’étude des molécules impliquées
dans l’adhésion cellulaire, c’est elle qui, dans le début des années 80 (26, 27) met en évidence
la région active de la fibronectine en s’appuyant sur les travaux de Klebe et Pearlstein (28,
29).
C’est elle qui évoquera pour la première fois le rôle d’un « récepteur de nature inconnu » que
l’on nommera par la suite le récepteur intégrine 51 (30). Parallèlement, les études de
Cheresh confirmeront l’existence de récepteurs d’adhésion à la surface de cellules de
mélanome M21 et de cellules endothéliales humaines (31, 32). Cheresh établit que ces
récepteurs sont composés de deux sous-unités et de 130 et 105 kDa et que leur
hétérodimérisation est nécessaire pour leur fonctionnement (33).
Ruoslahti établira la structure minimale complète du site de fixation de la fibronectine :
GRGDSP (26, 27). Elle synthétisera pour la première fois de petits peptides contenant la
« fameuse » séquence RGD et capables d’induire l’adhésion cellulaire (34). Constatant que la
séquence RGD est présente dans d’autres protéines de la matrice extra-cellulaire, tel que le
collagène ou la thrombine, elle entreprit de définir précisément les caractéristiques
structurales nécessaires pour une reconnaissance ligand-récepteur optimale. A la fin des
années 80 elle mènera des études de relation structure-activité sur différents peptides
contenant la séquence RGD en évaluant leurs capacités à inhiber la fixation de cellules NRK
(normal rat kidney) à de la fibronectine immobilisée (35). Se basant sur le remplacement d’un
acide aminé à la fois, les premiers résultats démontrèrent que la substitution d’un des trois
résidus R, G ou D provoquait une totale perte d’inhibition de l’adhésion cellulaire. A
l’inverse, le remplacement de la sérine dans la séquence GRGDSP par une alanine ne
changeait rien aux propriétés inhibitrices du peptide (Figure 6). De nombreuses études
utiliseront par la suite des peptides contenant les séquences RAD ou RGE en tant que
contrôles négatifs.
12
Figure 6 : Inhibition de l’attachement de cellules NRK sur de la fibronectine immobilisée par différents
peptides Les peptides contenant la séquence RGD inhibent l’adhésion cellulaire contrairement à ceux contenant
la séquence RGE ou RAD. (Source : (36))
La présence de la séquence RGD était parallèlement mise en évidence sur plusieurs ligands de
la matrice extracellulaire comme la vitronectine, le fibrinogène, la laminine ou le facteur de
von Willebrand. La découverte de récepteurs spécifiques de ces ligands apparaissait
également. L’hypothèse émise était que la sélectivité des ligands RGD pour leur récepteur ne
pouvait être liée qu’à leur conformation, car le peptide linéaire GRGDSP est capable de lier
tous ces récepteurs (36). Pour la valider, de courts peptides mimant cette sélectivité ont été
synthétisés. Les expérimentations portèrent sur la séquence GRGDSP dans laquelle les
résidus étaient remplacés un à un par leurs homologues en série D. Des tests d’inhibition de
l’adhésion de cellules NRK sur deux substrats purifiés différents, la fibronectine ou la
vitronectine, mirent à jour des différences de sélectivité. Par exemple, lorsque la sérine est
remplacée par son énantiomère, le peptide n’inhibe que la fixation des cellules à la
fibronectine alors que le peptide « normal » inhibe la fixation aux deux substrats.
Ruoslahti postula également que l’affinité de petits peptides pour leur cible pouvait être
augmentée en contraignant spatialement la séquence RGD. En effet, les peptides linéaires sont
flexibles et leur liberté de mouvement n’offre pas la structure optimale souhaitée. L’hypothèse
cette fois est que des peptides cycliques, dans lesquels la conformation de la séquence RGD
est contrainte, seraient plus affins pour leurs cibles que leurs homologues linéaires. Le même
test d’adhésion permit de valider l’hypothèse. Le peptide cyclique c[GRGDSP] se montra
ainsi 10 fois plus actif que le peptide linéaire GRGDSP (35).
13
Toutes ces études ouvrirent la voie des peptides RGD en tant que molécules utilisables dans le
traitement des cancers. L’implication des récepteurs d’adhésion et de migration cellulaire
dans le développement des cellules cancéreuses étant de plus en plus argumentée, il paraissait
logique que de petites molécules pouvant inhiber ces phénomènes seraient prometteuses.
Gehlsen et al. utilisèrent d’ailleurs le peptide linéaire GRGDSP pour inhiber la prolifération
de cellules de mélanomes A375M in vitro, son homologue GRGESP n’ayant lui aucun effet
(37).
II-2. Le peptide c[RGDfV]
Les petits peptides RGD sont adaptés pour les études de relation structure-activité. Au début
des années 90, Kessler entreprend de déterminer plus précisément les caractéristiques
structurales nécessaires pour une fixation optimale entre ligands et récepteurs. L’avènement
de la RMN bidimensionnelle permet de connaître précisément la conformation d’une
molécule dans l’eau. Il faut préciser que les peptides sont des entités flexibles et que leur
conformation dans l’eau n’est pas forcément identique à celle adoptée une fois liés à leurs
cibles. Les interactions (hydrophobes, liaisons hydrogènes, etc...) entre le ligand et le
récepteur peuvent induire des changements dans la conformation des ligands. L’idée de
Kessler est d’introduire des contraintes conformationnelles au sein de peptides flexibles pour
exploiter et développer des modèles pour la compréhension de leur fixation (38). On
comprend facilement que le fait de restreindre la liberté conformationnelle d’une molécule
peut augmenter son affinité pour son récepteur, si tant est que la séquence active de
reconnaissance soit « présentée » de façon adéquate pour s’insérer dans le site de fixation.
Cela s’explique par le fait qu’une conformation contrainte et bien définie spatialement
demande moins d’énergie pour se fixer qu’une molécule flexible qui devra en dépenser pour
adopter la bonne conformation, évidemment une minimisation de l’énergie dépensée étant
toujours favorisée.
Les études de Kessler sont basées sur l’induction de contraintes conformationnelles à des
peptides cycliques contenant la séquence de reconnaissance RGD et l’évaluation des relations
de structure-activité. Les premières expérimentations réalisées démontrèrent qu’un acide
aminé hydrophobe, en l’occurence la phénylalanine, adjacent à RGD était favorable à
l’affinité du peptide (39). Ainsi, des séries de penta et hexapeptides cycliques avec pour
séquence principale RGDF ont été synthétisées. La contrainte conformationnelle est introduite
14
grâce à l’incorporation de résidus en série D ou de résidus prolines. Ces incorporations ont
pour effet de former ce que les biologistes structuraux appellent un coude II (40, 41). Ainsi,
en remplaçant de façon séquentielle chaque acide aminé par son énantiomère on déplace le
coude II sur chacune des positions du peptide (Figure 7). Douze hexapeptides et six
pentapeptides cycliques ont été synthétisés, caractérisés par RMN bidimensionnelle puis
utilisés en tant qu’inhibiteurs de l’adhésion de différentes lignées cellulaires sur de la
vitronectine ou le fragment P1 de la laminine.
Figure 7 : Séquence et représentations schématiques des penta et hexapeptides synthétisés (Source : (38))
Tous les hexapeptides cycliques inhibent moins bien la fixation de cellules de fibrosarcomes
HT1080, de cellules de mélanomes A375 et de cellules épithéliales HBL100 sur la
vitronectine que le peptide linéaire standard GRGDS (38).
De façon similaire, tous les pentapeptides cycliques ont démontré une activité inférieure à
celle du peptide linéaire GRGDS sauf le peptide c[RGDfV] dans lequel le résidu
phénylalanine est en série D. Il s’est trouvé être très inhibiteur de la fixation des trois lignées
cellulaires utilisées à la fois sur la vitronectine et sur le fragment P1 de la laminine. Par
exemple, il inhibe 100 fois plus la fixation de cellules A375 sur la vitronectine que le peptide
linéaire, mais il n’inhibe que 8 fois plus leur fixation sur le fragment P1 de la laminine
démontrant une différence de sélectivité. Fait intéressant, son hexapeptide correspondant est
lui inactif. La conformation et la façon dont est « présentée » la séquence RGD aux récepteurs
est cruciale dans l’affinité et la sélectivité. On voit bien par ces études que la contrainte due au
cycle, qui joue sur les distances entre les résidus R et D ainsi que leurs orientations est
importante. La position sur laquelle est induite le coude II (grâce à l’incorporation d’un
résidu en série D) est également primordiale. Le fait que les peptides linéaires soient plus
affins que la quasi-totalité des peptides cycliques peut s’expliquer par leur flexibilité et leur
liberté de mouvement. Ils peuvent donc s’arranger de façon à intégrer au mieux le site de
15
fixation du récepteur. Les peptides cycliques sont contraints et si la séquence de
reconnaissance n’est pas présentée de façon à s’insérer correctement dans le site de
reconnaissance leur affinité sera inférieure à celle des peptides linéaires. Par contre, lorsque
cette séquence est contrainte et dans une conformation adéquate pour se loger dans ce site,
l’affinité en devient meilleure. Apporter une contrainte conformationnelle à une molécule
peut donc ne pas augmenter systématiquement son affinité pour sa cible mais permet
néanmoins de conclure sur les structures se rapprochant le plus du ligand naturel.
Ainsi, sur dix-huit peptides cycliques synthétisés, seul le c[RGDfV] présente une
augmentation de l’inhibition de l’adhésion cellulaire par rapport au peptide linéaire standard.
Afin de mieux interpréter la sélectivité des différents peptides, des expérimentations sur
récepteurs purifiés ont été entreprises (42). Le fait d’utiliser un test sur récepteurs purifiés
permet de quantifier uniquement l’interaction due à ce récepteur (43). Dans des tests
d’inhibition de la fixation cellulaire, plusieurs récepteurs peuvent jouer un rôle. Ainsi, les
mêmes dix-huit hexa ou pentapeptides cycliques ont été testés pour leur affinité avec les
intégrines, V3 et 51, récepteurs respectifs de la vitronectine et de la fibronectine. Seul le
peptide cyclique c[RGDfV] a présenté une activité supérieure à celle du peptide linéaire pour
les deux intégrines. Par exemple, il inhibe 10 fois plus la fixation de vitronectine au récepteur
V3 purifié que le peptide linéaire GRGDS. Lors du test précédent l’inhibition de l’adhésion
de cellules A375 sur la vitronectine était 100 fois plus forte par rapport au peptide linéaire.
Cette différence d’inhibition entre les deux tests peut être expliquée par le fait que le peptide
c[RGDfV] peut interagir avec d’autres intégrines présentes à la surface des cellules. Tous les
autres peptides se sont montrés moins actifs et comme précédemment observé, le
remplacement d’un des acides aminés de la séquence RGD induit une réduction dramatique
de leur activité. Les études structurales par RMN bidimensionnelle ont montré que la distance
entre les résidus R et D du peptide c[RGDfV] est de 0,67 nm.
Une étude montre également que l’acide aminé V peut être remplacé sans perte d’affinité pour
V3 (44). Des tests sur ce récepteur purifié ont montré que substituer la valine par une
sérine, une glycine, une alanine ou une lysine ne changeait pas l’affinité des molécules. Cela
constitue le point de départ de l’utilisation du peptide c[RGDfK] en tant que vecteur. La
fonction amine de la lysine permet en effet l’ancrage d’agents effecteurs.
Enfin, dans le but d’améliorer la demie-vie du peptide c[RGDfV] en milieu physiologique,
Kessler entreprit la synthèse du peptide retro-invero c[rgdFv] (45). Les peptides retro-inverso,
dans lesquels les acides aminés sont en série D et dont la séquence est inversée par rapport
aux peptides parents, sont connus pour être plus stables métaboliquement. Si la conformation
16
spatiale et l’orientation des chaînes latérales des résidus sont conservées, les liaisons amides
sont inversées. Ainsi, si ces liaisons sont impliquées dans la stabilisation du complexe
ligand/récepteur (par liaisons hydrogène par exemple), l’affinité peut être très inférieure à
celle du peptide parent. Ainsi le peptide c[rgdFv] est 500 fois moins affin pour l’intégrine
V3 que le peptide c[RGDfV].
Par ses travaux, Kessler confirma que l’affinité et la spécificité d’un ligand pour son récepteur
sont déterminées par la conformation spatiale de la séquence de reconnaissance. Utiliser de
petits peptides synthétiques essayant de mimer les ligands naturels permet de renseigner sur la
conformation nécessaire à la reconnaissance. La cyclisation permet d’induire des contraintes
et de « présenter » la séquence RGD de façon définie. L’incorporation de résidus en série D
permet de modifier la conformation des peptides en induisant des coudes II. Les études de
relation structure-activité ont montré que l’incorporation d’un acide aminé hydrophobe, en
série D, adjacent à la séquence RGD, dans des pentapeptides cycliques permettait de mimer
au mieux le ligand naturel de V3. L’implication de ce récepteur dans l’angiogénèse et le
développement tumoral faisant l’objet d’études grandissantes, la découverte du peptide
cyclique c[RGDfV] sélectif et ayant une haute affinité pour ce dernier en fit une structure de
référence dans la mise au point d’antagonistes.
II-3. Le Cilengitide
Le c[RGDfV] s’est montré très sélectif et très affin vis-à-vis de l’intégrine V3. Dans des
tests d'inhibition de la fixation à leur ligands naturels respectifs, le c[RGDfV] est 580 fois plus
sélectif pour DVE3 que pour D5E1 et 128 fois vis-à-vis d'DIIbE3 (IC50 50 nM pour DvE3 en
compétition avec la vitronectine, IC50 29 μM pour 51 en compétition avec le fibrinogène et
IC50 6,4 μM pour IIb3 en compétition avec la fibronectine) (42). Il est important de
souligner que l’intégrine IIb3 est l’intégrine la plus abondante à la surface des plaquettes et
régit leur l’agrégation. Ainsi des antagonistes d’IIb3 peuvent être néfastes et provoquer
diverses hémorragies. La sélectivité est donc primordiale.
Dans le but d’améliorer encore l’affinité et la spécificité de ce peptide, Kessler entreprit la
synthèse de nouveaux dérivés, notamment par la N-méthylation séquentielle de chacun des
acides aminés du c[RGDfV] (46). Il est reconnu que la N-méthylation est une manière de
modifier la lipophilicité (47), la stabilité protéolytique (48) la biodisponibilité (49) et pour
17
induire une rigidité conformationnelle au squelette peptidique (notamment en ajoutant des
répulsions stériques) (50). Ces changements peuvent apporter une meilleure affinité, une
meilleure sélectivité (51)et peuvent également convertir un agoniste en antagoniste (52).
Ainsi, chaque liaison peptidique du pentapeptide a été méthylée sur l’atome d’azote pour
aboutir à 5 nouveaux dérivés. Leur capacité à inhiber la fixation de vitronectine biotinylée sur
le récepteur V3 purifié a été évaluée (tableau 2).
Tableau 2 : Inhibition de la fixation de vitronectine biotinylée sur le récepteur V3 purifié par différents
peptides N-méthylés (Source : (46))
Le peptide N-méthylé sur l’amine de la valine s’est trouvé 4,3 fois plus actif que le peptide
initial dans ce test, alors que tous les autres peptides se sont trouvés eux, moins actifs. Dans
un test d’inhibition de la fixation de l’échistatine radiomarquée sur le récepteur V3 purifié,
le peptide c[RGDf(NMe)V] se trouve 10 fois plus actif que le peptide c[RGDfV] (53). Cela
prouve que le test choisi pour mesurer les IC50 des composés peut donner des résultats
différents et qu’il est important de comparer des résultats ayant été obtenus dans les mêmes
conditions.
La N-méthylation séquentielle du peptide c[RGDfV] a permis d’aboutir à un nouveau dérivé
encore plus affin pour l’intégrine V3. Ce composé, dont les droits sont détenus par Merck,
a été nommé Cilengitide et évalué pour ses propriétés antiangiogéniques dans différents
cancers (voir par la suite). Des études de RMN et de simulations moléculaires ont été menées
pour tenter de comprendre cette augmentation d’affinité. Il est apparu que la N-méthylation
empêchait la formation d’une liaison hydrogène entre le proton de l’azote de l’arginine et
l’oxygène de la liaison amide de l’aspartate. De plus, ce groupement méthyle induit des
répulsions stériques entre la liaison amide du couple -aspartate/phénylalanine- et la liaison
amide du couple -valine/arginine-. Cela résulte en un éloignement des chaînes latérales des
résidus R et D (la distance entre les carbones des ces deux résidus est de 0,8 nm dans ce cas
18
alors qu’elle est de 0,67 nm dans le cas du peptide parent). Ces différences structurales
apportées par la N-méthylation du résidu valine permettent de présenter le ligand dans une
conformation plus affine pour le récepteur V3.
Plus récemment, Kessler a démontré que la multi-N-méthylation de peptides cycliques
pouvait aussi augmenter la sélectivité vis-à-vis de différents récepteurs intégrines (50). Sur la
base du peptide cyclique c[GRGDfL], la N-méthylation d’un ou plusieurs résidus conduit à
des différences de sélectivité assez drastiques (tableau 3). Alors que le peptide non méthylé
est 2 fois plus sélectif pour V3 que pour IIb3, le peptide méthylé sur les amines des
résidus R et L est 400 fois plus sélectif pour IIb3 que pour V3. L’affinité de ce dernier
est améliorée d’un facteur 6,5 pour IIb3 comparée au peptide de référence, par contre
l’affinité pour V3 se trouve diminuée d’un facteur 120.
Tableau 3 : IC50 de différents peptide N-méthylés vis-à-vis des intégrines 51, V3 et IIb3
Les résidus N-méthylés sont représentés en rouge. (Source : (50))
Ces résultats sont donc à analyser avec précaution. En effet l’apparente sélectivité entre deux
intégrines résulte souvent d’une diminution de l’affinité pour un des deux récepteurs et non en
une augmentation de l’affinité pour l’un ou l’autre. On devient sélectif mais on ne diminue
pas l’IC50 du composé.
Ces multiples changements n’ont en tout cas pas permis de trouver une molécule plus affine et
plus sélective pour V3 que le Cilengitide, qui reste encore aujourd’hui la molécule de
référence en tant qu’antagoniste de cette intégrine.
19
II-4. Données structurales
Une avancée importante a été réalisée lorsqu’en 2002, Xiong et al. ont caractérisé l’interaction
du motif RGD du Cilengitide avec le récepteur V3. L’étude a été réalisée sur la structure
cristalline du complexe ternaire formé par le domaine extracellulaire de l’intégrine V3 en
interaction avec le ligand Cilengitide en présence de cations divalents manganèse (11). La
structure cristalline a été comparée à celle de l’intégrine en l’absence de ligand et en présence
de cations de façon à appréhender les principaux changements dans les structures tertiaires et
quaternaires du récepteur provoqués par l’approche du ligand.
Les résultats de cette étude montrent que l’interaction entre le récepteur V3 et le peptide
c[RGDf(NMe)V] requiert huit cations Mn2+ tandis que l’intégrine seule s’entoure de
seulement six cations. Dans le complexe, les deux cations supplémentaires sont coordinés à
l’interface de liaison avec le ligand avec deux sites du domaine A :
- un des cations interagit avec le motif MIDAS du domaine A et permet une liaison
directe entre la chaîne 3 de l’intégrine et le résidu acide aspartique du motif RGD du ligand.
- l’autre cation est engagé dans l’interaction avec le site LIMBS (ligand-associated
metal binding site) du domaine A et apporte une stabilité conformationnelle à la surface
d’interaction ligand/récepteur.
Le motif RGD du ligand s’associe au récepteur à l’interface des deux chaînes V et 3 et
établit des contacts de part et d’autre des deux sous-unités. Le résidu arginine est orienté vers
la chaîne V. Sa chaîne latérale s’insère dans un sillon étroit, le groupement guanidinium
pouvant y établir des ponts salins avec deux résidus acide aspartique, Asp150 et Asp218. Le
résidu D s’expose vers la chaîne 3 et se niche dans une crevasse du domaine A. L’un des
oxygènes du groupement carboxyle coordine le cation Mn2+ ponté par le résidu Glu220 du site
MIDAS du domaine A. Le deuxième atome d’oxygène établit des liaisons hydrogène avec le
squelette amide (groupements carbonyle) des résidus Tyr122 et Asn215 ainsi qu’un contact avec
la chaîne aliphatique du résidu Arg214. Le résidu glycine intermédiaire se situe lui à l’interface
entre les deux sous-unités V et 3 et a essentiellement des contacts hydrophobes avec la
sous-unité 3 (Arg216) (Figure 8). Les deux résidus complétant la structure du ligand,
f(NMe)V, sont eux exposés vers l’extérieur de l’interface d’interaction ligand/intégrine et
n’établissent aucun contact avec le récepteur. Mais comme nous l’avons vu, le fait que la
phénylalanine soit en série D induit un coude II qui est essentiel pour avoir une bonne
conformation du peptide.
20
Figure 8 : Interactions entre le ligand Cilengitide et l’intégrine V3
Le peptide est représenté en jaune, les résidus de la région DV sont représentés en bleu, ceux de la région 3 en
rouge. Les liaisons hydrogène (distances inférieures à 3.5 A) sont illustrées en pointillés. On peut se rendre
compte que les résidus V et f n’entrent pas en contact avec le récepteur. (Source : (11))
L’approche du ligand provoque essentiellement des modifications dans la structure tertiaire du
domaine A de la sous-unité 3 de l’intégrine mais induit peu de changements dans la
structure quaternaire du récepteur : seule une légère modification de l’orientation relative du
domaine A par rapport à la chaîne V est observée. Du côté du ligand, les simulations de
dynamique moléculaire montrent que le contact établi avec le récepteur V3 provoque une
légère distorsion du squelette pentapeptidique (11).
Les conclusions précédentes postulant que la distance et l’orientation des résidus R et D est
primordiale sont donc confirmées.
Grâce à ces nouvelles connaissances sur la structure du site de fixation des ligands d’V3,
Kessler entreprit des études de « docking » afin de redéfinir de façon encore plus précise le
pharmacophore idéal. Le concept consiste à étudier par modélisation in silico les interactions
21
ligand-récepteur V3 et à déterminer la structure la plus affine possible. Bien entendu, ces
résultats sont validés par des mesures d'IC50 des différents composés sur DVE3 (54).
L’étude entreprise fait intervenir un large panel de molécules différentes, peptidiques ou non.
Le but de cette discussion n’est pas de rentrer dans le détail de la simulation
computationnelle, mais simplement de comprendre l’apport et les conclusions de ces études.
Le premier composé testé est bien sûr le Cilengitide. La conclusion importante révélée est que
le programme (AutoDock V 3.0.5) peut reproduire de façon fidèle la fixation du ligand à son
récepteur. Les données sur l’orientation, les distances et les interactions mises en jeu sont en
parfait accord avec les données tirées de la structure cristallographique. Ceci a permis de
valider le programme de « docking » comme un futur outil au service de la conception de
molécules. Les autres composés testés (peptides cycliques ou peptidomimétiques) ont
démontré par simulation une moins bonne affinité pour le site de fixation d’V3.
Ces résultats renforcent encore un peu plus le Cilengitide en tant que structure de référence.
Ces simulations ont permis de définir et confirmer les règles et contraintes structurales
nécessaires à une fixation optimale. Pour V3, le site de fixation est dominé par des résidus
polaires et un réseau de liaisons hydrogène entre le ligand et la protéine.
Le ligand “idéal” pour cette intégrine devra donc avoir un espacement et une conformation de
la séquence RGD rigoureusement définie, permettant la coordination avec un ion métallique
dans la région MIDAS, la fixation aux aspartates 128 et 150, des interactions polaires avec les
arginines 214 et 216, le plus de liaisons hydrogène possibles et une minimisation des
encombrements. En ce sens, le Cilengitide s’est révélé être un ligand réunissant toutes les
caractéristiques requises. Les études de Kessler ont permis la mise au point d’une molécule
qui fait encore aujourd’hui office d’antagoniste de référence d’V3.
II-5. Evaluations du Cilengitide dans la thérapie des cancers
Ayant prouvé ses capacités à se fixer à DVE3 lors de tests in vitro, le Cilengitide a fait l'objet
d'études pré-cliniques in vivo sur des modèles murins.
Les doses efficaces du Cilengitide typiquement utilisées dans la littérature sont de 100-200
g/souris/j. Des injections journalières de la molécule (100 μg/souris) à des souris athymiques
inoculées avec des tumeurs cérébrales inhibèrent le développement tumoral (55). Une étude
publiée par Burke et al. a montré l’intérêt d’associer le Cilengitide à la RIT (56). L’étude a été
22
menée sur des souris nues portant des tumeurs du sein (cellules HBT3477). Les auteurs ont
alors étudié les effets d’un traitement au Cilengitide en combinaison avec une
radioimmunothérapie (RIT) de type
90
Y-DOTA-anticorps ChL6 (anticorps chimérique
souris/humain monoclonal reconnaissant une glycoprotéine membranaire sur-exprimée dans
les cancers du sein). Les réponses antitumorales ont été comparées entre différents groupes de
souris, soit traitées en association, soit avec un seul des deux traitements, soit non traitées. Les
résultats des régressions tumorales montrent une synergie des deux traitements, sans toxicité
supérieure par rapport aux traitements utilisés seuls. Les analyses histologiques des coupes de
tumeurs récupérées ont montré une augmentation de la proportion des cellules tumorales et
endothéliales en apoptose dans le groupe ayant reçu l’association des deux traitements par
rapport aux animaux traités par la RIT seule.
Il faut également souligner que l’effet du Cilengitide dans ces modèles n’est observé que lors
d’une utilisation à des stades précoces du développement tumoral. On peut le comprendre
facilement : ayant des propriétés anti-angiogéniques, son utilisation sur des tumeurs ayant
déjà créé leur réseau de vaisseaux sanguins est limitée. Ceci permet d’ores et déjà de pointer
du doigt les inconvénients de cette molécule à savoir une efficacité notable uniquement aux
stages précoces et l’obligation de traiter continuellement. Il est facile de penser que les
explications résident dans la petite taille du peptide pouvant provoquer une élimination rapide
(sa demie-vie est évaluée entre 3 et 5 h chez l’homme par exemple), un effet antiangiogénique
mais pas cytotoxique qui inhibe le développement tumoral mais ne le détruit pas.
II-6. Etudes cliniques
Des études cliniques de phase I ont débuté afin de déterminer la pharmacocinétique ainsi que
la toxicité du Cilengitide dans le traitement de cancers de types variés (57). La première
concerne l’administration intraveineuse de la molécule à des doses de 30 à 1600 mg/m2 deux
fois par semaine à des patients atteints de tumeurs solides métastatiques. Aucune dose limite
de toxicité n’a été observée et la pharmacocinétique est indépendante de la dose et du temps
d’injection. L’apparente demie-vie du Cilengitide a été évaluée entre 3 et 5h. La demie-vie
des petits peptides est généralement de quelques minutes (par exemple la demie-vie de la
cholecystokinine-8, un octapeptide linéaire, n’est que de 12 minutes) (58). Le fait que le
Cilengitide soit cyclique peut expliquer une résistance accrue aux protéases.
23
Grâce à ces informations d’autres études ont été menées sur ces bases et deux rapports sont
parus en 2007. Le premier concerne l’étude de phase I sur des patients atteints de gliomes
malins récurrents (59). Cinquante-et-un patients furent concernés, recevant des doses de 120 à
2400 mg/m2, administrées comme précédemment de façon intraveineuse deux fois par
semaine. Seulement 4 patients ont montré une dose limite de toxicité (grade 4 de toxicité
hématologique). La dose maximale tolérée n’a pas été atteinte, ce qui signifie que le
traitement est bien accepté même à la dose évaluée la plus forte. Deux patients ont montré une
réponse complète, 3 une réponse partielle et 4 une stabilité de la pathologie. L’efficacité de la
molécule sur un pourcentage de patients aussi faible peut paraître décevante suite aux bons
résultats des études pré-cliniques. La deuxième étude a été réalisée sur des enfants atteints de
tumeurs cérébrales réfractaires (60). Trente et un patients reçurent le Cilengitide toujours
suivant le même protocole. Cette fois-ci aucune dose limite de toxicité n’a été observée et la
dose maximale tolérée n’a pas non plus été atteinte. Trois patients sur treize traités à la dose
de 2400 mg/m2 ont fait l’objet d’hémorragies intra-tumorales. Aucun effet de ce type n’a été
observé pour la dose de 1800 mg/m2. Rappelons que les néo-vaisseaux tumoraux sont fragiles
et qu’empêcher leur formation peut conduire à des hémorragies. Une réponse complète et
deux stabilisations de la maladie ont été enregistrées. Là encore, le faible taux de patients
répondant favorablement au traitement est décevant.
Mais l’absence de toxicité du Cilengitide l’a autorisé à passer en essais cliniques de phase II
dans le traitement de cancers du poumon (61), et chez des patients atteints de glioblastomes
(62). Ainsi 81 patients présentant des glioblastomes ont reçu des doses hebdomadaires de 500
mg ou 2 g de Cilengitide. L’augmentation de la médiane de survie par rapport aux patients
traités avec un placebo est de 6,5 mois pour la dose la plus faible et 9,9 mois pour la dose la
plus forte. Aucune toxicité n’a été observée. Récemment, une étude de phase III utilisant le
Cilengitide dans le traitement des glioblastomes a été mise en place par Merck.
II-7. Thérapies multiples
Le Cilengitide a démontré des résultats en dessous des espérances lors de différents essais
cliniques, résultats contrastant souvent avec ceux obtenus lors des études pré-cliniques. Ainsi
plusieurs études de thérapies l'associant à d’autres types de traitement, comme la
chimiothérapie ou la radiothérapie, ont vu le jour. Le rationnel de ces études est que les
thérapies combinées pourront exercer des effets à la fois sur les cellules endothéliales (via les
molécules anti-angiogeniques) et sur les cellules tumorales (via les molécules cytotoxiques
24
par exemple) (63). Un des problèmes rencontré par les agents anti-cancéreux est leur faible
pénétration dans les tissus tumoraux. La cause est que l’angiogénèse tumorale crée un réseau
de vaisseaux sanguins anarchiques et non organisés,.provoquant un flux sanguin irrégulier,
une forte pression interstitielle et une mauvaise délivrance en oxygène. En 2001, Jain et al.
(64)ont démontré que l’utilisation de molécules antiangiogéniques « normalisait » la
vascularisation tumorale. Ils ont prouvé que ces molécules réduisaient la densité des vaisseaux
sanguins péri-tumoraux, détruisaient les vaisseaux immatures en développement et
réorganisaient le réseaux sanguins le rendant plus perméable. Ce phénomène s’accompagne
d’une augmentation du flux sanguin et de l’oxygénation de la tumeur donnant l’opportunité à
une meilleure délivrance de drogues cytotoxiques ou de radiations (65). Dès lors, des effets
synergiques ont été espérés en combinant judicieusement la thérapie antiangiogénique avec la
chimiothérapie ou la radiothérapie.
Le Cilengitide a par exemple été administré en association avec la gemcitabine (un
antimétabolite utilisé notamment dans le traitements des cancers de la vessie, du poumon ou
encore du pancréas) à un patient atteint d’une tumeur de la mâchoire (66). Présentant des
cellules de carcinomes à croissance rapide, il a d’abord été traité par chirurgie et
radiothérapie. Après la première récidive, il a été traité avec de la gemcitabine combinée à de
la radiothérapie. Après rémission partielle, la tumeur a repris un développement rapide. Un
traitement à base de cisplatin (un intercalant de l’ADN utilisé dans le traitement de divers
cancers) et de docetaxel (un alkaloïde anti-mitotique utilisé dans le traitement des cancers du
sein, du poumon et de la prostate) n’a eu aucun effet. Le patient a alors reçu un traitement
combinant gemcitabine (1000 mg/m2, deux fois toutes les trois semaines) et Cilengitide (600
mg/m2, deux fois par semaine). Dans ces conditions, une rémission partielle a été observée
ainsi qu’une amélioration de la qualité de vie du patient qui a retrouvé le goût et l’odorat. Le
patient a présenté une stabilité de la maladie durant un an avant de décéder. Cette étude a
confirmé le potentiel d’une combinaison entre le Cilengitide et un agent cytotoxique.
Une étude de phase II a alors été menée combinant le Cilengitide et la gemcitabine chez 89
patients atteints de tumeurs du pancréas (67). Ils ont reçu le Cilengitide et/ou la gemcitabine
deux fois par semaine pendant 24 semaines (600 mg/m2 et 1000 mg/m2 respectivement). La
médiane de survie a été de 6,7 mois pour la combinaison des deux traitements et 7,7 mois
pour la gemcitabine seule. Sans augmenter la toxicité, l’association du Cilengitide à la
gemcitabine n’a pas démontré de bénéfice dans le traitement. Cela soulève une efficacité du
Cilengitide différente suivant le type de tumeur traité. Les tumeurs à développement rapide
présentant une angiogénèse accrue (comme les carcinomes ou les glioblastomes) répondent
25
plus favorablement. Plus récemment Reardon et al. ont montré un synergisme dans
l’association du Cilengitide à la radiothérapie ainsi qu’au témozolomide dans le traitement de
glioblastomes multiformes (62).
Ces exemples prouvent, dans certains cas, le potentiel bénéfique de l’association d’agents
antiangiogéniques avec des drogues cytotoxiques ou de la radiothérapie. Mais ils prouvent
aussi leur complexité ainsi que la difficulté à prédire leur efficacité. Enfin, ils mettent à jour
l’importance des relations entre les doses et les séquences d’administration.
La combinaison d’antagonistes des intégrines avec d’autres types de traitement représente une
approche rationnelle dans le traitement des cancers. Elle permet de réorganiser le réseaux
vasculaire de la tumeur en permettant une meilleure pénétrabilité mais aussi d’utiliser des
doses d’irradiation ou de chimiothérapie plus faibles et donc moins toxiques. Plusieurs études
pré-cliniques et cliniques devront être menées afin de comprendre complètement le
phénomène de restructuration du réseau vasculaire tumoral afin d’en tirer le meilleur profit.
Les études pré-cliniques devront peut-être s’effectuer de façon différente, en recherchant le
meilleur protocole d’administration des différents traitements afin d’avoir une meilleure
efficacité. La dose biologique optimale pourrait aussi remplacer la dose maximale tolérée. En
effet, parfois le meilleur effet obtenu n’est pas forcément celui utilisant la plus forte dose (68).
26
III. Antagonistes d'DVE3: une forte concurrence!
Depuis l’avènement du Cilengitide et la résolution de la structure cristalline du site de fixation
d’V3, plusieurs laboratoires se sont lancés dans la recherche de molécules encore plus
affines vu le potentiel encourageant d’antagonistes de ce récepteur.
Nous avons vu que l’affinité de petites molécules pour l’intégrine dépend principalement de la
conformation et de la présentation de la séquence RGD. Les études de Kessler et la structure
cristalline de la protéine ont confirmé les impératifs en termes de structure, de conformation et
de distance entre les éléments composant le ligand. Bien que ces caractéristiques semblent
être respectées au mieux par le Cilengitide, des efforts ont été consentis afin de trouver une
molécule encore plus affine et sélective.
Il faut également noter que durant ces années d’étude, l’implication du récepteur intégrine
V5 dans l’angiogénèse tumorale a été décrite en faisant une nouvelle cible potentielle (6971).
III-1. Les peptides
Plusieurs laboratoires se sont appuyés sur les travaux de Kessler pour tenter de mettre au point
de nouveaux peptides cycliques RGD plus affins pour V3 que le Cilengitide. Ayant été
démontré que les acides aminés f et V du Cilengitide n’intervenaient pas de façon directe dans
l’affinité pour le récepteur (42) (d’après la structure cristalline ils n’entrent pas en contact
avec l’intégrine), ceux-ci ont été remplacés de façon systématique. Les seuls pré-requis sont
les distances entre les résidus R et D à respecter ainsi que l’induction d’un coude II en amont
de la séquence tripeptidique qui l’oriente de façon adéquate (72). Un test sur récepteur purifié
a été à chaque fois réalisé pour déterminer et comparer les affinités des différentes molécules.
Belvisi et al. en 2005 ont rapporté la synthèse de nouveaux cyclopeptides dans lesquels le
dipeptide f(NMe)V est remplacé par un motif 6,5 et 6,7-azabicycloalcane (53) (Figure 9).
Suivant la stéréoisomérie de ces motifs, il est possible d’induire des coudes plus ou moins
contraints et d’en tirer des relations de structure-activité. Parmi les sept stéréoisomères
synthétisés, le composé ST1646 démontra une affinité pour V3 5 fois supérieure à celle du
Cilengitide et 10 fois inférieure pour V5 avec une IC50 de 1,4 nM pour ce dernier.
