Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie

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La Microscopie confocale Formation Permanente, CNRS, Gif-sur-Yvette
octobre 2009
Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie
Spencer BROWN et Christel POUJOL*,
« Dynamique de la compartimentation cellulaire », Institut des Sciences du Végétal, CNRS UPR2355,
91198 Gif-sur-Yvette, et
*Plate-forme d'Imagerie Cellulaire de l'Institut de Neurosciences, Institut François Magendie,
Université de Bordeaux II, 33077 Bordeaux cedex
I) Principe de la fluorescence
II) Caractéristiques des spectres d’absorption et d’émission des fluorochromes
III) Propriétés des fluorochromes
III.1) Le rendement quantique
III.2) Le coefficient d’extinction
III.3) La durée de vie de fluorescence
IV) Autres propriétés des fluorochromes
IV.1) La polarisation
IV.2) La photostabilité
V) Facteurs influençant la fluorescence : l’environnement
V.1) La polarité
V.2) Le pH
V.3) Les ions métalliques
V.4) Concentration ou agrégation
V.5) Température
V.6) Quenching
V.7) Pénétration des fluorochromes dans la cellule
VI) Montage de l’échantillon
VII) Choix d’une sonde fluorescente
VII.1) Les paramètres fonctionnels
VII.2) Les paramètres structuraux
VII.3) Contrainte liée à l’excitation
VII.4) Recouvrement des spectres d’émission
VII.5) Autofluorescence
VII.6) Quantification
VII.7) Techniques ratiométriques
VII.8) Les nanoparticules
VIII) Perspectives
Spencer BROWN & Christel POUJOL
CNRSFormation : La Microscopie Confocale
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En microscopie confocale, notre objectif est d'obtenir un signal spécifique, durable et fort (peut-être
plusieurs signaux) sans dégradation et en respectant autant que possible les fonctions cellulaires.
L'efficacité du processus doit être constante dans le temps et globalement homogène dans l'espace
pour que la microscopie soit quantitative.
Les sondes fluorescentes marquent des cellules fixées, mais aussi des cellules vivantes. Leur
utilisation permet d’accéder à plusieurs types d’informations :
- marquage de structures subcellulaires qui correspondent généralement à des
macromolécules ou à un ensemble de constituants (ADN, protéines du cytosquelette,…) ou à des
molécules constitutives de taille plus faible mais présentes en concentration significative sur un
organite ;
- couplés à un anticorps, des fluorochromes sont aussi utilisés comme révélateur de réactions
immunologiques. Les innovations fortes sont le développement de marqueurs supposés plus
brillants et plus stables, avec des spectres d’excitation et d’émission plus étroits (gamme des Alexa
Fluors par exemple pour des observations immunocytochimiques sur cellules fixées) ;
- mesure de modifications métaboliques ou physiologiques rapides dans des cellules
vivantes (activités enzymatiques, mouvements ioniques, perméabilité membranaire,…) ;
- étude de la dynamique des protéines et des mouvements inter- et intra-cellulaires in vivo.
Ce dernier aspect a fait l’objet de développements remarquables ces dernières années, de nombreux
marqueurs pour cellules vivantes pouvant être utilisés simultanément (exemple des marqueurs de
mitochondries excités et émettant dans diverses parties du spectre, ou de divers dérivés de la GFP
tels que la YFP, CFP, etc. ) (voir chapitre : Les protéines fluorescentes, et Bolte et al. 2007)
Dans ce chapitre, nous rappelons le principe de la fluorescence et les propriétés des sondes
fluorescentes et l’influence de l’environnement. Tous ces éléments seront à prendre en compte pour
répondre à la question : « Quel choix de fluorochromes ? ».
I) Principe de la fluorescence
La fluorescence est une forme de luminescence se produisant suite à l’absorption de photons par
une molécule de type fluorophore, fluorochrome ou sonde fluorescentes. C’est un phénomène
physique classé dans l’ensemble des phénomènes de luminescence comprenant la
photoluminescence (fluorescence, phosphorescence) et les autres types de luminescence
(chimiluminescence, bioluminescence...). La photoluminescence est un phénomène radiatif
consécutif à une excitation lumineuse tandis que la chimiluminescence est un phénomène radiatif
consécutif à une réaction chimique (chimiluminescence vraie) ou enzymatique (bioluminescence).
