Jean Salamero - UMR144 - Compartimentation et dynamique

Équipe / Group : PICT-IBISA
Chef d’équipe / Group leader: Jean Salamero
Chef d’équipe : Jean Salamero, DR2 CNRS
Autres membres de l’équipe :
Vincent Fraisier, IR2 CNRS
François Waharte, IR2 CNRS
Lucie Sengmanivong, IE Curie
Perrine Paul-Gilloteaux, IR2 CNRS
Anatole Chessel, postdoc
Daniel Munch, ingénieur CDD
Charles Gueudry, ingénieur Roper Sc.
La plate-forme « Imagerie cellulaire et tissulaire » (PICT-IBiSA) permet aux chercheurs d'étudier des échantillons
biologiques grâce à des méthodes optiques, principalement en imageant la fluorescence émise par les
chromophores. Nous sommes spécialisés dans les études dynamiques, telles que la vidéo-microscopie 4D rapide
qui utilise la restauration d'images et des outils analytiques sophistiqués ou la microscopie confocale rapide
(spinning-disk).
La plate-forme Imagerie cellulaire et tissulaire assure la maintenance et la mise à jour des matériels et logiciels
d'imagerie hébergés au sein l'unité « Compartimentation et dynamique cellulaires » (CNRS UMR144) ainsi que
l’ensemble du Nikon Imaging Center@Curie-CNRS, inauguré en décembre 2007. Elle surveille les nouveautés
technologiques du domaine, s'assure de l'acquisition de compétences et savoir-faire et forme les utilisateurs.
Grâce aux relations forgées ces dernières années avec les industriels, nous pouvons offrir aux équipes de
recherche de l'institut un accès direct, sur place, aux nouveaux outils au fur et à mesure qu'ils sont
commercialisés.
Pour 2009, l’ensemble des systèmes de microscopie avancés présents sur le site Burg de la plateforme a été
utilisé pour un total de 34423 heures, réparties comme suit :
- Nikon Imaging Center : 17626 heures d’utilisation
- PICT-IBiSA, hors NIC : 16797 heures d’utilisation.
Sur l’année, la plateforme a accueilli 200 utilisateurs dont 16 utilisateurs extérieurs, répartis sur 8 unités internes
à l’Institut Curie, plus 5 unités externes (régionales ou non).
La plate-forme « Imagerie cellulaire et tissulaire » est membre de l'European Light Microscopy Initiative (ELMI ),
partenaire de l'European Advanced Light Microscopy Network (EAMnet), du GDR 2588 CNRS « Microscopie
fonctionnelle du vivant » et du RTmfm (Réseau Technologique en Microscopie Photonique de Fluorescence
Multidimensionnelle). Les installations gérées par la plate-forme ont été reconnues en 2003 par le comité de la
Réunion Inter-Organisme (RIO) (comité mixte du CNRS, de l'INSERM, de l'INRA et du CEA) et accréditées
comme « plate-forme d'imagerie cellulaire, programme RIO », maintenant sous label IBiSA depuis 2008. Enfin,
de nombreux membres de la plate-forme organisent régulièrement des cours de formation, ainsi que des ateliers
nationaux et internationaux où ils enseignent.
Par ailleurs, nous avons développé de nouvelles instrumentations de microscopie multi-modales (notamment par
l’ajout de modules de photoperturbation par laser) et d’imagerie des interactions moléculaires, en cellules
vivantes. En conséquence, nous avons été amenés à dédier une part toujours plus importante de notre activité à
l’analyse multi-variée des données de microscopie. Pour ce faire, de nouveaux algorithmes et formalismes
mathématiques ont été inventés ou adaptés. Ces outils « hardware et software », les plus génériques possibles
ont été développés et validés initialement dans le contexte de la dynamique particulière des mécanismes du trafic
intracellulaire et de la biogénèse des compartiments membranaires. Ils ont irrigué les activités de recherche des
diverses équipes de l’unité et d’autres laboratoires, au travers de leur mise à disposition via la PICT-IBiSA.
I. Activité de service
I.1. Installation de nouveaux matériels, formations aux utilisateurs et maintenance
Une des activités naturelles du service d’imagerie est la mise en place de nouveaux instruments et autres outils
et la formation systématique des utilisateurs à ces outils. Dans ce cadre, on pourra distinguer deux types
d’équipements :
- les postes d’observation « de routine » pour lesquels une hiérarchie a été établie en désignant des
responsables par équipes, chargés de la formation et de la maintenance routinière. Ils constituent notre réseau
de correspondants.