27
Figure 9 : Structure du ST1646. (Source : (53))
Les études in vivo menées sur des souris nues inoculées avec des cellules de carcinomes
A2780 ont révélé que des injections sous-cutanées continues (à l’aide d’une pompe osmotique
8 μg/h) du pseudopeptide inhibaient la prolifération tumorale (73). Les études de « docking »
réalisées semblent montrer un complexe avec V3 respectant les mêmes distances et
interactions que le complexe du Cilengitide. Une hypothèse pour son activité serait une
présentation spatiale de la séquence consensus nécessitant moins de réorganisation pour
s’insérer dans la cavité du site de fixation par rapport au Cilengitide qui lui, subit une légère
distorsion dans le complexe qu'il forme avec le récepteur.
En 2005, Casiraghi et al. ont publié l’utilisation de divers acides aminocyclopentane
carboxyliques comme lien cyclique de la séquence RGD (74). Il faut noter lors de leur
incorporation la réduction de la taille du cycle passant à 14 atomes alors que le Cilengitide en
compte 15. Onze composés furent mis au point, hydroxylés ou non et avec des combinaisons
d’isoméries différentes (Figure 10). Parmi eux, le composé 10, non hydroxylé et de
configuration 1R-3R, présenta une affinité pour V3 douze fois supérieure à celle du peptide
référent et seulement quatre fois inférieure pour V5. Les études de « docking » menées
montrèrent que les dérivés synthétisés adoptent un coude inversé et non un coude . Les
distances entre les chaînes latérales des résidus R et D sont comparables et les différentes
caractéristiques requises sont respectées.
28
Fiigure 10 : Structures des 11 composés synthétisés (Source : (74))
En 2008, le même groupe publia une étude sur des pseudopeptides RGD cyclisés cette fois
par l’intermédiaire d’un résidu 4-aminoproline (75). Huit peptides furent synthétisés et
évalués pour leur affinités avec V3 et V5 (Figure 11).
Figure 11 : Structures des 12 composés synthétisés (Source : (75))
Les résultats furent inattendus. Alors que les courbes obtenues lors de l’inhibition de la
fixation sur la protéine V3 purifiée de l’échistatine radiomarquée par des doses croissantes
d’inhibiteurs s’apparentent généralement à des sigmoides, les courbes obtenues ici sont
différentes. Elles présentent deux points d’inflexion et non un seul comme habituellement.
Les auteurs ont donc préconisé un modèle à deux états d’affinité. Bien que l’existence de
plusieurs « états d’affinité » soit documentée, comme nous l’avons vu dans la première partie
de cette introduction (14, 76, 77), aucune molécule de petite taille n’a été capable avant cette
étude de se fixer aux intégrines à la fois dans leur état de faible affinité (ou été inactif selon
29
les auteurs) et dans leur état de forte affinité (ou état actif). Les auteurs ont ainsi différencier
pour une molécule une IC50 de haute affinité (IC50h) et une IC50 de faible affinité (IC50l)
(Figure 12). Il semblerait donc que leurs dérivés puissent se fixer à l’intégrine V3 quelque
soit sa conformation. Il faut bien mentionner qu’il ne peut pas s’agir de deux sites de fixation
différents sur le même récepteur étant donné la nature du test. Celui-ci est une compétition
avec la fixation de l’échistatine qui elle, est admise comme n’ayant qu’un seul site de fixation.
Figure 12 : Inhibition de la fixation de l’échistatine sur V3 par les composés 9 (rouge) et 10 (noir)
(Source : (75))
Les peptides présentant des configurations 2,4-cis du motif proline sont plus affins que leurs
diastéréoisomères. Se basant sur le modèle à deux sites d’affinité, les auteurs ont démontré
des affinités picomolaires encore jamais atteintes à ce jour (IC50h V3 = 80 pM. et IC50h
V5 = 880 pM pour le composé 9).
Les études de « docking » réalisées confirment une conformation adéquate des composés 5 et
9 pour le site de fixation d’V3. Dans le cas du composé 5, l’explication d’une meilleure
affinité peut s’expliquer par le fait que l’hydrogène de l’azote de la proline est impliqué dans
une liaison hydrogène avec l’oxygène du groupement hydroxyle de la tyrosine 178. Pour le
composé 9, l’augmentation de l’affinité est expliquée par le fait que le groupement heptyle
hydrophobe s’insère dans une poche hydrophobe formée par la tyrosine 178, le tryptophane
179 et la phénylalanine 154 sur la partie V et les tyrosines 122 et 166 sur la partie 3. Toutes
ces interactions stabilisent un peu plus le complexe formé. Ainsi, il s’agit de la première étude
présentant un peptide nettement plus affin que le Cilengitide de référence et qui plus est
fonctionnalisable. Bien sûr ici, le groupement heptyle agit favorablement en stabilisant le
30
complexe via les interactions mentionnées ci-dessus, mais le remplacer par un groupement de
nature différente pourra peut-être ne pas s’avérer aussi bénéfique. On peut d’ailleurs s’étonner
que le groupement heptyle interagisse avec le récepteur car il se trouve en retrait par rapport à
la séquence RGD qui, elle, d’après la structure cristallographique, est la seule à établir des
contacts avec le récepteur.
Bien entendu, dans les différentes études citées ci-dessus, toutes les caractéristiques
structurales ont été élucidées par « docking ». Bien que plusieurs expérimentations aient
confirmé la bonne corrélation entre la simulation et l’expérimentation biologique, seules les
structures cristallines de ces différentes molécules avec le site actif des intégrines visées
pourront confirmer ces résultats.
Enfin, une nouvelle catégorie récemment mise à jour et s’apparentant plus à une pseudo
séquence RGD puisqu’il s’agit d’une séquence isoDGR. Les études menées sur cette nouvelle
séquence sont essentiellement dues à Corti et Kessler.
En 2006, le premier cité décrit la formation d’isoaspartate au sein de la fibronectine (78). La
fibronectine présente deux motifs NGR à l’extrémité de boucles localisées dans les fragments
FN-I5 et FN-I7. Les auteurs ont observé que la déamidation de l’asparagine aboutissait à la
formation de motif DGR ou isoDGR (figure 13). Des expériences d’adhésion cellulaire ont
montré que le fragment FN-I5 était capable de promouvoir l’adhésion alors qu’un mutant ne
contenant pas la séquence NGR en était incapable. L’hypothèse est que le motif isoDGR est,
tout comme le motif RGD, reconnu par les intégrines. Cela peut sembler curieux de prime
abord quand on sait que la séquence DGR n’est pas reconnue par ces récepteurs. Les auteurs
ont démontré que la déamidation de l’asparagine était un phénomène thermodynamique et
non une réaction enzymatique. Une analyse MALDI approfondie a démontré que la
déamidation passe par un intermédiaire succinimide qui après hydrolyse forme deux produits
contenant un aspartate en série L et un isoaspartate toujours en série L avec un ratio 1/3. La
formation de D-Asp ou D-isoAsp est possible mais très peu observée.
31
Figure 13 : Réaction de déamidation (Source : (78))
Des analyses complémentaires avec des peptides synthétiques ont montré que c’est bien la
séquence isoDGR et non la séquence DGR qui est pro-adhésive. Seul les peptides contenant la
séquence isoDGR sont capables d’inhiber la fixation de cellules sur la fibronectine. Enfin, des
études de fixation sur différentes intégrines purifiées ont prouvé que V3 était le récepteur
privilégié de la séquence isoDGR. Pour conclure, Corti démontra que des peptides isoDGR
agissaient comme inhibiteurs compétitifs des peptides RGD suggérant un même site de
fixation.
Parallèlement les études de Kessler ont montré que les peptides GNGRG et GDGRG étaient
bien moins affins pour V3 que les peptides GisoDGRG prouvant que c’est bien cette
séquence qui est reconnue par l’intégrine (79).
Début 2008, le groupe de Corti est allé plus loin en décrivant les bases structurales pour une
interaction du tripeptide isoDGR et le site de fixation « RGD » d’V3 (80). Les études
structurales par modélisation ont montré que le CisoDGRC se logeait sur V3 avec une
orientation inversée par rapport au ligand Cilengitide. Cette orientation lui permet
« d’accrocher » les deux sous-unité et et d’établir des interactions électrostatiques
stabilisantes. Les parties acides et basiques des résidus isoD et R sont à une distance de 1,37
nm et leurs orientations permettent des interactions polaires stabilisantes avec le récepteur. Si
le c[RGDf(NMe)V] adopte un coude inversé centré sur la glycine et provoquant des
interactions hydrophobes faibles, les liaisons amides entre la glycine et ces voisins du
CisoDGRC sont impliquées dans des interactions polaires plus fortes. Enfin, le fait d’avoir un
acide aminé permet une plus grande flexibilité du squelette peptidique lui permettant de
32
s’insérer facilement dans la crevasse du site de fixation et orientant l’isoD vers le cation
MIDAS.
L’hypothèse ainsi émise est que la transition NGR-isoDGR peut représenter un important
mécanisme physiologique permettant d’activer des sites de fixation de la fibronectine aux
intégrines.
Corti et al. ont évalué les propriétés du peptide CisoDGRC à cibler la néo-vasculature
tumorale (81). En le couplant à des nanoparticules fluorescentes (via une simple liaison
amide) ils ont pu montrer une localisation au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux
angiogéniques. Une colocalisation avec un anticorps anti-V3 montre l’implication de ce
récepteur dans la fixation du peptide. Les études sur souris inoculées avec des cellules de
fibrosarcomes ont montré des effets antitumoraux.
Plus récemment (poster Kessler 30EPS, Helsinki, 2008), Kessler a mené une étude de
« screening » sur différents peptides cycliques contenant la séquence isoDGR. Cela a permis
de synthétiser des peptides avec des affinité nanomolaires et une sélectivité différente pour
V3 et 51, ouvrant la voie à une nouvelle classe de ligands des intégrines.
Parmi les molécules ciblant V3, il y a un peptide qui ne contient pas la séquence RGD.
Ainsi le peptide ATN-161 est un peptide de cinq acides aminés dérivé d’une région de la
fibronectine. Il est acylé à l’extrémité N-terminale et amidé à l’extrémité C-terminale (AcPHSCN-NH2) (82). Dans des études pré-cliniques, il a montré des capacités à inhiber non
seulement la progression tumorale mais aussi la formation de métastases (83). Dans une étude
clinique de phase I impliquant 36 patients atteints de différents types de tumeurs solides
avancées, il a été administré à des doses de 0,1 à 16 mg/kg trois fois par semaine. Sa demi-vie
a été évaluée entre 3 et 5 h et la dose maximale tolérée n’a pas été atteinte. Il a été bien
accepté puisque aucun effet secondaire majeur n’a été dépisté. Malheureusement aucune
rémission ou régression n’ont été observées mais un tiers des patients ont montré une stabilité
de la maladie. L’ATN-161 est actuellement en essai clinique de phase II.
33
III-2. Les peptidomimetiques
Les études menées sur les peptides RGD cycliques ont démontré des caractéristiques
structurales importantes comme la distance entre les résidus R et D, la rigidité de la structure,
les interactions stabilisantes, etc...
Plusieurs laboratoires ont voulu conférer ces caractéristiques structurales à des molécules non
peptidiques pouvant cibler DVE3 (4, 84). Les peptidomimétiques sont de petites molécules
mimant les chaînes latérales des acides aminés des peptides. Par rapport à eux ils présentent
des caractéristiques pharmacologiques plus favorables, une durée de vie plus importante et
une meilleure biodisponibilité orale. Leur synthèse peut être combinatoire, grâce notamment à
la stratégie « one bead one compound », ce qui permet d’augmenter leur diversité et de créer
des chimiothèques. Chimiothèques dont le « screening » permet d’identifier les structures les
plus affines pour un récepteur donné. Ces structures sont ensuite soumises à des modifications
structurales et des études de relation structure-activité afin d’améliorer leur potentiel.
L’enjeu réside dans l’incorporation de mimes des parties acides et basiques des peptides
RGD. De très bonnes affinité et sélectivité vis-à-vis d’V3 ont été obtenues en utilisant des
groupes O-guanidine ou 2-(6-méthyl-amino-2-piridyl)éthoxy comme mimes de l’arginine et
des substitutions à l’extrémité carboxylique (85). La partie centrale des peptidomimétiques
est souvent composée de cycles phényles, biphényles, indoles, benzofuranes ou
benzothiophènes (85). Ces motifs induisent des coudes dont l’importance à été démontrée
par les études sur le Cilengitide.
Dès 1998, Carron et al. (86) proposent le screening d’une librairie de peptidomimétiques
antagonistes d’V3. Les modifications systématiques ont permis d’identifier le composé
SC68448 (Figure 14). Son IC50 est de 1,13 nM dans un test d’inhibition de la fixation de
vitronectine biotinylée sur V3 purifié. Cela en fait une molécule plus active que le
Cilengitide, dans ce type de test bien entendu (IC50 3 nM). Le SC68448 est actuellement en
essai clinique de phase I.
34
O
H
N
H2N
N
H
NH
H
N
OH
O
O
Cl
Cl
Figure 14 : Structure du SC68448 (Source : (86))
La même méthode a permis à Kumar et al. de sélectionner un antagoniste d’V3 et d’V5
(87). Le SCH221153, dans un test d’inhibition de l’échistatine radiomarquée sur récepteurs
purifiés, montre des IC50 de 3,2 nM et 1,7 nM respectivement et ne se fixe pas du tout à
IIb3. Il est plus affin que le Cilengitide pour V3 (IC50 18,9 nM dans ce test) mais moins
affin pour V5 (0,13 nM).
En 2002, Kessler publia la synthèse de peptidomimétiques utilisant des motifs aminopyridines
(88). Dans le test d’inhibition de la fixation de vitronectine biotinylée sur récepteurs purifiés
le composé 1 (figure 15) se trouva 6 fois plus affin pour V3 que le Cilengitide mais 70 fois
moins affin pour V5.
O
N
N
H
N
H
H
N
O
OH
O
1
Figure 15 : Structure du composé 1 (Source : (88))
Plus récemment, Marugan et al. ont décrit l’utilisation de motifs indoles, benzofuranes ou
benzothiophènes (85, 89) (Figure 16). L’incorporation d’un de ces 3 motifs n’a pas d’impact
sur l’affinité et la sélectivité mais les séries portant un groupe indole ont démontré de
meilleures pharmacocinétiques in vivo. En effet, un des freins au développement d’inhibiteurs
de petite taille est leur rapide élimination de l’organisme. Pour améliorer cela, les études
préconisent l’utilisation de groupements basiques avec de faible pKa (aminopyridine et
35
analogues par exemple). La réduction du nombre d’hétéroatomes de la molécule est une autre
approche pour améliorer les propriétés pharmacocinétiques. Par exemple, dans l’étude de
Marugan, après une administration par voie orale chez des souris nues, les composés portant
un groupe indole 3 présentent des demie-vies plus importantes que ceux portant des groupes
benzofuranes 1 ou benzothiophènes 2 (2,39 h contre 2,34 h et 1,92 h respectivement). La
différence est encore plus marquée lors d’administration par voie intra-veineuse (1,56 h contre
0,74 h et 0,09 h). Ces groupements étant des isostères, le remplacement d’un hétéroatome de
la molécule influe grandement sur leur pharmacocinétique, bien que leurs affinités restent
similaires (IC50 0,030 pour 1, 0,033 pour 2 et 0,049 pour 3 vis-à-vis d’V3).
H
N
N
O
H
N
O
N
O
H
N
S
N
O
N
1
O
OH
2
O
OH
3
O
OH
Figure 16 : Structure des composés 1, 2 et 3 (Source : (85))
Le même groupe publia en 2006 la synthèse de nouveaux inhibiteurs (90). En effet les auteurs
ont démontré la limite de leur composé (avec indole) qui se lie à plus de 95 % à l’albumine
humaine ou murine. La fixation de petites molécules à l’albumine est un problème majeur
dans la quête de nouveaux candidats car elle module clairement leur disponibilité et donc
leurs effets biologiques. Bien que montrant des affinités souvent supérieures à celle du
Cilengitide dans des tests sur récepteurs purifiés, leur efficacité dans des études pré-cliniques
reste bien inférieure à cause de ce phénomène (91). Parce qu’il est connu que la combinaison
d’une région hydrophobe avec une charge négative augmente l’affinité pour l’albumine, les
auteurs ont choisi de modifier leur molécule avec des motifs plus hydrophiles. Ainsi en
remplaçant le motif phényl du composé 1 (figure 17) par un motif diméthylaminométhyl-3pyridyl plus hydrophile (composé 2), la fixation à l’albumine passe de 97,3 % à 40 % tout en
améliorant l’affinité pour V3 et V5, ouvrant la voie à de nouveaux dérivés. Pour
comparaison, la fixation du Cilengitide à l’albumine n’est que de 3 %.
36
H
N
N
H
N
O
N
1
N
O
N
OH
O
2
N
OH
O
N
Figure 17 : Structure des composés 1 et 2 (Source : (90))
Parmi les antagonistes des deux récepteurs V3 et V5, il faut aussi citer le SB267268,
synthétisé sur la base d’un motif benzazépine (92). Dans un test d’inhibition de la fixation
d’un peptide RGD radiomarqué au tritium, le [3H]SKF107260, au récepteur V3 humains ou
murins purifiés, le SB267268 montre des IC50 de 0,68 nM et 0,29 nM respectivement.
Malheureusement, l'IC50 du Cilengitide mesurée avec ce test n'est pas mentionnée. Par contre,
on voit qu’il y a une différence entre les récepteurs humains et murins. Ceci est important car
il est très rare que cette différence soit prise en compte. Elle doit être gardée à l’esprit lors
d’interprétation de résultats d’études chez la souris. Le SB267268 permet de réduire de moitié
l’angiogénèse pathologique chez des souris atteintes de rétinopathies prématurées. Les
injections se faisaient de façon intra-péritonéale par des pompes miniatures à raison de 60
mg/kg/jr (si l’on considère le poids d’une souris à 30 g, cela fait une délivrance d’environ 8
μg/h, ce qui est identique à l'étude menée par Belvisi et al. avec leur pseudopeptide cyclique).
De plus cette molécule a un profil pharmacocinétique très intéressant (demie-vie de 12 h,
alors que celle du Cilengitide n’est que de 3 à 5 h) ce qui en fait un candidat très prometteur
dans les traitements antiangiogéniques.
Le développement de petites molécules organiques avec de fortes affinités pour V3 et
V5, une bonne biodisponibilité orale et une faible toxicité reste un challenge excitant et une
opportunité encourageante pour le traitement des cancers. Les obstacles sont pourtant
nombreux. Notamment la nécessité de mimer rigoureusement les parties basiques et acides de
la séquence RGD, avoir la meilleure biodisponibilité orale possible et une durée de vie dans
l’organisme accrue.
Les études se basent sur le "screening" de librairies et l’amélioration des meilleurs candidats.
Le problème soulevé par Marugan concernant la fixation de la plupart de ces molécules à
l’albumine devra être pris en considération et résolu ainsi que l’augmentation de la
biodisponibilité et l’amélioration des paramètres pharmacocinétiques, sous peine de devoir
utiliser des doses importantes pour avoir les effets thérapeutiques escomptés. Enfin,
37
l’utilisation d’antagonistes liant plusieurs récepteurs semble être de bonne augure tant on se
rend compte aujourd’hui de l’implications de multiples récepteurs dans l’angiogénèse
tumorale.
III-3. Les anticorps
Les anticorps sont des glycoprotéines reconnaissant avec une haute spécificité un épitope
contre lequel ils sont dirigés. Depuis le milieu des années 90, ils ont émergé comme une
nouvelle classe de médicaments incontournables. Vingt deux anticorps ont déjà été approuvés
par la FDA dont 12 en oncologie (93). Les progrès réalisés dans la production et l’ingénierie
des anticorps ont permis leur utilisation en tant qu’agent thérapeutiques. Notamment
l’avènement de la technologie hybridome et les avancées dans le domaine de la biologie
moléculaire ont facilité la mise au point d’anticorps humanisés non immunogènes une fois
injectés chez l'homme. Les progrès quant à leur production permettent de les fournir en
quantité suffisante pour être utilisés en thérapie (94).
Les anticorps présentent des avantages et des inconvénients par rapport à des petites
molécules chimiques. Premièrement pour les points négatifs, leur production requiert des
procédés complexes (humanisation de l’anticorps murin, génération d’hybridomes) et est
beaucoup plus onéreuse que la synthèse de petites molécules. De plus, de part leur haut poids
moléculaire (150 kDa), ils ont une pénétration des tissus tumoraux plus faible que les
molécules chimiques (95, 96). Des études ont montré qu’ils ne passaient pas la barrière
hémato-encéphalique notamment (97). Ils doivent de plus être administrés de façon
intraveineuse alors que les petites molécules chimiques peuvent être formulées pour une
administration orale.
Le principal point positif des anticorps réside dans leur haute affinité et spécificité pour leur
cible. Leur poids moléculaire, bien que limitant leur pénétration tissulaire, peut se révéler être
un atout car ils ne sont pas éliminés aussi rapidement que les molécules chimiques (la demivie d’un anticorps est de 3 à 7 jours permettant une administration hebdomadaire alors que
celle d’une petite molécule chimique est de 1 à 48 h, obligeant des administrations
journalières). Mais un atout majeur des anticorps est leur capacité à induire des réponses
immunitaires. En plus de leur effet inhibiteur (de part leur rôle d’antagoniste), ils ont les
propriétés de pouvoir activer de façon indirecte des réponses anti-tumorales. Les anticorps
38
monoclonaux possèdent un domaine Fc (de type immunoglobuline) capable de réguler la
cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante (ADCC) et la lyse tumorale via le complément
(CDC). Le complément est un ensemble de protéines circulantes plasmatiques qui agissent de
façon à augmenter la destruction de la cellule visée par l’anticorps. Ces protéines s’organisent
en un complexe qui forme des pores dans la membrane de la cellule cible. L’ADCC est un
mécanisme de défense faisant partie de l’immunité innée. Elle fait intervenir des cellules NK
(natural killer), qui se fixent à la partie Fc de l’anticorps et participent à la lyse de la cellule
visée.
Parmi les anticorps ciblant le récepteur V3, trois sont à mentionner.
Le premier est le Vitaxin (MEDI-523), une version humanisée de l’anticorps de souris antiV3 humain LM609. C’est le premier à être entré en essai clinique de phase I en avril 1997
(98). Le Vitaxin a été administré à des patients ayant des tumeurs solides variées et
réfractaires à la chimiothérapie (99). Les doses, injectées de façon intra-veineuse, allaient de 1
à 4 mg/kg/semaine. Les effets secondaires observés étaient principalement de la fièvre, des
nausées et des maux de tête. Un seul patient sur les 17 engagés répondit au traitement de
façon partielle. Deux autres études de phase I ont été menées à l’Université d’Alabama (100,
101). Bien qu’aucune toxicité n’ait été observée, aucune réponse majeure ne fut établie. Les
raisons invoquées pour ce manque d’efficacité étaient l’administration de doses trop faibles et
une affinité pour V3 pas assez forte. Cela peut contraster avec la définition même des
anticorps qui sont censés être les molécules les plus affines pour leur cible, mais il ne faut pas
oublier que le Vitaxin a été humanisé. Ce processus peut malheureusement réduire l'affinité
de l'anticorps (102).
Un dérivé du Vitaxin, l’Abegrin (MEDI-522), a été mis au point. Il dérive aussi du LM609 et
est humanisé. Des modifications par mutagénèse dirigée ont permis d’augmenter l’affinité
pour V3 (d’un facteur 7 par rapport au Vitaxin). Il faut noter que cet anticorps ne se fixe
pas sur le site de fixation RGD-dépendent d’V3 mais sur un site distinct provoquant un
changement conformationel du récepteur l’empêchant de fixer ses ligands naturels. Les études
pré-cliniques ont confirmé son activité in vitro et in vivo (103, 104). Il a alors été utilisé en
phase I chez des patients atteints de tumeurs solides résistantes aux traitements
conventionnels. Trente cinq patients ont reçu des doses de 2 à 10 mg/kg/semaine de façon
intra-veineuse. Le traitement a été bien accepté et la dose maximale tolérée n’a pas été
atteinte. Très peu d'effets secondaires ont été observés. Malheureusement aucune réponse
complète ou partielle n’a été observée. Seulement 3 patients ont montré une stabilité de la
39
maladie (105). Les études de pharmacocinétique ont montré une demie-vie de l’anticorps
d’environ 120 h (106). L’Abegrin est actuellement évalué en phase II chez des patients
souffrant de mélanomes métastatiques de grade 4.
Le CNTO95 est un anticorps monoclonal humanisé généré chez des souris transgéniques. Il se
lie aux intégrines V3 et V5 purifiées avec des Kd respectifs de 200 pM et 1 nM. Dans un
model pré-clinique de souris nue, des injections de CNTO95 (10 mg/kg, 3 fois par semaine)
ont inhibé à 80 % la croissance de cellules de mélanomes humains (107). Un effet synergique
a également été montré avec la radiothérapie chez des souris nues (108). Une étude clinique
de phase I a été réalisée sur 24 patients présentant des tumeurs solides avancées (109). Des
doses allant de 0,1 à 10 mg/kg ont été administrées aux jours 0, 28, 35 et 42. La molécule a
été bien tolérée et de fortes fièvres sont les effets secondaires observés les plus néfastes.
Malheureusement, seulement un seul patient traité à la dose de 6 mg/kg/semaine, atteint
d’angiosarcomes cutanés, a démontré une réponse partielle. On peut toutefois regretter qu'il
n'y ait pas eu de traitement entre les jours 0 et 28.
III-4. Conclusion
Nous venons de voir différentes classes de molécules ciblant les récepteurs V3 et/ou V5.
Parmi ces molécules certaines sont en essais cliniques. Leur utilisation future dans le
traitement des cancers dépend beaucoup des résultats de ces phases I et II. Pour le moment,
les résultats montrent toujours une faible toxicité des composés administrés, quelle que soit
leur classe. Par contre, leur efficacité est décevante car trop peu de réponses sont observées.
Seules des stabilités de la maladie sont généralement enregistrées. Cela contraste souvent avec
les bons résultats des études pré-cliniques menées sur l’animal avec ces molécules. Cela peut
s’expliquer de différentes façons. Premièrement, le choix de la cible elle-même. V3 et/ou
V5 sont impliqués dans l’angiogénèse tumorale mais plusieurs études ont démontré
l’implication d’autres récepteurs comme 51 ou le récepteur au VEGF. Par exemple, des
souris déficientes en intégrines V3 et V5 développent une réponse accrue au VEGF
permettant une angiogénèse (110). Inhiber V3 peut alors ne pas suffire à inhiber
l’angiogénèse tumorale. Des inhibiteurs pouvant interagir avec plusieurs cibles seraient donc
une solution à privilégier pour avoir de meilleurs effets. On pourrait imaginer des molécules
multimériques présentant divers antagonistes pour différents récepteurs ou encore l’utilisation
40
de « cocktails » de molécules. Une autre explication aux faibles efficacités observées est que
les études cliniques sont menées sur des patients à la santé très détériorée et avec des tumeurs
déjà bien établies et vascularisées. Les modèles pré-cliniques montrent en effet des efficacités
du Cilengitide notamment lorsqu’il est administré très tôt après la prise de greffe. Les essais
cliniques pourraient alors être conduits de façon différente. Constatant que les patients ne
répondent pas tous de la même manière, la mise en place de la détection de biomarqueurs
prédictifs de la réponse aux traitements pourrait être envisagée. Enfin des modèles précliniques plus pertinents devraient être utilisés. Par exemple l’utilisation de souris
transgéniques devrait être favorisée par rapport à des greffes sous-cutanées (111, 112). Ces
modèles développent spontanément des tumeurs humaines directement dans les organes
d’origine de la lignée et sont donc plus proches de la réalité (113).
La recherche d’antagonistes des intégrines toujours plus affins doit continuer. D’après les
faibles efficacités observées en utilisant ces inhibiteurs seuls, la combinaison de plusieurs
traitements semble une alternative intéressante. On voit de plus en plus d’études cliniques
associant des antagonistes des intégrines avec de la chimiothérapie ou de la radiothérapie (56,
67). Leur mécanisme d’action, la synergie éventuelle et les temps d’administration optimaux
devront être investigués.
41
IV. Les peptides RGD vecteurs de molécules diagostiques ou
thérapeutiques
L'efficacité d'antagonistes des récepteurs intégrines, que ce soit des peptides, des
peptidomimétiques ou des anticorps dans la thérapie des cancers reste encore à être validée.
Les résultats d’essais cliniques notamment de phase 3 sont attendus avec impatience. Un
usage différent de ces molécules a été envisagé. Ainsi, l’idée de les utiliser non pas pour leurs
propriétés antiangiogéniques, mais pour leur reconnaissance et leur fixation aux intégrines a
émergé afin de tirer profit de leur propriété de ciblage, pour amener différentes molécules au
niveau de ces récepteurs. Les molécules ainsi vectorisées peuvent être des drogues
cytotoxiques dans le cas de thérapies ou des molécules dédiées à l'imagerie ou le diagnostic.
La vectorisation désigne l’administration de molécules pharmacologiquement actives
couplées à un agent de ciblage cellulaire spécifique afin d’améliorer leur index thérapeutique.
Le vecteur désigne la structure moléculaire ciblant le récepteur d’intérêt et transportant la
molécule d’intérêt biologique. Son rôle est à la fois de protéger la molécule active des
dégradations chimiques ou enzymatiques se produisant in vivo et de la transporter jusqu’à son
site d’action. La vectorisation permet de diminuer significativement la dose de molécule
active administrée ainsi que les effets secondaires dus à un mauvais ciblage. Elle est au cœur
des recherches actuelles.
IV-1. Utilisation des dérivés du Cilengitide
L'utilisation de peptides cycliques comme vecteurs nécessite qu'ils soient fonctionnalisables
pour pouvoir être greffés aux entités à vectoriser, tout en maintenant leurs propriétés
d'adressage. Le Cilengitide ne peut donc servir de vecteur car il ne présente aucune fonction
chimique modifiable capable de le lier à d'autres molécules. Par contre, ses dérivés, et
notamment les peptides c[RGDfK], c[RGDyK] et c[RGDfE], de part leur possible
fonctionnalisation via les fonctions amines des lysines ou acide du glutamate sont de bons
candidats à la vectorisation.
Ces molécules ont surtout été évaluées pour le diagnostic des tumeurs d’abord en SPECT
(Single Photon Emission Computed Tomography) et puis en PET (Positron Emission
42
Tomography). Les principaux radioéléments couplés à ces vecteurs peptidiques ont été le
99
mTc (114) et l'111In (115) pour le SPECT et le 18F (116), le 64Cu (117) et le 68Ga (118) pour
le PET. Des études précliniques ont également été menées avec l'125I (119) ou l'131I (120).
Quelque soit la technique utilisée, les caractéristiques recherchées sont les mêmes, à savoir un
contraste entre la tumeur et les autres organes le plus élevé possible, une accumulation dans
les tissus sains la plus faible (notamment les reins et le foie) et une élimination rapide. La
période des éléments radioactifs est donc importante. Elle doit être assez longue pour
permettre l'examen médical et suffisamment courte pour limiter la toxicité et faciliter une
meilleure gestion des déchets. Un autre facteur important est le mode de fixation de l'atome
radioactif au vecteur. En effet, cette fixation doit d'une part être la plus stable possible (pour
éviter tout relargage d'atomes radioactifs libres) et d'autre part ne doit pas interférer avec les
propriétés de reconnaissance de la molécule de ciblage. L'iode (125 ou 131) peut être fixé sur
le résidu tyrosine du peptide c[RGDyK] sans affecter l'affinité de la molécule pour V3. Par
contre, le
18
F est introduit par des groupements chimiques tels que les groupes 4-
[18F]fluorobenzoyle ou fluoro-[18F]-2-desoxyglucose. Ces derniers, relativement encombrants,
peuvent perturber la reconnaissance du ligand à son récepteur. Il en va de même pour les
radioéléments métalliques, le 64Cu, le 68Ga, l'111In ou le 99mTc, qui nécessitent l'incorporation
d'un groupement permettant de les chélater. Le plus utilisé étant le DOTA.
Dès 1999, Kessler et al. ont radiomarqué le peptide c[RGDyK] à l'125I via la tyrosine (121).
Des tests sur récepteurs DVE3 purifiés ont montré le maintien de l'affinité du peptide.
Malheureusement, cette molécule, dans des études de biodistributions chez des souris nues
inoculées avec des tumeurs M21, a démontré une accumulation dans le foie et les reins (21,96
et 12,0 respectivement %ID/g à 10 min) plus importante qu'à la tumeur (2,07 % ID/g à 10
min). Cette distribution a été confirmée plus récemment par Chen et al (122). Les auteurs ont
comparé les propriétés biologiques du peptide c[RGDyK] marqué soit à l'125I via la tyrosine,
soit au
18
F via un groupe fluorobenzoyle couplé à la lysine, soit au
64
Cu via le chélateur
DOTA couplé également à la lysine. Les études de biodistributions ont été réalisées dans un
modèle murin xenogreffé avec la tumeur MDA-MB-435. Les 3 composés sont rapidement
éliminés du sang. La captation tumorale est plus importante pour le peptide couplé à l'iode
que pour celui couplé au cuivre, elle-même plus importante que pour celui couplé au fluor. Le
ratio tumeur/sang suit également le même ordre. L'inconvénient du composé iodé est son
accumulation dans les reins, les auteurs l'expliquant par la charge globale positive de la
molécule, ainsi qu'une rétention d'iode libre à l'estomac résultant de la déhalogénation de la
molécule. Pour le composé fluoré, le problème est une rapide élimination du site tumoral ainsi
43
qu'une accumulation dans les intestins et le système urinaire suggérant une excrétion par le
foie (sans doute à cause du caractère lipophile de la molécule). L'inconvénient du composé
cuivré est une concentration et une rétention dans le sang trop importantes. Cela étant
expliqué par la lente dissociation du complexe DOTA-cuivre. Plus récemment Decristoforo et
al. ont couplé le peptide c[RGDkK] au DOTA puis radiomarqué cette molécule avec du 68Ga
ou de l'111In (123). Chaque dérivé a été comparé dans des études de biodistribution avec le
composé
18
F-galacto-c[RGDfK]. La captation tumorale suit l'ordre: composé marqué au
Gallium > composé marqué à l'Indium > composé marqué au Fluor. L'inconvénient du
composé marqué au Gallium est une accumulation importante dans tous les tissus et rétention
dans le sang plus longue que pour les autres composés. Cela résulte en de moins bons
contrastes. Ce problème est régulièrement rencontré avec les radioéléments métalliques, dont
la chélation par le DOTA n'est pas toujours très stable. Des efforts sont ainsi fournis pour
mettre au point de meilleurs chélatants. Bien que plus difficile à synthétiser et également plus
cher, le radiomarquage de vecteurs au
18
F permet de donner aujourd'hui les images avec les
meilleurs contrastes possibles. Le composé
18
F-galacto-c[RGDfK] a été administré à 18
patients atteints de tumeurs pulmonaires primaires ou métastatiques (124). Ce conjugué a
permis une visualisation des tumeurs, mais aussi des métastases, avec un bon contraste. Il a
aussi permis de quantifier des degrés d'expression d'DVE3 différents, ce qui pourrait servir à
d'évaluer une réponse à un traitement anti-angiogénique.
Les vecteurs décrits ont été mis au point dans un but diagnostique. Les techniques d'imagerie
toujours plus sensibles et performantes promettent un bel avenir à ce type de composés. Des
améliorations restent encore à trouver notamment dans les rapports tumeur/sang, mais aussi
dans l'élimination rénale des composés. Les études se tournent vers la mise au point de
groupements chimiques capables de lier les radioéléments mais aussi de moduler les
propriétés pharmacocinétiques des molécules (lipophilicité, charge globale des dérivés,…). La
recherche de vecteurs plus affins pour l'intégrine DVE3 est également en développement,
notamment grâce à la multimérisation des motifs de reconnaissance.
44
IV-2. Multimérisation
Les ligands naturels sont parfois multivalents, c’est-à-dire qu’ils présentent plusieurs copies
de leur motif de reconnaissance (125). Souvent, augmenter la valence d’un ligand résulte en
une meilleure affinité pour sa cible (126). Mais cela peut également moduler la réponse
biologique due aux interactions ligands-récepteur. Plusieurs études ont rapporté différents
mécanismes d’action des ligands multivalents (127, 128). Alors que les ligands monovalents
se lient à un seul récepteur à la fois, les ligands multivalents vont interagir avec plusieurs
récepteurs via différents mécanismes (figure 18) (129) :
-l’effet chélate : la fixation d’un ligand à plusieurs récepteurs via plusieurs copies du
motif de reconnaissance. Dans ce cas, la disposition des récepteurs reste inchangée. Cela
implique que les distances entre les motifs de fixation soient assez grandes pour établir des
contacts entre plusieurs récepteurs (figure 18a)
-l’effet liaison multiple : lorsque plusieurs motifs de reconnaissance identiques ou non
d’une même molécule se fixent sur deux sites distincts et voisins du même récepteur. Cela
augmente la stabilité du complexe formé (figure 18b).