Ces différents phénomènes se distinguent essentiellement par la nature de l’énergie d’excitation
impliquée.
LUMINESCENCE
©
PHOTOLUMINESCENCE
©
ª
Fluorescence
Phosphorescence
(singulet)
(triplet)
ª
CHIMILUMINESCENCE
BIOLUMINESCENCE
THERMOLUMINESCENCE
ELECTROLUMINESCENCE, etc
La photoluminescence se traduit par l'émission de photons par une molécule qui a été irradiée par
un faisceau lumineux généralement dans une gamme de longueur d’onde s’échelonnant du visible à
l’ultraviolet. La photoluminescence englobe deux processus: la fluorescence et la
phosphorescence, qui dépendent de la nature des états fondamentaux et excités de la molécule
3
considérée. La figure 1 représente le diagramme de Jablonski très simplifié schématisant les
différents niveaux d’énergie d’une molécule et les différents phénomènes liés à la
photoluminescence.
La fluorescence a lieu suite à une absorption de lumière, elle est caractérisée par l’émission de
photons qui se produit lors des transitions électroniques d’une molécule entre un état excité singulet
S1 vers l’état fondamental singulet S0 (relaxation). L’excitation lumineuse peut être induite par un
seul photon (absorption monophotonique) ou par l’interaction simultanée de deux (ou trois)
photons dont la somme d'énergie est égale à un photon excitateur pour former un exciton
(absorption biphotonique, triphotonique). Par exemple deux photons à a700 nm peuvent ainsi
exciter le DAPI comme un seul photon à 350 nm. (Ce principe est mis en œuvre dans la
microscopie biphotonique.) Le temps nécessaire à l’absorption est immédiat, de l’ordre de 10-15 s
(fs). La durée de vie moyenne de l’état excité est de l’ordre de 10-9 à 10-7 s (>ns).
La phosporescence est un type de phospholuminescence qui persiste après l’arrêt de l’excitation
lumineuse (comme sur un écran cathodique). En effet, elle se distingue de la fluorescence par le
mode de désexcitation de la molécule. La phosphorescence est caractérisée par des transitions
électroniques entre un état triplet excité et l’état fondamental. Dans ce cas, la durée de vie moyenne
de l’état excité est plus longue, elle s’échelonne typiquement d’une centaine de microsecondes à
quelques secondes.
transfert d’énergie
10-12 à 10-4 s
cis
ci
fluorescence
absorption
T1
cis
T1
S0
S0
Raman
Stokes & anti-Stokes
S1
phosphorescence
10-8 à 10-2 s
~ps
S1
quenching de fluorescence
10-9à 10-7 s
virtuel:
inélastique et
sans absorption
phosphorescence
Niveaux d’énergie
S2
~fs
~ns
Figure 1. Représentation schématique des niveaux d’énergie des électrons d’une molécule fluorescente et d’une
molécule quencher et des différentes voies possibles correspondant aux phénomènes de photoluminescence. Les lignes
horizontales représentent les niveaux d’énergie, pour simplifier seuls les niveaux d’énergie électroniques sont indiqués.
S : état singulet ; T : état triplet ; les indices 0, 1 et 2 représentent respectivement l’état fondamental, le premier et le
second niveau d’énergie. Les lignes verticales représentent les transitions entre les différents niveaux d’énergie : lignes
pleines: transitions impliquant des photons et lignes pointillées : transitions non radiatives (couplage intersystème, cis ;
conversion interne, ci). Les boîtes représentent les niveaux et les spins électroniques. Une diffusion non-élastique de la
lumière par les molécules, les ions, les atomes, produit l’effet Raman avec un déplacement de Stokes (moins
énergétique) et anti-Stokes (plus énergétique), beaucoup plus faible que la fluorescence.