- Les postes d’observation « avancés » (type confocaux ou vidéo-microscopes), pour lesquels chaque utilisateur
est formé individuellement ou par petits groupes et sur lesquels le service intervient directement en cas de
problème.
I.2. Assistance/conseils
Les membres de plateforme ont un rôle primordial d’assistance des utilisateurs au quotidien afin d’assurer une
utilisation optimale des microscopes et la meilleure adéquation possible entre les besoins en imagerie des
équipes et les possibilités offertes par les équipements présents.
Cela passe par une part importante de conseils/recommandations sur les différentes techniques disponibles et
les modalités présentes sur chaque système d’acquisition.
I.3 Traitement/analyse de données
L’action de service de l’équipe est étendue au traitement de données, personnalisé en fonction des particularités
des acquisitions et en rapport avec les développements effectués (cf Activité R&D). Cela va d’une activité de
conseil et d’orientation sur les méthodes existantes, à des développements de programmes dédiés (Macros
ImageJ, journaux Metamorph…) via des collaborations avec les équipes.
Pour permettre au plus grand nombre d’utilisateurs l’accès aux outils de traitement et d’analyse, nous mettons à
disposition sur des ordinateurs très performants (salle des PC d’analyse) les derniers logiciels développés au
sein de l’équipe (débruitage, tracking, …) en plus des principaux logiciels d’imagerie (Metamorph, ImageJ).
Les membres de l’équipe assurent eux-même le traitement des données 3D par déconvolution comme un service
proposé aux utilisateurs de la plateforme.
I.4. La plateforme de tests
Depuis mai 2001, une structure de tests systématiques de nouveaux matériels a été mise en place dans une
pièce spécialement réservée à cet effet et sous la responsabilité directe de Vincent Fraisier. Le rôle de cette
infrastructure est d’évaluer précisément les nouveautés « matériels et logiciels » disponibles sur le marché. Ces
tests sont réalisés en étroite collaboration avec les chercheurs de l’Institut, afin que répondre au mieux à leurs
besoins. Néanmoins, avant toute validation biologique, des tests très minutieux d’objets calibrés sont
systématiquement effectués. Ces derniers permettent de déceler précisément les avantages et inconvénients des
systèmes étudiés. A titre d’exemples, ces dernières années, notre plateforme a accueilli les microscopes
confocaux Leica (RS, SP2-AOBS, SP5) et Zeiss (LSM 510 Meta and LSM5Live), les plus récents microscopes de
Zeiss (Axiovert 200, Axioimager), Leica (DMRXA2, DMIRB2 and DMI6000) et Nikon, les systèmes “Nipkow-disk”
de VisiTech et PerkinElmer, le CARV-II de BD Science, le système LIMO de Nikon (fluorescence lifetime
imaging). De nouvelles caméras (Cascade, QuantEM, Evolve de Roper), et divers logiciels de visualisation, de
traitement et d’analyse d’images ont été évalués.
II. Activité de Recherche/Développement
II.1. Instrumentation
Microscopie assistée Laser
Désigné sous le terme de « Photobleaching » ou photo-blanchiment, la perte de fluorescence photo-induite
(généralement par une impulsion laser intense) de façon contrôlée donne accès via les techniques de FRAP
(Fluorescence Recovery After Photobleaching) ou FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) à la mesure de le
mobilité moléculaire dans des systèmes biologiques. Cette technique de FRAP/FLIP est accessible à tous les
chercheurs de l’Institut Curie. Des groupes de l’UMR 144, U 520, UMR 168 et UMR 218 l’utilise depuis 2001,
principalement sur les microscopes confocaux TCS SP2 AOBS (Leica) et LSM 510 Meta (Zeiss) équipés de
modules de FRAP et de photoactivation. La relative lenteur d’acquisition de ces instruments en marque toutefois
les limites notamment lorsqu’on s’intéresse à l’étude dynamique de multiples types de composants
intracellulaires.
Une solution intégrée (projet L5D), combinant l’introduction de lasers appropriés avec une microscopie rapide
4-5D à déconvolution a été développée par notre groupe, en collaboration étroite avec les physiciens de l’UMR
168 (F. Amblard et C. Geudry) à l’Institut. Nous avons également bénéficié de l’expertise du Dr C. Favard
(Toulouse) pour l’analyse des données de FRAP, une collaboration soutenue par le GDR2588 du CNRS. Ce
projet a été financé en partie par la “Fondation pour la Recherche Médicale”, et a progressé dans le contexte d’un
partenariat industriel avec Roper, Leica et Universal Imaging. Brièvement, un microscope 4-5D à déconvolution
est interfacé avec un laser Argon-Ion et une diode laser bleue. Ces sources d’illumination sont assez puissantes
pour permettre la photo-extinction ou la photo-activation lors d’impulsion brèves d’illumination (environ 10 msec).
