poster_ESPCI_SFEAP_2010_Demey

Mi
Micro-ondes
Micro-ondes,
d , ultrasons
lt
ett p
pla
lastiques
tiq
: un mariage
i g délicat
déli t
Emmanuelle DEMEY,, Emie DURIGHELLO,, Marie CO
OUZINIÉ,
É, Séga
g NDIAYE et Joëlle VINH
ESPCI ParisTech CNRS USR3149 - SMBP: 10 rue Vauquelin 75231 Paris cedex 05
ication des p
protéines [[1,, 2]] a connu ces dernières années une avancée importante
p
par sa combinaison avec la spectrométrie
p
p
de
e masse. Cependant
p
la p
préparation
p
des échantillons reste un facteur limitant dans l’identification à g
grande échelle,, lors de la g
ge
sq
quantités d’échantillons sensibles, notamment dans les études de q
quantification ou d’interaction p
protéique.
q
s étapes
p clé de la p
protéomique
q bottom-up
p est la digestion
g
protéique.
p
q
Klimek [[3]] utilise p
pour la p
préparation
p
d’un mélange
g standard de 18 p
protéines, la digestion
g
conventionnelle ((incubation à 37°C entre 2 et 16h),
) et la digestion
g
par ultrasons [[2],
p
] à l’aide d’un son
nologie du micro-ondes, existe depuis plus de trente ans. Depuis quelques années, de nouvelles techniques de digestion impliq
quant les micro-ondes ont fait leur apparition, allant du séquençage par hydrolyse [4] à la digestion enzymatique [5]. Ainsi, l’éner
ndes induit un processus de rotation des molécules, basé sur leur moment dipolaire [6] ; l’échauffement ainsi généré induit une
u
accélération des réactions chimiques et une efficacité accrue. Cependant de nombreuses mises au point sont nécessair
ner les conditions les plus adaptées.
MA
ATERIEL & METHODES
Matériel biologique / Enzymes :
-Mise
Mise au point des conditions de travail réalisée sur différente
es concentrations
de protéine standard BSA (Sigma A3059)
3 lotts à disposition
(spécificité : faib
ble taux de
rétention de pep
ptides)
TM (Applied
C t
Cartographies
hi peptidiques
tidi
: GPS E
Explorer
l
(A li d Biosystems)/
Bi
t
)/ Mascot
M
t Distiller
Di till TM (Matrix
(M t i Scien
S i
Recherches : MASCOT
MASCOT, 2 MC
MC, précision MS: TOF 50ppm/ Orbi 2ppm
Modifications partielles: Carbamidométhylation (C)
(C), oxydation (M
MICRO-ONDE DISCOVERTM System Single-Mode (CEM )
Code Etude
Lot 1
Founisseurs
Treff lab 1
1.5ml
5ml
Lot 2
Epp. Lobind 1.5ml
Lot 3
Axygen
yg 1.5ml
de type réacteur ouvert,
ouvert température contrôlée par une sonde fibre optique et régulée par air comprim
MICROSON Ultrasonic Cell disruptor (model XL2007)
PARAMETRE
ES MATERIEL
PARTIE 2 :
ETUDE DE LA STABILITE ENZYMATIQUE
PARTIE 1 :
CHOIX DES CONSOMMABLES
30
20
10
3350.2
4013.0
0
699.0
699
0
1361 8
1361.8
2024 6
2024.6
3350 2
3350.2
4013 0
4013.0
us avons finalement sélectionné le lot 1 comme étant plus proche de nos conditions habituelles (TX). Des tests ont également
alisés avec une sonde ultrasons, avec les mêmes résultats: dans ce cas il faut éviter le contact entre la sonde et la paroi du
c)) Trypsine
T
i 2
60°C
60
C
1639.882
28
1439.75
583
2873.26
651
2529.16
643
2612.10
079
188
80.8663
1724.7
7860
1305.6636
1463.53
344
1479.7458
1567.6893
847.4583
8
3
1567.58
865
0.14
0.10
0.06
MO TX
MO
0.02
0
MO TX
TX
MO
Peptide BSA m/z
m/z=
0.10
0.08
0 06
0.06
0.04
2024.6
2687.4
3350.2
4013.0
0
699.0
1361.8
MO TX
Trypsine 3
Trypsine 2
2024.6
T
26
611.9011
1
18
880.7294
4
20
044.8130
0
10
1724.6
6592
3052
2.3330
20
1419
9.5459
30
MO TX
0
2687.4
3350.2
4013.0
=> La digestion micro-ondes (fig2-a) avec trypsine 1, ne donne que 5 des peptides les plus intenses de la BSA (voir spectre f
TX contrôle), pour des temps de digestion de 15, 25, 30 ou 40min. La trypsine bovine modifiée n’est pas adaptée à la digestio
micro-ondes dans les conditions fixées ici. L’expérience est étendue à 2 autres enzymes (porcine, test 2) à dispositio
laboratoire, en conservant le lot2 pour comparaison. La trypsine 3 est conservée pour la suite.