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Plus précisément, dans des conditions normales, le niveau d’énergie des électrons d’une molécule a
une valeur minimale (niveau fondamental, S0). Lorsqu’une quantité appropriée d’énergie
électromagnétique est fournie à une molécule, cette molécule peut passer de l’état stable S0 à un
état excité supérieur S1 ou S2, chacun de ces états ayant encore divers niveaux d’énergie
vibrationnelles, rotationnelles, etc. Après un certain temps, avec d’abord des réorganisations
concernant les faibles énergies vibrationnelles etc., l’électron quitte l’état excité pour retrouver son
état d’énergie initial. Ce retour peut se produire suivant différentes voies :
- soit ce retour se fait directement vers l’état fondamental S0 et on a émission d’un photon
de fluorescence,
- soit ce retour se fait par étapes successives avec passage pendant un certain intervalle de
temps à des niveaux d’énergie intermédiaires. Ainsi une molécule excitée à un niveau élevé (état S2
ou supérieur) est rapidement désexcitée en suivant un processus non radiatif (conversion interne) et
atteint l’état excité métastable S1. Une conversion interne S1 o S0 peut se produire rapidement,
cependant, dans le cas des molécules fluorescentes, cette vitesse est suffisamment lente pour que la
désexcitation par émission de lumière puisse avoir lieu. La fluorescence est aussi en compétition
avec le passage intersystème : état singulet S1 o état triplet T1 , l’émission de lumière qui
accompagne le passage T1 o S0 est appelée phosphorescence. Signalons que la probabilité de
passage de S1 vers T1 est au moins un ordre plus faible que la désexcitation radiative S1 vers S0,
- soit la molécule revient dans son état fondamental sans émission de photons. Ces
transitions non radiatives sont plus ou moins fréquentes en fonction de divers paramètres liés à
l’environnement direct de la molécule et la présence de quencher.
Evidemment, bien d’autres interactions lumière / matière sont possibles : la diffusion Raleigh (sans
changement d’énergie photonique) qui limite beaucoup notre travail sur tissus, et la diffusion
Raman (élastique, Stokes et anti-Stokes) exploitée dans certaines microscopies spectrales.
II) Caractéristiques des spectres d’absorption et d’émission de fluorescence d’une molécule
Chaque molécule peut être caractérisée par des spectres d’absorption et d’émission qui lui sont
propres et qui reflètent la distribution de probabilités des transitions énergétiques. Ils sont
caractéristiques de la structure énergétique des molécules. Comme nous l'avons vu, une partie
seulement de l’énergie absorbée peut être émise sous forme de rayonnement, moins énergétique
(ainsi longueur d'onde O du maximum d'excitation < O du maximum d'émission). Le spectre
d'absorption est caractéristique d'une molécule dans un environnement donné et le spectre
d'excitation de son éventuel centre fluorescent lui est très généralement identique. Le spectre
d’émission de fluorescence est approximativement une image inversée (effet miroir) du spectre
d’absorption.
Chacun est sans doute familier avec la fluorescence de l’iso-thiocyanate de fluorescéine ou FITC
(Figure 2A), son spectre d'émission étant approximativement l'image miroir décalée vers le rouge
de la bande d'absorption située vers les plus courtes longueurs d'onde. On note que le spectre
d'émission conserve sa forme indépendamment de la partie du spectre d'excitation effectivement
exploitée par la source lumineuse. Par contre, l'efficacité du processus sera modifiée, et des
phénomènes annexes comme la photodestruction ou la dépendance sur pH peuvent être largement
modifiés.
La distance entre les maxima d'excitation et d'émission s'appelle le déplacement de Stokes (ou
Stokes Shift) (pour la fluorescéine, respectivement 495 nm et 521 nm, soit un Stokes Shift = 26 nm).
Si ce déplacement est faible, il sera difficile de séparer les longueurs d’onde d’excitation et
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d’émission au moyen de filtres. En pratique, pour pouvoir séparer efficacement, à l'aide de miroirs
dichroïques, la forte lumière incidente (O1) de la faible fluorescence émise (O2), ce déplacement
doit être >20 nm. Éventuellement, un déplacement de Stokes important (vis. chlorophylle, iodure
de propidium, Red670, Tricolor) facilitera la réalisation de marquages multiples en conjonction
avec des fluorochromes ayant des déplacements de Stokes plus faibles (FITC, RITC, Texas Red).