-l’effet « cluster » : c’est le plus souvent mis en jeu et le plus important. La fixation
d’un ligand multivalent à plusieurs récepteurs permet leur recrutement et leur rapprochement
ce qui entraîne une modulation de la transduction du signal (figure 18d).
-l’effet statistique : dans le cas de récepteurs isolés, le fait d’avoir plusieurs copies du
motif de fixation séparés par de faibles distances permet d’occuper avec une plus grande
probabilité le site de liaison que dans le cas de ligands monovalents (figure 18e).
-l’effet par stabilisation stérique peut aussi être mentionné (figure 18c).
Figure 18 : Illustration des effets de la multivalence (Source : (130))
45
L’augmentation de l’avidité pour un récepteur de ligands multivalents (on parle d’avidité dans
le cas de ligands multivalents et d’affinité dans le cas de monovalents) par rapport à leurs
homologues monovalents peut être expliquée par une augmentation de la concentration locale
en ligands ce qui rejoint l’effet statistique. La liaison ligands/récepteurs étant un phénomène
dynamique, une augmentation de la concentration en ligands permet de saturer plus vite le site
de fixation.
Afin d'améliorer l'affinité des antagonistes d'DVE3, plusieurs équipes se sont lancées dans la
synthèse de molécules multimériques, présentant plusieurs copies de la séquence RGD.
Différentes structures (souvent appelées « scaffold » ou « chassis ») peuvent être utilisées
pour la multimérisation et la vectorisation. Cette structure peut également être fonctionnalisée
avec des molécules cytotoxiques, des radioéléments ou des fluorophores. Cette
fonctionnalisation doit aussi interférer le moins possible avec les motifs de reconnaissance.
IV-3. Mutlimérisation et vectorisation via des petites molécules
organiques
Certaines molécules de faibles masses moléculaires ont été utilisées comme chassis
moléculaires. On peut ainsi citer les monosaccharides (131), les stéroïdes (132)ou encore les
acides aminés (acides aspartiques par exemple) (133). Leurs caractéristiques sont :
-une faible taille permettant une bonne perméabilité de l’environnement péri-tumoral.
-des facilités de synthèse et de caractérisation structurale.
-un contrôle dans l’orientation des ligands.
-un nombre de copies du motif de reconnaissance limité (entre 2 et 8 généralement).
-des capacités à agir grâce à l’effet d’augmentation de la concentration locale en ligand
et non par effet de clustering. Les distances souvent trop courtes ne permettent pas de lier
plusieurs récepteurs.
Dans le cas des multimères de peptides RGD l’utilisation de l’acide glutamique est la plus
décrite (133-135). Ses deux fonctions acides permettent de lier deux ligands présentant des
fonctions amines. Le ligand c[RGDfK] s’est trouvé être un candidat de choix.
Dijkgraaf et al. ont ainsi synthétisé des dimères et tétramères du c[RGDfK] (136). Les
peptides monomériques (E-c[RGDfK]), dimériques (E-[c(RGDfK)]2) et tétramériques
46
(E{E(c[RGDfK])2)2) ont été couplés à du DOTA puis radiomarqué à l'111In. Dans un test sur
récepteurs DVE3 purifiés, le tétramère s'est montré 3,5 fois plus affin que le dimère, lui-même
1,7 fois plus affin que le monomère. Des études de biodistribution chez des souris athymiques
présentant des tumeurs sous-cutanées ont révélé une meilleure accumulation du tétramère à la
tumeur par rapport au dimère et au monomère (% ID/g 7,4 ; 5,2 et 2,3 respectivement, 8 h
après l'injection (137). Une meilleure affinité pour leur cible est la raison pour expliquer ces
résultats. Le point négatif de ces molécules est leur accumulation néfaste au niveau des reins
et du foie. Le remplacement de l’111In par du 64Cu ne modifie pas l’accumulation à la tumeur
et les propriétés pharmacocinétiques des multimères (135).
Li et al. ont synthétisé un octamère du c[RGDfK], toujours en utilisant des acides glutamiques
comme lien. L'octamère est 3,5 fois plus affin que le tétramère pour le récepteur DVE3
purifié. Sur des souris nues greffées avec des cellules U87MG V3 positives, l’accumulation
à la tumeur de l’octamère est de 11,7 %ID/g à 30 min post-injection alors que celle du
tétramère est de 9,9. L’élimination du site tumoral est également plus lente pour l’octamère
que pour le tétramère (10,3 %ID/g contre 6,4 %ID/g après 20 h). Par contre l’accumulation
rénale est beaucoup plus élevée pour l’octamère que pour le tétramère. Après 20 h, on
retrouve 27 % ID/g dans les reins du premier cité et seulement 5 %ID/g du second. Le fait de
co-injecter le peptide c[RGDyK] réduit cette rétention rénale prouvant que celle-ci est V3
dépendante. En effet en injectant un excès de ce peptide on va saturer les récepteurs V3. Si
on observe alors une diminution de la rétention rénale, on peut conclure que le récepteur
V3 est impliqué.
Une autre explication avancée est que l’octamère contient plus de charges positives que le
tétramère (8 arginines au lieu de 4) or il est connu que la membrane des cellules tubulaires
rénales est chargée négativement et lie les molécules chargées positivement (135). Ce
phénomène a aussi été illustré par Dijkgraaf et al. (138). Ils ont étudié l’effet de différents
bras espaceurs séparant le dimère E-[c(RGDfK)]2 du DOTA marqué à l’111In. Lorsque
l’espaceur est un glutamate le pourcentage de la dose injectée retenue dans les reins après 2 h
est de 2,16. Lorsque le glutamate est remplacé par une lysine chargée positivement, ce
pourcentage est de 4,1. L’accumulation à la tumeur reste inchangée.
Les propriétés recherchées pour ces molécules sont toujours un contraste entre la tumeur et les
autres organes élevé et une rétention à la tumeur assez longue pour effectuer l’examen.
Développer des multimères augmente toujours l’accumulation à la tumeur mais augmente
aussi la rétention rénale alors que les monomères s’accumulent moins à la tumeur mais sont
47
plus facilement éliminés. Les différences observées dans le choix des bras espaceurs sont
toujours en cours d’investigations (115, 138). Dans le futur, le but sera de trouver des ligands
bifonctionnels entre les radioéléments et les motifs RGD qui influeront sur l’hydrophilicité, la
taille de la molécule, sa charge globale pour tenter d’en améliorer les propriétés
pharmacocinétiques.
Certaines équipes ont également utilisé ces multimères pour véhiculer des fluorophores. Ils
restent moins utilisés que les radioéléments sans doute à cause des techniques d’imagerie
moins développées, moins sensibles et avec de plus faibles résolutions. Néanmoins Cheng et
al. ont couplé les molécules monomériques (E-c[RGDfK]), dimériques (E-[c(RGDfK)]2) et
tétramériques (E{E(c[RGDfK])2)2) à la Cy5,5 (134). Dans un test d’inhibition de l’adhésion
cellulaire le tétramère s’est montré 2 fois plus afin que le dimère, lui même 2 fois plus affin
que le monomère. En 2006, Wu et al. (139) ont remplacé la Cy5,5 par la Cy7. Si l’affinité
pour V3 n’était pas modifiée, la rétention à la tumeur se trouva amoindrie et l’élimination
rénale plus rapide. Ceci est expliqué par le fait que la Cy7 est plus hydrophobe que la Cy5,5 et
donc moins retenue dans les reins.
Le vecteur « idéal » est encore en cours de recherche. Ces études auront montré le compromis
à trouver entre l’augmentation de l’avidité par multimérisation qui résulte en de meilleures
accumulation à la tumeurs, mais aussi dans les reins. Le choix des molécules pour l’imagerie
ainsi que la façon de les accrocher au vecteur s’est révélé être important, et des recherches
restent à faire pour les améliorer.
IV-4. Multimérisation et vectorisation via les gabarits RAFT
(Regioselectively Addressable Functionalized Template)
De façon plus élaborée, Dumy et al. ont décrit la synthèse et l’utilisation d'un chassis
moléculaire appelé RAFT fonctionnalisé avec le peptide cyclique c[RGDfK] (140).
Initialement conçu par Mutter et al. (141) ce dernier est un décapeptide cyclique de
conformation définie, comportant plusieurs résidus prolines et lysines (142) (Figure 19). Un
des avantages du RAFT est de définir deux domaines distincts limitant les gênes stériques
entre eux. La face supérieure du chassis est généralement fonctionnalisée avec 4 motifs
c[RGDfK]. Ils sont liés au RAFT grâce à des liaisons oxymes qui présentent les avantages de
48
pouvoir être générées en solution aqueuse et d'être stables en milieu physiologique. La face
inférieure, qui peut présenter deux sites de liaison, est fonctionnalisée avec des drogues (143),
des fluorophores (144), ou des radioéléments (145). Le RAFT présentant 4 motifs RGD est
également plus affin (d’un facteur 10) pour DVE3 que le RAFT ne présentant qu’un seul
motif c[RGDfK] (146). La multimérisation via le RAFT est donc meilleure que la
multimérisation via l’acide glutamique où le tétramère n’est que 4 fois plus affin que le
monomère. Des études de microscopie confocale de fluorescence ont montré l'internalisation
via un mécanisme d’endocytose actif du RAFT (144).
Figure 19 : représentation schématique du RAFT (Source : Thèse Elisabeth Garanger, 2005)
Les conjugués destinés à des applications de tomographie ont permis, chez le petit animal, la
détection non-invasive de tumeurs pulmonaires profondes non détectables en imagerie
optique 2D (145). Un analogue du conjugué (Cy5)RAFT(c[-RGDfK-]4) va être utilisé dans
des protocoles pré-cliniques et cliniques pour l’aide au geste chirurgical pour l’ostéosarcome
de l’enfant en collaboration avec le Pr. Rousseau du Centre Léon Bérard de Lyon (source :
thèse Stéphanie Foillard, 2008). Plus récemment, les innovations apportées à la voie de
synthèse des gabarits RAFT (travaux de thèse de Stéphanie Foillard) (147), ont permis une
augmentation significative du rendement réactionnel global. Cette méthodologie va être
utilisée pour la synthèse en conditions GMP pour de futures applications cliniques
(collaboration avec le laboratoire Synth-Innove, Paris) (source thèse Stéphanie Foillard,
2008).
Enfin la facilité de synthèse du RAFT sur support solide va permettre son utilisation en vue de
la détection de nouveaux motifs de reconnaissance. L’incorporation de boucles variables
49
d’anticorps (CDR) sur ces « chassis » permettra le screening d’éventuelles cibles directement
sur la résine (Figure 20).
Figure 20 : Future utilisation des RAFT (Source : thèse Foillard)
IV-5. Multimérisation et vectorisation via les MAP (Multiple Antigens
Peptides)
En 1988, Tam et al. développent les systèmes MAP pour la présentation de plusieurs copies
d’un motif antigénique pour la conception de vaccins synthétiques (148). Ces structures sont
basées sur un squelette polylysines branchées. Les deux fonctions amines de chaque résidu
lysine permettant l’élongation du squelette ou l’accrochage de diverses molécules (Figure 21).
Les protections orthogonales de ces fonctions, largement décrites, rendent ces systèmes très
versatiles et permettent d’incorporer plusieurs molécules différentes (149). Les avantages et
inconvénients des MAP sont :
-une facilité de synthèse sur support solide.
-la versatilité des systèmes et leur pluri-fonctionnalisation.
-la capacité de faire varier les distances entre les motifs greffés via l’incorporation de
« bras espaceurs » (typiquement des résidus glycine, du PEG,...).
-une multimérisation limitée : entre 2 et 16 copies (Les gênes stériques devenant trop
importantes ensuite).
-l’apparition de problèmes de synthèse avec l’élongation du squelette (agrégations,
problèmes de solubilité).
50
Figure 21 : Représentation des MAP (Source : (148))
Les MAP ont été utilisées par Kessler et al. pour former des dimères ou tétramères du peptide
c[RGDfE] (150). Des bras espaceurs de types PEG ou acide aminohexanoïque ont été utilisés
pour minimiser les contraintes stériques (Figure 22). La base du squelette MAP a été
fonctionnalisée avec un dérivé benzénique (p-triméthylstannylbenzaldhéhyde) permettant un
radiomarquage à l’iode.
Figure 22 : Multimérisation du peptide c[RGDfE] par le système MAP (Source : (150)).
Dans un test d’inhibition de vitronectine biotinylée sur le récepteur V3 purifié le tétramère
s’est seulement montré deux fois plus affin que le peptide c[RGDfV] seul.
IV-6. Multimérisation et vectorisation via des protéines
Les protéines peuvent être « décorées » par plusieurs copies d’un ligand. Les fonctions
chimiques des chaînes latérales des résidus lysines, histidines, ou cystéines peuvent servir à
51
leur accrochage via différents liens bifonctionnels. Les avantages et inconvénients de ces
systèmes sont :
-un poids moléculaire élevé permettant une circulation optimale dans le sang, une
durée de vie dans l’organisme accrue mais un pouvoir de pénétration des tissus tumoraux
restreint.
-la capacité de présenter un grand nombre de copies du ligand (15 à 25).
-une composition chimique non définie avec un indice de valence imprécis sans
contrôle de la distance entre les ligands.
Ainsi, Schraa et al. ont greffé le peptide c[RGDfK] sur une protéine inerte de type IgG par
l’intermédiaire d’une fonction thioéther (151). La mesure d’IC50 par un test d’inhibition de
l’adhésion de cellules HUVEC sur la vitronectine a confirmé la meilleure affinité pour V3
du ligand multivalent vis-à-vis du peptide monovalent c[RGDfV] (IC50 0,6 nM et 158 nM
respectivement (152). La demie-vie du composé est également accrue (90 min contre
quelques minutes pour le peptide seul). L’administration de cette molécule radiomarquée à
l’iode chez des souris C57Bl6 porteuses de tumeurs B16F10 a montré une faible accumulation
à la tumeur (3 %ID/g à 2 h). De plus, ce dérivé s’accumule aussi dans le foie et la rate. En
2004, le même groupe coupla le peptide c[RGDfK] à un anticorps monoclonal anti-CD3 avec
des ratios peptides/protéine différents (153). L’augmentation du nombre de peptides RGD par
anticorps résulta en une augmentation de l’affinité pour V3. Ces modifications n’altérèrent
pas les propriétés de l’anti-CD3 qui était toujours capable de se fixer et d’activer les
lymphocytes T cytotoxiques. Nous avons ici l’illustration d’une structure servant à la
multimérisation de motifs de reconnaissances et qui joue également un rôle thérapeutique.
IV-7. Multimérisation et vectorisation via des nanoparticules
Les progrès réalisés en recherche galénique, en sciences des matériaux et dans les
nanotechnologie ont permis de développer des systèmes de vectorisation appelés
génériquement nanoparticules (154, 155). Ces systèmes, au départ composés de bicouches de
phospholipides, permettaient d’encapsuler des drogues hydrophiles dans la cavité aqueuse
interne ou des drogues lipophiles dans la bicouche lipidique. Leur inconvénient majeur était
une accumulation et une dégradation hépatique due au phénomène d’opsonisation. Les
opsonines sont des protéines plasmatiques qui se lient par liaisons hydrophobes à la surface
52
des vésicules et induisent leur phagocytose par des macrophages. Des vésicules de deuxième
génération ont alors été créées en recouvrant ces vésicules par divers polymères (PEG,
polysaccharides) empêchant les opsonines de s’adsorber. Afin de les diriger, ces
nanoparticules ont été recouvertes de motifs d’adressage (anticorps, peptides, sucres) souvent
par l’intermédiaire de chaînes PEG (156, 157). Les avantages et inconvénients des ces
systèmes sont :
-une vectorisation d’un large panel d’éléments effecteurs de nature différente (drogues
hydrophiles ou hydrophobes, fluorophores,...).
-une présentation d’un grand nombre de copie des motifs d’adressage (supérieur à 20).
-une taille et un poids moléculaire important permettant une demie-vie dans
l’organisme accrue (la nanoparticules développée par Montet et al. a une demie-vie de 3 h par
exemple (158).
-suivant la forme galénique employée la possibilité de moduler le relargage des agents
effecteurs (relargage prolongé par exemple).
-la possibilité de lier plusieurs récepteurs, d’induire des clusters et d’être internalisés.
-une pénétration des tissus tumoraux relativement bonne mais inférieure à celle des
petites molécules.
-une synthèse et des caractérisations parfois difficiles.
-pas de contrôle précis du nombre de ligands et de leur orientation.
Aujourd’hui de nombreux vecteurs lipidiques ciblés montrent des résultats pré-cliniques très
satisfaisants (159-161).
En 2006, Montet et al.ont décoré des nanoparticules d’oxide de fer avec des peptides
cycliques RGD (Figure 23). L’IC50 des nanoparticules fonctionnalisées avec 20 motifs RGD
s’est montré 38 fois plus faible que dans le cas des peptides étudiés seuls (158). Les
nanoparticules sont de plus en plus utilisées en imagerie. Récemment des nanoparticules à
base d’oxide de fer, fonctionnalisées avec des peptides cycliques RGD et pouvant aussi être
marquées au 64Cu ont été capable de détecter des tumeurs précoces et d’évaluer l’expression
d’V3 par PET et MRI (162).
53
Figure 23 : schéma de nanoparticules d’oxide de fer fonctionnalisées avec des peptides cycliques RGD
ainsi que du cuivre 64 (Source : (162))
L’utilisation de « quantum dots », nanoparticules composées de cristaux semi-conducteurs
présentant des propriétés de fluorescences, est également à mentionner (163). Smith et al. par
exemple ont récemment utilisé des « quantum dots » recouverts de peptide RGD afin de cibler
et de quantifier l’expression d’V3 dans les néo-vaisseaux (164). Ils ont pu montrer pour la
première fois la liaison de nanoparticules aux vaisseaux sanguins en formation sur des
animaux vivants par microscopie intravitale. La microscopie intravitale est une technique de
développement récent qui permet de visualiser des phénomènes in situ directement chez
l'animal vivant. Cela a permis de voir que ces molécules se fixaient sous forme d’agrégats et
non individuellement. Elles pourront être utilisées pour mieux comprendre leurs mécanismes
d’interactions avec les intégrines. Bien que très encourageants, la présence de métaux lourds
dans les « quantums dots » peut être un frein à leur développement clinique dû à leur toxicité.
Enfin, plusieurs nanoparticules décorées avec les peptides c[RGDfK] ou c[RGDfC] ont été
utilisées pour encapsuler puis relarguer de la doxorubicine (165, 166). Leur internalisation
dans les cellules tumorales a été montrée mais leur efficacité reste cependant à améliorer
(167). Leur accumulation néfaste dans le système réticuloendothélial est encore un problème.
IV-8. Multimérisation via les polymères
Les différents vecteurs décrits plus haut sont capables de cibler V3, de vectoriser des agents
effecteurs, d’être internalisés et certains sont aussi capables de former des clusters de
récepteurs. Les intégrines ont un mode de fonctionnement complexe qui n’est pas encore
totalement compris. Comme nous avons pu le voir, elles jouent un rôle dans l’adhésion et la
migration cellulaire. La fonctionnalisation de polymères par des motifs RGD en est une
54
nouvelle utilisation permettant de promouvoir l’adhésion cellulaire (168) (figure 24). Ce
phénomène peut s’expliquer par le fonctionnement de ces récepteurs. Des études ont montré
que plus une molécule pouvait rassembler un grand nombre de récepteurs, plus la réponse
biologique en résultant était forte (130). La concentration en ligands des intégrines ainsi que
leur distribution spatiale (qui permet ou non de former des clusters) influence l’adhésion et la
mobilité des cellules (169, 170). Ainsi, augmenter la concentration en ligands provoque une
augmentation de la migration des cellules (171).
Figure 24 : photomicrographes à différents temps de cellules HUVEC proliférant sur un polymère de type
PPEGMA fonctionnalisé avec le peptide GGGRGDS
La concentration en peptide est de 1 mM. (Source : (168))
Les polymères sont des structures de plus en plus utilisées dans les domaines de la réparation
tissulaire par exemple, qui fait intervenir la migration de cellules endothéliales. Les
techniques de polymérisation conduisent à des ligands multivalents de très grande taille
(20 000 à 100 000 Da) dans lesquels les motifs de ciblage sont distribués en très grand
nombre (100 à 200 000 molécules par μm2). Les réactions de polymérisation étant
difficilement contrôlables la taille du ligand obtenu est imprécise et l’indice de valence de la
structure indéterminé. Dans des tests d’inhibition de la fixation de ligands naturels sur
récepteurs purifiés ces structures présentent les IC50 les plus faibles vis-à-vis des autres
systèmes multimériques (jusqu’à 100 fois inférieure aux petites molécules organiques) (130,
172). De part leur taille et le très grand nombre de motifs d’ancrage ils permettent la
migration de cellules (171, 173). C’est pourquoi plusieurs laboratoires utilisent ces structures,
qu’on appelle biomatériaux aujourd’hui, comme promoteurs pour la réparation des lésions
tissulaires notamment (174).
Ce genre d’utilisation est en plein essor. Les polymères à base de polylysines et de PEG sont
les plus utilisés (175). On peut ainsi citer les études de Marko et al. (174). Les auteurs ont
55
fonctionnalisés un polymère composé de poly[Lys(DL-Ala(m))] avec le peptide c[RGDfC].
Ce biomatériel est capable de faire proliférer différents types cellulaires sur-exprimant V3.
Aujourd’hui il est confirmé que les caractéristiques de la surface employée, le type de
polymère, le nombre et l’orientation des motifs de ciblage (ou d’ancrage dans ces cas) influent
grandement sur la qualité et la quantité de la réponse cellulaire (176, 177). Des implants
présentant ces structures se développent pour être utilisés en clinique, notamment dans des
applications orthopèdiques, maxillofaciales et dentaires, dans le but de la prolifération de
cellules osseuses. En effet, les intégrines, notamment celles présentant la sous-unité 1
permettent l’adhésion des cellules osseuses sur des motifs RGD.
Les peptides cycliques RGD sont à l’heure actuelle les molécules les plus utilisées dans le
ciblage d’V3. Leur facilité de synthèse et d’incorporation dans différentes structures a
permis la mise au point de divers types de vecteurs. La multimérisation des motifs de
reconnaissance est un moyen efficace d’augmenter leur affinité pour les récepteurs. Ces
différents vecteurs sont utilisés à des fins diagnostiques ou thérapeutiques et ont chacun des
avantages et des inconvénients. Pour le moment, aucune catégories semble prendre le dessus
même si les avancées dans les nanotechnologies promettent un bel avenir aux nanoparticules.
L’imagerie, avec l’avènement des technologies SPECT et PET notamment permet aussi un
futur prometteur pour les vecteurs de petites tailles radiomarqués.
56
DEFINITION DU PROJET DE
RECHERCHE
57
Nous venons de le voir, pour le diagnostic et la thérapie des cancers, la notion de spécificité
est primordiale afin de cibler le plus efficacement possible les cellules tumorales sans affecter
les tissus sains. Le développement de nouveaux outils de ciblage peptidique plus efficaces,
plus simples à produire et à caractériser, et plus adaptés à la délivrance de drogues diverses et
variées (anticorps, peptides, oligonucléotides, radioisotopes, molécules cytotoxiques) est donc
pleinement justifié.
Les nouvelles molécules que nous souhaitons développer sont basées sur la séquence
peptidique RGD et le ciblage de l'intégrine DVE3. Le Cilengitide fait encore office de
référence dans le ciblage de ce récepteur. Ses dérivés, les peptides cycliques c[RGDfK] et
c[RGDfE] ont été développés spécifiquement dans le but de vectoriser différentes molécules
via les fonctions amines et acides des résidus K et E, respectivement. Bien qu’aujourd’hui, ces
vecteurs soient les plus affins pour V3, ils ont une affinité pour l'intégrine dix fois
inférieure à celle du Cilengitide dans un test d’inhibition de l’échistatine sur récepteur purifié
(IC50 = 18,9 nM pour le Cilengitide et IC50 = 196 nM pour ses dérivés). Cette perte d’affinité
est principalement due à la non méthylation de l’azote des résidus K et E. Ainsi, notre but est
de mettre au point une molécule plus affine que ces dérivés mais gardant leurs propriétés de
vectorisation.
I. Synthèse de nouveaux tétrapeptides cycliques
Comme nous avons pu le voir précédemment, les dipeptides –fV-, -fK- ou –fE- peuvent être
interchangés sans moduler l’affinité pour V3. Certaines études ont même remplacé ces
séquences par des motifs organiques qui ont résulté en une augmentation de l’affinité des
molécules mais qui malheureusement perdaient leur propriétés de vectorisation (les motifs
incorporés n’étant pas fonctionnalisables chimiquement). Ainsi, nous avons choisi de
remplacer les séquences –fK- et –fE- des peptides c[RGDfK] et c[RGDfE], par un seul acide
aminé, en l’occurrence la lysine.
Dans ce contexte, un nouveau type de cyclisation a été réalisé sur des peptides de séquence
RGDK ou DGRK par formation d’une liaison de type urée entre les fonctions H-amine ou Damine d’une lysine et la fonction D-amine de l’acide aminé N-terminal (figure 25).
Cette nouvelle approche est motivée par le fait qu’un acide aminé hydrophobe favorise
l’affinité pour le récepteur DVE3. Dans notre stratégie, les 4 groupements méthylènes
58
apolaires de la chaîne latérale de la lysine seront ainsi totalement intégrés au cycle, se
substituant aux dipeptides –fK- ou –fE- tout en maintenant une structure cyclique de taille
comparable (17 atomes contre 15). Suivant la stratégie de synthèse utilisée, le lien urée peut
être formé entre les amines des résidus R ou D et l’amine de la lysine, mais aussi entre les
amines de ces résidus et l’amine de la lysine. Dans ce dernier cas, l’élongation du peptide
linéaire se fait via l’amine de cette dernière. Ces structures présentent l’avantage d’avoir une
fonction acide libre permettant diverses réactions chimiques. Leur synthèse, comportant un
acide aminé de moins par rapport aux pentacyclopeptides de référence est un atout en terme
de coût et de temps de synthèse. La synthèse de molécules contrôle, ne se fixant pas au
récepteur d’intérêt a été réalisée en remplaçant l’acide aminé D de la séquence consensus par
l’acide aminé E. Nous verrons que tous les peptides synthétisés n’ont pas la même affinité
pour V3. Cette affinité a bien entendu toujours été comparé à la molécule c[RGDfE] qui
fait office de référence dans tous nos tests.
HN
NH 2
OH
NH
O
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
NH2
HN
O
NH
O
H
N
HN
O
NH
O
NH
O
O
NH
OH
NH
O
OH
O
OH
HN
OH
NH
O
H
N
HN
O
HO
O
NH
O
NH
O
O
NH2
HN
NH
HN
NH2
NH
H
N
O
HO
O
NH
O
NH
O
O
O
OH
NH
Figure 25 : Structure des nouveaux tétrapeptides cycliques RGD
59
II. Evaluations biologiques des nouveaux tétracyclopeptides
II-1. Evaluation de l'affinité des peptides pour DVE3
Ces nouveaux peptides ont été évalués par cytométrie de flux pour leur affinité à l'intégrine
DVE3. Pour ce faire notre laboratoire dispose de plusieurs lignées cellulaires endothéliales ou
cancéreuses présentant divers degrés d'expression de ce récepteur. L'utilisation de la
cytométrie de flux nécessite obligatoirement le marquage de nos dérivés par un fluorophore.
Cela nous a permis de valider nos molécules en tant que vecteurs. Le marquage, dans les
mêmes conditions du peptide de référence c[RGDfE] a permis d'évaluer de façon qualitative
et de comparer l'affinité de nos peptides pour les différents types cellulaires choisis. Le
meilleur candidat a ensuite été évalué de manière plus approfondie grâce à un test sur
récepteur DVE3 purifié. Une mesure de l'IC50 précise de notre composé a alors été possible.
II-2. Etudes in vivo
La facilité d'incorporation de nos molécules via la création d'une liaison amide a été utilisée
pour ajouter une tyrosine au peptide. Le radiomarquage de celle-ci à l'iode125 a permis des
études de biodistribution chez des souris nues greffées avec différentes lignées cellulaires.
Enfin, l'efficacité de notre meilleur candidat a été évaluée en thérapie chez des souris C57Bl6.
Un modèle pour une évaluation rapide et quantitative a été développé. La lignée murine de
mélanomes B16 génère chez la souris des métastases pulmonaires en trois semaines. La
capacité de notre dérivé à inhiber la formation de ces métastases a alors rapidement été mise
en évidence.
III. Applications à la vectorisation spécifiques d’agents effecteurs
III-1. Vectorisation de drogues
Nous avons évalué la capacité de notre meilleur peptide cyclique monomérique à être
internalisé dans différentes lignées cellulaires. Dans la perspective d’utiliser ce motif de
60
reconnaissance spécifique des cellules tumorales pour vectoriser dans celles-ci des composés
cytotoxiques, le choix de la nature du lien entre le motif de ciblage et la drogue a également
été primordial pour permettre son relarguage intracellulaire. Les données bibliographiques
encouragent l'emploi d'un pont disulfure (S-S) (Figure 26). En conséquence, une fonction
thiol activée par un noyau thionitropyridine a été intégrée à notre motif pour greffer toute
drogue (anticorps, peptide, oligonucléotide, radioisotope, agent cytotoxique) possédant
également une fonction thiol. Le choix de la drogue vectorisée s'est porté sur le peptide proapoptotic (KLAKLAK)2. Largement décrit, il est facilement fonctionnalisable par un résidu
cystéine en vue de la création d'un pont disulfure. De plus, pour avoir un effet pro-apoptotic il
doit être internalisé et atteindre les mitochondries. Cette pro-drogue nous a permis de
confirmer l'internalisation de nos nouveaux vecteurs ainsi que le relargage de la drogue
vectorisée.
Figure 26 : Représentation schématique de l’approche pro-drogue
III-2. Vectorisation de radioéléments
Notre peptide cyclique a été couplé à l’iode125, un radioisotope émetteur d’électrons Auger
actuellement évalué en radiothérapie métabolique dans notre laboratoire. Une des limites de la
radioimmunothérapie est l’irradiation importante induite par les isotopes utilisés actuellement
(notamment l’iode131) et les lésions subséquentes qui touchent les tissus sains. Certains
isotopes de plus faible énergie pourraient être alternativement utilisés sous réserve qu’ils
soient internalisés efficacement dans les cellules tumorales visées. Il a été montré dans
différents modèles que ces émetteurs induisent des lésions de l’ADN léthales pour la cellule
ciblée. Ainsi, il est donc important que le ciblage et l’internalisation de notre peptide soient
préalablement attestés. En terme de synthèse, il suffit d’ajouter un résidu tyrosine directement
sur nos dérivés via leur fonction acide libre.
61
IV. Multimérisation du motif de reconnaissance
Comme nous avons pu le constater, la multimérisation est un outil efficace pour augmenter
l’affinité d’une molécule pour sa cible. Nous avons choisi de dupliquer nos tétrapeptides
cycliques par des systèmes MAP (Multi Antigen Peptides). Ceux-ci sont constitués de polylysines branchées. Chaque fonction amine ( ou ) permet l’élongation de la chaîne et est
parfaitement adaptée pour l’incorporation de nos peptides via un simple couplage peptidique.
L’intercalation d’acides aminés glycines dans ces systèmes permet de moduler la distance
entre les motifs de reconnaissance. Des relations structure-activité peuvent alors mettre à jour
le système polymérique le plus affin pour V3. De plus, l’ajout d’un résidu cystéine à la
base du MAP permettra la création de pont disulfure avec des entités à vectoriser. De la même
façon, incorporer un résidu tyrosine peut servir pour le marquage radioactif et le suivi des
molécules in vivo.
Les installations disponibles au laboratoire (synthèse peptidique, culture cellulaire,
habilitation à manipuler des éléments radioactifs, animalerie) ont permis de réaliser la totalité
de ce projet sur site par le même expérimentateur et d'acquérir des connaissances et un savoirfaire dans de multiples disciplines (synthèse peptidique, radioactivité, tests in vitro et in
vivo…). Des capacités relationnelles entre les spécialistes des différents domaines ont
également été développées. Ce projet a été très enrichissant et très excitant.
62
RESULTATS ET DISCUSSIONS
63
I. Synthèse de nouveaux tétracyclopeptides RGD
I-1. Objectifs
Les pentapeptides cycliques c[RGDfE] et c[RGDfK], dérivés du Cilengitide, ont été exploités
pour la mise au point de motifs de ciblage de l’intégrine DVE3 (150, 178). Il a été démontré
que le remplacement de l’acide aminé V du Cilengitide par les acides aminés E ou K ne
changeait pas de façon dramatique l’affinité de la molécule pour sa cible (44). Les études
cristallographiques menées révèlent en effet que cet acide aminé se situe en retrait par rapport
à la séquence de reconnaissance RGD qui pour sa part est enfouie dans une cavité du site de
fixation.
Notre objectif est de remplacer les deux acides aminés f et E par un seul, en l’occurrence
l’acide aminé K et d’aboutir ainsi à des cyclotétrapeptides dont nous espérons que l’affinité
pour DVE3 sera meilleure. Les fonctions amines ou de la lysine serviront à cycliser le
peptide via un lien urée.
I-2. Structures à synthétiser
L’incorporation de l’acide aminé K en plus de la séquence RGD va permettre, du fait de la
présence d’une fonction amine sur sa chaîne latérale, d’aboutir à des peptides cyclisés via un
lien de type urée. La stratégie de synthèse concernant l’enchaînement des acides aminés va
permettre d’obtenir les séquences RGDK ou DGRK. La fermeture du cycle va s’effectuer
entre les fonctions amine-D de l’acide aspartique ou de l’arginine et l’amine-H de la lysine,
mais également entre l’amine-D, toujours de l’acide aspartique ou de l’arginine, et l’amine-D
de la lysine. Dans ce cas, l’élongation de la chaîne peptidique devra se faire sur la chaîne
latérale de la lysine, par l’intermédiaire de sa fonction amine-H (Figure 27). Il en résultera
donc quatre structures différentes dont nous comparerons les affinités pour le récepteur V3.
Pour la synthèse de molécules contrôles, nous avons choisi de remplacer la séquence RGD par
la séquence RGE dans laquelle l’acide aspartique est remplacé par l’acide glutamique. Cette
séquence est connue pour ne pas se fixer aux récepteurs intégrines (36).
64
HN
NH2
HN
NH
NH
H
N
HN
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
O
HO
O
NH
NH
O
OH
NH
OH
OH
O
H
N
HN
NH
O
O
OH
O
O
O
OH
NH
O
NH2
O
O
O
NH
O
NH2
NH
NH
O
HN
H
N
HN
O
HO
NH
O
O
NH
HN
O
O
NH2
NH
NH
OH
Figure 27 : Nouveaux tétracyclopeptides RGD cyclisés par un lien urée
L’arginine est représentée en rouge, la glycine en vert, l’acide aspartique en bleu et le lien urée en orange
La conception de ces structures a été motivée par plusieurs points importants :
-Il a été montré qu’une région hydrophobe en retrait de la séquence de reconnaissance
améliorait l’affinité des molécules (44). L’incorporation de la lysine et de sa chaîne latérale
relativement hydrophobe (4 méthylènes) pourrait se substituer aux 2 acides aminés de la
molécule parente.
-La réduction du nombre d’acides aminés du cycle de cinq à quatre résidus, bénéfique
en termes de coût de production, maintient des proportions de taille comparables à celles du
peptide de référence (17 atomes contre 15 pour le Cilengitide).
-Le fait de cycliser par l’intermédiaire de l’une ou l’autre des fonctions amines de la
lysine permet de conserver sa fonction acide libre. Cette dernière peut alors servir pour lier
différentes entités à vectoriser comme des drogues, des fluorophores ou des radioéléments.
I-3. Synthèse peptidique sur support solide : rappels
La synthèse peptidique sur support solide est apparue dans les années 60 (179, 180). Elle
consiste en l’incorporation séquentielle des acides aminés, de l’extrémité C-terminale vers
65
l’extrémité N-terminale sur un support solide constitué typiquement de billes de polymères
synthétiques. Ces billes sont fonctionnalisées par divers groupements chimiques qui
permettent la liaison du premier acide aminé. Il existe aujourd’hui un très large panel de
résines
commerciales
possédant
différentes
propriétés
de
solvatation
(solvants
aqueux/organiques) et diverses fonctions chimiques. Le choix de la résine permet la synthèse
de peptides protégés ou non après décrochage de celle-ci et conditionne la nature de
l’extrémité C-terminale (acide, amide, hydrazide, ester méthylique, aldéhyde).