0 25
0.25
TX
T=55°C
T=60°C
0.2
0.15
927
0.05
1439
0
TX
50w 60w 70w 50w 60w 70w 100w
c un temps de digestion réduit de 15min, aucune
ation n’est observée après augmentation des valeurs
aut de la température ou la puissance du micro-onde.
1567
TX
t=15min
t=30min
HCA
0.20
0 15
0.15
0.10
0 05
0.05
=>
> Lorsque la concentration en protéine diminue (100 fmol/µl),
fmol/µl) le taux
de couverture de séquence est plus important avec la méthode
conventionnelle Lorsque la concentration diminue encore (10 fmol/µl)
conventionnelle.
on obtient un taux de couverture de séquence équivalent avec les deux
méthodes. On peut attribuer la différence de résultats entre les fortes et
les faibles concentrations en protéines au phénomène de « collage »
des p
peptides
p
sur les p
parois des tubes q
qui p
pourraient être accentué avec
la méthode des ultrasons.
0 00
0.00
TX
40°c 50°c 55°c 40°c 50°c 55°c
Peptides
p
tryptiques
yp q
de la BSA
s bibliographiques :
t h
trophoresis.
i 1995 Jul;16(7):1090-4.
J l 16(7) 1090 4 Progress
P
with
ith gene-product
d t mapping
i off the
th Mollicutes:
M lli t
M
Mycoplasma
l
genitalium.
it li
W i
Wasinger
VC ett al.
VC.
l
trophoresis 1999 Aug;20(11):2149-59.
trophoresis.
Aug;20(11):2149 59 Diagnosis of cellular states of microbial organisms using proteomics.
proteomics VanBogelen RA.
RA et al.
al
Journal of Proteome Research 2008, 7, 96
96–103,
103, ] J. Klimek et al
Biotechnol. 2004 Oct;22(10):1291-6.
( )
Protein sequencing
q
g byy mass analysis
y of p
polypeptide
yp p
ladders after controlled p
protein hydrolysis.
y
y
Zhong
g H. et al.
Cell Proteomics. 2006 Apr;5(4):769-76. Microwave-assisted protein preparation and enzymatic digestion in proteomics. Sun W. et al.
M Publishing: Matthews, NC, 2002; 11. In Microwave Synthesis. Hayes BL (ed). Collins MJ.
70
70
Méthode
60
60
50
50
US
40
40
79.47
79.47
77.68
70.93
70.93
30
30
TX
61.57
20
20
22.90
10
10
19.13
00
1 pmol/µl
p 1µ
2
100 fmol/µl
µ
3 µ
10 fmol/µl
Fig 8:
Fi
8 Comparaison
C
i
d nombre
du
b
d peptid
de
tid
f
fonction
ti
d la
de
l méthode
éth d ett de
d la
l concentration
t ti
Nombres de peptides de BSA en fonction de la méthode et de la concentration
50
50
45
45
Méthodes
Couvertures
C
t
d
de séquence
é
(Fig
(Fi 9)
D
De
meilleures
ill
couvertures
t
d
de
séquence
é
sontt obtenues
bt
par
ultrasons Il y a plus de MC avec la
ultrasons.
méthode des ultrasons.
ultrasons
Ce
nombre plus important de MC
permet d
d’avoir
avoir accès à des
séquences de peptides de masses
inférieures à la limite de détection
fixée sur le MALDI-TOF/TOF.