L’effet « miroir » entre spectres d’excitation et d’émission n’est pas toujours observé : des
dissimilitudes entre les deux spectres peuvent révéler l’existence de plusieurs formes de la
molécule considérée, caractérisées par des longueurs d’onde d’absorption et/ou d’émission
différentes (cas de la chlorophylle, Figure 2B). Les spectres d’excitation biphotonique ressemblent
à peu près aux spectres conventionnels d’absorption (mais fortement émoussés) décalés d’un
facteur 2x (sur l’axe O nm) et le spectre d’émission reste apparemment semblable.
déplacement de Stokes
521
)
489
excitation
émission
Intensité (UA,
)
iso-thiocyanate
1 de fluorescéine
Intensité (UA,
iso-thiocyanate de fluorescéine
PM : 389 dalton
acide faible
pKa ≈ 6,4
I ≈ 0,85
H ≈ 80.000M-1.cm-1
O
COOH
N C S
Chlorella vulgaris
)
O
1
Intensité (UA,
OH
Absorbance (DO,
)
0
0
200
300
400
500
600
Longueur d’onde (nm)
700
800
Figure 2. (A) Spectres d'excitation et d'émission d'iso-thiocyanate de fluorescéine dans l'eau à pH 7. Intensité de
l'émission à une longueur d'onde fixe en balayant les longueurs d'onde d'excitation, et inversement. (B) Spectres
d'absorption ( ) et de l'émission ( - - - ) de la chlorophylle in situ de Chlorella vulgaris à 4°K (d'après Kramer et al,
1985), (voir également figure 8).
III) Propriétés des fluorochromes
Trois autres caractéristiques importantes de l’émission de fluorescence sont le rendement
quantique, le coefficient d’extinction et le temps de déclin de fluorescence.
III.1) Le rendement quantique
L’efficacité de l’émission de lumière fluorescente pour une molécule donnée est déterminée par le
rendement quantique I, phi, défini par le rapport entre le nombre de photons de fluorescence émis
et le nombre de photons absorbés par la molécule. Les fluorochromes ont des rendements
quantiques compris entre 0,1 et 1.
rendement quantique, If
If = If Ia
If et Ia = nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et émettant (f) la lumière
Exemple : If | 0,85 pour la fluorescéine. Remarque : Pour la sonde iodure de propidium, le
rendement quantique s’améliore de 100 fois lorsqu’il est intercalé dans l’ADN.
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III.2) Le coefficient d’extinction
L’intensité d’absorption (optical cross-section of a molecule) ou coefficient d'extinction H ou
absorbance spécifique reflète la probabilité d’absorption. Sa valeur peut constituer un critère pour
le choix des colorants ; plus H est grand, plus élevée sera la fluorescence à intensité lumineuse
incidente égale.
-1
-1
(exemple pour la fluorescéine à 488 nm, H = 8 x 104 M . cm )
L’intensité de fluorescence ou « brillance » d’une sonde est déterminée par le produit du
coefficient d’extinction et du rendement quantique. Le tableau 1 donne quelques exemples
d’intensité de fluorescence de certains fluorochromes et par comparaison les valeurs obtenues pour
le tryptophane et des boîtes quantiques (Quantum Dots, nano-particules inorganiques).
Tableau 1 : Exemple de valeurs caractérisant la fluorescence
-1
à 490 nm
à 490 nm
fluorescéine
Cyanine5.18
EYFP
B-phycoérythrine
tryptophan
Quantum Dot 605
Quantum Dot 655
-1
H (M . cm )
80 000
250 000
84 000
2 410 000
6 000
1 000 000
3 000 000
brillance (unité arbitraire)
I
0,9
72 000
0,35
90 000
0,61
51 000
0,98
2 360 000
0,1
600
0,55
550 000
0,60
1 800 000
NLO Action cross section = absorption cross section (en NLO) multiplié par le rendement quantique.