Tableau 4 : Les grandes dates de la synthèse peptidique sur support solide
L’incorporation de chaque acide aminé nécessite la formation d’une liaison amide. Il est alors
nécessaire de protéger les fonctions chimiques non-engagées dans la liaison peptidique,
notamment les fonctions amines- ainsi que les fonctions réactives des chaînes latérales de
certains résidus (179, 181). La création de la liaison peptidique nécessite l’activation du
groupement acide de l’acide aminé à incorporer. Divers activateurs ont été mis au point et
permettent de minimiser les réactions d’épimérisations pouvant survenir. Ainsi chaque
incorporation d’un résidu fait intervenir une réaction de déprotection de la fonction amine puis une réaction de couplage (figure 28). Les avantages de la synthèse sur support solide sont
l’utilisation d’un excès de réactifs permettant des réactions rapides et quantitatives, l’absence
66
de purification entre chaque cycle grâce à l’élimination des excès par simple filtration et la
possibilité d’automatisation. Depuis quarante ans, la SPPS (Synthèse Peptidique en Phase
Solide) s’est largement imposée et de nombreuses améliorations techniques (composants et
bras espaceurs fonctionnalisés des supports de synthèse, groupements protecteurs
orthogonaux) l’ont rendue de plus en plus performante (182)(tableau 4).
En SPPS, il existe principalement deux grandes stratégies : les stratégies Boc/Bzl et
Fmoc/tBu. Celles-ci diffèrent par le choix du groupe protecteur de la fonction amine (Boc
ou Fmoc) et des groupements protecteurs orthogonaux pouvant être utilisés pour protéger les
chaînes latérales des acides aminés (respectivement Bzl ou tBu).
Figure 28 : Principe de la synthèse peptidique sur support solide
I-4. Stratégies de synthèse
La synthèse des peptides linéaires se fait sur support solide. Les séquences à synthétiser sont
les séquences RGDK, DGRK (où l’élongation des peptides se fait à partir de la fonction
amine- de la lysine), RGDK et DGRK (où l’élongation des peptides se fait sur la fonction
amine- de la lysine) (figure 29). Les peptides contrôles sont synthétisés de la même manière
en remplaçant l’aspartate par un glutamate.
67
HN
HN
pbf
pbf
HN
NH
H2N
(CH2)3
H
N
O
COOtBu
O
H
N
N
H
O
COOH
(CH2)4
H2N
O
NH2
HN
HN
H2N
HN
COOtBu
O
H
N
(CH2)3
H
N
O
COOtBu
COOH
COOtBu
NH
COOH
(CH2)4
H
N
H2N
O
O
pbf
H2N
NH
HN
(CH2)4
N
H
O
HN
H2N
O
(CH2)3
H
N
N
H
NH2
pbf
NH
NH
O
COOH
(CH2)3(CH2)4
N
H
NH
O
Figure 29: Structure des peptides linéaires synthétisés contenant la séquence RGD
La stratégie adoptée est la stratégie Fmoc/tBu. Les avantages de cette stratégie sont : une
régiosélectivité des couplages, très peu de réactions secondaires, la possibilité de suivre la
charge en cours de synthèse (absorbance à 299 nm). Par contre, les inconvénients sont : la
formation possible de dicétopipérazines, la formation de structures secondaires (lors de
l’assemblage de long peptides) et parfois une élimination spontanée du fmoc.
La résine choisie pour cette synthèse est la résine 2-chlorotrytile (183, 184). Elle présente
l’avantage d’avoir des conditions de clivage douces permettant de maintenir les groupements
protecteurs des chaînes latérales des acides aminés. Typiquement, un traitement de deux
heures avec une solution de AcOH/TFE/DCM permet de cliver la totalité du peptide en
régénérant la fonction acide de l’acide aminé C-terminal (185). Cela nous permettra
d’effectuer la réaction de cyclisation de façon régiosélective.
Pour les groupements protecteurs, nous avons choisi de travailler avec les acides aminés R et
D protégés respectivement par les groupements pbf et tBu qu’un traitement au TFA 92,5%
permet de cliver. Pour le résidu K, nous avons fait le choix de protéger sa chaîne latérale par
le groupement alloc, afin d’avoir des protections orthogonales entre les différents acides
aminés et ainsi permettre une réaction spécifique entre les fonctions amines libres des
peptides. Le groupement alloc dernier s’élimine avec un traitement à base de catalyseur au
Paladium, en présence d’un large excès de PhSiH3 (186). Une autre alternative aurait été
l’utilisation du groupe protecteur Dde, qui se déprotège avec 20 % d’hydrazine et lui aussi
utilisé de façon orthogonale avec les résidus R et D.
68
I-5. Résultats des synthèses sur support solide
Nous avons synthétisé les peptides linéaires contenant la séquence RGD, ainsi que tous les
peptides contrôles où l’aspartate est remplacé par un glutamate. Pour la synthèse des peptides
6 à 9 nous avons utilisé l’acide aminé Alloc-Lys(fmoc)-OH, lui même synthétisé à partir de
l’acide aminé commercial H-Lys(fmoc)-OH (Figure 30).
fmoc
H
N
O
OH
NH2
+
O
O
a
fmoc
Cl
H
N
O
OH
5
alloc
NH
Figure 30 : Synthèse de fmoc-Lys(alloc)-OH (5)
a. H2O/dioxane (1/1), Na2CO3.
La première étape de la synthèse est l’incorporation de la fmoc-Lys(alloc)-OH ou de l’allocLys(fmoc)-OH (2 éq.) sur la résine 2-chlorotrytile, étape se réalisant en présence de 4 éq. de
DIEA. La résine peut être préalablement rechlorée en la traitant avec une solution de chlorure
d’acétyle/DCM (1/9, 10 mL par gramme de résine). En effet, avec le temps on peut observer
une déchloration de la résine résultant en une diminution de sa charge. Avant de passer à
l’élongation du peptide, une étape de « capping » est nécessaire (traitement avec une solution
de DCM/MeOH/DIEA (10/2/1)) afin de saturer les sites de la résine n’ayant pas réagi.
L’élongation se fait ensuite en déprotégeant le groupement fmoc à l’aide d’une solution de
pipéridine à 20% dans le DMF. Celle-ci est suivie par mesure de la DO à 299 nm du
dibenzofulvène relargué, donnant une idée précise de la charge en acide aminé. Typiquement,
deux traitements de 5 min avec une solution de pipéridine à 20 % permettent une totale
déprotection du fmoc.
Le couplage de l’acide aminé à incorporer se réalise avec de 2 éq. par rapport aux fonctions
amines présentes sur la résine, ainsi que 2 éq. de TBTU, 2 éq. de HOBt et 4 éq. de DIEA. La
complétion de la réaction est mise en évidence par un test de Kaiser (187). De façon
classique, des temps de couplage d’1 h ont été utilisés.
Après déprotection de la fonction amine du dernier acide aminé, le groupement alloc de la
lysine est traité avec une solution de DCM contenant 0.2 éq. de Pd(PPh3)4 et 24 éq. de PhSiH3
pendant 2 h. On régénère ainsi les deux fonctions amines libres qui serviront à la cyclisation
ultérieure (Figure 31). L’étape suivante est le clivage des peptides de la résine qui se fait dans
69
des conditions acides douces à l’aide d’une solution de AcOH/TFE/DCM (2/2/6). Les
peptides sont ensuite précipités à l’éther, puis resuspendus dans H2O avant d’être lyophilisés.
Des analyses de la phase éthérée ne recensent aucune trace des composés désirés prouvant
leur totale précipitation dans ce solvant. Les rendements de synthèse, calculés par pesée des
composés, sont supérieurs à 98%. La pureté, appréciée par rapport aux profils HPLC, est
supérieure à 95 %. Des purifications supplémentaires n’ont donc pas été justifiées.
pbf
HN
HN
fmoc
NH
(CH2)3
H
N
N
H
COOtBu
O
H
N
N
H
O
O
COO
Cl-Trt
(CH2)4
alloc
NH
a, b
pbf
HN
HN
NH
(CH2)3
H
N
H2 N
O
COOtBu
O
H
N
N
H
O
COO
Cl-Trt
(CH2)4
NH2
c
HN
HN
H2N
pbf
NH
(CH2)3
H
N
O
COOtBu
O
N
H
H
N
O
COOH
(CH2)4
NH2
Figure 31 : Schéma de synthèse des peptides linéaires contenant la séquence RGD
Les peptides contenant la séquence RGE ont été synthétisés de la même façon.
a. pipéridine 20%. b. Pd(PPh3)4, PhSiH3, DCM. c. AcOH/TFE/DCM (2/2/6).
70
I-6. Cyclisation des peptides
Un moyen de cycliser les peptides linéaires est la formation d’une liaison de type urée entre
les deux fonctions amines ainsi régénérées. Cette réaction nécessite l’introduction d’un
groupement carbonyle. Parmi les « donneurs » de carbonyles, les réactifs les plus connus et
que nous avons testés sont le triphosgène, dérivé du phosgène mais beaucoup moins
dangereux et plus facile à manipuler, et le CDI. La réaction nécessite d’être en milieu alcalin
(pH 9-10) pour que les amines ne soient pas protonnées et puissent réagir pleinement grâce à
leur caractère nucléophile.
Première stratégie : cyclisation sur résine.
Une cyclisation sur résine a d’abord été envisagée. Elle aurait facilité la purification des
molécules, un simple clivage permettant de les récupérer. Les précautions à prendre pour cette
réaction sont :
-le choix du solvant, qui va être primordial pour une bonne solubilité des composés et
une bonne solvatation de la résine, ce qui facilitera l’accès des réactifs à leur site d’action.
-la charge de la résine, qui va conditionner des gênes stériques inéluctables.
-la quantité de réactifs utilisée. En effet, on s’attend à ce qu’une molécule de
« donneur » de carbonyle réagisse avec une molécule de peptide. Un excès de réactif pourra
entraîner la production de sous-produits et l’inverse conduira à une réaction incomplète.
-le choix du réactif « donneur » de carbonyle.
-le pH du milieu réactionnel qui conditionne la nucléophilie des amines.
La première conclusion est que le CDI tout comme le triphosgène ont une meilleure solubilité
dans le DCM que dans le DMF. Par contre le DMF solvate mieux la résine. Un mélange
DCM/DMF (1/1) est donc apparu judicieux. La quantité de réactif utilisé est de 1 éq. dans le
cas du CDI et 0,3 éq. dans le cas du triphosgène car une molécule de ce dernier libère trois
carbonyles. Le pH est ajusté à 9 par ajout de DIEA, base classiquement utilisée pour
déprotoner les amines en SPPS.
Des résines portant les différents peptides à cycliser ont été utilisées avec des charges
différentes. Des charges de 0,8, 0,4 et 0,1 mmol/g ont été testées. Pour suivre l’avancement de
71
la réaction, des microclivages opérés sur quelques billes de résine ont été effectués et les
produits de réaction obtenus analysés par HPLC, puis par spectrométrie de masse.
Les premiers résultats ont montré que l’utilisation du CDI était préférable à celle du
trisphosgène. En effet, ce dernier, au cours de la réaction libère de l’HCl. Cet acide est assez
fort pour cliver le peptide de la résine chlorotrityle. Une parade aurait été l’ajout d’une base
pour piéger l’HCl formé. Le choix de continuer les expérimentations avec le CDI a été
préféré.
Malgré ces précautions, les résultats obtenus indiquent une réaction très incomplète et
n’aboutissant que faiblement (rendement de 5 à 8 %) au produit désiré. La formation de
diisocyanates a été observée ainsi que d’autres sous-produits non identifiés et ce même en
variant les conditions (rajout de réactif, augmentation du temps de réaction, rajout de base...).
Le peptide linéaire reste toujours largement majoritaire en fin de réaction. La charge de la
résine n’a pas montré d’influence sur le déroulement de la synthèse. On peut cependant penser
que même à 0,1 mmol/g, l’encombrement stérique est une limite à la réaction.
C’est pourquoi une cyclisation en solution a été envisagée.
Deuxième stratégie : cyclisation en solution.
Pour cette réaction des précautions sont également à prendre.
-Tout d’abord, le choix des solvants, pour les mêmes raisons déjà invoquées.
-Les quantités de réactifs utilisées et leur concentration. Pour éviter les réactions intermoléculaires et favoriser les réactions intra-moléculaires il est nécessaire d’être en milieu
dilué.
La réaction est suivie par HPLC. Nous avons continué à utiliser un système de solvants
DCM/DMF (1/1). La DIEA est toujours ajoutée pour rendre les amines plus nucléophiles (pH
9-10). De façon classique, une concentration en peptide à 10-3 M est préconisée. Le CDI est
utilisé en quantité égale au peptide. Il est dissout dans le DCM et introduit goutte à goutte
sous agitation pour éviter la formation de diisocyanates. Cela permet d’être toujours en défaut
de se réactif. Un ajout trop brusque a montré une formation excessive de ce dernier composé.
Dans ces conditions le produit cyclique désiré a pu être obtenu avec des rendements
quantitatifs (Figure 32). La réaction est totale mais lente. A TA, il faut 12 h avant d’amener la
réaction à complétion. Par contre une modulation de la température permet d’avoir de
72
meilleurs résultats. Ainsi, en chauffant à 50°C le mélange réactionnel, la réaction est totale en
deux heures.
pbf
HN
HN
HN
H 2N
NH
pbf
NH
(CH2)3
H
N
O
NH
a
COOtBu
O
N
H
H
N
O
COOH
HN
O
NH
10
H
N
O
O
NH
O
(CH2)4
NH2
O
NH
O
O
tBu
OH
Figure 32 : Réaction de cyclisation du tétrapeptide H-R(pbf)GD(tBu)K-OH
a. CDI, DIEA,DMF/ DCM
Figure 33 : Cyclisation du peptide H-R(pbf)GD(tBu)K-OH. Profils HPLC superposés
73
Figure 34 : Analyse de masse obtenue par LC/MS pour le composé c[R(pbf)GD(tBu)K]-OH
Les peptides cycliques protégés sur les chaînes latérales des résidus R et D ne sont que des
intermédiaires de synthèse. Une pureté optimale n’est pas essentielle pour continuer les
synthèses avec ces dérivés puisqu’une purification rigoureuse doit être opérée après obtention
des molécules finales avant leur utilisation. Les peptides précipitent dans l’éther lorsqu’ils
sont déprotégés et donc très polaires. Ici, nos dérivés sont entièrement protégés et seule la
fonction acide leur confère un caractère hydrophile. Après évaporation totale des solvants de
la réaction, l’huile obtenue est diluée dans un faible volume de DMF. Un ajout d’un grand
volume d’éther (10 à 15 fois le volume de DMF) permet de précipiter le peptide. Ce dernier
peut être récupéré par centrifugation. L’analyse HPLC montre bien l’isolation des produits
désirés mais également les traces minimes de sous-produits de la réaction qui, de nature
peptidique également, ont eu le même comportement dans l’éther. La pureté appréciée par
HPLC et LC/MS est acceptable et dépasse les 95 % (figure 33, 34). Cependant, les analyses
systématiques des phases éthérées ont aussi mis en évidence leur présence. La conclusion est
que de part leur nature relativement hydrophobe, ceux-ci sont partiellement solubles dans
l’éther. Des variations du volume d’éther ajouté et des conditions de centrifugation n’ont rien
changé, les pertes s’estimant à 10 %. Une autre solution a été trouvée. Les peptides sont
précipités par un mélange d’éther et d’acétone (1/1). Cette fois, les analyses des surnageant
n’ont pas démontré la présence de peptide.
Lorsque les peptides cycliques ne sont que des intermédiaires de synthèse, cette seule
précipitation à l’éther suffit. Par contre, pour la synthèse des peptides cycliques déprotégés 19
à 22, une purification plus rigoureuse est nécessaire pour leur utilisation dans des tests
d’affinité sur récepteurs purifiés.
74
I-7. Déprotection totale des peptides cycliques
Les groupes protecteurs pbf et tBu sont déprotègés efficacement avec un traitement au TFA
aqueux à 92,5 % (figure 35). Pour ces réactions, une purification des peptides cycliques par
HPLC semi-préparative a été effectuée ainsi que des analyses LC/MS garantissant une pureté
optimale (> à 95 %). Le suivi de la réaction de déprotection s’effectue par HPLC. Celle-ci est
totale en 2 h. Des analyses LC/MS ont révélé la présence des peptides cycliques déprotégés
attendus, sans observer d’autres produits. Les masses haute résolution confortent ces résultats.
H
N
HN
HN
pbf
NH
NH
H
N
HN
O
O
NH
O
a
NH
O
O
O
H
N
HN
O
NH
O
NH
O
O
NH
O
NH2
OH
NH
tBu
O
OH
O
OH
19
10
Figure 35 : Etape finale de déprotection du peptide c[RGDK]-OH
a :TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5)
Les peptides sont récupérés par précipitation à l’éther sous forme de sels de TFA.
I-8. Marquage des peptides à la fluorescéine
Pour fonctionnaliser les tétracyclopeptides synthétisés avec des molécules cytotoxiques ou
des fluorophores, nous avons choisi de leur incorporer une fonction thiol qui pourra servir à la
formation de ponts disulfures ou de liens thioéthers. Dans le milieu réducteur du cytoplasme,
les ponts disulfures sont réduits, conduisant à la libération de la molécule véhiculée qui peut
exercer son action.
Nous avons choisi d’incorporer cette fonction thiol en utilisant la cystéamine, molécule
contenant une fonction amine et une fonction thiol qui doit être préalablement protégée.
75
Le choix du groupe protecteur s’est porté sur le groupement thio-nitro-pyridine. Déjà décrit
(188), celui-ci est connu pour être non seulement un groupe protecteur des fonctions thiols,
dont les conditions de déprotection sont orthogonales à celles couramment utilisées en
synthèse peptidique, mais aussi un activateur de ces dernières dans le but d’induire la
formation d’un pont disulfure hétérologue (figure 36).
N
H2N
SH
+
Cl
N
a
H2N
S
NO2
S
S
18
NO2
Figure 36 : Synthèse du composé 18
a : HCOOH
La synthèse de la cystéamine protégée est réalisée en faisant réagir 1 éq. de cystéamine avec
1,2 équivalent de chlorure de 3-nitro-2-pyridinesulphényle dans l’acide formique à TA. La
réaction est lente et au bout de 72 h le produit désiré est précipité à l’éther puis purifié par
recristallisation. La molécule est obtenue avec un rendement de 68 %.
Le couplage de la cystéamine-Npys 18 aux peptides cycliques protégés se fait par la
formation d’une liaison amide. On utilise les conditions de couplage peptidique classiques en
solution (BOP, DIEA, DMF). La réaction, suivie par HPLC, est totale. Les produits 23 à 30
sont récupérés par précipitation à l’H2O et ne nécessitent pas d’être purifiés (rendement
d’environ 95 %).
Un traitement classique au TFA 92,5% permet de déprotéger les chaînes latérales des résidus
arginine et acide aspartique (figure 37 et 38). Par précipitation à l’éther on récupère les
produits déprotégés. Ces réactions sont totales et les rendements quantitatifs.
76
H
N
HN
HN
pbf
NH
H
N
HN
pbf
NH
HN
O
NH
O
O
NH
O
O
NH
O
O
NH
O
O
b
O
O
NH
O
tBu
NH
O
NH
O
O
O
NH
O
O
NH
H
N
HN
O
a
H
N
NH
H
N
HN
NH2
OH
NH
O
NH
tBu
S
OH
O2N
10
S
S
O2N
N
23
S
N
31
Figure 37 : Synthèse du dérivé 31
a) composé 18, BOP, DIEA. b) TFA/TIPS/H20 (92,5/5/2,5)
Figure 38 : Profil HPLC du composé 31
L’étape suivante est la déprotection du groupement Npys afin de régénérer la fonction thiol
nécessaire à l’accrochage d’un fluorophore-maléimide. Celle-ci est réalisée en milieu
réducteur, dans un mélange CH3CN/H2O (1/1) en présence d’un équivalent de Bu3P. La
réaction est totale en 30 min. Une précipitation à l’éther permet d’isoler le produit désiré. La
réaction peut être suivie par mesure de l'absorbance de la 3-pyridine-2-thione. Si le
groupement Npys lié par pont disulfure a un maximum d’absorption à 350 nm, la thione
libérée a deux maximums d’absorption à 310 nm et 410 nm (correspondant au deux formes
tautomères thiopyridine et thiopyridone) (188). De simples mesures de la DO permettent de
déterminer si la réaction de déprotection est terminée.
Les peptides cycliques peuvent, par l’intermédiaire de leur fonction thiol libre, être couplés à
un fluorophore fonctionnalisé par un groupement maléimide par formation d’une liaison
77
thioéther. Ainsi, nous avons orienté le choix de notre fluorophore vers la fluorescéinemaléimide. La synthèse du dérivé fluorescéine-maléimide, décrite dans la littérature, est facile
à mettre en œuvre (figure 39). Cette molécule, une fois liée aux différents peptides nous
permettra de les étudier par cytométrie en flux ou microscopie de fluorescence.
HO
HO
O
OH
OH
O
O
+
O
O
O
O
O
a
O
NH
OH
NH 2
O
O
HO
O
OH
b
O
O
O
N
O
Figure 39 : Synthèse de la fluorescéinemaléimide 47
a)AcOH, anhydride maléique b).ZnCl2, HMDS, Benzène, DMF
La synthèse de la fluoresceine-maléimide 47 a été réalisée comme décrite par Reddy et al
(189). Le produit désiré est obtenu pur avec un rendement de 87 %.
Le groupement maléimide réagit spécifiquement avec les fonctions thiols à un pH de 6,5-7,5
pour former une liaison thioéther. Nos peptides sont donc couplés à la fluorescéine-maléimide
en milieu tamponné. Le solvant est un mélange d’une solution aqueuse de Tris HCl pH 7 et de
DMSO dans lequel la fluorescéine-maléimide est préalablement dissoute. La réaction est
suivie par HPLC. Au bout de deux heures la réaction n’évolue plus. Plusieurs produits
apparaissent à l’HPLC mais les analyses LC/MS révèlent que le produit attendu est le produit
majoritaire.
Initialement, nous avons tenté de purifier les produits désirés par précipitation à l’acétone.
Vivès et al. ont montré que des peptides marqués à la fluorescéine-maléimide étaient
insolubles dans ce solvant qui par contre solubilise bien la fluorescéine-maléimide résiduelle
(190). Malheureusement, cette méthodologie n’a pas permis de récupérer la totalité de notre
peptide qui reste partiellement soluble dans l’acétone. Ces molécules étant destinées à des
78
applications biologiques, leur degré de pureté doit être au moins supérieur à 95 % (figure 40).
Sur ces considérations, nous avons choisi de les purifier par HPLC semi-préparative. Après
lyophilisation, les peptides-FM sont obtenus avec des rendements de 35 à 50 %. Les analyses
de masses LC/MS confirment l’obtention des bons produits. La pureté appréciée par HPLC
est supérieure à 95 % (figure 41).
HN
NH2
NH
HN
NH2
HN
NH
NH2
H
N
HN
NH
O
H
N
HN
O
NH
O
NH
O
NH
O
O
a
OH
NH
O
NH
NH
O
OH
NH
b
O
O
O
O
NH
O
O
H
N
HN
O
O
NH
OH
NH
O
S
NH
O
S
O2N
31
O
NH
N
O
S
O
SH
O
N
39
HO
OH
O
48
Figure 40 : Marquage du peptide 31 par la fluorescéine-maléimide 47
a.Bu3P, H2O/MeCN (1/1). b. Tris HCl pH 7.5, fluorescéine-maléimide
Figure 41 : Profil HPLC du composé 48 après purification
Afin de comparer l’affinité de nos nouveaux tétracyclopeptides avec un peptide de référence,
nous avons synthétisé le peptide c[RGDfE] et son contrôle c[RGEfE] et marqués de la même
manière à la fluorescéine-maléimide. La synthèse de ces dérivés a également été effectuée sur
79
support solide en utilisant la résine 2-chlorotrytile. Les couplages des acides aminés sont
effectués suivant les mêmes protocoles et les peptides linéaires ont été obtenus avec des
rendements quantitatifs. La seule différence intervient dans la cyclisation du peptide. Cette
fois, la cyclisation est réalisée en milieu très dilué (10-3 M) par l’intermédiaire d’une liaison
amide. Pour éviter tout problème d’épimérisation, nous avons choisi d’effectuer la cyclisation
entre la glycine et le glutamate ou l’aspartate. La suite de la synthèse est la même que décrite
précédemment, la fonction acide de l’acide glutamique servant à l’insertion de la cystéamine
qui ,après déprotection du groupement Npys, permet de lier la fluorescéine maléimide (figure
42).
HN
O
NH
O
O
N
H
O
NH2
HN
NH
NH
H
N
H
N
O
NH
O
O
OH
HO
O
NH
OH
H
N
O
O
S
O
O
68
OH
O
N
O
O
O
O
NH
S
O
N
H
O
O
N
O
NH
O
H
N
NH
O
NH2
HO
69
O
OH
Figure 42 : Structure des molécules 68 et 69
80
II.
Evaluations
biologiques
in
vitro
des
nouveaux
tetracyclopeptides
La cytométrie de flux est une technique permettant d’analyser des cellules par un faisceau
laser. Ce dernier peut exciter des fluorophores leur étant associés. La fluorescence émise est
alors enregistrée, puis retranscrite informatiquement sous forme d’histogrammes rendant
compte de l’intensité de fluorescence de la population cellulaire analysée. Nous avons choisi
dans un premier temps, d’utiliser cette technique pour comparer l’affinité des différents
tetracyclopeptides à celle du peptide c[RGDfE] pour des types cellulaires exprimant plus ou
moins V3. La meilleure structure sera choisi pour des analyses complémentaires. Dans un
deuxième temps, un test de compétition de la fixation de l’échistatine sur le récepteur V3
purifié permettra une mesure précise de l’IC50 du composé.
II-1. Choix des lignées
Nous voulons évaluer l’affinité de nos peptides marqués à la fluorescéine pour le récepteur
V3. Nous avons quantifié son expréssion sur différentes lignées cellulaires disponibles au
laboratoire :
-Les cellules HUVEC (Human Umbelical Vein Endothelial Cells). C’est une lignée de
cellules endothéliales de cordon ombilical humain qui expriment de nombreuses intégrines à
leur surface. Ce modèle nous permettra de vérifier le ciblage de cellules que l'on retrouve sur
les néo-vaisseaux en formation. Leur principal inconvénient est leur culture délicate. C’est
une lignée qui pousse lentement, dans un milieu à base de facteurs de croissances. De plus, le
nombre de passage influe grandement sur la présence de récepteurs à la surface cellulaire
comme nous avons pu le démontrer.
-La lignée d’adénocarcinomes pulmonaires humains A549. Son expression d'DVE3 est
controversée. Certaines études se servent de cette lignée comme lignée DVE3 positive (191)et
d'autres comme DVE3 négative (192). Dans nos conditions d’analyse, nous avons révélé un
faible taux d'expression du récepteur.
-La lignée de mélanomes humains SKmeL28. Elle se développe rapidement et
exprime un fort taux d’V3. Cette lignée nous permettra de vérifier le ciblage de cellules
tumorales.
81
-La lignée humaine d’adénocarcinomes du sein MCF7. L’expression d’V3, dans nos
conditions de marquage, est égale à celle des cellules A549.
II-2. Evaluation de la présence d’V3 à la surface de différentes
lignées cellulaires
L’évaluation de la présence d’V3 à la surface des cellules est effectuée par cytométrie de
flux grâce à un anticorps anti-V3 (LM609 ou C51/C61). Cet anticorps est ajouté à un
nombre défini de cellules, de façon à être en large excès par rapport aux nombre de
récepteurs, et incubé à 4°C afin de s’affranchir des phénomènes d’internalisation. Un
deuxième anticorps marqué à la fluorescéine va reconnaître spécifiquement l’anticorps
primaire. Après plusieurs lavages pour éliminer les anticorps non fixés, les cellules sont
analysées au cytomètre. L’intensité de fluorescence rend alors compte de façon qualitative et
quantitative du nombre de récepteurs V3 à la surface cellulaire.
Le degré d’expression d’V3 a été évalué sur les lignées HUVEC, A549, et SKmeL28 et
MCF7 par cytométrie de flux (figure 43).
Figure 43 : Expression du récepteur V3 sur les lignées HUVEC, A549, SKmeL28 et MCF7
82
L’intensité de fluorescence permet de voir que les cellules HUVEC et SKmeL28 expriment
fortement V3. Les cellules A549 et SkmeL28 l’expriment très faiblement.
Dans nos expérimentations, les lignées HUVEC et SKmeL28 seront considérées comme
V3 positives. Les lignées A549 et MCF7 seront nos lignées V3 négatives.
II-3. Evaluation de l’association pour V3 des tetracyclopeptides par
cytométrie de flux
Les peptides marqués à la fluorescéine ont été comparés pour leur affinité à V3 par
cytométrie de flux, le peptide c[RGDfE], marqué de la même manière à la fluorescéine,
servant de référence. Une différence dans l’intensité de fluorescence reflète alors une
différence dans l’accumulation des peptides dans ou à la surface cellulaire et donc une
différence dans leur affinité.
Nos premières expériences ont été faites sur les lignées HUVEC et A549 avec les dérivés
cyclisés via l’amine de la lysine. La concentration finale en peptides fluorescents a été fixée
à 1 μM et l’incubation s’effectue sur 24 h. La fluorescéine-maléimide seule a également été
incubée avec les cellules à la concentration de 1 μM afin d’apprécier la diffusion passive de
cette molécule à travers la membrane, tout comme les molécules contrôles contenant la
séquence RGE. Afin d'avoir des concentrations rigoureusement égales de chaque peptide, des
mesures préalables de la DO à 488 nm (signal de la fluorescéine) et de l'aire des pics de
chaque composé par HPLC ont été effectuées.
Figure 44 : Evaluation de l’association des différents peptides pour les cellules HUVEC et A549
83
Nous pouvons observer sur la figure 44 l'intensité de fluorescence relative de chaque dérivé
associé aux lignées HUVEC et A549. Cette intensité correspond à la moyenne géométrique
calculée par le cytomètre. Nous avons ramené les valeurs sur une base 100 attribué au peptide
cRGDfE auquel nous voulons comparer nos peptides.
Pour la lignée A549, l’intensité de fluorescence de tous les peptides est du même ordre que
celle de la fluorescéine-maléimide seule (48,0 +/- 3,0). On peut penser que ces peptides de
petite taille peuvent traverser la membrane cytoplasmique via un phénomène d’endocytose
fluide. Par contre, toujours pour les cellules A549, on peut observer une intensité de
fluorescence légèrement plus forte pour les peptides présentant la séquence RGD vis-à-vis de
ceux présentant la séquence RGE : 31,3 +/- 9,1 contre 58,0 +/- 5,9 pour c[RGD(E/D)fE], 43,9
+/- 23,7 contre 53,9 +/- 20,1 pour c[RG(E/D)K] et 35,3 +/- 16 contre 47,1 +/- 3,5 pour
c[(E/D)GRK]. Ces valeurs peuvent s’expliquer par la présence, faible mais non négligeable,
du récepteur V3. Pour la lignée HUVEC, exprimant un fort degré d’V3, les différences
entre les peptides RGD et les peptides RGE est beaucoup plus marquée, confirmant
l’implication de ce récepteur pour discriminer les deux séquences. Les valeurs mesurées sont
46,6 +/- 16,2 pour le peptide c[RGEfE] contre 100 pour le peptide c[RGDfE], 35,3 +/- 11,5
pour c[RGEK] contre 157,2 +/- 9,1 pour c[RGDK] et 52,8 +/- 24,6 pour c[EGRK] contre
107,3 +/- 10 pour c[DGRK]. Le tétracyclopeptide c[RGDK] démontre une meilleure
association pour les cellules V3-positives que le peptide c[RGDfE] de référence (environ
60 % de plus). Sa sélectivité est maintenue car l’intensité de fluorescence du peptide
c[RGEK] associée aux cellules V3-positives est de l’ordre de celle de la fluorescéinemaléimide seule. Par contre, on peut être surpris par l’intensité de fluorescence associée au
peptide c[DGRK] qui est du même ordre que celle du pentacyclopeptide de référence.
Pourtant la sélectivité est maintenue étant donné que l’intensité de fluorescence du peptide
c[EGRK] reste plus faible. Plusieurs publications démontrent que cette séquence n’est pas
reconnue par les intégrines (80, 81). L’implication d’un récepteur alternatif peut être
envisagée.
Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les lignées SKmel28 et MCF7 confirmant
la plus grande affinité de notre dérivé pour le récepteur V3 que le peptide de référence
c[RGDfE] (155,9 +/- 5,7 pour le peptide c[RGDDK] sur la lignée SKmeL28 contre 100 pour
le peptide c[RGDfE] et 10,5 +/- 1,8 contre 15,7 +/- 0,7 respectivement, pour la lignée MCF7).
La différence d’expression d’V3 entre les lignées SKmeL28 et MCF7 est la même que celle
entre les lignées HUVEC et A549 et confirment l’implication de ce récepteur dans les
84
affinités observées. Là encore, le peptide c[DGRK] se lie aux cellules alors que son
homologue contrôle ne se lie pas. Si un autre récepteur est impliqué dans l’internalisation des
peptides contenant la séquence DGR, alors il doit être présent et sur les cellules HUVEC et
sur les cellules SKmeL28.
Nous avons renouvelé ces expériences avec les peptides cyclisés via l’amine de la lysine (52
à 55). Les résultats obtenus sur la lignée A549 sont du même ordre que ceux obtenus
précédemment (figure 45).
Figure 45 : Evaluation de l’association des différents peptides pour les cellules SKmeL28 et A549
Les intensités de fluorescence mesurées pour les différents peptides sont du même ordre que
celle de la fluorescéine-maléimide incubée seule (29,1 +/- 19,6). Les peptides contenant la
séquence RGD s’associent néanmoins plus aux cellules que leurs homologues contenant la
séquence RGE (36,7 +/- 22,0 pour le peptide c[RGDfE] contre 17,4 +/- 8,1 pour le peptide
c[RGEfE], 32,3 +/- 20,4 pour c[RGDK] contre 29,0 +/- 18,4 pour c[RGEK] et 36,6 +/- 16,7
pour c[DGRK] contre 23,9 +/- 10,2 pour c[EGRK]) La présence, en faible quantité, du
récepteur V3 peut expliquer ce résultat. Par contre, pour la lignée SKmeL28, exprimant
fortement ce récepteur, les variations sont plus importantes. Les intensités de fluorescence
mesurées sont de 100 pour le peptide c[RGDfE] de référence contre 39,4 +/- 10,2 pour le
peptide c[RGEfE], 84,3 +/- 10,7 pour c[RGDK] contre 47,1 +/- 14,1 pour c[RGEK] et 75,2
+/- 12,5 pour c[DGRK] contre 55,7 +/- 21,5 pour c[EGRK]. La différence entre chaque
peptide RGD et son contrôle RGE permet d’impliquer une association des peptides V3dépendante. Cependant, nous pouvons observer des différences par rapport aux intensités de
fluorescence recensées avec les peptides cyclisés via l’amine de la lysine. Si le peptide
c[RGDK] montrait une association pour le récepteur supérieure au peptide c[RGDfE]
85
(environ 65 %), le peptide c[RGDK] lui, montre une association inférieure (environ 16 % de
moins). La seule différence est l’orientation du résidu lysine. Dans le premier cas, la
cyclisation est effectuée entre l’amine de l’arginine et l’amine de la lysine. Dans le
deuxième cas, elle est effectuée entre l’amine de l’arginine et l’amine de la lysine, la
fonction acide libre se retrouvant à proximité de la liaison urée. Cette configuration semble
être néfaste pour la fixation au récepteur. De la même manière, le composé c[DGRK] montre
une moins bonne association pour le récepteur que les peptides c[RGDfE] et c[RGDK]. Le
fait que l’association aux cellules de son homologue c[EGRK] soit inférieure met en cause
une reconnaissance via un récepteur capable de discriminer ces deux séquences.
Nous avons évalué l’association des peptides synthétisés par cytométrie de flux, pour
différentes lignées exprimant divers degrés du récepteur DVE3. Le peptide c[RGDfE],
capable de vectoriser des drogues et auquel nous voulons nous comparer a servi de référence
dans ces tests. Les peptides présentant la séquence RGD montrent une association à toutes les
lignées cellulaires testées plus importante que leurs homologues présentant la séquence RGE.
De plus, des intensités de fluorescence supérieures sont obtenues pour chaque dérivé avec les
lignées HUVEC ou SKmeL28, exprimant un fort taux d’V3, par rapport aux lignées A549
et MCF7 exprimant peu ce dernier. Cela confirme bien une association V3-dépendante des
différents peptides. Parmi nos nouveaux tétracyclopeptides, seul le composé c[RGDK] s’est
trouvé plus affin pour l’intégrine d’intérêt que le peptide référent c[RGDfE]. L’orientation de
la lysine dans ces structures joue un rôle sur l’affinité des composés. Une cyclisation entre
l’amine de l’arginine et l’amine de la lysine est meilleure pour la reconnaissance du
récepteur qu’une cyclisation entre l’amine de l’arginine et l’amine de la lysine. On peut
supposer que ces deux cyclisations induisent des changements de la conformation de la
séquence RGD. L’orientation de la fonction acide libre peut aussi jouer un rôle. Dans le
premier cas elle se situe à proximité de l’aspartate, dans le second elle est du côté de
l’arginine, à proximité de la liaison urée. Etant donné que les molécules utilisées ici sont
fonctionnalisées par un fluorophore via cette fonction, on peut envisager une interaction
défavorable avec le récepteur, par exemple une gêne stérique. Notre but est de mettre au point
un peptide pouvant servir de vecteur, le peptide c[RGDK] est donc plus approprié que le
peptide c[RGDK].