MALDI TOF/TOF Par
conséquent un meilleur taux de
conséquent,
couverture de séquence peut être
atteint
atteint.
MO
de plus approfondie montre que les peptides qui “apparaissent” lors des digestions aux micro-ondes, sont essentiellement des
s à 1 “miss-cleavage”
“
( C) Cette
(MC).
C
augmentation de la proportion de peptides à 1 MC,
C ne réduit pas pour autant le nombre
es à 0 MC (à l’exception
l’
ti de
d 1 à 2 peptides).
tid ) La
L réduction
éd ti du
d temps
t
d digestion
de
di
ti présente
é
t donc
d
un double
d bl avantage,
t
puisque
i
mbine
bi gain
i de
d temps
t
ett augmentation
t ti de
d la
l couverture
t
d séquence,
de
é
résultant
é lt t des
d peptides
tid supplémentaires
lé
t i
à 1MC quii sontt
s.
80
80
40
40
0.05
Les échantillons des analyses précédentes sont analysés sur MALDI LTQ Orbitrap.
Orbitrap Cet appareil nous permet d
d’obtenir
obtenir des
aphies peptidiques avec une tolérance de masse de 2ppm,
2ppm ce qui lève certaines ambiguités sur ll’attribution
attribution de peptides.
peptides
Même si tous les peptides de la BSA n
n’ont
ont pas pu être pointés sur ces
ctres cependant,
ctres,
cependant ll’analyse
analyse manuelle des spectres suggère que la
stion au micro-ondes permet d
d’obtenir
obtenir des spectres plus riches en
tides tryptique.
tryptique
90
90
DHB
0.10
=> Le temps de digestion doit être au minimum de 15min (pas de
signal observé à 5 et 10min) sans dépasser 30min (perte de signal
et de l’avantage de la digestion aux micro-ondes: gain de temps))
Cartographies peptidiques sur MALDI
rbitrap Digest BSA 10fmol/µl
op: t=15min / T=40
T=40°c
c / W=50w)
Couverture de séquence
0 25
0.25
0 15
0.15
0.00
01
0.1
Fig 7:
Fi
7 Comparaison
C
i
d
des
t
taux
d couvertu
de
t
séquence
é
en fonction
f
ti
d
des
méthodes
éth d
e
concentrations
t ti
en protéines
téi
couve
erture de séq
quence
e%
Fig 5: Intensités normalisées par rapport à
l’intensité totale, de 3
peptides tryptiques de la
BSA (moy.
(
d 2 tubes,
de
t b
dé ôt
dépôts
en triplicate).
t i li t )
P i
Puissance
: W = 50w
50
Tests de sensibilité (Fig 7 et 8)
Les concentrations étudiées sont 1 pmol/µl, 100 fmol/µl et 10 fmol/µl.
Pour chaque concentration, 3 échantillons sont préparés de manière
conventionnelle, et 3 échantillons sont préparés avec la digestion par
ultrasons. Les dépôts sont analysés avec le MALDI– TOF/TOF. Sont
comparés: les taux de couverture de séquence, le nombre de peptides
obtenus en fonction des méthodes et des concentrations. Pour les
concentrations de 100 fmol/µl et 10 fmol/µl une étape de dessalage
est ajoutée avant le dépôt sur la plaque MALDI.
35
35
US
30
30
TX
25
25
20
20
45
45
43
42
43
42
40
40
15
15
10
10
55
10
10
13
13
00
1
1 pmol/µl
2
100 fmol/µl
3
10 fmol/µl
Fig 9:
Fi
9 Comparaison
C
i
d couvertures
des
t
d séquen
de
é
l méthode
la
éth d conventionnelle
ti
ll ett de
d la
l méthod
éth d
ultrasons
lt
Couverture de séquence BSA 1 pmol/µl
84
82
Couverrture de séquence %
55°C
947
No
ombre de
d pep
ptides
Intensités normalisées par rapport à l’intensité
de 3 peptides tryptiques de la BSA (moy. de 2
dépôts en triplicate) Temps de digestion : t =15 min
X
d) T
Trypsine
i 2 TX
Peptide BSA m/z=
0 18
0.18
PARTIE 4 : DIGESTION AUX ULTRASO
Test 2 : Influence de la température pour des temps de 15 et 30min
: Intensités
I t
ité de
d 3 peptides
tid ttryptiques
ti
d la
de
l BSA,
BSA selon
l
10min il n
n’yy a pas de signal observé et au
t
tes
valeurs
l
d puissance
de
i
ett de
d température,
t
é t
pour un (pour les temps de 5 et 10min,
delà des 30min
30min, on perd ll’intérêt
intérêt du procédé,
procédé cc’est
est à dire le gain de
e digestion
di
ti de
d 15min.