L’injection laser est totalement découplée du système d’acquisition d’images, permettant ainsi une optimisation
maximale des intervalles entre les séquences de pre-(contrôle) et post-(récupération) excitation laser. Cette
solution externe aboutit à une excellente résolution XYZt. L’utilisation de galvanomètres et d’un objectif monté sur
pièzo permet un positionnement 3D précis du spot d’illumination, d’un diamètre d’environ 1mm dans une zone de
l’échantillon, directement choisie sur l’écran, par l’utilisateur. Les lasers et la source d’excitation pour l’acquisition
d’images (monochromateur) sont introduits dans le microscope par des fibres optiques différentes et sont couplés
par un miroir spécifique.
Le microscope L5D prototype, combinaison de la microscopie 4-5D à déconvolution avec les techniques assistées par laser.
Pour de plus larges régions, une extinction efficace de la fluorescence est obtenue par un positionnement discret
de multiples points, incrémentant le temps total nécessaire pour photoblanchir la région déterminée. Grâce à
l’acquisition en champ large et à la collection 3D des données, ce système permet une quantification précise des
mécanismes responsables du recouvrement de fluorescence sur des structures cellulaires préalablement
éteintes.
Photoextinction « multipoint-multiregion » par le système L5D. Moins d’une seconde sépare la fin de l’étape antérieure à la
photoextinction (prebleach, gauche) et l’acquisition de la première image de la phase de récupération de fluorescence (recovery,
droite). Chaque image présentée correspond à la projection déconvoluée d’un empilement de 10 plans, soit 3 microns de
profondeur acquis en 500ms.
Les droits des plans et les logiciels du module L5D sont protégés et le système a été industrialisé et est
disponible sur le marché (distribué par Roper). Plusieurs systèmes de ce type ont d’ailleurs été installés dans
divers laboratoires français. Un système similaire couplé à un laser pulsé femto-seconde Ti:Saph a été monté et
installé dans le département de Physique. Il permet une localisation de l’excitation par absorption à deux photons
et par conséquent un meilleur contrôle du volume de la photo-destruction.
Notre expérience nous a conduit à étendre ce concept intégratif de solutions d’imagerie multi-modes.
- TIRF/4D/FRAP
En effet, dans cet esprit, nous avons récemment combiné un système de TIRF avec une microscopie 4-5D
(collaboration avec Nikon), et notre module de FRAP. La disponibilité de ces modalités sur un même microscope
permet de concevoir des expériences originales (3D+TIRF, TIRF+FRAP,…) et inédites et préfigure une tendance
majeure dans le développement instrumental actuel en microscopie biologique. En particulier, la combinaison
TIRF/3D permet de suivre en 3D les structures apparaissant ou disparaissant de l’image TIRF, elle-même très
restreinte en profondeur (d’où le gain en résolution en z).
L’ajout d’un séparateur d’image (module DualView) avant la caméra CCD permet le suivi de deux protéines en
simultané, condition nécessaire pour décortiquer les mécanismes moléculaires en jeu par exemple dans les
phénomènes d’endo/exocytose très transitoires et rapides. Des outils logiciels ont été développés pour l’analyse
de ce type de données (cf partie II.2 Logiciels ci-dessous).
Ce dispositif ouvre également la possibilité d’effectuer des expériences de FRAP en double marquage
(photoblanchiment d’une couleur et suivi en parallèle des deux couleurs, expériences de FLAP, …).
- FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging)
Dans l’étude des processus biologiques, il est intéressant de pouvoir suivre les interactions moléculaires dans le
temps et l’espace, au sein de cellules vivantes. En imagerie classique, il n’est pas possible de distinguer deux
protéines proche de moins d’environ 250 nm à cause de la limite de diffraction.
Cependant, en utilisant le phénomène de transfert d’énergie entre deux fluorophores (FRET : Forster Resonance
Energy Transfer), il est possible d’obtenir une information sur leur proximité à l’échelle de quelques nanomètres.
La technique la plus fiable à ce jour pour faire cette mesure est l’imagerie de temps de vie de fluorescence
(FLIM). Le système de mesure en Microscopie FLIM TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) que nous
avons utilisé au départ permettait combiner (séquentiellement) les mesures spectrales et la durée de vie de
fluorescence, avec une approche particulièrement adaptée à l'imagerie FRET. La technologie de base de ce
système a été décrite et a été validée par une série d'applications biologiques (Voir publications).