Un point surprenant est la fixation des peptides contenant la séquence DGR. Il est prouvé que
celle-ci n’est pas reconnue par les intégrines. Des tests de compétition entre les peptides
c[RGDK] et c[DGRK] sont en cours pour définir si la fixation de ces deux molécules fait
86
intervenir le même récepteur. Des études de modélisation in silico permettraient de mieux
comprendre ces relations entre structure et activité.
II-4. Evaluation de l’affinité du c[RGDK] pour le récepteur V3
purifié
L’évaluation de l’association des différents peptides synthétisés pour les cellules V3positives par cytométrie de flux nous a permis d’évaluer le peptide c[RGDK] comme étant
plus affin que le peptide de référence c[RGDfE]. Le principal reproche que l’on pourrait faire
à ce test est l’utilisation de lignées cellulaires. Bien que l’évaluation de l’expression du
récepteur V3 ait été faite, nous n’avons pas vérifié l’expression d’autres récepteurs. Nous
savons que d’infimes variations dans la conformation de la séquence RGD peuvent induire
une sélectivité vis-à-vis d’autres intégrines. Aussi l’implication de différents récepteurs n’est
pas à exclure totalement (V5 par exemple). Néanmoins, ce test reste un bon moyen
d’évaluer rapidement l’affinité des peptides pour des cellules exprimant différents degrés
d’V3 et de sélectionner la meilleure structure.
Afin de s’affranchir de ces problèmes et pour évaluer de manière plus précise l’affinité du
c[RGDK] pour V3 nous avons conduit un test de compétition en phase solide sur
récepteur purifié. Ce test fait intervenir le récepteur purifié V3 qui est adsorbé sur des
plaques 96 puits. L’échistatine, qui contient la séquence RGD, est une petite protéine de 49
acides aminés isolée de venin de serpent, capable de se fixer à V3. L’échistatine
radiomarquée à l’iode125 est incubée avec des concentrations croissantes des différents
peptides qui vont inhiber ou non sa fixation aux récepteurs. La radioactivité de chaque puits
est mesurée rendant ainsi compte de la quantité d’échistatine fixée aux récepteurs. L’IC50, qui
est la concentration en peptide inhibant 50 % de la fixation de l’échistatine à V3 peut alors
être calculée.
87
-Radiomarquage de l’échistatine à l’iode125
La méthode la plus employée pour le marquage à l’iode de peptides ou protéines est la
méthode iodogène. C’est une méthode oxydante permettant d’incorporer un atome d’iode
spécifiquement sur les résidus tyrosines.
Nous avons donc utilisé cette méthode pour marquer l’échistatine. Classiquement, 50 μg
d’échistatine en solution dans du tampon de marquage (PBS 10 mM, NaCl 150 mM) sont
ajoutés à un tube contenant du iodogène adsorbé sur les parois. De l’iode125 (de 125 μCi à
500 μCi) est alors ajouté à la solution et le mélange est agité pendant 12 min. L’iode libre est
séparé du peptide radiomarqué grâce à une purification sur colonne d’exclusion de sépharose
G10. Cette sépharose G10 a une taille d’exclusion de 500 da et permet une bonne séparation.
On récolte ainsi différentes fractions dont la radioactivité est ensuite comptée. Les trois
fractions émettant le plus de radioactivité sont récoltées. La quantité de protéine marquée est
définie comme suit : Qté = (radioactivité des fractions récoltées / radioactivité totale) x Qté
initiale de protéine x 0,95.
Cette équation permet d’apprécier la quantité de protéine radiomarquée. Il faut bien prendre
en compte que lors de la purification sur colonne, l’échistatine marquée et celle qui n’aurait
pas été marquée s’éluent en même temps. Les fractions récoltées peuvent donc contenir de la
protéine non marquée. Les pertes dues à la purification sur colonne sont estimées à 5 %, d’où
l’introduction d’un facteur x0,95.
Connaissant la quantité d’échistatine marquée, le volume des fractions rassemblées, et la
radioactivité nous pouvons calculer l’activité spécifique de notre marquage.
En utilisant la méthode iodogène nous avons obtenu des activités spécifiques allant de 4,7
Ci/mmol (en utilisant 125 μCi d’iode) à 35,3 Ci/mmol d’échistatine (en utilisant 500 μCi
d’iode).
Avant toute utilisation dans des tests de compétition, il était impératif de vérifier que le
marquage n’avait pas altéré les propriétés de la protéine. Pour cela nous avons fait un test
d’adhésion de l’échistatine radiomarquée sur le récepteur V3 purifié et adsorbé sur des
plaques 96 puits. Nous avons obtenu au maximum 6 % de fixation de l’échistatine
radiomarquée sur V3. Cette très mauvaise fixation peut s’expliquer par une dénaturation de
la protéine lors du marquage. Le iodogène est un oxydant puissant qui peut altérer la protéine.
Quoiqu’il en soit ce faible taux de fixation ne nous a pas permis d’utiliser l’échistatine
radiomarquée par cette méthode pour nos tests de compétition.
88
Nous avons opté pour une méthode de marquage différente, la méthode des lactopéroxydases.
C’est une méthode de marquage enzymatique. Grâce à celle-ci nous avons pu marquer des
quantités d’échistatine avec une activité spécifique de 12 Ci/mmol. Par contre, la fixation aux
récepteurs V3 purifiés adsorbés sur des plaques est de 30 %. Pour des activités spécifiques
du même ordre, nous avons ainsi multiplié par 5 le pourcentage de fixation de la molécule. On
peut expliquer cela par le fait que le iodogène est un oxydant puissant qui peut altérer les
protéines, mais nous n’avons pas pu le vérifier. Bien que le taux de fixation reste encore assez
faible, nous l’avons jugé suffisant pour entamer des tests de compétition.
-Tests de compétition sur récepteur V3 purifié
Nous avons évalué l’affinité pour V3 des peptides c[RGDfE] 70, c[RGDK] 19, c[RGEK]
20, c[RGDK]Y 72, c[RGEK]Y 73 et c[DGRK] 21. Les composés 72 et 73 nous servirons
plus tard dans des études de biodistributions (voir partie IV). Nous avons voulu apprécier la
variation d’affinité due à l’incorporation de la tyrosine. La synthèse de ces composés a été
réalisée en solution par simple couplage peptidique entre les peptides 10 et 11 et l’acide aminé
H-Tyr(OtBu)-OtBu. La gamme de concentration en peptide utilisée va de 10-13 M à 10-6 M
(figure 46).
120
% d'échistatine liée
100
80
60
c[RGDfE]
c[RGDK]
c[RGEK]
c[RGDK]Y
c[RGEK]Y
c[DGRK]
40
20
0
-13
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
log [concentration en peptide]
Figure 46 : Inhibition de la fixation d’échistatine radiomarquée au récepteur V3 purifié par différents
peptides
89
Nous pouvons voir que les peptides contenant la séquence RGD inhibent de façon dose
dépendante la fixation de l’échistatine aux récepteurs V3 purifiés. En revanche, les peptides
contenant la séquence RGE n’inhibent cette fixation qu’à des concentrations élevées (10-7, 106
M). Le peptide c[DGRK] a également très peu d’effet sur l’inhibition de cette fixation, ce
qui prouve bien que la séquence DGR n’intéragit pas avec V3. Cela va à l’encontre des
résultats obtenus avec le test de cytométrie de flux, renforçant l’idée que ce peptide puisse
interagir sur un autre récepteur. Nous avons pu calculer les IC50 des différents dérivés.
IC50 c[RGDfE] = 2,05 nM.
IC50 c[RGDK] = 0,79 nM.
IC50 c[RGEK] = 4,7 μM.
IC50 c[RGDK]Y = 0,86 nM.
IC50 c[RGEK]Y = 4,0 μM.
L’IC50 du composé c[DGRK] n’a pas pu être mesurée car même à la plus forte concentration
une inhibition de 50 % de la fixation n’est pas atteinte. La première remarque que l’on peut
faire est que la valeur de l’IC50 du composé c[RGDfE] est différente de celle trouvée dans la
littérature (196 nM dans le même test d’inhibition). La seule différence que nous avons notée
est que dans nos expériences, l’activité spécifique de l’échistatine radiomarquée est de 12
Ci/mmol alors que celle décrite dans la littérature est de 2000 Ci/mmol (117). Nous n’avons
pas réussi à reproduire un marquage aussi radioactif. Néanmoins, cela ne peut expliquer les
différences observées. Cette expérimentation a été reproduite 5 fois avec des lots d’echistatine
radiomarquée différents et nous avons toujours obtenu les mêmes résultats.
Ainsi nous pouvons constater que le tétracyclopeptide c[RGDK] est 2,6 fois plus affin pour
V3 que le pentacyclopeptide c[RGDfE], alors que leurs homologues contenant la séquence
RGE sont aussi peu affins pour ce récepteur.
La fixation d’un résidu tyrosine sur le peptide c[RGDK] ne modifie que très légèrement son
affinité pour le récepteur (0,86 contre 0,79 nM). Cela montre d’une part que le peptide
c[RGDK]Y que nous utiliserons plus tard pour des expérimentations de biodistribution garde
son affinité pour V3 et d’autre part que le peptide c[RGDK] peut servir de vecteur car
l’incorporation d’une molécule (ici la tyrosine) via la liaison acide (en retrait par rapport à la
séquence RGD) ne semble pas gêner sa liaison au récepteur.
L’évaluation de l’affinité des différents peptides mis au point par cytométrie de flux nous a
permis d’identifier le peptide c[RGDK] comme structure plus affine pour V3 que le
90
peptide c[RGDfE]. Un test d’inhibition de la fixation de l’échistatine radiomarquée sur ce
récepteur purifié a confirmé ce résultat. La valeur d’IC50 que nous avons obtenue est de 0,79
nM. L’incorporation d’un résidu tyrosine via la fonction acide libre de notre peptide n’a pas
d’impact sur son affinité (IC50 = 0,86 nM).
Nous avons mis au point un peptide plus affin pour V3 que le peptide c[RGDfE] utilisé
dans de nombreuses études pour la vectorisation de divers agents effecteurs. Notre composé
peut facilement être lier à diverses molécules grâce à sa fonction acide libre. Nous étudierons
par la suite (voir partie III) ses capacités de vectorisation.
II-5. Evaluation de l’internalisation du peptide c[RGDK]
La fixation de molécules à un récepteur peut provoquer leur internalisation (193). Nous avons
vérifié par microscopie de fluorescence si notre peptide monovalent c[RGDK] était
internalisé par le récepteur V3. Les lignées cellulaires choisies pour ce test sont les lignées
HUVEC et A549 exprimant des degrés différents du récepteur V3.
Les mises au point préliminaires à l’expérimentation ont concerné :
-le nombre de cellules à ensemencer. Les cellules ne doivent pas être à confluence car
elle perdent l’expression du récepteur (notamment les cellules HUVEC). Nous avons opté
pour un ensemencement de 200 000 cellules par puits de chaque lignée.
-la concentration en dérivés fluorescents. Elle doit être suffisante pour avoir un bon
signal de détection. Après plusieurs essais nous avons choisi une concentration de 5 μM.
-le temps d’incubation des cellules avec les différents dérivés. Il doit être assez long
pour permettre une internalisation des molécules. Un temps de 30 min est suffisant.
Afin de pouvoir mettre à jour des différences d’internalisation entre les peptides c[RGDK] et
c[RGDfE] nous avons fait en sorte que le temps d’acquisition de la fluorescence par le
microscope soit le même dans toutes les expériences.
Pour éviter tout phénomène de relocalisation pouvant survenir lors des étapes de fixation
(194), nous avons choisi de travailler sur des cellules vivantes non fixées.
L’incubation, à 37°C, de cellules HUVEC avec 5 μM des dérivés c[RGDfE] et c[RGDK]
permet d’observer une coloration verte des cellules, les deux peptides donnant le même
résultat (figure 47). La présence de fluorescence à l’intérieur du cytoplasme indique qu’ils
91
pénètrent dans le milieu intracellulaire. De plus, l’observation de cette fluorescence sous
forme de vésicules, confirme une internalisation et non une simple diffusion passive.
Figure 47 : Observation par microscopie de fluorescence de cellules HUVEC incubées avec 5 μM des
composés 68 (gauche) et 48 (droite)
L’incubation des cellules avec la fluorescéine-maléimide ou le peptide c[RGEK], à la
concentration de 5 μM, ne permet pas d’observer le même résultat (figure 48). La
fluorescéine-maléimide provoque une coloration nettement moins intense sur les cellules que
les peptides c[RGDK] et c[RGDfE]. La fluorescence observée avec le peptide c[RGEK] est
également très faible (même plus faible que celle observée avec la fluorescéine-maléimide).
De plus, la coloration due à ces deux molécules est homogène et on ne voit pas comme
précédemment la formation de vésicules.
Figure 48 : Observation par microscopie de fluorescence de cellules HUVEC incubées avec 5 μM de la
fluorescéine-maléimide 47 (gauche) et le peptide 49 (droite)
92
L’internalisation du peptide c[RGDK] est visible sur les cellules HUVEC. Le fait que son
homologue c[RGEK] rentre beaucoup moins dans ces cellules implique une internalisation
médiée par le récepteur V3. Ces deux peptides ont été incubés à la même concentration sur
les cellules A549 exprimant un degré plus faible de ce récepteur (environ 30 fois) (figure 49).
Figure 49 : Observation par microscopie de fluorescence de cellules A549 incubées avec 5 μM des
composés 48 (gauche) et 49 (droite)
On peut noter une fluorescence beaucoup moins intense que pour les cellules HUVEC
pouvant s’expliquer par une plus faible expression du récepteur d’intérêt. Néanmoins, on peut
visualiser une fluorescence plus marquée pour le peptide RGD que pour le peptide RGE
confirmant tout de même son implication. Là encore on peut observer des zones plus intenses
pouvant supposer une internalisation via des vésicules.
Ces expériences nous ont permis de montrer une internalisation du peptide c[RGDK].
L’utilisation du peptide contrôle c[RGEK] ainsi que des lignées exprimant divers degrés du
récepteur V3 ont confirmé que cette internalisation était due à ce dernier. Le peptide
c[RGDDK] se présente donc comme un candidat idéal pour la vectorisation ciblée de cellules
exprimant le récepteur V3 et la délivrance intra-cellulaire de divers agents (fluorophores,
drogues,...).
93
III. Le peptide c[RGDDK] en tant que vecteur
III-1. Objectifs
Dans le but d'évaluer les capacités de vectorisation du peptide c[RGDDK], nous avons voulu
le coupler à une drogue. Nous avons choisi de l’utiliser comme vecteur en établissant une
liaison qui sera labile dans les conditions intracellulaires. La drogue pourra, une fois
désolidarisée du système de vectorisation, atteindre sa cible intracellulaire et exercer son
activité cytotoxique. Nous avons ainsi choisi les liaisons disulfures. Elles sont sensibles aux
environnements réducteurs que l’on retrouve essentiellement dans le milieu intracellulaire.
Ainsi le cytosol et les lysosomes contiennent des enzymes capables de réduire les ponts
disulfures (thiorédoxines, glutarédoxines,...).
III-2. Fonctionnalisation par un peptide pro-apoptotique
Le choix de la drogue à vectoriser s’est porté sur le peptide pro-apoptotique (KLAKLAK)2.
Largement décrit, il est incapable de pénétrer seul les membranes cellulaires (195). En le
couplant au peptide c[RGDDK]-OH par l'intermédiaire d'un lien disulfure nous pourrons donc
évaluer sa délivrance intracellulaire et confirmer les propriétés d'internalisation de notre
vecteur.
La séquence (KLAKLAK)2 a été découverte par Javadpour et al. qui ont étudié des modèles
de peptides amphipathiques présentant une activité antimicrobienne (196). Elle est composée
de résidus polaires et apolaires suivant le schéma [(PNN)(PNN)P]2 (où P sont des résidus
polaires et N des résidus apolaires). Elle s’organise en hélice amphipathique contenant une
face polaire et une face apolaire. La toxicité intracellulaire de la séquence (KLAKLAK)2 a été
attribuée à un mécanisme intrinsèque d’induction de l’apoptose faisant intervenir les
mitochondries. Elle a déjà été couplée à des peptides RGD afin d’être vectorisée au niveau
tumoral chez la souris. Par exemple, Ellerby et al. l’ont couplé au peptide cyclique
ACDCRGDCFC (appelé RGD-4C) (197). Dans un modèle de souris nues inoculées avec des
tumeurs pulmonaires MDA-MB-435, l’injection i. v. de 250 μg de conjugué par souris et par
semaine résulta en une inhibition de la croissance tumorale et une survie des souris prolongée
par rapport aux souris traitées uniquement avec le peptide RGD-4C à la même dose. Plus
récemment, Smolarczyk et al. ont utilisé ce conjugué chez des souris C57Bl6 inoculées avec
94
des tumeurs de mélanomes B16 (198). Seulement 6 jours après la greffe intradermale des
tumeurs, les souris ont été traitées i. v. avec 50, 100 ou 250 μg de conjugué deux fois par
semaine pendant deux semaines. L’effet observé a été une inhibition dose-dépendante de la
croissance tumorale. Cela prouve que le peptide RGD utilisé est capable de servir de vecteur
et que le peptide (KLAKLAK)2, une fois à la tumeur est internalisé et élimine les cellules
cancéreuses.
III-3. Synthèse
D’un point de vue synthétique, cette séquence peut être obtenue par SPPS en stratégie fmoc
suivant les protocoles classiques. Nous avons incorporé à son extrémité N-terminale la
séquence CGG. La cystéine sert à la formation de ponts disulfures et les glycines d’espaceur
entre le peptide et le vecteur. Ces incorporations ne modifient pas l’activité apoptogène du
peptide. La synthèse SPPS sur résine RINK AMIDE a permis d’obtenir le peptide HCGG(KLAKLAK)2 avec un rendement de 90 %. Sa purification a été effectuée par HPLC
préparative.
Pour la formation du lien disulfure entre le peptide H-CGG(KLAKLAK)2 et le peptide
vecteur nous avons utilisé le groupement Npys. S'il est parfois utilisé en tant que groupe
protecteur des fonctions thiols, il est aussi un activateur de ces dernières. La réaction de deux
molécules présentant des fonctions SH libres peut générer des homodimères. L'utilisation du
groupement Npys permet de favoriser les hétérodimères. Ici, le mécanisme réactionnel est une
attaque nucléophile du thiol libre du peptide pro-apoptotique sur la fonction thiol activé du
peptide 31 (figure 50). Cette réaction s'effectue en milieu tamponné légèrement acide (pH 6,5)
pour éviter les oxydations éventuelles. La réaction libère la 3-nitro-2-thiopyridone dont la
formation peut être suivie par spectrométrie.
95
HN
HN
NH2
NH2
NH
NH
H
N
HN
O
O
O
NH
O
NH
NH
O
O
O
+
H2N
O
NH
O
O
O
OH
NH
GG(KLAKLAK)2
HS
O
H
N
HN
a
S
OH
+
NH
O
O2N
NH
NH
NH
75
S
S
S
S
O2 N
N
GG(KLAKLAK)2
H2N
O
76
31
Figure 50 : Synthèse du conjugué 76
a) DMF/tampon phosphate (3/1)
Le produit désiré est directement purifié et récolté par HPLC semi-préparative. Le rendement
après purification est de 22 % et la pureté observée par HPLC est supérieure à 95 % (figure
51).
Figure 51 : Profil HPLC et masse associée du conjugué 76
La synthèse de notre composé « pro-drogue » 76 a été facilité par l’utilisation du groupement
Npys, qui permet d’activer les fonctions thiols et favorise la création de ponts disulfures.
96
Néanmoins la réaction ne forme pas qu’un seul produit car des homodimères du peptide 75
ont été observés. Une purification rigoureuse par HPLC a donc été nécessaire.
III-4. Evaluations biologiques de la « pro-drogue »
Afin d'évaluer la délivrance intracellulaire du peptide (KLAKLAK)2 par le peptide
c[RGDDK] nous avons mis en place un test de viabilité cellulaire. Celui-ci consiste à mesurer
la survie de cellules en présence de différentes concentrations de notre pro-drogue. La survie
des cellules est mesurée par un test colorimétrique utilisant le MTS.
La lignée cellulaire que nous avons choisie pour cette étude est la lignée SKmeL28 qui
exprime fortement l’intégrine V3 et qui se divise rapidement.
Se basant sur les données de la littérature, nous avons utilisé le composé, ainsi que son
contrôle, dans une gamme de concentration de 10 nM à 100 μM. Bien entendu, les peptides
c[RGDDK], c[RGEDK] et H-CGG(KLAKLAK)2 ont aussi été incubés avec les cellules à la
concentration la plus forte (100 μM). L’observation quotidienne au microscope des cellules a
permis d'apprécier l'effet sur leur viabilité et de mettre un terme à l'expérimentation au bout de
96 h. Les cellules vivantes ont alors été colorées grâce au MTS puis par simple mesure de la
DO à 490 nm, la viabilité par rapport aux cellules seules non traitées a été calculée (figure
52).
Figure 52 : Evaluation de l’effet des conjugués 76 et 77 sur les cellules SKmeL28 par un test MTS
97
Les observations résultant de cette expérimentation sont nombreuses. Premièrement, les
peptides c[RGDK], c[RGEK] et H-CGG(KLAKLAK)2 utilisés à la concentration de 100
μM n’ont quasiment pas d’effet sur la survie cellulaire. Au bout de 96 h, les pourcentages de
survie cellulaire sont respectivement de 100,9 +/- 7,5, 101,0 +/- 5,1 et 96,6 +/- 2,7. Ceci
prouve que ces trois molécules utilisées seules à cette concentration ne sont pas toxiques sur
ce type cellulaire. En revanche, la pro-drogue c[RGDK]-(KLAKLAK)2 montre un effet sur
la survie des cellules. Après 96 h d’incubation avec cette molécule à la concentration
minimale de 10 nM, seulement 83,3 +/- 5,0 % des cellules sont vivantes. La survie cellulaire
diminue avec une augmentation de la concentration en conjugué. Ainsi, aux concentrations de
100 nM et 1 μM les pourcentages de survie sont respectivement de 74,2 +/- 6,8 et 27,3 +/1,2. On constate une augmentation drastique de l’effet du composé entre ces deux
concentrations. Par contre utiliser le composé c[RGDK]-(KLAKLAK)2 à des concentrations
de 10 μM et 100 μM ne semble pas augmenter significativement la mortalité des cellules
(pourcentage de survie de 23,5 +/- 2,4 et 21,1 +/- 1,3 respectivement). Il semble que la
mortalité des cellules atteigne un palier. Ce phénomène a déjà été observé par Smolarczyk et
al. sur les lignées cellulaires MDA-MB-435 et MCF7 (198).
La molécule c[RGEK]-(KLAKLAK)2 ne montre pas d’effet significatif sur la survie des
cellules aux concentrations de 10 nM, 100 nM et 1 μM. Aux concentrations de 10 μM et 100
μM, ces pourcentages atteignent respectivement 92,2 +/- 1,3 et 75,8 +/- 1,5. Ces valeurs
restent cependant nettement supérieures à celles obtenues avec la molécule RGD.
L’effet du conjugué c[RGDK]-(KLAKLAK)2 sur la survie des cellules SKmeL28 a été mis
en évidence par un test de viabilité cellulaire. Le pourcentage de survie des cellules de 21,1 %
+/- 1,3 à la concentration de 100 μM montre bien l’effet d’une association covalente des deux
molécules c[RGDK] et H-CGG(KLAKLAK)2, qui utilisées seules à la même concentration
n’ont pas d’effet notable. La mortalité des cellules observée est donc indéniablement due au
peptide pro-apoptotique qui a pu rentrer à l’intérieur des cellules. On peut en déduire que
l’internalisation de la molécule s’est effectuée par l’intermédiaire du peptide c[RGDK]. Par
contre nous n’avons pas pu vérifier si la liaison disulfure était rompue dans le milieu intracellulaire de même que si le peptide (KLAKLAK)2 toujours lié au vecteur, gardait ses
propriétés pro-apoptotiques. Le fait que la liaison de ce peptide à la molécule c[RGEK] ne
montre pas d’effet aux concentrations les plus basses et un effet mineur aux deux
concentrations les plus élevées implique une internalisation spécifique médiée par la séquence
RGD.
98
IV. Evaluations biologiques in vivo du peptide c[RGDK]
Les évaluations in vitro du peptide c[RGDK] nous ont permis de mettre en évidence
certaines de ses propriétés, à savoir :
-une affinité pour le récepteur intégrine V3 supérieure à celle du peptide c[RGDfE].
-un mécanisme d’internalisation médié par ce récepteur.
-sa capacité à vectoriser différentes molécules (peptide apoptotique, fluorophore,...).
Nous avons voulu évaluer ce peptide in vivo, chez la souris. Les expérimentations in vivo sont
les seules à rendre compte du comportement d’une molécule de la façon la plus réelle
possible. Les paramètres physiologiques propres à l’animal peuvent influer sur les molécules
et aboutir à des résultats différents de ceux observés dans des tests in vitro. Ainsi, il est
fréquent que des molécules prometteuses in vitro déçoivent in vivo (63).
IV-1. Etudes de biodistribution
Premièrement, nous avons voulu savoir si notre peptide présentait des propriétés de ciblage
dans un modèle animal. Dans le but de s’en servir en thérapie ou en tant que vecteur pour le
diagnostic, il était important d’estimer ses capacités à cibler les sites tumoraux. Nous avons
choisi d’effectuer des études de biodistribution. Elles consistent à évaluer la distribution d’une
molécule dans le corps entier d’une souris. Pour cela, les molécules que l’on veut suivre sont
radiomarquées puis injectées à l’animal. Ce dernier est ensuite sacrifié puis disséqué de façon
rigoureuse. Chaque organe est prélevé, pesé, puis la radioactivité qui lui est associée est
comptée. La biodistribution de la molécule s’exprime en pourcentage de la dose injectée par
rapport au poids de chaque organe (en grammes).
Choix des modèles tumoraux :
Afin d’estimer le ciblage du récepteur V3, nous avons choisi de greffer aux souris deux
lignées cellulaires exprimant des taux différents du récepteur et qui sont également connues
pour bien se développer chez l’animal. Nous avons opté pour les lignées A549 et SKmeL28.
La lignée SKmeL28 exprime environ 30 fois plus le récepteur d’intérêt que la lignée A549.
Ces deux lignées se répliquent rapidement, et en trois semaines forment des tumeurs souscutanées d’environ 300 mm3.
99
Choix du modèle murin et de la greffe :
Les lignées sus-citées sont des lignées humaines. Nous avons choisi des souris nues,
immunodéprimées et dans lesquelles ces lignées peuvent pousser. Les cellules sont greffées
de façon s.c. pour deux raisons. La première est qu’une tumeur sous-cutanée est visible et
permet une mesure facile et rapide de sa taille. Cela permet de savoir quand réaliser l’étude de
biodistribution (dans notre cas lorsque les tumeurs atteignaient 300 mm3). La deuxième raison
est que ce mode de greffe a permis d’inoculer les deux lignées sur la même souris, sur chacun
de ses flancs.
Choix des radioéléments utilisés :
Le fait de greffer les deux lignées tumorales sur le même animal a permis d’évaluer la
distribution du peptide c[RGDK] entre elles. Pour quantifier et comparer les biodistributions
de ce peptide avec le peptide contrôle c[RGEK] nous avons marqué ces deux molécules avec
deux isotopes de l’iode différents. Cela nécessite l’introduction d’un résidu tyrosine qui sert
au marquage à l’iode. Nous avons montré précédemment que l’incorporation de ce résidu
n’influait pas sur l’affinité des peptides pour V3. Le peptide c[RGDK]Y a ainsi été
marqué à l’iode125 et le peptide c[RGEK]Y à l’iode131 par la méthode iodogène avec des
activités spécifiques comparables (1,54 μCi/μg pour le peptide c[RGDDK]Y-I125 et 1,58
μCi/μg pour son homologue RGE).
Principe de l’expérimentation :
Des groupes de 3 souris nues sont constitués. Chaque souris est greffée avec 2 millions de
cellules SKmeL28 de façon s.c. sur le flanc droit et 2 millions de cellules A549 sur le flanc
gauche. Lorsque le volume tumoral atteint environ 300 mm3 (il faut environ 3 semaines et les
deux lignées poussent de la même façon), les biodistributions sont réalisées. La veille de
l’expérimentation du lugol est ajouté à l’eau de boisson des animaux afin de saturer la
thyroïde et éviter une accumulation aspécifique de l’iode à ce niveau. Au temps To, 10 μg de
peptide c[RGDK]Y marqué à l’iode125 et 10 μg de peptide c[RGEK]Y marqué à l’iode131
sont injectés de façon i.v. à chaque souris. L’injection i.v. est choisie pour avoir une
délivrance des peptides directement dans le sang et ainsi une distribution rapide dans la
totalité du corps.
100
Biodistributions.
Aux temps 15 min, 30 min, 1 h et 2 h, les souris sont disséquées et la biodistribution des
molécules évaluée (figure 53). (La tumeur A549 est nommée tumeur – et la tumeur SKmeL28
est nommée tumeur +).
c[RGDK]Y-I125
c[RGEK]Y-I131
os
pe
le
us
c
es au
to
m
ac
in
t.
G
re
le
co
ca lon
rc
as
se
sa
ng
Tu
m
ra
te
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
m
e
tu ur m
eu
r+
fo
ie
re
po ins
um
on
s
% ID/g
Temps 15 min
c[RGDK]Y-I125
c[RGEK]Y-I131
ac
G
re
le
co
ca lon
rc
as
se
sa
ng
u
in
t.
es
to
m
pe
a
os
us
cl
e
m
fo
ie
re
po ins
um
on
s
ra
te
+
eu
r
tu
m
eu
r-
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
Tu
m
% ID/g
Temps 30 min
101
c[RGDK]Y-I125
c[RGDK]Y-I131
os
pe
le
us
c
es au
to
m
ac
in
t.
G
re
le
co
ca lon
rc
as
se
sa
ng
Tu
m
ra
te
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
m
e
tu ur m
eu
r+
fo
ie
re
po ins
um
on
s
% ID/g
Temps 1 h
c[RGDK]Y-I125
c[RGEK]Y-I131
ac
G
re
le
co
c a lon
rc
as
se
sa
ng
m
au
in
t.
to
es
pe
os
m
us
cl
e
Tu
ra
te
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
m
e
tu ur m
eu
r+
fo
ie
re
p o ins
um
on
s
% ID/g
Temps 2 h
Figure 53 : Etudes de biodistributions chez des souris nues injectées avec 10 μg des composés 72 et 73
marqués respectivement à l’iode 125 et l’iode 131
On note une présence du composé RGD supérieure à celle du composé RGE dans tous les
organes sauf les reins et l’intestin grèle. On constate une diminution de la radioactivité globale
dans tous les organes au cours du temps sauf pour l’estomac où celle-ci augmente jusqu’à 1 h,
quelque soit le radioisotope, avant de diminuer. Cette augmentation est certainement due à
une accumulation d’iode libre. Il est connu que l’iode peut se délier des molécules et
s’accumuler dans l’estomac. Si l’on regarde au niveau des tumeurs, on note une accumulation
à 15 min dans la tumeur A549 de 4,2 et 3,5 % pour les peptides RGD et RGE, respectivement.
Pour la tumeur SKmeL28 ces pourcentages sont de 3,2 et 3,0 %. Ces valeurs sont en accord
avec celles de la littérature pour des molécules peptidiques de petites tailles. A 2 h, on
retrouve 1,6 % ID/g du peptide RGD à la tumeur A549 et 1,2 % du peptide RGE. Pour la
102
tumeur SKmeL28, à 2 h, nous avons 0,9 % ID/g du peptide RGD et 0,7 % du peptide
contrôle. Cela montre une élimination rapide des molécules et une faible rétention aux
tumeurs. Deux observations sont intéressantes : la première est la faible différence dans la
distribution entre les deux peptides, surtout au niveau des tumeurs. On aurait pu s’attendre à
une accumulation spécifique des peptides RGD aux tumeurs exprimant le récepteur V3 par
rapport aux peptides RGE qui ne sont pas reconnus. La deuxième est une meilleure
accumulation des deux molécules pour la tumeur A549 que pour la tumeur SKmeL28. Les
cellules A549 expriment un taux d’V3 inférieur aux cellules SKmeL28 (environ 30 fois).
Lors de la dissection, nous avons pu vérifier que la tumeur A549 était très peu vascularisée à
l’inverse de la tumeur SKmeL28. Il faut également mentionner une accumulation des deux
molécules supérieure dans le foie et les reins par rapport aux tumeurs. Cela peut s’expliquer
par leur faible poids moléculaire qui favorise une élimination rapide.
Bien que le % ID/g aux tumeurs reste correct par rapport à la littérature, ces biodistributions
ont révélés des points négatifs importants. Le premier est une accumulation à la tumeur A549
plus importante qu’à la tumeur SKmeL28, ce qui est contradictoire à l’expression de
l’intégrine V3. Le deuxième est une différence d’accumulation entre les peptides RGD et
RGE très peu marquée dans la plupart des organes, hormis les reins où le peptide RGE se
retrouve 2,5 fois plus que le peptide RGD. Une hypothèse est la présence de récepteur
spécifiques de cette séquence dans cet organe, mais cela n’est pas mentionné dans la
littérature.
Si nous n’avions fait qu’une mesure de l’affinité des peptides sur récepteurs V3 purifiés
nous aurions pu supposer l’implication d’un autre récepteur intégrine pour expliquer la
différence de « ciblage » entre les deux lignées. Mais le test de cytométrie de flux révèle une
affinité nettement supérieure du peptide c[RGDK] pour la lignée SKmeL28 que pour la
lignée A549. Nos composés auraient dû se comporter in vivo de la même manière que dans ce
test. L’hypothèse que nous pouvons émettre est une expression différente de l’intégrine V3
entre des cellules utilisées in vitro et des cellules utilisées in vivo. D’autre part, l’observation
d’une vascularisation n’est pas forcément corrélée à l’expréssion d’V3, d’autres récepteurs
peuvent également intervenir dans l’angiogénèse tumorale (DVE5, VEGFR,..). Des analyses
immunohistochimiques nous auraient permis de conclure sur l’abondance d’DVE3.
103
IV-2. Essais de thérapie chez la souris
Nous avons montré que le peptide c[RGDK] se fixait avec une forte affinité à l’intégrine
V3. Bien que les études de biodistribution ne montrent pas une spécificité dans
l’accumulation de ce dernier au sein de tumeurs V3-positives, par rapport au peptide
c[RGEK], nous avons voulu évaluer sa capacité à inhiber la croissance tumorale. En ciblant
ce récepteur impliqué dans la néo-angiogénèse, nous espérons bloquer le développement des
cellules cancéreuses. Nous avons évalué ce peptide seul, sans vectoriser d’agents
thérapeutiques, afin de mettre en évidence ces propriétés dues à son seul rôle d’antagoniste.
-Choix du modèle
Nous avons travaillé avec la lignée B16, une lignée de mélanomes de souris sur-exprimant le
récepteur V3. Ce qui les rend particulièrement attrayantes est leur capacité à former des
métastases pulmonaires chez l’animal. Les métastases formées sont de couleur noire et sont
facilement visibles sur les poumons de couleur rose. Le résultat d’un traitement pouvant
inhiber la croissance tumorale est alors facilement appréciable à l’œil nu de manière
qualitative (199).
La lignée B16 est d’origine murine et il n’est pas nécessaire d’utiliser des souris
immunodéprimées pour les expérimentations. Nous avons travaillé avec des souris de type
C57Bl6.
-Choix du protocole de traitement
Pour avoir la formation de métastases pulmonaires, la greffe des cellules B16 doit se faire
intraveineusement. D’après des expérimentations préalablement réalisées au laboratoire,
l’injection de 700 000 cellules permet d’avoir en trois semaines des poumons complètement
envahis de métastases. L’évolution de la croissance tumorale n’étant pas possible à suivre,
nous avons observé le comportement et l’état physique des animaux chaque jour.
Nous avons traité les souris tous les jours dès le lendemain de la greffe. Comme nous avons
pu le voir dans l’introduction de ce manuscript, un traitement précoce est plus efficace et
permet d’amener une dose régulière de notre composé. En effet, pour bloquer la croissance
tumorale, il est nécessaire de maintenir des doses les plus constantes possibles en inhibiteurs.
Sur la base des données de la littérature, nous avons injecté 2 mg/jour/souris. Des injections
i.v. auraient été les plus adaptées car elles auraient permis la délivrance de la drogue
104
directement dans la circulation sanguine. Malheureusement, il est impossible de traiter
quotidiennement des souris par voie i.v. sur une période de 20 jours. Nous avons donc opté
pour des injections i.p.