15 i
temps) Les digestions sont déposés avec 2 matrices différentes
temps).
(HCCA DHB).
(HCCA-DHB)
639
4013.0
MO TX
MO TX
0
0.02
40
1361.8
3350.2
MO TX
MO TX
PARAMETRES OPERATOIRES
ramètres consommables et enzymes
y
étant p
posés,, une série d’analyses
y
croisées est réalisée en faisant varier les p
paramètres
ques de la digestion
q
g
((température
p
T, temps
p de digestion
g
t, p
puissance W).
) Des p
peptides
p
spécifiques
p
q
de la digestion
g
tryptique
yp q de
sont sélectionnés comme marqueurs de digestion,
g
après analyse
y des digestions
g
par MALDI-TOFTOF.
001
70
2687.4
0.04
50
RTIE 3 : PARAMETRES DE DIGESTION
927
90
2024.6
0.08
60
2872
2.1077
10
MO
1067
250
01.0059
258
83.9443
20
1361.8
80
40
30
4013.0
100
80
50
3350.2
1532.620
1
07
90
2687.4
1439.669
16
639.721
2024.6
0
699.0
Fig 3 : Intensité
normalisées des
moyennes
y
((3 dépôts)
p ) pour
p
les 2 modes de
digestion:
Micro-ondes (MO)
vs Thermomixer
(TX)
BSA 5f
5fmol/µl
l/ l lots de trypsine
234
2-3-4
Intenssité norm
mailsée
163
39.7690
1361.8
100
0
699.0
2687 4
2687.4
1195.4579
706
6.0198
0
699.0
23
342.7437
7
f) Lot Tubes 3 TX
10
2210.8342
1881.003
31
169
97.0377
8
847.5226
952
2.6222
253
30.3538
2612.3042
4013.0
20
1993.772
1
29
2096
6.7581
08.3656
743..3969 70
40
2687.4
3350.2
36.2
70
50
2024.6
2687.4
60
10
60
b) Trypsine 1 TX
70
1707.5983
1798
8.8221
90
60
361.8
2024.6
100
80
10
1361.8
20
70
0.12
1416
30
1391.6321
1493.586
1
64
e) Lot Tubes 3 MO
0
699.0
1812.9
9102
4013.0
14
443.6746
6
1532.8247
163
39.9913
3350.2
1195.6307
2687.4
935.5
5731
2024.6
72
20.4319
10
893.042
24
100
01.6119
361.8
20
952.591
18
1464.743
1
38
30
147
79.8601
1567.8124
40
13
305.7484
50
1083.6359
116
63.6359 1195.6
6407
60
30
12
234.5580
1639.9
9071
311
70
80
90
40
1064.50
071
1630
17
876..9435
d)) Lot Tubes 2 TX
40
a) Trypsine 1 MO
100
P tid BSA m/z=
Peptide
/
0 16
0.16
50
927.40
088
4013 0
4013.0
50
72
21.3324
3350 2
3350.2
3592.8
8198
3383.7
7783
2872.4
4126
3000.5
5122
2529.3110
2612
2.2583
2148.1
1189
1880.97
712
2019.9
9993
1724
4.8823
2277.2
2227
2687 4
2687.4
60
975.4477
90
2024 6
2024.6
70
807.3273
3
100
80
1195.5
5690
1479.832
28
156
67.7843
1361 8
1361.8
80
842.4
4296
c) Lot Tubes 2 MO
1446.7
7950
0
699.0
699
0
4013.0
L aspect visuel des tubes montre également
L’aspect
une différence d
d’opacité
opacité (lot1 translucide/ lot2
légèrement opaque) et d
d’épaisseur
épaisseur (lot1 plus
fin) La nature du plastique peut influer sur la
fin).
passage des ondes électromagnétiques et
donc modifier la qualité de la digestion.
digestion
Le traitement même du tube et sa nature peuvent jouer
un rôle non négligeable sur les phénomènes
d’adsorption
d
adsorption des peptides à la surface du tube.