Elle a également montré certaines limites, notamment en terme de qualité d'image et de fréquence d'acquisition.
Nous avons donc étendu ces études au niveau instrumental et dans les méthodes d'analyse. Un prototype du
système FLIM basé sur la modulation de phase a été construit. Il inclut un amplificateur d’image modulable
(Lambert Instruments), interfacé avec une tête confocale spinning-disk. Ce microscope multi-modal permet la
détermination de temps de vie de fluorescence à haute résolution spatiale avec capacité de coupes optiques et
des mesures fiables. De nouveaux algorithmes de traitement d'images, basés sur l'analyse sur chaque pixel x de
l'image dans ses différentes dimensions au cours du temps, sont maintenant en cours d'élaboration.
II.2. Logiciels
La nature et la taille des données générées par les différents instruments disponibles en microscopie optique de
pointe constituent un vrai goulot d'étranglement pour l'analyse de l'imagerie cellulaire, en plus de la diversité des
applications. Nous avons développé des outils spécifiques, certains d'entre eux aussi génériques que possible,
pour l'analyse de données multidimensionnelles extraites des piles d'images. Dans notre première stratégie, les
structures d'intérêt ont été extraites et vectorisées en fonction de leurs caractéristiques morphologiques (plans
d’ondelettes, segmentation) et des statistiques (coordonnées, taille, ...). Même si elle a été développée et validée
afin de déchiffrer le parcours et la fonction de l'antigène présentant CD1e, molécule pour laquelle aucune autre
méthode de quantification n’a été satisfaisante, de nombreuses équipes internes et externes ont entièrement
validées cette approche. Pour répondre aux problèmes biologiques dans le suivi des mouvements complexes, en
particulier dans le domaine des membranes, organites, et dynamique du cytosquelette ou en cytocinèse, une
relation interactive entre l'approche de segmentation 3D ci-dessus et une analyse en ondelettes kymographiques
a été créée, qui extrait automatiquement les données statistiques de l'objet suivi. Cette méthode permet la
visualisation et la quantification du mouvement vésiculaire le long de réseaux non prédéfinis. Il peut être utilisé
soit dans un mode semi-automatique dans les domaines spécifiés par l'utilisateur, ou plus intéressant,
automatiquement, sans intervention d'utilisateur. Toutefois, l'extraction de données détaillées aussi sophistiquée
soit-elle, a ses limites et, par conséquent, les informations analysées sont toujours partielles. La séquence
temporelle des images provenant directement de la microscopie se distingue aussi par la nature des objets
observés (cellule, organite ...), tantôt par un nombre élevé de petites particules mobiles (dans les chromosomes,
vésicules, tubules ...), la complexité de dynamique impliquant plusieurs entités moléculaires ou groupes d'entités
en interaction, les phénomènes de coalescence des entités individuelles et par l'équilibre biochimique discret,
comme la diffusion de la membrane ou la dissociation moléculaire d'un complexe macromoléculaire. Toutes ces
questions sont aussi particulièrement liées aux problèmes de résolution de l'image, et souvent de rapport signal
sur bruit très faible. Une meilleure compréhension de la régulation et la coordination des assemblages
moléculaires responsables des architectures intracellulaires dynamiques exige certains développements et la
corrélation des divers descripteurs d'images et des approches quantitatives qui devrait finalement donner lieu à
une vision plus globale. Des études ont été lancées dans ce sens depuis début 2007. Dans le contexte particulier
de la coordination des plates-formes d'organisation des membranes intracellulaires qui constitue notre modèle
biologique "pilote", et afin d'analyser leurs mécanismes de régulation, nos principales réalisations ont consisté à
identifier, détecter et extraire des informations à partir des 1) mouvements dirigés, 2) concentrations moléculaires
spatiales et transitoires ou de dissociation. En suivant cette approche, nous avons maintenant déduit quelques
formalismes mathématiques adaptés à la dynamique intracellulaire, comme le trafic des organites et des
membrane ou de leur biogénèse :
- Une méthode de régression non paramétrique pour le débruitage des séquences d'images de microscopie de
fluorescence, réalisées par analyse non-locale basée sur des patchs, permet de minimiser le problème SNR.