Premier essai
Le premier essai a été réalisé sur 3 groupes de 5 souris, greffées avec 700 000 cellules B16.
Le premier groupe de souris est traité tous les jours, dès le lendemain de la greffe, avec 2
mg/souris du peptide c[RGDK]. Le deuxième groupe est traité tous les jours avec 2
mg/souris du peptide c[RGEK]. Enfin le troisième groupe contrôle est traité avec du PBS
seul (200 μL/jour/souris). Au bout de 20 jours, chaque animal est sacrifié, disséqué, puis les
poumons sont prélevés, photographiés et pesés. L’efficacité du traitement est également
appréciée visuellement (figure 54).
105
Figure 54 : Photographies des poumons de souris C57Bl6 inoculées avec 700 000 cellules B16 et traitées
pendant 20 jours avec les peptides c[RGDK] et c[RGEK] (2 mg/jour/souris) ou du PBS (200
μL/jour/souris). Sous chaque photographie est associée la masse du poumon
Dans le groupe non traité (groupe 3), tous les poumons présentent un nombre élevé de
métastases. La lignée B16 est agressive et a envahi en 20 jours la quasi-totalité des poumons.
Les 5 poumons présentent un développement tumoral homogène. Leur poids moyen est de
914 mg avec un écart-type de 58 mg. Cela contraste fortement avec le poids d’un poumon
sain qui se situe entre 200 et 300 mg. Le groupe traité avec le peptide c[RGEK] présente les
mêmes caractéristiques que le groupe non traité. Les poumons sont totalement recouverts de
métastases. Leur poids moyen est également nettement supérieur à celui de poumons sains
(1145 +/- 117 mg). En revanche le groupe traité avec le peptide c[RGDK] ne présente pas la
même homogénéité des 5 poumons. Les poumons A, B et D sont totalement recouverts de
métastases et présentent le même profil que ceux des groupes 2 et 3. Leur poids est d’ailleurs
du même ordre. Par contre les poumons C et E présentent un taux de « recouvrements »
nettement plus faible et leur poids est également très sensiblement inférieur à tous les autres.
On peut ainsi observer un effet d’inhibition de la croissance tumorale du au peptide
c[RGDK]. alors que son homologue, le peptide c[RGEK] n’a aucun effet sur la croissance
tumorale. Cette différence prouve une inhibition impliquant le récepteur intégrine V3
auquel le premier peptide cité se fixe avec une haute affinité, alors que le second ne se fixe
pas. Dans le groupe 1, on observe une hétérogénéité de la réponse au traitement, ce
phénomène étant courant dans les études in vivo. De nombreux paramètres physiologiques
propres à l’animal (expression différentes d’V3 par exemple) peuvent expliquer ces
différences.
Ces résultats sont encourageants, le peptide c[RGDK] est capable, utilisé seul, d’inhiber le
développement de métastases pulmonaires. Il faut également noter que nous nous sommes
placés dans un modèle difficile. La lignée B16 est agressive et l’injection de nos peptides de
façon intra-péritonéale, est également moins favorable qu’une délivrance continue comme on
106
peut l’observer dans certaines études. Bien que traitant quotidiennement, les études de
biodistributions ont montré une rapide élimination de nos molécules (% ID/g inférieur à 1,6 %
au niveau des tumeurs après 2 h). Les cellules ne sont donc pas constamment en présence
d’inhibiteurs. Traiter avec des doses plus importantes ne paraît pas avantageux car
l’élimination des molécules resterait aussi rapide, par contre traiter de façon plus continue
(grâce à des systèmes de pompes par exemple) permettrait de maintenir une concentration
stable en peptides et améliorerait leur effet inhibiteur.
Afin de confirmer les résultats obtenus, nous avons reproduit l’expérimentation en modifiant
plusieurs paramètres. Premièrement nous avons évalué l’efficacité du traitement à des temps
plus courts. En effet, à J20 les poumons sont trop atteints par la maladie pour pouvoir
apprécier une différence précise. Deuxièmement, une dose en peptide plus faible a été
évaluée.
Deuxième essai
Nous avons continué à injecter 700 000 cellules B16. Cependant, nous avons disséqué les
animaux aux jours 12, 15 et 18. De plus, un groupe traité avec une dose de 1 mg/jour du
peptide c[RGDK] a aussi été constitué. Les souris du groupe contrôle sont injectées avec le
peptide c[RGEK] (2 mg/jour) et disséquées aux jours 12, 15 et 18 (figure 55).
107
Figure 55 : Photographies des poumons de souris C57Bl6 inoculées avec 700 000 cellules B16 et traitées
pendant 12 jours avec les peptides c[RGDK] et c[RGEK] (2 mg/jour/souris). Sous chaque photographie
est associé la masse du poumon
A J12, les poumons sont nettement moins envahis par les métastases qu’à J20, ce qui est
normal car les cellules ont eu moins de temps pour se développer. Dans le groupe contrôle
(groupe 2), on peut voir des poumons atteints de métastases isolées, le poumon G étant plus
marqué que les deux autres. Le poids moyen des poumons de ce groupe est de 391 mg. Le
groupe traité avec le peptide c[RGDK] est plus hétérogène. Les poumons B et C présentent
un profil semblable à celui du groupe contrôle alors que les poumons A et D sont beaucoup
moins envahis par les métastases. Aucune métastase n’est d’ailleurs visible sur le poumon D.
Le poids moyen des poumons de ce groupe est de 365 mg. ce qui confirme une plus faible
présence de cellules cancéreuses.
Encore une fois, toutes les souris n’ont pas répondu de la même manière mais la tendance
observée dans la première expérimentation est confirmée.
108
Figure 56 : Photographies des poumons de souris C57Bl6 inoculées avec 700 000 cellules B16 et traitées
pendant 15 jours avec les peptides c[RGDK] et c[RGEK] (2 mg/jour/souris). Sous chaque photographie
est associé la masse du poumon
A J15 (figure 56), les poumons du groupe contrôle sont plus envahis par les métastases qu’à
J12. Si les poumons F et G sont semblables, le poumon E est plus recouvert par les cellules
B16, sont poids est d’ailleurs plus élevé et confirme cela. Les poumons du groupe traité ne
présentent pas tous le même profil. Les poumons C et D sont atteints de la même manière que
les poumons F et G du groupe contrôle. Par contre, le poumon A est moins envahis par les
mélanomes que ceux du groupe contrôle et le poumon B est lui quasi sain. La différence dans
le poids moyen des poumons est encore plus prononcée qu’à J12 (388 mg pour le groupe 1
contre 496 mg pour le groupe 2). L’inhibition de la croissance tumorale induite par le peptide
c[RGDK] est donc encore visible à J15. Comme précédemment, la réponse au traitement est
différente suivant les souris mais l’effet de ce dernier est confirmé.
109
Figure 57 : Photographies des poumons de souris C57Bl6 inoculées avec 700 000 cellules B16 et traitées
pendant 18 jours avec les peptides c[RGDK] et c[RGEK] (2 mg/jour/souris) ou c[RGDK] (1
mg/jour/souris). Sous chaque photographie est associé la masse du poumon
A J18, la différence entre les groupe traité à 2 mg/jour (groupe 1) et contrôle (groupe 2) n’est
plus visible (figure 57). Tous les poumons présentent un profil similaire et la différence entre
leurs poids moyens est beaucoup moins marquée qu’à J15 (435 mg pour le groupe traité
contre 476 mg pour le groupe contrôle). Dans le groupe 3, où les souris ont été traitées à la
dose de 1 mg/jour avec le peptide c[RGDK], les poumons H et J sont semblables aux
poumons du groupe 2 (que ce soit en terme de « recouvrement » métastatique ou en poids). Le
poumon I par contre n’est que très peu envahi par les cellules tumorales et son poids est
110
seulement de 279 mg. Ce résultat est inattendu car aucun poumon traité à la dose de 2 mg/jour
ne présente une telle inhibition de la formation de métastases. Le trop faible nombre de souris
engagées dans cette expérience ne permet pas de conclure sur l’efficacité de la molécule
administrée à raison de 1 mg/jour et devra être reproduite.
Ainsi, à J18, le bénéfice de notre traitement est moins visible qu’aux jours antérieurs. Cela est
dû à un effet inhibiteur pas assez fort pour empêcher totalement le développement tumoral.
Ces expériences ont mis en évidence l’effet inhibiteur du peptide c[RGDK] sur la croissance
tumorale. On peut ainsi observer dans les groupes traités avec ce peptide à la dose de 2
mg/jour une plus faible présence de métastases. Les poids moyens des poumons de chaque
groupe confirment l’impression visuelle. Cet effet est plus facilement observable aux jours 12
et 15 qu’aux jours 18 et 20, confirmant un ralentissement du développement des tumeurs et
non un blocage total.
Néanmoins, la tendance observée permet d’envisager des perspectives prometteuses du
peptide c[RGDK]. Une délivrance du peptide de façon plus continue permettrait une
meilleure inhibition de la croissance tumorale. Qui plus est, le peptide c[RGDK] a montré
des capacités de vectorisation. Reconduire ces expérimentations avec notre composé couplé à
une drogue cytotoxique, permettrait non seulement d’inhiber la croissance tumorale via un
effet anti-angiogénique mais aussi de détruire les cellules tumorales elles-mêmes via un effet
cytotoxique. Enfin, l’utilisation de multimères de notre peptide pourrait apporter des
bénéfices, notamment en termes de durée de vie dans l’organisme et d’affinité pour le
récepteur V3.
111
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
112
Le développement d’un agent diagnostique ou thérapeutique dans le domaine du cancer
intègre nécessairement la notion de ciblage vers les cellules tumorales elles-mêmes ou vers les
néo-vaisseaux indispensables à leur développement. Agir sur la néo-angiogénèse permet de
limiter la croissance tumorale et le développement métastatique. La spécificité des traitements
est primordiale afin de minimiser leurs effets sur les tissus sains et d’augmenter leur
efficacité.
La formation des néo-vaisseaux met en jeu des récepteurs de la surface cellulaire, notamment
ceux de la famille des intégrines. Parmi eux, le récepteur DVE3 bénéficie d’un intérêt
particulier. Impliqué dans l’adhésion, la prolifération et la migration cellulaire, il est surexprimé au niveau de ces vaisseaux en développement ce qui en fait une cible privilégiée.
Parce qu’il reconnaît de manière spécifique le tripeptide RGD lorsqu’il est présenté dans une
conformation adéquate, de nombreux laboratoires se sont penchés sur la mise au point de
peptides cycliques contenant cette séquence et la présentant dans une conformation contrainte.
Ces travaux ont aboutis au développement du pentapeptide cyclique c[RGDf(Nme)V],
nommé Cilengitide et aujourd’hui en essai clinique de phase III pour ses propriétés antiangiogéniques. L’absence de fonctions chimiques permettant sa liaison à diverses molécules
ne permet pas son utilisation en tant que vecteur, c’est pourquoi plusieurs dérivés ont été mis
au point. Les peptides c[RGDfK] et c[RGDfE], bien que moins affins pour DVE3 que le
Cilengitide (d’un facteur 10), sont ainsi largement utilisés, couplés à divers agents effecteurs
dans des buts diagnostiques ou thérapeutiques.
Notre but était la mise au point de nouveaux tétracyclopeptides RGD, antagonistes d’DVE3
capables de servir de vecteur et plus affins pour l’intégrine d’interêt que les peptides
c[RGDfE] ou c[RGDfK] de référence. L’incorporation d’un résidu lysine nous a permis de
synthétiser différents peptides cyclisés par l’intermédiaire d’un lien urée. Des tests de
cytométrie de flux nous ont permis d’évaluer leur association à différentes lignées cellulaires
exprimant DVE3 et de mettre en évidence le peptide c[RGDDK]. Dans un test d’affinité sur le
récepteur DVE3 purifié, ce peptide s’est montré deux fois plus affin que le peptide de
référence c[RGDfE]. La présence d’une fonction acide libre nous a permis de le coupler à
divers agents effecteurs. Premièrement, en le couplant à un fluorophore (la fluorescéinemaléimide), nous avons pu vérifier par microscopie de fluorescence son internalisation
médiée par le récepteur DVE3. Deuxièmement, nous l’avons couplé au peptide proapoptotique (KLAKLAK)2 via une liaison disulfure. Sur les cellules SkmeL28, sur-exprimant
l’intégrine d’intérêt, ce conjugué s’est montré capable d’être internalisé et d’induire
113
l’apoptose des cellules de façon dose-dépendante. Le conjugué contrôle, contenant la
séquence RGE s’est lui, montré incapable du moindre effet prouvant la spécificité de la
reconnaissance due au tripeptide RGD.
Le peptide c[RGDDK] a ensuite été évalué in vivo, chez la souris. Les études de
biodistribution ont montré une captation tumorale et une élimination dans la norme par
rapport à la littérature concernant ce type de peptides. Des essais de thérapies chez des souris
C57Bl6 inoculées avec des cellules de mélanomes murins B16 ont révélé une inhibition de la
formation de métastases pulmonaires pour les animaux traités avec ce peptide.
Nos travaux ont permis de mettre au point le peptide c[RGDDK], qui est plus affin pour
l’intégrine DVE3 que le peptide c[RGDfE]. Nous avons prouvé qu’il était internalisé par ce
récepteur et qu’il pouvait servir à vectoriser différents agents effecteurs à l’intérieur de
cellules exprimant cette intégrine. Par ses propriétés anti-angiogéniques, il est capable
d’inhiber la formation de métastases pulmonaires chez l’animal. Afin d’améliorer son affinité
pour DVE3 et d’accroître sa durée de vie dans l’organisme, sa multimérisation via des
systèmes MAP est en cours de réalisation au laboratoire.
Notre peptide c[RGDDK] est un antagoniste du récepteur intégrine DVE3 prometteur qui
pourrait remplacer les peptides c[RGDfE] et c[RGDfK] dans de nombreuses études. Sa
synthèse, simple et optimisée, permet de le produire en grande quantité par les méthodes
classiques de la SPPS. Sa fonction acide libre permet de le fonctionnaliser facilement et en
fait un motif de reconnaissance de choix pour la vectorisation d’agents diagnostiques ou
thérapeutiques.
Les perspectives sont la multimérisation du peptide c[RGDDK] qui devrait permettre la mise
au point de structures encore plus affines pour DVE3 ainsi que des essais de thérapie chez la
souris en vectorisant diverses drogues cytotoxiques, comme par exemple l’Apratoxine
(collaboration avec l’IBMM de Montpellier).
114
MATERIELS ET METHODES
115
Protocoles des synthèses
Matériels et equipements
Les acides aminés ND-fmoc protégés et la résine 2-chlorotrityle sont obtenus de CalbiochemNovabiochem (Merck Biosciences , Limonest, France). TBTU, HOBt et les autres réactifs et
solvants sont obtenus chez Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France).
Les analyses HPLC sont réalisées sur un équipement Waters comprenant un module de
séparation Waters 2695 et un détecteur UV-visible Waters 2996. La colonne analytique
(Kromasil 120Å 3 Pm C18 particles, 250 x 4.6 mm) a un débit d’1 mL/min et la colonne semipréparative (Kromasil 300A 15 Pm C18 particles, 25 x 4.6 mm) de 3 mL/min. avec une
mesure de l’UV à 214 nm. Le solvant A est constitué d’H2O contenant 0,1% de TFA et le
solvant B de CH3CN contenant 0,08% de TFA. Les spectres de masse SM(ESI) sont
enregistrés avec un spectromètre Micromass Platform II équipé d'une source Èlectrospray.
Les LC/ESI-MS sont effectuées en ajoutant une cartouche XTerra MS C18. Les masses haute
résolution (HRMS) ont été mesurées avec un spectromètre JEOL JMS-SX-102A en FAB
positif ou négatif. Enfin, les spectres MALDI ont été enregistrés par un spectrophotomètre
4800 Plus MALDI-TOF/TOF Proteomics Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA)
Protocole A: synthèse peptidique en phase solide. L’assemblage des peptides protégés est
realisé en stratégie fmoc manuellement dans une seringue possédant un filtre. Pour les
réactions de couplage, et par rapport au loading de la résine, 2 équiv d’acide aminé N-Dfmoc-protégés sont utilisés et activés in situ avec 2 équiv de TBTU, 2 équiv de HOBt et 4
équiv de DIEA dans le DMF (10 mL/g de résine) pendant 1h. La résine est ensuite lavée 4
fois au DMF pendant 2 min. La synthèse est contrôlée régulièrement par un test de Kaiser. Le
groupe protecteur N-D-fmoc est enlevé par action d’une solution de pipéridine/DMF (1:4) (10
mL/g de résine) pendant 5 min. Le procédé est répété 2 fois, puis la résine est lavée 4 fois au
DMF pendant 2 min.
Test de Kaiser: ce test, également appelé test ninhydrine fait intervener trios solution.
-
une solution A d’EtOH (10 mL) contenant 500 mg de ninhydrine.
116
-
une solution B d’EtOH (20 mL) contenant 80 g de phenol.
-
une solution C de pyridine (100 mL) contenant 2 mL de KCN à 1 nM.
Une goutte de solution A, deux de solution B et une goutte de solution C sont ajoutées à
quelques billes de résine puis le tout est chauffé 2 min à 100°C. La présence d’amines libres
donne une coloration bleue à la solution (test positif), alors que le maintien d’une coloration
jaune pale signifie une absence d’amines libres et par consequent un couplage peptidique
total.
Protocole B: déprotection sélective du groupement alloc. Le groupe protecteur alloc est
retiré par action sur la résine d’une solution de DCM contenant 0,2 équiv de Pd(PPH3)4 et 24
équiv de PhSiH3 (10 mL/g de résine) pendant 4h.
Protocole C: clivage des peptides de la résine 2-chlorotrityle. Les peptides synthétiques
linéaires sont obtenus directement par clivage acide de la résine à l’aide d’une solution de
AcOH/TFE/DCM (2/2/6) (10 mL/g de résine) pendant 2h. La résine est lavée 2 fois avec la
même solution pendant 10 min. La solution de clivage est récupérée et 50 volumes d’ether
sont ajoutés. Les peptides précipitent. Le mélange est centrifugé 5 min à 2000 rpm. Le culot
est repris par le volume minimum d’une solution d’H2O contenant 0,1% de TFA et mis à
lyophiliser. Les peptides sont récupérés sous forme de solides blancs, analysés par HPLC et
utilisés la plupart du temps sans purification supplémentaire.
La masse molaire des composés sous forme de sels de TFA est prise en compte. (Un sel de
TFA par amine libre, 114 mg.mol-1).
Protocoles des tests biologiques
Lignées cellulaires
HUVEC (HumanUmbelical Vein Endothéliale Cell) est une lignée de cellules endothéliales
de la veine umbélicale humaine. Ces cellules sont cultivées dans du milieu EBM2 contenant 2
% de sérum foetal bovin, des facteurs de croissance et des suppléments. Les cellules sont
117
maintenues sous à 37°C sous 5 % de CO2. Seules les cellules comprenants moins de 7
passages sont utilisées.
A549 est une lignée d’adénocarcinômes pulmonaires humains. SKmel28 est une lignée de
mélanomes humains. MCF7 est une lignée de cellules épithéliales humaines de carcinomes
mammaires. Ces 4 lignées poussent dans du milieu RPMI et sont maintenues à 37°C sous 5 %
de CO2.
La lignée B16 est une lignée de mélanomes murins. Ces cellules poussent dans du milieu
DMEM et sont également maintenues à 37°C sous 5 % de CO2.
Tests in vitro
Expression du récepteur V3 par cytométrie en flux
Les cellules en culture sont décollées au versène puis comptées. 100 000 cellules, dans un
volume de 500 μL de PBS-BSA (1 mg. mL-1), sont distribuées dans des tubes FACS (Falcon
2052). Les cellules sont lavées deux fois dans ce même tampon et centrifugées cinq minutes à
1000 tr.min-1. Le surnageant est aspiré puis le culot cellulaire est repris par 100 μL de PBSBSA contenant un anticorps monoclonal anti-V3 (LM609 ou C51/C61), utilisé à 20 μg/mL.
Les cellules sont alors incubées 2 h à 4°C. Elles sont ensuite lavées deux fois comme
précédemment avec du PBS-BSA. Après avoir aspiré le surnageant les cellules sont incubées
avec 100 μL de PBS-BSA contenant un anticorps secondaire murin marqué au FITC utilisé à
20 μg/mL, pendant 30 min à 4°C. Elles sont ensuite lavées deux fois avec du PBS et les culots
sont remis en suspension dans 600 μL de PBS et analysés au cytomètre.
Evaluation de l’affinité de peptides fluorescents pour les cellules V3 positives
Les cellules HUVEC, Skmel28, A549, ou MCF7 exprimant différents degrés du récepteur
d’intérêt, sont ensemencées dans des plaques 24 puits (50 000 cellules par puits) dans leur
milieu respectif. Après 24 h, les cellules sont rincées deux fois avec du PBS et incubées avec
600 μL de milieu frais contenant les différents peptides fluorescents à une concentration de 1
μM. Après 24 h, les cellules sont rincées deux fois avec du PBS-BSA, décollées avec du
versène, collectées, distribuées dans des tubes FACS (Falcon 2052) et centrifugées 5 min à
1000 tr.min-1. Les culots sont ensuite remis en suspension dans 600 μL de PBS et analysés au
cytomètre.
118
Microscopie de fluorescence
Les cellules HUVEC, A549 ou SkmeL28 sont ensemencées sur une lamelle LabTek 8 puits
(200 000 cellules par puits dans 400 μL de leur milieu respectif). Après 24 h, les cellules sont
rincées au PBS puis incubées à 37°C pendant 30 min avec du milieu frais contenant les
différents dérivés peptidiques fluorescents à la concentration de 5 μM. Les cellules sont
ensuites rincées deux fois avec du PBS. La lame est montée avec une lamelle et quelques
gouttes de Vectashield contenant du DAPI et laissée à sécher 30 min à l’abri de la lumière
avant observation au microscope.
Test de cytotoxicité cellulaire
Une solution de PBS contenant 2 mL de MTS et 100 μL de PMS est préparée. Les cellules
SkmeL28, MCF7 et A549 sont distribuées dans des plaques 96 puits à raison de 2000 cellules
par puits dans 100 μL de leur milieu respectif. Après 24 h, lorsque les cellules ont adhéré, on
ajoute dans les puits 100 μL de milieu frais contenant les différents composés dont la toxicité
doit être évaluée. La concentration de ces derniers varie de 10 nM à 100 μM. Des puits où 100
μL de milieu seul sont rajoutés servent de contrôle. Après 96 h d’incubation à 37°C, on ajoute
directement dans les puits 40 μL de la solution de MTS préparée et on incube à 37°C pendant
1 h. Dans une nouvelle plaque 96 puits, 150 μL de chaque puits sont transférés et la densité
optique est lue à 490 nm.
Radiomarquage de composés par la méthode iodogène
Des tubes servant au marquage doivent être préalablement préparés. L’oxydant iodogène
(1,3,4,6-tétrachloro-3a,6a-diphénylglycoluril) est dissout dans du chloroforme à une
concentration de 0,5 μg.mL-1. La solution est répartie dans des tubes en verre (2 x 6 mm) à
raison de 100 μL par tubes puis le chloroforme est évaporé sous un flux d’azote. Les tubes
ainsi préparés peuvent être conservés dans un dessicateur à TA plusieurs années.
Une solution de PBS (50 μL) contenant les composés à radiomarquer (1 mg.mL-1) est déposée
dans un tube iodogène, puis de l’iode125 ou de l’iode131, dont la quantité dépend du
marquage souhaité, est ajouté et le mélange est agité 12 min à 4°C. La réaction de iodination
est arrêtée par ajout de 100 μL de PBS contenant 1,5 mM de NaN3. Le produit radiomarqué
est ensuite purifié sur colonne de gel filtration Sephadex G10 préalablement équilibrée avec
119
du PBS-BSA (1 mg.mL-1) et éluée au PBS. Douze fractions de 500 μL sont récoltées. La
radioactivité de 10 μL de chaque fraction est comptée sur un compteur gamma (Hewlett
Packard Company, CA, USA). Les trois fractions ayant le plus fort taux de radioactivité sont
rassemblées et les activités volumiques et spécifiques sont calculées. Les produits
radiomarqués peuvent être conservés à 4°C et utilisés pendant deux semaines (en fonction de
la demie vie de l’iode 125 qui est de 60 jours).
Radiomarquage de l’échistatine par la méthode des lactopéroxidases
A une solution d’échistatine (10 μL, 1 mg.mL-1) dans du PBS, sont ajoutés dans l’ordre, de la
lactopéroxidase (10 μL, diluée à 1 U.mL-1 dans du PBS), et 3,6 mCi d’iode125. Du péroxyde
d’hydrogène (1 μL, dilué à 1/20 000 dans du PBS) est ajouté pour démarrer la réaction.
Toutes les minutes et pendant quatre minutes, 1 μL de la solution de péroxyde d’hydrogène
est ajouté. La réaction de iodination est arrêtée par ajout de 25 μL de PBS contenant 1,5 mM
de NaN3. L’échistatine radiomarquée est purifiée sur colonne de gel filtration Sephadex G10
préalablement équilibrée avec du PBS-BSA (1 mg.mL-1) et éluée au PBS. Douze fractions de
500 μL sont récoltées. La radioactivité de 10 μL de chaque fraction est comptée sur un
compteur gamma (Hewlett Packard Company, CA, USA). Les trois fractions ayant le plus fort
taux de radioactivité sont rassemblées et les activités volumiques et spécifiques sont calculées.
Les produits radiomarqués peuvent être conservés à 4°C et utilisés pendant deux semaines.
Test d’inhibition de fixation de ligand sur récepteur purifié en phase solide
L’échistatine est radiomarquée à l’iode125 par la méthode des lactopéroxidases à une activité
spécifique de 12 Ci.mmol-1. La protéine intégrine V3, purifiée à partir de placenta humain
(Chemicon International Inc., Temecula, CA), est diluée à une concentration de 500 ng.mL-1
dans du tampon de fixation [20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM
MgCl2, 1 mM MnCl2] puis distribuée à raison de 100 μl par puits dans une plaque de 96 puits
sécables (Optiplate-96 HB, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA). La plaque ainsi
préparée est incubée 10 h à 4°C. La plaque est rincée avec du tampon de blocage [20 mM Tris
(pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 % BSA] et incubée 2 h
à TA. Après deux rinçage avec le même tampon, les tests de compétition sont réalisés.
Chaque puits contient alors une concentration fixe d’échistatine radiomarquée (10 000 cpm
dans 50 μL de tampon de fixation), et des concentrations finales allant de 10-6 à 10-13 M des
120
inhibiteurs à tester dilués dans 50 μL de tampon de fixation. 100 μL de tampon de blocage
sont rajoutés dans chaque puits. Chaque condition est réalisée en triplicat. La fixation nonspécifique est définie comme étant la fixation d’échistatine radiomarquée en présence
d’échistatine non marquée (1 μM par puits). Après 3 h d’incubation à TA, la plaque est lavée
trois fois avec du tampon de blocage, puis chaque puits est séparé et la radioactivité est
comptée par un compteur gamma (Hewlett Packard Company, CA, USA).
Tests in vivo
Préparation des cellules
Les cellules d’intérêt sont décollées aux versène puis lavées deux fois dans du milieu SSAb
(RPMI 1640 avec L-Glutamine, sans sérum de veau foetal et avec antibiotiques). Les cellules
sont comptées puis remises en suspension dans du milieu SSAb à la dilution souhaitée pour
être greffées aux souris.
Greffes chez la souris
Les greffes sont réalisées en injectant 200 μL de suspension cellulaire fraîchement préparée
soit de façon sous-cutanée sur les flancs de la souris soit de façon intra-veineuse dans la queue
de la souris.
Biosdistributions
Des groupes de trois souris femelles nues sont constitués. Il y a autant de groupes que de
conditions différentes à tester. Les souris nues, âgées de quatre à six semaines, sont greffées
de façon sous-cutanée, sur les deux flancs avec deux lignées cellulaires différentes. Sur le
flanc droit elles reçoivent 2 millions de cellules SkmeL28 et sur le flanc gauche 2 millions de
cellules A549. Les souris sont utilisées pour la biodistribution lorsque le volume tumoral
atteint environ 300 mm3. La veille de l’expérimentation, 5 mL de lugol sont rajoutés par
biberon de 250 mL dans chaque groupe. A To, 10 μg de peptide c[RGDK]Y marqué à l’iode
125 aini que 10 μg de peptide c[RGEK]Y marqué à l’iode131 en solution dans 200 μL de
PBS sont injectés de façon intra-veineuse à chaque souris. Le groupe contrôle est uniquement
injecté avec 200 μL de PBS. A 15 min, 30 min, 1 h et 2 h, les souris sont sacrifiées par
121
asphyxie au CO2. Elles sont ensuite soigneusement disséquées et chaque organe est pesé puis
la radioactivité émise par ce dernier est comptée sur un compteur gamma (Hewlett Packard
Company, CA, USA). Les résultats sont exprimés en pourcentage de dose injectée par
gramme de tissu en fonction de l’organe.
Evaluation de l’activité du peptide c[RGDK] in vivo
A Jo, des souris C57Bl6 sont greffées de façon intra-veineuse avec 700 000 cellules B16.
Chaque souris est injectée tous les jours à la même heure, de façon intra-péritonéale avec soit
du PBS seul (200 μL), soit le peptide c[RGDDK] (1 ou 2 mg dilués dans 200 μL de PBS) soit
le peptide c[RGEDK] (2 mg dilués dans 200 μL de PBS). A J12, J15, J18 ou J20, les souris
sont disséquées, les poumons prélevés puis photographiés. Le poids de chaque poumon est
également mesuré.
122
H-R(pbf)-G-D(tBu)-K-OH
1
HN
HN
Le peptide linéaire 1 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (667 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A. La déprotection du groupement alloc a été effectuée en
suivant le protocole B.
Le peptide 1 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (620 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H 2N
pbf
NH
(CH2)3
H
N
O
O
COOH
(CH2)4
NH2
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 10,1 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 782,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 782,8 g.mol-1.
2
HN
HN
H 2N
pbf
COOtBu
NH
(CH2)3
H
N
O
H
N
N
H
O
O
COOH
(CH2)4
NH2
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 10,6 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 796,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 796,9 g.mol-1.
H-D(tBu)-G-R(pbf)-K-OH
3
HN
Le peptide linéaire 3 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (668 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A. La déprotection du groupement alloc a été effectuée en
suivant le protocole B.
Le peptide 3 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (619 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
N
H
H-R(pbf)-G-E(tBu)-K-OH
Le peptide linéaire 2 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (666 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A. La déprotection du groupement alloc a été effectuée en
suivant le protocole B.
Le peptide 2 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (616 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
COOtBu
O
H2N
HN
COOtBu
O
H
N
O
pbf
NH
N
H
(CH2)3
H
N
O
COOH
(CH2)4
NH2
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 12,0 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 782,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 782,9 g.mol-1.
123
H-E(tBu)-G-R(pbf)-K-OH
4
HN
COOtBu
HN
Le peptide linéaire 4 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (665 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A. La déprotection du groupement alloc a été effectuée en
suivant le protocole B.
Le peptide 4 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (613 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
H2N
O
N
H
(CH2)3
H
N
O
COOH
(CH2)4
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 11,0 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 796,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 796,8 g.mol-1.
5
H
N
fmoc
O
OH
NH
O
O
Rendement : 75 %..
HPLC : Rt = 20,3 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 542,5 g.mol-1.
Masse trouvée = 452,2 g.mol-1.
H-R(pbf)-G-D(tBu)-K-OH
6
HN
Le peptide linéaire 6 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (660 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole A
en utilisant l’acide aminé 5 comme acide aminé Cterminal. La déprotection du groupement alloc a été
effectuée en suivant le protocole B.
Le peptide 6 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (608 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
NH
O
NH2
Alloc-Lys(fmoc)-OH
4,94 mmol de H-Lys(Fmoc)-OH sont dissoutes dans 48
mL d’H2O et 32 mL de dioxane. 24 mmol de Na2CO3 (5
éq.) sont dissoutes dans la solution à 0°C sous agitation.
5,54 mmol d’allylchloroformate (1,1 éq.) diluées dans 16
mL de dioxane sont ajoutées, sur 15 min. Après retour à
température ambiante, le mélange est agité overnight. Le
dioxane est évaporé. Le mélange est extrait avec Et2O
(3x50 mL). La phase aqueuse est acidifiée avec HCl 1N.
Formation d’un précipité blanc. Extraction à l’acétate
d’éthyle (3x50 mL). Après séchage sur MgSO4 et
évaporation du solvent, le produit est récupéré sous forme
de solide blanc et ne nécessite pas d’être purifié.
pbf
HN
H2N
pbf
NH
(CH2)3
H
N
O
COOtBu
H2N
O
COOH
(CH2)4
N
H
NH
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 8,5 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 782,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 782,5 g.mol-1.
124
H-R(pbf)-G-E(tBu)-K-OH
7
HN
Le peptide linéaire 7 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (660 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole A
en utilisant l’acide aminé 5 comme acide aminé Cterminal. La déprotection du groupement alloc a été
effectuée en suivant le protocole B.
Le peptide 7 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (612 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
HN
pbf
NH
H2N
H2N
COOtBu
(CH2)3
H
N
O
(CH2)2 (CH2)4
NH
N
H
O
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 10,1 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 796,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 796,9 g.mol-1.
H-D(tBu)-G-R(pbf)-K-OH
8
HN
Le peptide linéaire 8 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (669 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole A
en utilisant l’acide aminé 5 comme acide aminé Cterminal. La déprotection du groupement alloc a été
effectuée en suivant le protocole B.
Le peptide 8 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (613 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
COOtBu
O
H
N
H2N
pbf
H2N
NH
HN
COOH
(CH2)3(CH2)4
NH
N
H
O
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 11,7 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 782,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 782,8 g.mol-1.
H-E(tBu)-G-R(pbf)-K-OH
9
HN
COOtBu
Le peptide linéaire 9 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (669 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole A
en utilisant l’acide aminé 5 comme acide aminé Cterminal. La déprotection du groupement alloc a été
effectuée en suivant le protocole B.
Le peptide 9 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (613 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
COOH
H
N
H2N
O
pbf
H2N
NH
HN
O
COOH
(CH2)3 (CH2)4
N
H
NH
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 14,6 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 796,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 796,8 g.mol-1.
125
c[R(pbf)-G-D(tBu)-K]-OH
10
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 1 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 10 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
O
O
NH
O
tBu
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 14,9 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 808,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 808,3 g.mol-1.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-K]-OH
11
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 2 (40 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 11 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
O
NH
O
tBu
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 15,3 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 822,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 822,7 g.mol-1.
126
c[D(tBu)-G-R(pbf)-K]-OH
12
O
tBu
O
Le peptide linéaire 3 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 12 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
HN
O
H
N
pbf
NH
NH
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 15,9 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 808,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 808,5 g.mol-1.
c[E(tBu)-G-R(pbf)-K]-OH
13
tBu
O
Le peptide linéaire 4 (40 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 13 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
O
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
HN
H
N
pbf
NH
NH
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 16,0 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 822,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 822,8 g.mol-1.
127
c[R(pbf)-G-D(tBu)-K]-OH
14
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 6 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 14 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
HO
NH
O
O
NH
O
O
O
O
tBu
NH
Rendement : quantitatif
HPLC : Rt = 17,0 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 808,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 808,9 g.mol-1.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-K]-OH
15
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 7 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 15 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
HO
O
NH
O
O
O
NH
tBu
O
Rendement : quantitatif
HPLC : Rt = 17,7 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 822,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 822,8 g.mol-1.
c[D(tBu)-G-R(pbf)-K]-OH
16
O
Le peptide linéaire 8 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 16 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
NH
O
tBu
O
H
N
HN
O
HO
NH
O
O
NH
O
O
HN
H
N
pbf
NH
NH
Rendement : quantitatif
HPLC : Rt = 16,9 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 808,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 808,9 g.mol-1.
128
c[E(tBu)-G-R(pbf)-K]-OH
17
tBu
O
O
Le peptide linéaire 9 (39 mg, 50 μmol) est dissout dans 20
mL d’un mélange DCM/DMF (1/1). Le pH est ajusté à 8-9
par ajout de DIEA et la solution est agitée à TA pendant 10
min. Du CDI (8,9 mg, 55 μmol) en solution dans 20 mL de
DCM est ajouté gouttes à gouttes et le mélange est agité à
50°C pendant 2h. Après évaporation du solvent, le produit
brut est obtenu sous forme d’huile jaune. Il est récupéré
par precipitation dans 50 mL d’un mélange ether/acetone
(1/1). Le procédé est répété trois fois puis le peptide 17 est
ressuspendu dans de l’eau et lyophilisé. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
HN
O
HO
O
NH
O
NH
O
O
H
N
HN
pbf
NH
NH
Rendement : quantitatif
HPLC : Rt = 19,4 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 822,9 g.mol-1.
Masse trouvée = 822,9 g.mol-1.