Cependant
p
pour les lots 1 et 2 l’intensité des p
p
peptides
p
des spectres
p
n’est jjamais équivalente
q
aux spectres
p
témoins TX.
L’autre p
paramètre q
qu’il nous reste à tester est donc la
trypsine
yp
elle-même q
qui p
pourrait être altérée p
par les
ondes, réduisant ainsi sa capacité
p
enzymatique.
y
q
90
720
0.3511
3350.2
1640
0.0060
2687.4
14
439.8654
4
10
721.39
985
820.46
603
906..4969
2439.4
4001
1880
0.8965
2024.6
20
1001.6298
361.8
2025.1577
30
1083.6184
119
95.6239
1305
5.7278
1567.7245
40
1724.8
8132
1305.6
6655
1419.6
6483 14
439.7875
5
50
817.3892
100
1001.543
1
33
4759
60
Testt 2:
T
2 Comparaison
C
i
d trois
de
t i trypsines
t
i
d
porcine
i par suivi
i i de
d l’intensité
l’i t
ité relative
l ti de
d 3p
majoritaires
j it i
i
issus
d la
de
l digestion
di
ti de
d la
l BSA.
BSA
Fig 2 : Comparaison digestion Micro
Micro-ondes
ondes (MO) vs Thermomixer (TX)
BSA 5fmol/µl pour les lots de trypsine 1 et 2
1357.5
5819
14
439.6641
70
Testt 1:
T
1 Les
L
conditions
diti
d digestion
de
di
ti
par défaut:
déf t en solution,
l ti
protocole
t
l du
d
l b t i (thermomixer
laboratoire
(th
i
TX) ett pour la
TX),
l digestion
di
ti
au micro-ondes,
i
d
protocole
t
l
constructeur
t t
( i
(micro-ondes
d MO).
MO) Il s’agit
’ it de
d comparer les
l enzymes employées.
l é
1001.4781
80
616
L’incidence des micro-ondes/ultrasons sur la qualité de digestion (en fonction de l’origine et/ou des ses modifications...)
paramètre crucial. Les digestions sont analysées par MALDI-TOFTOF.
O O
1193.4872
2
1277.58
847
90
1639.9769
927.5178
100
1639.9127
7
1195.5
5782
1439.8
8401
stance des tubes (relargage de polymères, perte de matériel...) doit être testée vis à vis des ultrasons et des micro-ondes.
vons testé 3 types de microtubes en polypropylene dédiés à l’analyse des protéines (moindre
(
rétention),
) sur un volume de
d 100µl,
de
100 l puis
i 20ul,
20 l pour reproduire
d i les
l conditions
diti
d digestions
de
di
ti
fé
fréquemment
t rencontrées
t é au laboratoire.
l b t i Les
L digestions
di
ti
sontt
é par MALDI-TOFTOF.
ées
MALDI TOFTOF
L
Les
résultats
é lt t des
d
spectres
t
e)) ett f) nous conduisent
d i
t à
Comparaison digestion Micro-ondes (MO) vs Thermomixer
abandonner
b d
l lot3.
le
l t3 La
L faible
f ibl intensité
i t
ité des
d peptides
tid de
d
(TX) BSA 25fmol/µl sur 3 lots de tubes
BSA retrouvés
t
é pour tous
t
l
les
modes
d
d digestion
de
di
ti
peutt
b) Lot Tubes 1 TX
a) Lot Tubes 1 MO
êt
être
dû à une perte
dûe
t de
d peptides
tid
accentuée
t é par la
l
nébullisation
éb lli ti engendrée
d é par les
l micro-ondes..