Cela ouvre des perspectives intéressantes pour le suivi des échantillons biologiques à haute résolution
temporelle et spatiale, sans pour autant augmenter la dose de rayonnement
- La décomposition modale et en espace d’échelle basée sur un calcul géométrique de convexité permet de
séparer du fond de l’image les éléments en l'avant-plan dans des séquences vidéos et, par conséquent, la
détection automatique et la classification des structures mobiles par rapport aux stables au sein de la séquence
d'images.
- Une méthode basée sur des patchs pour la détection d’événements répétitifs et transitoires a été mis au point
pour distinguer les mouvements dus au trafic intracellulaire de l'apparition et de disparition des éléments au sein
des séquences vidéo, ce qui donne une alternative aux algorithmes gloutons fondé sur le suivi systématique de
toutes les structures contenues dans la cellule. [Boulanger et al., En préparation]
- Des modèles probabilistes et de chemin minimal pour l’estimation du trafic origine-destination pour l'imagerie
sur cellules vivantes sont proposées actuellement et vont être développés.
III. Partenariats/collaborations et financements :
L’essor de la plateforme n’a pu se faire au fil des années seulement grâce à la mise en place de partenariats
privilégiés avec des industriels proposant des produits performants en imagerie. L’ouverture de la plateforme vers
l’extérieur se retrouve également dans les collaborations avec des équipes ou des chercheurs reconnus du
domaine, notamment via l’élaboration de projets à l’échelle internationale.
Industriels :
Nikon Instruments, Roper Scientific/Photometrics, Molecular Devices, DELL, Chroma, Life Imaging Services,
Photon Lines, TMC.
Principaux collaborateurs externes à l’Institut Curie :
G. De Libero, University Hospital, Basel, Suisse ; P. Elbau, RICAM, Lindz, Autriche; S. Siegmund & T. Gross,
Tech.Univ-Dresden -B. Hoflack & S.Pautot Biotech Center TU-Dresden ; T. Wilson, University of Oxford, UK; D.
Hanau & H. de la Salle INSERM 725-EFS, Strasburg ; L. Héliot, IRI, Lille; P. Bouthémy & C. Kervrann, INRIAIRISA, Rennes ; A. Trubuil, MIA Unit, INRA, Jouy en Josas. M. Réfrégiers, Synchrotron SOLEIL, Saclay.
Financements :
Grâce à une veille technologique constante et les collaborations internes et externes, l’équipe a pu obtenir des
financements propres permettant la mise en place de nouveaux postes d’acquisition et le développements des
outils instrumentaux et logiciels.
Sur les 4 dernières années, l’équipe a reçu de nombreux financements de l’A.R.C. INRIA (coordinateur C.
Kervrann; 2006-07), FRM (coordinateur J.S., 2006-08), Canceropole IdF (coordinateur, J.S. 2007-09), IBiSA
(coordinateur J.S. 2009-11), FP7 EU (Collaborative Project Small, coordinateur J.L. Viovy, 2009-11) ANR,
(RNTS, coordinateur N. Chateau 2005-08; BioTechSan, coordinateur J. Weber, 2009-11).
IV. Publications/Brevets :
2009
Delevoye C., I. Hurbain, D. Tenza, J.B. Sibarita, S. Uzan-Gafsou, H. Ohno, W.J.C Geerts, A.J. Verkleij, J.
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Symposium on Biomedical Imaging, Juin 28-Juillet 1, Boston, Massachusets, USA. To be published in Book
Series: IEEE International Symposium on Biomedical Imaging.
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Pages: 132-142.
Ouvrages
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Machiraju, J. Rittscher (eds.), Artech Publishing House,.pp 168-190
Revues et autres publications
2008
J. Salamero. The green revolution is under way, 2008. Medecine Sciences. Volume: 24
Pages: 987-988
2006
C . Gueudry, J. Salamero, V. Fraisier, F. Amblard, V. Racine, J.B. Sibarita, F. Perez, A. Dimitrov, C. Favard.
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2005-Module de photo-perturbation laser- Dépôt légal du module L5D. Plans et codes 2 Février 2005 (CNISF n°
19688). 2006 Industrialisation-Distribution via les sociétés Errol (Contrat de licence CNRS/Institut Curie) et Roper
Scientific-Photometrics.
2006-Logiciel d’analyse « Multidimensional Image Analysis. Dépôt des Codes SEGMENTATION & TRACKING
12 décembre 2006 (CNISF n° 20721)
2007-Licence exclusive d’exploitation internationale à Photometrics-MAG Biosystems du module L5D, sous le
nom FRAP-3D.
2009 -Développement du logiciel PBED (Patch Based Event Detection), en cours de dépôt.