H2N-(CH2)2-S-Npys
18
N
Une solution d’acide formique (100 mL) contenant de la
cystéamine (1 g, 8,8 mmol) est agitée à TA. On ajoute du
chlorure de 3-nitro-2-pyridinesulphényle (1,84 g, 9,7
mmol). Après 72h, le produit désiré est précipité par ajout
de 800 mL d’éther. Le produit 18 est purifié par
recristalisation dans un mélange MeOH/éther (1/1).
S
H2N
S
NO2
Rendement : 68 %.
HPLC : Rt = 5,6 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 231,3 g.mol-1.
Masse trouvée = 231,3 g.mol-1.
c[R-G-D-K]-OH
19
HN
NH2
NH
Le peptide cyclique 10 (161 mg, 200 μmol) est dissout
dans 2 mL d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5).
Le mélange est agité 24h à TA.Le peptide 19 est récupéré
par precipitation à l’éther (30 mL) puis centrifugation. Ce
procédé est répété quatre fois. Le produit est alors dissout
dans de l’eau puis lyophilize. Il est obtenu sous forme de
poudre blanche.
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
O
O
OH
NH
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 2,4 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (TOF-MS-ES+)
Masse calculée = 500,5 g.mol-1.
Masse trouvée = 500,3 g.mol-1.
129
c[R-G-E-K]-OH
20
HN
NH2
NH
Le peptide cyclique 11 (164 mg, 201 μmol) est dissout
dans 2 mL d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5).
Le mélange est agité 24h à TA.Le peptide 20 est récupéré
par precipitation à l’éther (30 mL) puis centrifugation. Ce
procédé est répété quatre fois. Le produit est alors dissout
dans de l’eau puis lyophilize. Il est obtenu sous forme de
poudre blanche.
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
O
OH
NH
O
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 2,3 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (TOF-MS-ES+)
Masse calculée = 514,5 g.mol-1.
Masse trouvée = 514,2 g.mol-1.
c[D-G-R-K]-OH
21
OH
O
H
N
HN
Le peptide cyclique 12 (160 mg, 200 μmol) est dissout
dans 2 mL d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5).
Le mélange est agité 24h à TA.Le peptide 21 est récupéré
par precipitation à l’éther (30 mL) puis centrifugation. Ce
procédé est répété quatre fois. Le produit est alors dissout
dans de l’eau puis lyophilize. Il est obtenu sous forme de
poudre blanche.
O
O
NH
O
NH
HN
O
NH2
NH
NH
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 2,3 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (TOF-MS-ES+)
Masse calculée = 500,5 g.mol-1.
Masse trouvée = 500,2 g.mol-1.
c[E-G-R-K]-OH
22
OH
O
H
N
HN
Le peptide cyclique 13 (160 mg, 200 μmol) est dissout
dans 2 mL d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5).
Le mélange est agité 24h à TA.Le peptide 22 est récupéré
par precipitation à l’éther (30 mL) puis centrifugation. Ce
procédé est répété quatre fois. Le produit est alors dissout
dans de l’eau puis lyophilize. Il est obtenu sous forme de
poudre blanche.
O
NH
O
O
NH
O
HN
NH2
NH
NH
O
OH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 2,4 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (TOF-MS-ES+)
Masse calculée = 514,5 g.mol-1.
Masse trouvée = 514,3 g.mol-1.
130
c[R(pbf)-G-D(tBu)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
23
H
N
HN
pbf
NH
H
N
HN
O
NH
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 10
(40 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
O
O
NH
O
O
O
NH
O
tBu
NH
S
S
O2N
N
Rendement : 96 %.
HPLC : Rt = 21,7 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
24
H
N
HN
pbf
NH
H
N
HN
O
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 11
(41 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
NH
O
O
NH
O
O
NH
O
tBu
O
NH
S
O2N
S
N
Rendement : 97 %.
HPLC : Rt = 21,9 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
131
c[D(tBu)-G-R(pbf)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
25
O
tBu
O
H
N
HN
O
O
NH
O
O
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 12
(40 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
H
N
HN
NH
pbf
NH
NH
O
NH
S
S
O2N
N
Rendement : 94 %.
HPLC : Rt = 21,6 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[E(tBu)-G-R(pbf)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
26
tBu
O
O
H
N
HN
O
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 13
(41 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
NH
O
O
HN
NH
O
H
N
pbf
NH
NH
O
NH
S
O2N
S
N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 21,9 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
132
c[R(pbf)-G-D(tBu)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
27
H
N
HN
pbf
NH
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 14
(40 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
O
O
tBu
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 94 %.
HPLC : Rt = 23,4 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
28
H
N
HN
pbf
NH
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 15
(41 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
O
NH
tBu
O
S
S
N
O2N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 23,8 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
133
c[D(tBu)-G-R(pbf)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
29
O
tBu
O
H
N
HN
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 16
(40 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
O
O
O
NH
O
NH
O
HN
H
N
HN
pbf
NH
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 23,1 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[E(tBu)-G-R(pbf)-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
30
tBu
O
O
H
N
HN
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 17
(41 mg, 50 μmol) sont ajoutés le compose 18 (13 mg, 55
μmol), du BOP (24 mg, 55 μmol) et de la DIEA (17 μL,
100 μmol). Le mélange est agité 2h à TA. Le produit
desiré est obtenu après precipitation par ajout d’eau (10
mL) puis centrifugation. Le procédé est répété quatre fois
pour donner le produit desiré sous forme de poudre jaune
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
HN
H
N
pbf
NH
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 96 %.
HPLC : Rt = 23,5 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
134
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
31
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
O
O
Le peptide 23 (49 mg, 48 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
OH
NH
O
NH
S
S
O2N
N
Rendement : 94 %.
HPLC : Rt = 9,8 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 713,8 g.mol-1.
Masse trouvée = 713,6 g.mol-1.
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
32
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
NH
Le peptide 24 (49 mg, 48 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
NH
O
OH
NH
O
O
NH
S
O2N
S
N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 9,9 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 727,8 g.mol-1.
Masse trouvée = 727,3 g.mol-1.
135
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
33
OH
O
H
N
HN
O
O
NH
O
HN
NH
O
NH2
NH
NH
Le peptide 25 (45 mg, 46 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
NH
S
S
O2N
N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 9,5 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 713,8 g.mol-1.
Masse trouvée = 713,2 g.mol-1.
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
34
HO
O
H
N
HN
O
NH
O
O
HN
NH
O
Le peptide 26 (47 mg, 47 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
NH2
NH
NH
O
NH
S
O2N
S
N
Rendement : 98 %.
HPLC : Rt = 10,1 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 727,8 g.mol-1.
Masse trouvée = 727,4 g.mol-1.
136
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
35
HN
NH2
NH
H
N
HN
Le peptide 27 (32 mg, 32 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
O
NH
O
O
NH
O
O
HN
OH
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 97 %.
HPLC : Rt = 9,5 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
36
HN
NH2
NH
H
N
HN
Le peptide 28 (27 mg, 27 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
O
O
NH
O
NH
O
HN
OH
NH
O
S
S
N
O2N
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 9,5 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : N.D.
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
37
OH
O
H
N
HN
Le peptide 29 (31 mg, 31 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
HN
NH2
NH
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 94 %.
HPLC : Rt = 9,6 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : N.D.
137
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
38
HO
O
H
N
HN
Le peptide 30 (28 mg, 28 μmol) est dissout dans 1 mL
d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5). La solution
est agitée 4h à TA puis 10 mL d’éther sont ajoutés. Le
produit desiré précipite et est récupéré par centrifugation.
Le procédé est répété quatre fois puis le peptide est
solubilisé dans de l’eau, lyophilisé et récupéré sous forme
de poudre jaune.
O
O
O
NH
O
NH2
HN
NH
O
NH
HN
NH
S
S
N
O2N
Rendement : 98 %.
HPLC : Rt = 9,7 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
39
HN
NH2
NH
Le peptide 31 (32 mg, 45 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 39 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
O
O
OH
NH
O
NH
SH
Rendement : 93 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 559,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 559,6 g.mol-1.
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
40
HN
NH2
NH
Le peptide 32 (32 mg, 44 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 40 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
OH
NH
O
O
NH
SH
Rendement : 90 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 573,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 573,6 g.mol-1.
138
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
41
OH
O
Le peptide 33 (30 mg, 44 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 41 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
Le peptide 34 (33 mg, 45 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 42 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
H
N
HN
O
O
NH
O
NH2
HN
NH
O
NH
NH
O
NH
SH
Rendement : 95 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 559,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 559,4 g.mol-1.
42
HO
O
H
N
HN
O
NH
O
O
NH2
HN
NH
O
NH
NH
O
NH
SH
Rendement : 94 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 573,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 573,2 g.mol-1.
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
43
HN
NH2
NH
Le peptide 35 (32 mg, 45 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 43 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
O
OH
NH
SH
Rendement : 97 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 559,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 559,6 g.mol-1.
139
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
44
HN
NH2
NH
Le peptide 36 (30 mg, 43 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 44 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
H
N
HN
O
O
O
NH
HN
OH
O
SH
Rendement : 95 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 573,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 573,6 g.mol-1.
45
OH
O
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
HN
O
HN
NH2
NH
NH
SH
Rendement : 96 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 559,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 559,4 g.mol-1.
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
Le peptide 38 (33 mg, 45 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 46 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
NH
NH
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-SH
Le peptide 37 (32 mg, 44 μmol) est dissout dans 500 μL
d’une solution de CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA
puis Bu3P (10 μL, 40 μmol) est ajouté. La solution est
agitée 30 min puis refroidie à -80°C et lyophilisée sans
traitement supplémentaire. Le produit brut est récupéré
sous forme de poudre blanche par précipitation après ajout
d’1 mL d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété
quatre fois et le peptide 45 est conservé à -80°C pour éviter
toute oxidation. Il est utilisé sans purification
supplémentaire.
O
O
46
O
HO
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
HN
NH2
NH
NH
SH
Rendement : 92 %.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 573,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 573,2 g.mol-1.
140
Fluorescéine-maléimide
47
O
Une solution d’AcOH (50 mL) contenant de la
fluorescéine-amine (isomère I, 0,5 mmol), est ajouté de
l’anhydride maléique (0,5 mmol). Le mélange est agité 4h
à TA. N-(5-fluorescéinyl)maléamique acide précipite
durant sa formation. Il est filtré, lavé avec EtOAc (100
mL), séché et utilisé sans purification. A une solution de
benzène/DMF (9/1, 30 mL) contenant l’intermédiaire N(5-fluorescéinyl)maléamique et ZnCl2 (1 mmol), est ajouté
HMDS (2 mmol). Le mélange est agité à reflux pendant 3
h. Après retour à TA, la mixture est filtré et le filtrat
concentré sous pression réduite. 50 mL d’H2O sont ajoutés
et la phase aqueuse est acidifiée jusqu’à pH 6 par ajout
d’HCl 0,1 N. En refroidissant, fluorescéine-maléimide est
obtenu sous forme de solide orange.
N
O
O
O
OH
O
HO
Rendement : 87 %.
HPLC : Rt = 16,9 min (C18, 214 nm,
20-60%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 427,4 g.mol-1.
Masse trouvée = 427,4 g.mol-1.
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
48
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
O
OH
NH
Le peptide 39 (22 mg, 40 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
O
NH
S
O
N
O
O
O
HO
O
OH
Rendement : 40 %.
HPLC : Rt = 15,1 min (C18, 214 nm, 0100%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 987,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 986,4 g.mol-1.
141
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
49
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
NH
O
NH
O
OH
NH
Le peptide 40 (22 mg, 38 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
O
O
NH
S
O
N
O
O
O
HO
OH
O
Rendement : 35 %.
HPLC : Rt = 15,0 min (C18, 214 nm, 0100%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1001,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 1001,2 g.mol-1.
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
50
OH
O
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
HN
NH2
NH
NH
O
Le peptide 41 (22 mg, 39 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
NH
S
O
N
O
O
O
HO
O
OH
Rendement : 50 %.
HPLC : Rt = 14,9 min (C18, 214 nm, 0100%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 987,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 987,2 g.mol-1.
142
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
51
HO
O
H
N
HN
O
NH
O
O
NH2
HN
NH
O
NH
NH
O
Le peptide 42 (23 mg, 40 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
NH
S
O
N
O
O
O
OH
O
HO
Rendement : 47 %.
HPLC : Rt = 15,0 min (C18, 214 nm, 0100%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1001,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 1001,2 g.mol-1.
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
52
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
Le peptide 43 (22 mg, 40 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
O
OH
NH
S
O
N
O
O
O
HO
O
OH
Rendement : 43 %.
HPLC : Rt = 13,2 min (C18, 214 nm,
25-50%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 987,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 987,0 g.mol-1.
143
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
53
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
O
NH
O
NH
O
HN
Le peptide 44 (23 mg, 40 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
OH
NH
O
S
O
N
O
O
O
OH
O
HO
Rendement : 45 %.
HPLC : Rt = 12,9 min (C18, 214 nm,
25-50%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1001,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 1001,2 g.mol-1.
c[D-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
54
OH
O
H
N
HN
O
O
NH
O
O
NH
O
HN
Le peptide 45 (23 mg, 40 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
HN
NH2
NH
NH
S
O
N
O
O
O
HO
O
OH
Rendement : 51 %.
HPLC : Rt = 9,6 min (C18, 214 nm, 2550%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 987,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 987,2 g.mol-1.
144
c[E-G-R-K]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
55
HO
O
H
N
HN
O
O
NH
O
O
HN
Le peptide 46 (22 mg, 38 μmol) est dissout dans 160 μL de
tampon Tris HCl (pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO
(40 μL) contenant de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg,
40 μmol) est ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le
produit desiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis
lyophilisé et récupéré sous forme de poudre orange.
NH2
HN
NH
O
NH
NH
S
O
N
O
O
O
OH
O
HO
Rendement : 52 %.
HPLC : Rt = 12,8 min (C18, 214 nm,
25-50%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1001,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 1001,2 g.mol-1.
H-D(tBu)-f-E(alloc)-R(pbf)-G-OH
56
COOalloc
COOtBu
Le peptide linéaire 56 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (330 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A.
Le peptide 56 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (377 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
H2N
O
N
H
O
O
O
H
N
(CH2)3
HN
NH
pbf
OH
O
NH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 9,9 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : N.D.
H-E(tBu)-f-E(alloc)-R(pbf)-G-OH
57
COOalloc
COOtBu
Le peptide linéaire 57 a été synthétisé sur résine
chlorotrityle (330 mg, 1,2 mmol.g-1) d’après le protocole
A.
Le peptide 57 est libéré de la résine en suivant le protocole
C et obtenu sous forme de poudre blanche (382 mg) après
précipitations et lavages à l’ether. Il est utilisé sans
purification supplémentaire.
H
N
H
N
H2N
O
O
N
H
H
N
O
O
H
N
(CH2)3
HN
NH
pbf
OH
O
NH
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 10,5 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
145
c[R(pbf)-G-D(tBu)-f-E(alloc)]
58
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 56 (377 mg, 397 μmol) est dissout dans
du DMF (400 μL). BOP (177 mg, 400 μmol) et DIEA (175
μL, 1 mmol) sont ajoutés et le mélange est agité 24 h.
Le produit est concentré sous pression réduite puis
précipité par ajout d’H2O (30 mL). Après centrifugation et
séchage sous vacuum, le produit 58 est récupéré sous
forme de solide blanc.
H
N
O
NH
O
O
NH
O
H
N
N
H
allocCOO
O
tBu
O
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 16,8 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-f-E(alloc)]
59
H
N
HN
pbf
NH
Le peptide linéaire 57 (382 mg, 396 μmol) est dissout dans
du DMF (400 μL). BOP (177 mg, 400 μmol) et DIEA (175
μL, 1 mmol) sont ajoutés et le mélange est agité 24 h.
Le produit est concentré sous pression réduite puis
précipité par ajout d’H2O (30 mL). Après centrifugation et
séchage sous vacuum, le produit 59 est récupéré sous
forme de solide blanc.
H
N
O
NH
O
O
NH
O
H
N
N
H
allocCOO
O
tBu
O
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 17,5 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-D(tBu)-f-E]
60
H
N
HN
pbf
NH
H
N
O
NH
O
O
Le peptide 60 est obtenu en traitant le peptide 58 (361 mg,
390 μmol) suivant le protocole B.
HOOC
N
H
O
NH
H
N
O
O
tBu
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 12,2 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
146
c[R(pbf)-G-E(tBu)-f-E]
61
H
N
HN
pbf
NH
H
N
NH
O
O
O
Le peptide 61 est obtenu en traitant le peptide 59 (366 mg,
390 μmol) suivant le protocole B.
NH
O
H
N
N
H
HOOC
O
tBu
O
O
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = 12,5 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-D(tBu)-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
62
H
N
HN
pbf
NH
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 60
(343 mg, 388 μmol) sont ajoutés le dérivé 18 (92 mg, 400
μmol), du BOP (177 mg, 400 μmol) et de la DIEA (175
μL, 1 mmol). La solution est agitée 2 h à TA puis le
produit brut est précipité par ajout d’H2O (20 mL) puis
centrifugé. Le procédé est répété quatre fois pour donner le
produit attendu sous forme de solide jaune qui peut être
utilisé sans autre purification.
H
N
NH
O
O
O
N
H
O
O
NH
H
N
O
O
tBu
O
NH
NO2
S
S
N
Rendement : 88 %.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
c[R(pbf)-G-E(tBu)-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
63
H
N
HN
pbf
NH
A une solution de DMF (500 μL) contenant le peptide 61
(346 mg, 385 μmol) sont ajoutés le dérivé 18 (92 mg, 400
μmol), du BOP (177 mg, 400 μmol) et de la DIEA (175
μL, 1 mmol). La solution est agitée 2 h à TA puis le
produit brut est précipité par ajout d’H2O (20 mL) puis
centrifugé. Le procédé est répété quatre fois pour donner le
produit attendu sous forme de solide jaune qui peut être
utilisé sans autre purification.
H
N
O
NH
O
O
N
H
O
O
NH
O
H
N
O
tBu
O
NH
NO2
S
S
N
Rendement : 92 %.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
147
c[R-G-D-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
64
HN
NH2
NH
H
N
NH
O
Le peptide 64 est obtenu après traitement du peptide 62 par
une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5) pendant 16 h à
TA. Il est ensuite récupéré par précipitation à l’éther puis
centrifugation. Le procédé est répété quatre fois.
O
O
NH
O
H
N
N
H
O
O
OH
O
NH
NO2
S
S
N
Rendement : quantitatif.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
c[R-G-E-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-Npys
65
HN
NH2
NH
H
N
NH
O
Le peptide 65 est obtenu après traitement du peptide 63 par
une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5) pendant 16 h à
TA. Il est ensuite récupéré par précipitation à l’éther puis
centrifugation. Le procédé est répété quatre fois.
O
O
O
N
H
O
NH
OH
H
N
O
O
NH
NO2
S
S
N
Rendement : quantitatif.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
c[R-G-D-f-E]-CO-NH-(CH2)2-SH
66
HN
NH2
NH
Le peptide 64 est dissout dans 500 μL d’une solution de
CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA puis Bu3P (10 μL,
40 μmol) est ajouté. La solution est agitée 30 min puis
refroidie à -80°C et lyophilisée sans traitement
supplémentaire. Le produit brut est récupéré sous forme de
poudre blanche par précipitation après ajout d’1 mL
d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété quatre
fois et le peptide 66 est conservé à -80°C pour éviter toute
oxidation. Il est utilisé sans purification supplémentaire.
H
N
O
NH
O
O
N
H
O
O
NH
H
N
O
OH
O
NH
HS
Rendement : N.D.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
148
c[R-G-E-f-E]-CO-NH-(CH2)2-SH
67
HN
NH2
NH
Le peptide 65 est dissout dans 500 μL d’une solution de
CH3CN/H2O (1/1) sous agitation à TA puis Bu3P (10 μL,
40 μmol) est ajouté. La solution est agitée 30 min puis
refroidie à -80°C et lyophilisée sans traitement
supplémentaire. Le produit brut est récupéré sous forme de
poudre blanche par précipitation après ajout d’1 mL
d’éther puis centrifugation. Le procédé est répété quatre
fois et le peptide 67 est conservé à -80°C pour éviter toute
oxidation. Il est utilisé sans purification supplémentaire.
H
N
NH
O
O
O
NH
OH
H
N
N
H
O
O
O
O
NH
HS
Rendement : N.D.
HPLC : N.D.
MS : N.D.
c[R-G-D-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
68
HN
NH2
NH
H
N
O
NH
O
O
Le peptide 66 est dissout dans 160 μL de tampon Tris HCl
(pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO (40 μL) contenant
de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg, 40 μmol) est
ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le produit desiré
est directement purifié par RP-HPLC semi-préparative
(C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis lyophilisé et
récupéré sous forme de poudre orange.
N
H
O
O
NH
H
N
O
OH
O
NH
O
S
N
O
O
O
HO
O
OH
Rendement : 60 %.
HPLC : Rt = 14,4 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1091,0 g.mol-1.
Masse trouvée = 1091,1 g.mol-1.
149
c[R-G-E-f-E]-CO-NH-(CH2)2-S-FM
69
HN
NH2
NH
H
N
NH
O
O
O
Le peptide 67 est dissout dans 160 μL de tampon Tris HCl
(pH 7, 0,1 M). Une solution de DMSO (40 μL) contenant
de la fluorescéine-maléimide 47 (17 mg, 40 μmol) est
ajoutée et le mélange est agité 2 h à TA. Le produit desiré
est directement purifié par RP-HPLC semi-préparative
(C18, 214 nm, 20-60 % B en 20 min) puis lyophilisé et
récupéré sous forme de poudre orange.
N
H
O
O
NH
OH
H
N
O
O
NH
O
S
N
O
O
O
HO
OH
O
Rendement : 58 %.
HPLC : Rt = 16,0 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 1105,1 g.mol-1.
Masse trouvée = 1105,1 g.mol-1.
c[R-G-D-f-E]
70
HN
NH2
NH
H
N
Le peptide 60 est dissout dans 1 mL de TFA/TIPS/H2O et
agité 16 h à TA. Le produit désiré est récupéré par
précipitation à l’éther puis centrifugation. Le procédé est
répété quatre fois. Le peptide 70 est purifié par RP-HPLC
semi-préparative (C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min)
puis lyophilisé.
O
NH
O
O
O
N
H
O
NH
O
H
N
OH
O
HO
Rendement : quantitatif.
HPLC : N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 604,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 604,6 g.mol-1.
c[R-G-E-f-E]
71
HN
NH2
NH
H
N
Le peptide 61 est dissout dans 1 mL de TFA/TIPS/H2O et
agité 16 h à TA. Le produit désiré est récupéré par
précipitation à l’éther puis centrifugation. Le procédé est
répété quatre fois. Le peptide 71 est purifié par RP-HPLC
semi-préparative (C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min)
puis lyophilisé.
O
NH
O
O
O
N
H
O
NH
OH
H
N
O
O
HO
Rendement : quantitatif.
HPLC : Rt = N.D.
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 618,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 618,6 g.mol-1.
150
c[R-G-D-K]-Y-OH
72
HN
NH2
NH
H
N
HN
A une solution de DMF (250 μL) contenant le peptide 10
(4,5 mg, 5,6 μmol) sont ajoutés, de l’H-Y(tBu)-OtBu (2
mg, 6 μmol), du BOP (3,5 mg, 8 μmol) et de la DIEA (4,4
μL, 25 μmol) et on agite 2 h à TA. On ajoute 2 mL d’H2O,
il se forme un précipité. On centrifuge et le culot est lavé
quatre fois à l’H2O. Le solide obtenu est séché au
lyophilisateur puis solubilisé dans 200 μL d’une solution
de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5) et agité 4 h à TA. Le
produit 72 est récupéré par précipitation à l’éther et
centrifugation puis purifié par RP-HPLC semi-préparative
(C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min) et lyophilisé.
O
NH
O
O
NH
O
O
OH
NH
O
NH
OH
O
OH
Rendement : 80 %.
HPLC : Rt = 10,1 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 663,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 664,0 g.mol-1.
c[R-G-E-K]-Y-OH
73
HN
NH2
NH
A une solution de DMF (250 μL) contenant le peptide 11
(4,5 mg, 5,6 μmol) sont ajoutés, de l’H-Y(tBu)-OtBu (2
mg, 6 μmol), du BOP (3,5 mg, 8 μmol) et de la DIEA (4,4
μL, 25 μmol) et on agite 2 h à TA. On ajoute 2 mL d’H2O,
il se forme un précipité. On centrifuge et le culot est lavé
quatre fois à l’H2O. Le solide obtenu est séché au
lyophilisateur puis solubilisé dans 200 μL d’une solution
de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5) et agité 4 h à TA. Le
produit 73 est récupéré par précipitation à l’éther et
centrifugation puis purifié par RP-HPLC semi-préparative
(C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min) et lyophilisé.
H
N
HN
O
NH
O
O
NH
O
OH
NH
O
O
NH
OH
O
OH
Rendement : 85 %.
HPLC : Rt = 11,2 min (C18, 214 nm,
30-70%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 677,7 g.mol-1.
Masse trouvée = 677,8 g.mol-1.
151
H-Y-R-G-D-K-OH
74
H-Y-R-G-D-K-OH
Le peptide 74 est assemblé sue résine RINK AMIDE
suivant le protocole A.
Rendement : 95 %.
HPLC : Rt = 8,9 min (C18, 214 nm, 3070%B en 20 min).
MS : (ESI-MS)
Masse calculée = 637,4 g.mol-1.
Masse trouvée = 637,4 g.mol-1.
H-CGGKLAKLAKKLAKLAK-OH
75
Le peptide 75 (300 mg, 172 μmol) est assemblé sur résine
RINK AMIDE (280 mg, 0,6 mmol.g-1) suivant le protocole
A. Il est relargué de la résine par traitement avec une
solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/5/2,5) pendant 24 h, puis
précipité quatre fois à l’éther et centrifugé. Il est ensuite
ressuspendu dans de l’H2O et lyophilisé. Il est concervé à 20°C pour éviter toute oxydation.
H-CGG-(KLAKLAK)2-OH
Rendement : 90 %.
HPLC : Rt = 14,4 min (C18, 214 nm,
10-80%B en 20 min).
MS : (MALDI-TOF)
Masse calculée = 1740,1 g.mol-1.
Masse trouvée = 1740,1 g.mol-1.
c[R-G-D-K]-CO-NH-(CH2)2-S-S-CGG(KLAKLAK)2-OH
76
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
O
NH
A une solution de DMF (30 μL) contenant le peptide 31
(7,2 mg, 10 μmol) on ajoute une solution de tampon
phosphate (10 μL, pH 5, 0,1 M) contenant le peptide 75
(17,4 mg, 10 μmol). Le mélange est agité 1h à TA. Le
produit désiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min) puis
lyophilisé pour donner une poudre blanche.
O
NH
O
O
OH
NH
O
NH
S
S
CGG-(KLAKLAK)2-OH
Rendement : 30 %.
HPLC : Rt = 14,1 min (C18, 214 nm,
10-80%B en 20 min).
MS : (MALDI-TOF)
Masse calculée = 2298,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 2298,5 g.mol-1.
152
c[R-G-E-K]-CO-NH-(CH2)2-S-S-CGG(KLAKLAK)2-OH
77
HN
NH2
NH
H
N
HN
O
NH
A une solution de DMF (30 μL) contenant le peptide 32
(7,2 mg, 10 μmol) on ajoute une solution de tampon
phosphate (10 μL, pH 5, 0,1 M) contenant le peptide 75
(17,4 mg, 10 μmol). Le mélange est agité 1h à TA. Le
produit désiré est directement purifié par RP-HPLC semipréparative (C18, 214 nm, 10-80 % B en 20 min) puis
lyophilisé pour donner une poudre blanche.
O
O
NH
O
OH
NH
O
O
NH
S
S
CGG-(KLAKLAK)2-OH
Rendement : 22 %.
HPLC : Rt = 14,1 min (C18, 214 nm,
10-80%B en 20 min).
MS : (MALDI-TOF)
Masse calculée = 2312,6 g.mol-1.
Masse trouvée = 2312,3 g.mol-1.
153
BIBLIOGRAPHIE
154
1.
Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971;285:
1182-6.
2.
Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch
during tumorigenesis. Cell 1996;86: 353-64.
3.
Bergers G, Benjamin LE. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer
2003;3: 401-10.
4.
D'Andrea LD, Del Gatto A, Pedone C, Benedetti E. Peptide-based molecules in
angiogenesis. Chem Biol Drug Des 2006;67: 115-26.
5.
Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast
cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.
Science 1987;235: 177-82.
6.
Cai W, Chen X. Anti-angiogenic cancer therapy based on integrin alphavbeta3
antagonism. Anticancer Agents Med Chem 2006;6: 407-28.
7.
Luo BH, Springer TA. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin
Cell Biol 2006;18: 579-86.
8.
Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 2002;110: 673-
87.
9.
Lu X, Lu D, Scully MF, Kakkar VV. Integrins in drug targeting-RGD templates in
toxins. Curr Pharm Des 2006;12: 2749-69.
10.
Xiong JP, Stehle T, Diefenbach B, et al. Crystal structure of the extracellular segment
of integrin alpha Vbeta3. Science 2001;294: 339-45.
11.
Xiong JP, Stehle T, Zhang R, et al. Crystal structure of the extracellular segment of
integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science 2002;296: 151-5.
12.
Luo BH, Carman CV, Springer TA. Structural basis of integrin regulation and
signaling. Annu Rev Immunol 2007;25: 619-47.
13.
Xiong JP, Stehle T, Goodman SL, Arnaout MA. New insights into the structural basis
of integrin activation. Blood 2003;102: 1155-9.
14.
Gupta V, Gylling A, Alonso JL, et al. The beta-tail domain (betaTD) regulates
physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood 2007;109: 3513-20.
15.
Zhu J, Boylan B, Luo BH, Newman PJ, Springer TA. Tests of the extension and
deadbolt models of integrin activation. J Biol Chem 2007;282: 11914-20.
16.
Brooks PC, Clark RA, Cheresh DA. Requirement of vascular integrin alpha v beta 3
for angiogenesis. Science 1994;264: 569-71.
155
17.
Brooks PC, Montgomery AM, Rosenfeld M, et al. Integrin alpha v beta 3 antagonists
promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 1994;79:
1157-64.
18.
Brooks PC. Role of integrins in angiogenesis. Eur J Cancer 1996;32A: 2423-9.
19.
Stromblad S, Becker JC, Yebra M, Brooks PC, Cheresh DA. Suppression of p53
activity and p21WAF1/CIP1 expression by vascular cell integrin alphaVbeta3 during
angiogenesis. J Clin Invest 1996;98: 426-33.
20.
Sheu JR, Lin CH, Peng HC, Huang TF. Triflavin, an Arg-Gly-Asp-containing peptide,
inhibits the adhesion of tumor cells to matrix proteins via binding to multiple integrin
receptors expressed on human hepatoma cells. Proc Soc Exp Biol Med 1996;213: 71-9.
21.
Nicosia RF, Bonanno E, Smith M. Fibronectin promotes the elongation of
microvessels during angiogenesis in vitro. J Cell Physiol 1993;154: 654-61.
22.
Brooks PC, Stromblad S, Klemke R, Visscher D, Sarkar FH, Cheresh DA.
Antiintegrin alpha v beta 3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human
skin. J Clin Invest 1995;96: 1815-22.
23.
Haier J, Goldmann U, Hotz B, Runkel N, Keilholz U. Inhibition of tumor progression
and neoangiogenesis using cyclic RGD-peptides in a chemically induced colon carcinoma in
rats. Clin Exp Metastasis 2002;19: 665-72.
24.
Hynes RO. A reevaluation of integrins as regulators of angiogenesis. Nat Med 2002;8:
918-21.
25.
Plow EF, Haas TA, Zhang L, Loftus J, Smith JW. Ligand binding to integrins. J Biol
Chem 2000;275: 21785-8.
26.
Ruoslahti E, Hayman EG, Engvall E, Cothran WC, Butler WT. Alignment of
biologically active domains in the fibronectin molecule. J Biol Chem 1981;256: 7277-81.
27.
Pierschbacher MD, Ruoslahti E, Sundelin J, Lind P, Peterson PA. The cell attachment
domain of fibronectin. Determination of the primary structure. J Biol Chem 1982;257: 95937.
28.
Klebe RJ. Isolation of a collagen-dependent cell attachment factor. Nature 1974;250:
248-51.
29.
Pearlstein E. Plasma membrane glycoprotein which mediates adhesion of fibroblasts
to collagen. Nature 1976;262: 497-500.
30.
Pierschbacher M, Hayman EG, Ruoslahti E. Synthetic peptide with cell attachment
activity of fibronectin. Proc Natl Acad Sci U S A 1983;80: 1224-7.
156
31.
Cheresh DA, Harper JR. Arg-Gly-Asp recognition by a cell adhesion receptor requires
its 130-kDa alpha subunit. J Biol Chem 1987;262: 1434-7.
32.
Cheresh DA, Spiro RC. Biosynthetic and functional properties of an Arg-Gly-Asp-
directed receptor involved in human melanoma cell attachment to vitronectin, fibrinogen, and
von Willebrand factor. J Biol Chem 1987;262: 17703-11.
33.
Cheresh DA. Human endothelial cells synthesize and express an Arg-Gly-Asp-
directed adhesion receptor involved in attachment to fibrinogen and von Willebrand factor.
Proc Natl Acad Sci U S A 1987;84: 6471-5.
34.
Pierschbacher MD, Ruoslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be
duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature 1984;309: 30-3.
35.
Pierschbacher MD, Ruoslahti E. Influence of stereochemistry of the sequence Arg-
Gly-Asp-Xaa on binding specificity in cell adhesion. J Biol Chem 1987;262: 17294-8.
36.
Pierschbacher MD, Ruoslahti E. Variants of the cell recognition site of fibronectin that
retain attachment-promoting activity. Proc Natl Acad Sci U S A 1984;81: 5985-8.
37.
Gehlsen KR, Argraves WS, Pierschbacher MD, Ruoslahti E. Inhibition of in vitro
tumor cell invasion by Arg-Gly-Asp-containing synthetic peptides. J Cell Biol 1988;106: 92530.
38.
Gurrath M, Muller G, Kessler H, Aumailley M, Timpl R. Conformation/activity
studies of rationally designed potent anti-adhesive RGD peptides. Eur J Biochem 1992;210:
911-21.
39.
Tranqui L, Andrieux A, Hudry-Clergeon G, et al. Differential structural requirements
for fibrinogen binding to platelets and to endothelial cells. J Cell Biol 1989;108: 2519-27.
40.
Weisshoff H, Prasang C, Henklein P, Frommel C, Zschunke A, Mugge C. Mimicry of
beta II'-turns of proteins in cyclic pentapeptides with one and without D-amino acids. Eur J
Biochem 1999;259: 776-88.
41.
Jurka J, Smith TF. Beta-turn-driven early evolution: the genetic code and biosynthetic
pathways. J Mol Evol 1987;25: 15-9.
42.
Pfaff M, Tangemann K, Muller B, et al. Selective recognition of cyclic RGD peptides
of NMR defined conformation by alpha IIb beta 3, alpha V beta 3, and alpha 5 beta 1
integrins. J Biol Chem 1994;269: 20233-8.
43.
Hautanen A, Gailit J, Mann DM, Ruoslahti E. Effects of modifications of the RGD
sequence and its context on recognition by the fibronectin receptor. J Biol Chem 1989;264:
1437-42.
157
44.
Haubner R, Gratias R, Diefenbach B, Goodman SL, Jonczyk A, Kessler H. Structural
and functional aspects of RGD containing cyclic pentapeptides as highly and selective
integrin alphaVbeta3 antagonists. J Am Chem Soc 1996;118: 7461-72.
45.
Wermuth J, Goodman SL, Jonczyk A, Kessler H. Stereoisomerism and biological
activity of the selective and superactive alphaVbeta3 integrin inhibitor cyclo(-RGDfV-) and
ints retro-inverso peptide. J Am Chem Soc 1997;119: 1328-35.
46.
Dechantsreiter MA, Planker E, Matha B, et al. N-Methylated cyclic RGD peptides as
highly active and selective alpha(V)beta(3) integrin antagonists. J Med Chem 1999;42: 303340.
47.
West ML, Fairlie DP. Targeting HIV-1 protease: a test of drug-design methodologies.
Trends Pharmacol Sci 1995;16: 67-75.
48.
Cody WL, He JX, Reily MD, et al. Design of a potent combined pseudopeptide
endothelin-A/endothelin-B receptor antagonist, Ac-DBhg16-Leu-Asp-Ile-[NMe]Ile-Trp21
(PD 156252): examination of its pharmacokinetic and spectral properties. J Med Chem
1997;40: 2228-40.
49.
Biron E, Chatterjee J, Ovadia O, et al. Improving oral bioavailability of peptides by
multiple N-methylation: somatostatin analogues. Angew Chem Int Ed Engl 2008;47: 2595-9.
50.