i
d
990.524
47
1083.548
1
82
1163.58
823
1195.5468
de réduction/alkylation réalisée manu
manuellement (DTT 5mM final, 30min, 56°C
56 C /
Iodoacétamide 25mM final 20min)
Conventionnel Micro-ondes
Ultrasons
MO
US
thermomixer TX
2h / 37
37°C
C
15min / 55°C
55 C
30s / 4
4°C
C
sous agitation puissance par
Puissance
douce
défaut de 50W
75W
Tubes :
927
7.4095
Digestion : Précédée par une étape
Esp
pèce
Bovine
Porrcine
Porrcine
Porrcine
98
84.4186
1001..4963
10
083.4926
6
1163.5
5140
1249.49
983
Désignation (Code étude)
Roche (1)
Promega (2)
Promega Gold (3)
S
Sigma
((4))
720.37
703
-Trypsines utilisées :
-Dépôt CHCA 4mg/ml
-FTMS
FTMS F
Fullll scan 815-4000
81 4000 D
Da / Energie
E
i laser
l
2
AGC on (A
(Automatic
t
ti Gain
G i Control)
C t l)
-Resolution
R
l ti 60000 / 5 Microscans
Mi
/CPS on (Dé
automatique
t
ti
d
des cristaux
i t
d
de matrice)
ti )
-ASF
ASF off
ff (Filtre
(Filt Automatique
A t
ti
des
d spectres)
t )
Dépôt CHCA 4mg/ml et calibration externe de la plaque
(standard - Proteomix Peptide mix4 Laserbiolab)
-Acquisition automatique ((mode positiff / réflectron
f
/ tirs
4000/ llaser 2500/ 700
700-4000
4000 D
Da))
TM (Applied
-Cartographies
C t
hi peptidiques
tidi
: GPS E
Explorer
l
(A li d
Bi
Biosystems
t
842..4304
•Tester des trypsines d’origine différentes
(porcine, bovine..) en digestion liquide,
pour connaitre leur efficacité et fixer
certains paramètres opératoires.
•Evaluer
l’influence
du
choix
des
consommables employés qui peut avoir
une répercussion non négligeable sur les
résultats.
•Optimiser les conditions opératoires afin
d reproduire
de
d i un résultat
é l
d digestion
de
di
i
au
moins
i équivalent
é i l t au contrôle
t ôl manuell ett ce,
pour des
d quantités
tité très
t è faibles
f ibl de
d matériel
té i l
bi l i
biologique
d
dans
d temps
des
t
réduits.
éd it
MALDI LTQ O
Orbitrap
bit
(O
(Orbitrap
bit
XL
Th
ThermoFisher
Fi h Scientific.,
S i tifi USA)
MALDI-TOF/TOF
MALDI
TOF/TOF 4800
(A l
(Applera
Applied
A li d )
720.3481
7
1
But de l’étude
US
80
78
TX
76
74
72
70
68
66
79,46%
70,93%
64
62
Méthode
Conclusion & perspectives :
L introduction de nouvelles techniques de digestion dans le domaine protéomique est prometteuse.
L’introduction
prometteuse Il es
possible de diminuer les temps de traitement des échantillons tout en augmentant les couvertures de séqu
La propriété de certains matériaux comme le téflon par exemple,
exemple d’être transparent aux micro-ondes
micro ondes et d
une bonne
b
résistance
é i t
chimique
hi i
a permis
i de
d développer
dé l
d nouveaux réacteurs
de
é t
qui,
i placés
l é dans
d
un carro
plusieurs
l i
positions
iti
permettent
tt t de
d traiter
t it de
d nombreux
b
é h till
échantillons
simultanément
i
lt é
t ett plus
l
rapidement
id
t qu
d digestions
des
di
ti
conventionnelles.
ti
ll
Les ultrasons permettent d’envisager des extractions et protéolyses combinées sur des échantillons br
non solubles.
L’application à ce type d’échantillon complexe et non solubilisé est en cours au laboratoire.
Le choix des réactifs et tubes est toutefois p
particulier et p
peut totalement compromettre
p
l’analyse
y si une ét
validation n’est p
pas menée en p
préliminaire.