Chatterjee J, Ovadia O, Zahn G, et al. Multiple N-methylation by a designed approach
enhances receptor selectivity. J Med Chem 2007;50: 5878-81.
51.
Rajeswaran WG, Hocart SJ, Murphy WA, Taylor JE, Coy DH. N-Methyl scan of
somatostatin octapeptide agonists produces interesting effects on receptor subtype specificity.
J Med Chem 2001;44: 1416-21.
52.
Wormser U, Laufer R, Hart Y, Chorev M, Gilon C, Selinger Z. Highly selective
agonists for substance P receptor subtypes. Embo J 1986;5: 2805-8.
53.
Belvisi L, Riccioni T, Marcellini M, et al. Biological and molecular properties of a
new alpha(v)beta3/alpha(v)beta5 integrin antagonist. Mol Cancer Ther 2005;4: 1670-80.
54.
Marinelli L, Lavecchia A, Gottschalk KE, Novellino E, Kessler H. Docking studies on
alphavbeta3 integrin ligands: pharmacophore refinement and implications for drug design. J
Med Chem 2003;46: 4393-404.
55.
Taga T, Suzuki A, Gonzalez-Gomez I, et al. alpha v-Integrin antagonist EMD 121974
induces apoptosis in brain tumor cells growing on vitronectin and tenascin. Int J Cancer
2002;98: 690-7.
158
56.
Burke PA, DeNardo SJ, Miers LA, Lamborn KR, Matzku S, DeNardo GL. Cilengitide
targeting of alpha(v)beta(3) integrin receptor synergizes with radioimmunotherapy to increase
efficacy and apoptosis in breast cancer xenografts. Cancer Res 2002;62: 4263-72.
57.
Eskens FA, Dumez H, Hoekstra R, et al. Phase I and pharmacokinetic study of
continuous twice weekly intravenous administration of Cilengitide (EMD 121974), a novel
inhibitor of the integrins alphavbeta3 and alphavbeta5 in patients with advanced solid
tumours. Eur J Cancer 2003;39: 917-26.
58.
Ervin GN, Mosher JT, Birkemo LS, Johnson MF. Multiple, small doses of
cholecystokinin octapeptide are more efficacious at inducing taste aversion conditioning than
single, large doses. Peptides 1995;16: 539-45.
59.
Nabors LB, Mikkelsen T, Rosenfeld SS, et al. Phase I and correlative biology study of
cilengitide in patients with recurrent malignant glioma. J Clin Oncol 2007;25: 1651-7.
60.
MacDonald TJ, Stewart CF, Kocak M, et al. Phase I clinical trial of cilengitide in
children with refractory brain tumors: Pediatric Brain Tumor Consortium Study PBTC-012. J
Clin Oncol 2008;26: 919-24.
61.
Smith JW. Cilengitide Merck. Curr Opin Investig Drugs 2003;4: 741-5.
62.
Reardon DA, Nabors LB, Stupp R, Mikkelsen T. Cilengitide: an integrin-targeting
arginine-glycine-aspartic acid peptide with promising activity for glioblastoma multiforme.
Expert Opin Investig Drugs 2008;17: 1225-35.
63.
Medina MA, Munoz-Chapuli R, Quesada AR. Challenges of antiangiogenic cancer
therapy: trials and errors, and renewed hope. J Cell Mol Med 2007;11: 374-82.
64.
Jain RK. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new
paradigm for combination therapy. Nat Med 2001;7: 987-9.
65.
Jain RK. Antiangiogenic therapy for cancer: current and emerging concepts. Oncology
(Williston Park) 2005;19: 7-16.
66.
Raguse JD, Gath HJ, Bier J, Riess H, Oettle H. Cilengitide (EMD 121974) arrests the
growth of a heavily pretreated highly vascularised head and neck tumour. Oral Oncol
2004;40: 228-30.
67.
Friess H, Langrehr JM, Oettle H, et al. A randomized multi-center phase II trial of the
angiogenesis inhibitor Cilengitide (EMD 121974) and gemcitabine compared with
gemcitabine alone in advanced unresectable pancreatic cancer. BMC Cancer 2006;6: 285.
68.
Gasparini G, Longo R, Fanelli M, Teicher BA. Combination of antiangiogenic therapy
with other anticancer therapies: results, challenges, and open questions. J Clin Oncol 2005;23:
1295-311.
159
69.
Maubant S, Saint-Dizier D, Boutillon M, et al. Blockade of alpha v beta3 and alpha v
beta5 integrins by RGD mimetics induces anoikis and not integrin-mediated death in human
endothelial cells. Blood 2006;108: 3035-44.
70.
Marinelli L, Gottschalk KE, Meyer A, Novellino E, Kessler H. Human integrin
alphavbeta5: homology modeling and ligand binding. J Med Chem 2004;47: 4166-77.
71.
Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F, Yamashita K, Eboshida A. Distinct structural
requirements for binding of the integrins alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1
and alpha9beta1 to osteopontin. Matrix Biol 2005;24: 418-27.
72.
Haubner R, Finsinger D, Kessler H. Stereoisomeric peptide libraries and
peptidomimetics for designing selective inhibitors of the DvE3 integrin for a new cancer
therapy. Angew Chem Int Ed Eng 1997;36: 1374-89.
73.
Belvisi L, Bernardi A, Colombo M, et al. Targeting integrins: insights into structure
and activity of cyclic RGD pentapeptide mimics containing azabicycloalkane amino acids.
Bioorg Med Chem 2006;14: 169-80.
74.
Casiraghi G, Rassu G, Auzzas L, et al. Grafting aminocyclopentane carboxylic acids
onto the RGD tripeptide sequence generates low nanomolar alphaVbeta3/alphaVbeta5
integrin dual binders. J Med Chem 2005;48: 7675-87.
75.
Zanardi F, Burreddu P, Rassu G, et al. Discovery of subnanomolar arginine-glycine-
aspartate-based alphaVbeta3/alphaVbeta5 integrin binders embedding 4-aminoproline
residues. J Med Chem 2008;51: 1771-82.
76.
Garcia AJ, Schwarzbauer JE, Boettiger D. Distinct activation states of alpha5beta1
integrin show differential binding to RGD and synergy domains of fibronectin. Biochemistry
2002;41: 9063-9.
77.
Takagi J, Petre BM, Walz T, Springer TA. Global conformational rearrangements in
integrin extracellular domains in outside-in and inside-out signaling. Cell 2002;110: 599-11.
78.
Curnis F, Longhi R, Crippa L, et al. Spontaneous formation of L-isoaspartate and gain
of function in fibronectin. J Biol Chem 2006;281: 36466-76.
79.
Robinson NE, Robinson ZW, Robinson BR, et al. Structure-dependent nonenzymatic
deamidation of glutaminyl and asparaginyl pentapeptides. J Pept Res 2004;63: 426-36.
80.
Spitaleri A, Mari S, Curnis F, et al. Structural basis for the interaction of isoDGR with
the RGD-binding site of alphavbeta3 integrin. J Biol Chem 2008;283: 19757-68.
81.
Curnis F, Sacchi A, Gasparri A, et al. Isoaspartate-glycine-arginine: a new tumor
vasculature-targeting motif. Cancer Res 2008;68: 7073-82.
160
82.
Khalili P, Arakelian A, Chen G, et al. A non-RGD-based integrin binding peptide
(ATN-161) blocks breast cancer growth and metastasis in vivo. Mol Cancer Ther 2006;5:
2271-80.
83.
Donate F, Parry GC, Shaked Y, et al. Pharmacology of the novel antiangiogenic
peptide ATN-161 (Ac-PHSCN-NH2): observation of a U-shaped dose-response curve in
several preclinical models of angiogenesis and tumor growth. Clin Cancer Res 2008;14: 213744.
84.
Wu Z, Li ZB, Chen K, et al. microPET of tumor integrin alphavbeta3 expression using
18F-labeled PEGylated tetrameric RGD peptide (18F-FPRGD4). J Nucl Med 2007;48: 153644.
85.
Marugan JJ, Manthey C, Anaclerio B, et al. Design, synthesis, and biological
evaluation of novel potent and selective alphavbeta3/alphavbeta5 integrin dual inhibitors with
improved bioavailability. Selection of the molecular core. J Med Chem 2005;48: 926-34.
86.
Carron CP, Meyer DM, Pegg JA, et al. A peptidomimetic antagonist of the integrin
alpha(v)beta3 inhibits Leydig cell tumor growth and the development of hypercalcemia of
malignancy. Cancer Res 1998;58: 1930-5.
87.
Kumar CC, Malkowski M, Yin Z, et al. Inhibition of angiogenesis and tumor growth
by SCH221153, a dual alpha(v)beta3 and alpha(v)beta5 integrin receptor antagonist. Cancer
Res 2001;61: 2232-8.
88.
Goodman SL, Holzemann G, Sulyok GA, Kessler H. Nanomolar small molecule
inhibitors for alphav(beta)6, alphav(beta)5, and alphav(beta)3 integrins. J Med Chem
2002;45: 1045-51.
89.
Marugan JJ, Haslow KD, Crysler C. Design, synthesis, and biochemical evaluation of
novel alpha V beta 3 integrin ligands. Bioorg Med Chem Lett 2004;14: 4553-5.
90.
Raboisson P, Manthey CL, Chaikin M, et al. Novel potent and selective
alphavbeta3/alphavbeta5 integrin dual antagonists with reduced binding affinity for human
serum albumin. Eur J Med Chem 2006;41: 847-61.
91.
Mao H, Hajduk PJ, Craig R, Bell R, Borre T, Fesik SW. Rational design of diflunisal
analogues with reduced affinity for human serum albumin. J Am Chem Soc 2001;123: 1042935.
92.
Wilkinson-Berka JL, Jones D, Taylor G, et al. SB-267268, a nonpeptidic antagonist of
alpha(v)beta3 and alpha(v)beta5 integrins, reduces angiogenesis and VEGF expression in a
mouse model of retinopathy of prematurity. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47: 1600-5.
161
93.
Reichert JM, Valge-Archer VE. Development trends for monoclonal antibody cancer
therapeutics. Nat Rev Drug Discov 2007;6: 349-56.
94.
Weiner LM. Building better magic bullets--improving unconjugated monoclonal
antibody therapy for cancer. Nat Rev Cancer 2007;7: 701-6.
95.
Yokota T, Milenic DE, Whitlow M, Schlom J. Rapid tumor penetration of a single-
chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res 1992;52: 3402-8.
96.
Schlom J, Eggensperger D, Colcher D, et al. Therapeutic advantage of high-affinity
anticarcinoma radioimmunoconjugates. Cancer Res 1992;52: 1067-72.
97.
Doolittle ND, Peereboom DM, Christoforidis GA, et al. Delivery of chemotherapy and
antibodies across the blood-brain barrier and the role of chemoprotection, in primary and
metastatic brain tumors: report of the Eleventh Annual Blood-Brain Barrier Consortium
meeting. J Neurooncol 2007;81: 81-91.
98.
Tucker GC. Integrins: molecular targets in cancer therapy. Curr Oncol Rep 2006;8:
96-103.
99.
Gutheil JC, Campbell TN, Pierce PR, et al. Targeted antiangiogenic therapy for cancer
using Vitaxin: a humanized monoclonal antibody to the integrin alphavbeta3. Clin Cancer Res
2000;6: 3056-61.
100.
Posey JA, Khazaeli MB, DelGrosso A, et al. A pilot trial of Vitaxin, a humanized anti-
vitronectin receptor (anti alpha v beta 3) antibody in patients with metastatic cancer. Cancer
Biother Radiopharm 2001;16: 125-32.
101.
Patel SR, Jenkins J, Papadopolous N, et al. Pilot study of vitaxin--an angiogenesis
inhibitor-in patients with advanced leiomyosarcomas. Cancer 2001;92: 1347-8.
102.
Roque-Navarro L, Mateo C, Lombardero J, et al. Humanization of predicted T-cell
epitopes reduces the immunogenicity of chimeric antibodies: new evidence supporting a
simple method. Hybrid Hybridomics 2003;22: 245-57.
103.
Wu H, Beuerlein G, Nie Y, et al. Stepwise in vitro affinity maturation of Vitaxin, an
alphav beta3-specific humanized mAb. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95: 6037-42.
104.
Cai W, Wu Y, Chen K, Cao Q, Tice DA, Chen X. In vitro and In vivo
Characterization of 64Cu-Labeled AbegrinTM, a Humanized Monoclonal Antibody against
Integrin {alpha}v{beta}3. Cancer Res 2006;66: 9673-81.
105.
McNeel DG, Eickhoff J, Lee FT, et al. Phase I trial of a monoclonal antibody specific
for alphavbeta3 integrin (MEDI-522) in patients with advanced malignancies, including an
assessment of effect on tumor perfusion. Clin Cancer Res 2005;11: 7851-60.
162
106.
Delbaldo C, Raymond E, Vera K, et al. Phase I and pharmacokinetic study of
etaracizumab (Abegrin), a humanized monoclonal antibody against alphavbeta3 integrin
receptor, in patients with advanced solid tumors. Invest New Drugs 2008;26: 35-43.
107.
Trikha M, Zhou Z, Nemeth JA, et al. CNTO 95, a fully human monoclonal antibody
that inhibits alphav integrins, has antitumor and antiangiogenic activity in vivo. Int J Cancer
2004;110: 326-35.
108.
Ning S, Nemeth JA, Hanson RL, Forsythe K, Knox SJ. Anti-integrin monoclonal
antibody CNTO 95 enhances the therapeutic efficacy of fractionated radiation therapy in vivo.
Mol Cancer Ther 2008;7: 1569-78.
109.
Mullamitha SA, Ton NC, Parker GJ, et al. Phase I evaluation of a fully human anti-
alphav integrin monoclonal antibody (CNTO 95) in patients with advanced solid tumors. Clin
Cancer Res 2007;13: 2128-35.
110.
Reynolds LE, Wyder L, Lively JC, et al. Enhanced pathological angiogenesis in mice
lacking beta3 integrin or beta3 and beta5 integrins. Nat Med 2002;8: 27-34.
111.
Anisimov VN, Ukraintseva SV, Yashin AI. Cancer in rodents: does it tell us about
cancer in humans? Nat Rev Cancer 2005;5: 807-19.
112.
Kamb A. What's wrong with our cancer models? Nat Rev Drug Discov 2005;4: 161-5.
113.
Finkle D, Quan ZR, Asghari V, et al. HER2-targeted therapy reduces incidence and
progression of midlife mammary tumors in female murine mammary tumor virus huHER2transgenic mice. Clin Cancer Res 2004;10: 2499-511.
114.
Jung KH, Lee KH, Paik JY, et al. Favorable biokinetic and tumor-targeting properties
of 99mTc-labeled glucosamino RGD and effect of paclitaxel therapy. J Nucl Med 2006;47:
2000-7.
115.
Jia B, Liu Z, Shi J, et al. Linker effects on biological properties of 111In-labeled
DTPA conjugates of a cyclic RGDfK dimer. Bioconjug Chem 2008;19: 201-10.
116.
Haubner R, Wester HJ, Weber WA, et al. Noninvasive imaging of alpha(v)beta3
integrin expression using 18F-labeled RGD-containing glycopeptide and positron emission
tomography. Cancer Res 2001;61: 1781-5.
117.
Chen X, Hou Y, Tohme M, et al. Pegylated Arg-Gly-Asp peptide: 64Cu labeling and
PET imaging of brain tumor alphavbeta3-integrin expression. J Nucl Med 2004;45: 1776-83.
118.
Jeong JM, Hong MK, Chang YS, et al. Preparation of a promising angiogenesis PET
imaging agent: 68Ga-labeled c(RGDyK)-isothiocyanatobenzyl-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7triacetic acid and feasibility studies in mice. J Nucl Med 2008;49: 830-6.
163
119.
Haubner R, Wester HJ, Burkhart F, et al. Glycosylated RGD-containing peptides:
tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. J Nucl Med
2001;42: 326-36.
120.
Hallahan DE, Geng L, Cmelak AJ, et al. Targeting drug delivery to radiation-induced
neoantigens in tumor microvasculature. J Control Release 2001;74: 183-91.
121.
Haubner R, Wester HJ, Reuning U, et al. Radiolabeled alpha(v)beta3 integrin
antagonists: a new class of tracers for tumor targeting. J Nucl Med 1999;40: 1061-71.
122.
Chen X, Park R, Hou Y, et al. microPET and autoradiographic imaging of GRP
receptor expression with 64Cu-DOTA-[Lys3]bombesin in human prostate adenocarcinoma
xenografts. J Nucl Med 2004;45: 1390-7.
123.
Decristoforo C, Hernandez Gonzalez I, Carlsen J, et al. 68Ga- and 111In-labelled
DOTA-RGD peptides for imaging of alphavbeta3 integrin expression. Eur J Nucl Med Mol
Imaging 2008;35: 1507-15.
124.
Beer AJ, Lorenzen S, Metz S, et al. Comparison of integrin alphaVbeta3 expression
and glucose metabolism in primary and metastatic lesions in cancer patients: a PET study
using 18F-galacto-RGD and 18F-FDG. J Nucl Med 2008;49: 22-9.
125.
Mammen M, Chio SK, Whitesides GM. Polyvalent interactions in biological systems:
implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed
Engl 1998;37: 2755-94.
126.
Hato T, Pampori N, Shattil SJ. Complementary roles for receptor clustering and
conformational change in the adhesive and signaling functions of integrin alphaIIb beta3. J
Cell Biol 1998;141: 1685-95.
127.
Kramer RH, Karpen JW. Spanning binding sites on allosteric proteins with polymer-
linked ligand dimers. Nature 1998;395: 710-3.
128.
Cairo CW, Gestwicki JE, Kanai M, Kiessling LL. Control of multivalent interactions
by binding epitope density. J Am Chem Soc 2002;124: 1615-9.
129.
Owen RM, Carlson CB, Xu J, Mowery P, Fasella E, Kiessling LL. Bifunctional
Ligands that Target Cells Displaying the alpha(v)beta(3) Integrin. Chembiochem 2006;8: 6882.
130.
Gestwicki JE, Cairo CW, Strong LE, Oetjen KA, Kiessling LL. Influencing receptor-
ligand binding mechanisms with multivalent ligand architecture. J Am Chem Soc 2002;124:
14922-33.
164
131.
Ni J, Powell R, Baskakov IV, DeVico A, Lewis GK, Wang LX. Synthesis,
conformation, and immunogenicity of monosaccharide-centered multivalent HIV-1 gp41
peptides containing the sequence of DP178. Bioorg Med Chem 2004;12: 3141-8.
132.
Li H, Wang LX. Cholic acid as template for multivalent peptide assembly. Org
Biomol Chem 2003;1: 3507-13.
133.
Liu S, Hsieh WY, Jiang Y, et al. Evaluation of a (99m)Tc-labeled cyclic RGD
tetramer for noninvasive imaging integrin alpha(v)beta3-positive breast cancer. Bioconjug
Chem 2007;18: 438-46.
134.
Cheng Z, Wu Y, Xiong Z, Gambhir SS, Chen X. Near-infrared fluorescent RGD
peptides for optical imaging of integrin alphavbeta3 expression in living mice. Bioconjug
Chem 2005;16: 1433-41.
135.
Li ZB, Cai W, Cao Q, et al. (64)Cu-labeled tetrameric and octameric RGD peptides
for small-animal PET of tumor alpha(v)beta(3) integrin expression. J Nucl Med 2007;48:
1162-71.
136.
Dijkgraaf I, Kruijtzer JA, Liu S, et al. Improved targeting of the alpha(v)beta (3)
integrin by multimerisation of RGD peptides. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2006.
137.
Janssen ML, Oyen WJ, Dijkgraaf I, et al. Tumor targeting with radiolabeled
alpha(v)beta(3) integrin binding peptides in a nude mouse model. Cancer Res 2002;62: 614651.
138.
Dijkgraaf I, Liu S, Kruijtzer JA, et al. Effects of linker variation on the in vitro and in
vivo characteristics of an (111)In-labeled RGD peptide. Nucl Med Biol 2007;34: 29-35.
139.
Wu Y, Cai W, Chen X. Near-Infrared Fluorescence Imaging of Tumor Integrin
alpha(v)beta (3) Expression with Cy7-Labeled RGD Multimers. Mol Imaging Biol 2006.
140.
Boturyn D, Coll JL, Garanger E, Favrot MC, Dumy P. Template assembled
cyclopeptides as multimeric system for integrin targeting and endocytosis. J Am Chem Soc
2004;126: 5730-9.
141.
Dumy P, Eggleston IM, Esposito G, Nicula S, Mutter M. Solution structure of
regioselectively addressable functionalized templates: an NMR and restrained molecular
dynamics investigation. Biopolymers 1996;39: 297-308.
142.
Garanger E, Boturyn D, Jin Z, Dumy P, Favrot MC, Coll JL. New multifunctional
molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Mol Ther 2005;12:
1168-75.
143.
Foillard S, Jin ZH, Garanger E, et al. Synthesis and biological characterisation of
targeted pro-apoptotic peptide. Chembiochem 2008;9: 2326-32.
165
144.
Jin ZH, Josserand V, Foillard S, et al. In vivo optical imaging of integrin alphaV-beta3
in mice using multivalent or monovalent cRGD targeting vectors. Mol Cancer 2007;6: 41.
145.
Sancey L, Ardisson V, Riou LM, et al. In vivo imaging of tumour angiogenesis in
mice with the alpha(v)beta (3) integrin-targeted tracer (99m)Tc-RAFT-RGD. Eur J Nucl Med
Mol Imaging 2007.
146.
Garanger E, Boturyn D, Coll JL, Favrot MC, Dumy P. Multivalent RGD synthetic
peptides as potent alpha(V)beta(3) integrin ligands. Org Biomol Chem 2006;4: 1958-65.
147.
Foillard S, Rasmussen MO, Razkin J, Boturyn D, Dumy P. 1-Ethoxyethylidene, a new
group for the stepwise SPPS of aminooxyacetic acid containing peptides. J Org Chem
2008;73: 983-91.
148.
Tam JP. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density
multiple antigenic peptide system. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: 5409-13.
149.
Lo-Man R, Bay S, Vichier-Guerre S, Deriaud E, Cantacuzene D, Leclerc C. A fully
synthetic immunogen carrying a carcinoma-associated carbohydrate for active specific
immunotherapy. Cancer Res 1999;59: 1520-4.
150.
Thumshirn G, Hersel U, Goodman SL, Kessler H. Multimeric cyclic RGD peptides as
potential tools for tumor targeting: solid-phase peptide synthesis and chemoselective oxime
ligation. Chemistry 2003;9: 2717-25.
151.
Schraa AJ, Kok RJ, Moorlag HE, et al. Targeting of RGD-modified proteins to tumor
vasculature: a pharmacokinetic and cellular distribution study. Int J Cancer 2002;102: 469-75.
152.
Schraa AJ, Kok RJ, Berendsen AD, et al. Endothelial cells internalize and degrade
RGD-modified proteins developed for tumor vasculature targeting. J Control Release
2002;83: 241-51.
153.
Schraa AJ, Kok RJ, Botter SM, et al. RGD-modified anti-CD3 antibodies redirect
cytolytic capacity of cytotoxic T lymphocytes toward alphavbeta3-expressing endothelial
cells. Int J Cancer 2004;112: 279-85.
154.
Couvreur P, Barratt G, Fattal E, Legrand P, Vauthier C. Nanocapsule technology: a
review. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2002;19: 99-134.
155.
Couvreur P, Vauthier C. Nanotechnology: intelligent design to treat complex disease.
Pharm Res 2006;23: 1417-50.
156.
Cheong I, Huang X, Thornton K, Diaz LA, Jr., Zhou S. Targeting cancer with bugs
and liposomes: ready, aim, fire. Cancer Res 2007;67: 9605-8.
157.
Russ V, Wagner E. Cell and tissue targeting of nucleic acids for cancer gene therapy.
Pharm Res 2007;24: 1047-57.
166
158.
Montet X, Funovics M, Montet-Abou K, Weissleder R, Josephson L. Multivalent
effects of RGD peptides obtained by nanoparticle display. J Med Chem 2006;49: 6087-93.
159.
Torchilin VP. Targeted pharmaceutical nanocarriers for cancer therapy and imaging.
Aaps J 2007;9: E128-47.
160.
Karathanasis E, Chan L, Balusu SR, et al. Multifunctional nanocarriers for
mammographic quantification of tumor dosing and prognosis of breast cancer therapy.
Biomaterials 2008.
161.
Peer D, Karp JM, Hong S, Farokhzad OC, Margalit R, Langer R. Nanocarriers as an
emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol 2007;2: 751-60.
162.
Lee HY, Li Z, Chen K, et al. PET/MRI dual-modality tumor imaging using arginine-
glycine-aspartic (RGD)-conjugated radiolabeled iron oxide nanoparticles. J Nucl Med
2008;49: 1371-9.
163.
Lieleg O, Lopez-Garcia M, Semmrich C, Auernheimer J, Kessler H, Bausch AR.
Specific integrin labeling in living cells using functionalized nanocrystals. Small 2007;3:
1560-5.
164.
Smith BR, Cheng Z, De A, Koh AL, Sinclair R, Gambhir SS. Real-Time Intravital
Imaging of RGD-Quantum Dot Binding to Luminal Endothelium in Mouse Tumor
Neovasculature. Nano Lett 2008;8: 2599-606.
165.
Nasongkla N, Shuai X, Ai H, et al. cRGD-functionalized polymer micelles for
targeted doxorubicin delivery. Angew Chem Int Ed Engl 2004;43: 6323-7.
166.
Bibby DC, Talmadge JE, Dalal MK, et al. Pharmacokinetics and biodistribution of
RGD-targeted doxorubicin-loaded nanoparticles in tumor-bearing mice. Int J Pharm
2005;293: 281-90.
167.
Patil RR, Guhagarkar SA, Devarajan PV. Engineered nanocarriers of doxorubicin: a
current update. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2008;25: 1-61.
168.
Tugulu S, Silacci P, Stergiopulos N, Klok HA. RGD-Functionalized polymer brushes
as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.
Biomaterials 2007;28: 2536-46.
169.
Yamada KM, Aota S, Akiyama SK, LaFlamme SE. Mechanisms of fibronectin and
integrin function during cell adhesion and migration. Cold Spring Harb Symp Quant Biol
1992;57: 203-12.
170.
Dedhar S, Hannigan GE. Integrin cytoplasmic interactions and bidirectional
transmembrane signalling. Curr Opin Cell Biol 1996;8: 657-69.
167
171.
Maheshwari G, Brown G, Lauffenburger DA, Wells A, Griffith LG. Cell adhesion and
motility depend on nanoscale RGD clustering. J Cell Sci 2000;113 ( Pt 10): 1677-86.
172.
Gestwicki JE, Strong LE, Kiessling LL. Tuning chemotactic responses with synthetic
multivalent ligands. Chem Biol 2000;7: 583-91.
173.
Kalinina S, Gliemann H, Lopez-Garcia M, et al. Isothiocyanate-functionalized RGD
peptides for tailoring cell-adhesive surface patterns. Biomaterials 2008;29: 3004-13.
174.
Marko K, Ligeti M, Mezo G, et al. A novel synthetic peptide polymer with cyclic
RGD motifs supports serum-free attachment of anchorage-dependent cells. Bioconjug Chem
2008;19: 1757-66.
175.
Maddikeri RR, Tosatti S, Schuler M, et al. Reduced medical infection related bacterial
strains adhesion on bioactive RGD modified titanium surfaces: a first step toward cell
selective surfaces. J Biomed Mater Res A 2008;84: 425-35.
176.
Blummel J, Perschmann N, Aydin D, et al. Protein repellent properties of covalently
attached PEG coatings on nanostructured SiO(2)-based interfaces. Biomaterials 2007;28:
4739-47.
177.
Le Guillou-Buffello D, Bareille R, Gindre M, Sewing A, Laugier P, Amedee J.
Additive effect of RGD coating to functionalized titanium surfaces on human osteoprogenitor
cell adhesion and spreading. Tissue Eng Part A 2008;14: 1445-55.
178.
Dijkgraaf I, Kruijtzer JA, Frielink C, et al. Synthesis and biological evaluation of
potent alpha(v)beta(3)-integrin receptor antagonists. Nucl Med Biol 2006;33: 953-61.
179.
Merrifield RB. Solid-Phase Peptide Synthesis. 3. An Improved Synthesis of
Bradykinin. Biochemistry 1964;3: 1385-90.
180.
Merrifield RB. Solid-phase peptide synthesis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol
1969;32: 221-96.
181.
Meienhofer J, Waki M, Heimer EP, Lambros TJ, Makofske RC, Chang CD. Solid
phase synthesis without repetitive acidolysis. Preparation of leucyl-alanyl-glycyl-valine using
9-fluorenylmethyloxycarbonylamino acids. Int J Pept Protein Res 1979;13: 35-42.
182.
Manning M. Synthesis by the Merrifield method of a protected nonapeptide amide
with the amino acid sequence of oxytocin. J Am Chem Soc 1968;90: 1348-9.
183.
Barlos K, Chatzi O, Gatos D, Stavropoulos G. 2-Chlorotrityl chloride resin. Studies on
anchoring of Fmoc-amino acids and peptide cleavage. Int J Pept Protein Res 1991;37: 513-20.
184.
Barlos K, Gatos D, Kutsogianni S, Papaphotiou G, Poulos C, Tsegenidis T. Solid
phase synthesis of partially protected and free peptides containing disulphide bonds by
168
simultaneous cysteine oxidation-release from 2-chlorotrityl resin. Int J Pept Protein Res
1991;38: 562-8.
185.
Chang CD, Meienhofer J. Solid-phase peptide synthesis using mild base cleavage of N
alpha-fluorenylmethyloxycarbonylamino
acids,
exemplified
by
a
synthesis
of
dihydrosomatostatin. Int J Pept Protein Res 1978;11: 246-9.
186.
Kates SA, Daniels SB, Albericio F. Automated allyl cleavage for continuous-flow
synthesis of cyclic and branched peptides. Anal Biochem 1993;212: 303-10.
187.
Kaiser E, Colescott RL, Bossinger CD, Cook PI. Color test for detection of free
terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem 1970;34: 5958.
188.
Mezo G, Mihala N, Andreu D, Hudecz F. Conjugation of epitope peptides with SH
group to branched chain polymeric polypeptides via Cys(Npys). Bioconjug Chem 2000;11:
484-91.
189.
Reddy PY. Efficient synthesis of fluorophore linked maleimide derivatives. Synthesis
1998: 999-1002.
190.
Vives E, Lebleu B. One-pot labeling and purification of peptides and proteins with
fluorescein maleimide. Tetrahedron Letters 2003;44: 5389-91.
191.
Achilefu S, Bloch S, Markiewicz MA, et al. Synergistic effects of light-emitting
probes and peptides for targeting and monitoring integrin expression. Proc Natl Acad Sci U S
A 2005;102: 7976-81.
192.
Kunath K, Merdan T, Hegener O, Haberlein H, Kissel T. Integrin targeting using
RGD-PEI conjugates for in vitro gene transfer. J Gene Med 2003;5: 588-99.
193.
Bareford LM, Swaan PW. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv
Drug Deliv Rev 2007;59: 748-58.
194.
Vives E, Brodin P, Lebleu B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly
translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem
1997;272: 16010-7.
195.
Marks AJ, Cooper MS, Anderson RJ, et al. Selective apoptotic killing of malignant
hemopoietic cells by antibody-targeted delivery of an amphipathic peptide. Cancer Res
2005;65: 2373-7.
196.
Javadpour MM, Juban MM, Lo WC, et al. De novo antimicrobial peptides with low
mammalian cell toxicity. J Med Chem 1996;39: 3107-13.
197.
Ellerby HM, Arap W, Ellerby LM, et al. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic
peptides. Nat Med 1999;5: 1032-8.
169
198.
Smolarczyk R, Cichon T, Graja K, Hucz J, Sochanik A, Szala S. Antitumor effect of
RGD-4C-GG-D(KLAKLAK)2 peptide in mouse B16(F10) melanoma model. Acta Biochim
Pol 2006;53: 801-5.
199.
Stirnemann K, Romero JF, Baldi L, et al. Sustained activation and tumor targeting of
NKT cells using a CD1d-anti-HER2-scFv fusion protein induce antitumor effects in mice. J
Clin Invest 2008;118: 994-1005.
170
ANNEXE
171
L’efficacité d’une drogue est souvent associée à sa capacité à être délivrée directement à son
site d’action. La délivrance d’une molécule spécifiquement à sa cible permet d’une part, de
limiter les problèmes dus à une accumulation dans les tissus sains, provoquant généralement
des effets secondaires néfastes, et d’autre part d’améliorer leur efficacité.. Mais vectoriser un
agent effecteur à son site d’action peut ne pas être suffisant. Ainsi, en thérapie, les drogues
cytotoxiques doivent non seulement atteindre les cellules qu’elles doivent éliminer, mais
souvent pénétrer à l’intérieur de celles-ci pour effectuer leur action. Là encore, pour avoir
l’effet biologique intracellulaire souhaité, les doses sont souvent augmentées.
Les CTP (Cell Targeting Peptide) sont de petits peptides reconnaissant spécifiquement, avec
une haute affinité, un récepteur sur-exprimé sur un type cellulaire donné. Ils sont identifiés
par différentes méthodes, comme le phage-display ou le « screening » de chimiothèques. Les
peptides RGD sont les plus représentés et font encore l’objet de nombreuses études. Comme
nous avons pu le voir tout au long de ce manuscript, ces petits peptides permettent de
vectoriser divers composés spécifiquement au niveau tumoral. Les progrès réalisés dans la
mise au point de vecteurs multivalents a permis d’améliorer l’affinité de ces molécules pour
leur cible, l’intégrine V3. Il existe beaucoup de CTP, ciblant des types cellulaires variés
impliqués dans diverses pathologies. En tant que vecteur de drogues à effet thérapeutique, leur
inconvénient réside dans une internalisation trop faible.
Améliorer le passage à travers la membrane plasmique est donc une nécessité. Dans les
années 90, la découverte de protéines pouvant passer les membranes spontanément a ouvert
de nouvelles perspectives. Les premières études ont mis à jour de petits peptides capables de
traverser la membrane plasmique que l’on a appelé CPP (Cell Penetrating Peptides). Deux
peptides sont les plus étudiés, le peptide TAT et le peptide Antennapedia. Ils sont riches en
acides aminés basiques, notamment en arginine. Leur mécanisme d’internalisation est encore
aujourd’hui mal connu et sujet à controverse. Néanmoins diverses études associant ces CPP à
divers agents effecteurs ont clairement montré un gain dans la délivrance intra-cellulaire de
ces derniers. Malheureusement, le principal inconvénient de ces peptides est leur absence de
sélectivité résultant en une accumulation dans tous les tissus. Diverses méthodes ont été
élaborées pour s’affranchir de ce problème. Notamment l’utilisation de CPP « cachés », ou
inactifs, et qui recouvrent leurs propriétés biologiques uniquement au niveau de leur cible.
Ainsi, l’utilisation combinée des CTP et des CPP pourrait permettre la mise au point de
systèmes capables de cibler les cellules pathologiques, mais aussi d’améliorer l’internalisation
des drogues véhiculées.
172
Nous avons ainsi rédigé une revue rendant compte des avancées faites dans la découverte, la
mise au point, l’utilisation et l’efficacité de ces peptides. Nous faisons également diverses
propositions concernant l’association de ces deux classes de peptides dans un but
thérapeutique.
173
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
Pour se développer une tumeur doit se constituer un réseau de vaisseaux sanguins capable
d’apporter des nutriments et de l’oxygène. L’intégrine V3 est sur-exprimée au niveau des
néo-vaisseaux et participe activement à l’angiogénèse tumorale. Elle reconnaît spécifiquement
la séquence RGD (Arg-Gly-Asp). De petits peptides cycliques, antagonistes de ce récepteur et
présentant cette séquence de façon contrainte ont été capables d’inhiber la croissance
tumorale dans des modèles murins. Le peptide c[RGDf(NMe)V], nommé Cilengitide, est
actuellement évalué en essai clinique de phase III pour ses propriétés anti-angiogéniques.
Cette thèse, présente la synthèse d’un nouveau tétrapeptide cyclisé via un lien urée, c[RGDK],
et se liant à V3 avec une haute affinité. La présence d’une fonction acide libre permet de
l’utiliser comme vecteur de divers agents effecteurs, notamment un fluorophore qui nous a
permis de montrer son internalisation V3-dépendante, mais aussi un peptide proapoptotique ou des radioéléments. Enfin, le peptide c[RGDK] est capable d’induire une
inhibition de la prolifération métastatique in vivo, chez la souris.
Ce nouveau tétrapeptide cyclique est un outil précieux pour la vectorisation d’agents
thérapeutiques ou diagnostiques directement au sein de la tumeur.
Discipline : Chimie-Biologie.
Mots-clés : angiogénèse tumorale, ciblage, peptides RGD, vectorisation.
Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Parc Euromédecine, rue des
Apothicaires 34298 Montpellier. Equipe : Immunocliblage et Radiobiologie en Oncologie.