1 Göppert-Mayer = 10-50 . cm4 . s
En imagerie quantitative, on cherche une réaction linéaire entre concentration de fluorochrome et
intensité de signal. Avec une absorbance spécifique très réduite ( H.C.l < 0,02 ), la loi d’absorption
de Beer-Lambert :
H
Ia = Io - It = Io ( 1 - 10-HHC.l
)
Io , intensité lumineuse incidente
It , intensité lumineuse transmise
-1
C , concentration de la molécule absorbante, en mol.l (M)
l , trajet optique, en cm
se simplifie à
If | 2,3 If . Io . H.C.l
soit une relation linéaire entre C, la concentration du fluorophore, et If , l'intensité d'émission.
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III.3) La durée de vie de fluorescence
La troisième caractéristique importante d’une molécule fluorescente est le temps de déclin, ou
durée de vie de fluorescence, Wf (tau). Elle correspond à la durée de vie moyenne de l’état excité.
La plupart des fluorochromes ont des durées de vie de l’ordre de la nanoseconde. Plus ce temps
sera court, meilleur sera la sensitivité du fluorochrome. En effet, plusieurs excitations successives
seront possibles car il repassera rapidement dans son état fondamental.
durée de vie du singulet excité le plus bas
= tau, la constante de temps de déclin de fluorescence, Wf
Wf = If . WN
WN , constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seule la fluorescence).
IF , rendement quantique
(exemple : Wf | 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau)
IV) Autres propriétés des fluorochromes (d’après Valeur 2002, 2004 ; Hovius et al, 2000)
IV.1) La polarisation
Les vecteurs électromagnétiques associés à la propagation d'une onde peuvent être quelconques
(isotropes) ou plus ou moins anisotropes. Les fluorophores absorbent préférentiellement les ondes
lumineuses dont le champ électromagnétique est parallèle à leur dipôle d’absorption : un faisceau
polarisé privilège une sous-population moléculaire ayant les orientations favorables. Si les
molécules étaient immobiles, leur excitation par une lumière polarisée rectilignement donnerait
naissance à une radiation polarisée dans la direction du dipôle d’émission de la molécule.
Cependant, étant donné le phénomène de diffusion moléculaire, et plus particulièrement la rotation
des molécules, la fluorescence émise va se dépolariser. Ainsi, le degré de polarisation (p) de
l’émission quelques ns plus tard (en fonction de Wf ) fournira un renseignement sur la
microviscosité de l’environnement moléculaire. Dans la pratique, l’anisotropie d’émission (r) est
rarement accessible sur des microscopes. Dans un couple FRET, l’anisotropie d’émission résiduelle
du donneur augmente et Wapparent diminue au fur et mesure que le transfert d’énergie augmente.
Bien que les lasers de microscopie confocale fournissent un faisceau polarisé verticalement, la
polarisation de l'émission est ignorée dans les analyses. Par contre, elle est exploitée dans le mode
réflectance, en insérant dans le microscope une lame quart-d'onde et un filtre polarisé devant le
détecteur pour rejeter les réflexions internes. (Détail pratique : des composants optiques de DIC
peuvent être en conflit avec des faisceaux laser incidents.)
IV.2) La photostabilité
La photostabilité correspond au nombre d'excitations que peut subir une molécule fluorescente
avant d'être dégradée. C'est ainsi que la fluorescéine peut subir entre 104 et 105 excitations avant
d'être détruite. Alors pendant le passage du laser pour constituer un pixel, une molécule va être
excitée quelques centaines de fois. L’état triplet est particulièrement vulnérable. Cette perte de
fluorescence (photodéstruction = fading) est souvent évidente avec la fluorescéine si le balayage
est lent, mais moins avec la rhodamine.
8
Les fluorochromes « Alexa Fluor » (Tableau 5, Molecular Probes Invitrogen) et les Cyanines
« Cy » sont de très intéressants alternatifs à la fluorescéine pour leur brillance, leur stabilité et leur
indépendance de l’environnement - mais soyons clairs sur quel dérivé est utilisé (par exemple
Cy3.18 ex 552, em 570 nm ; Cy3.5 ex 588, em 604 nm ; Cy5.18 ex 650, em 667 nm ; Cy5.5 ex
675, em 694). Dans tous les cas, le milieu de montage doit minimiser ce phénomène de photoinstabilité, notamment en dissipant de l'environnement les radicaux réactifs de toutes sortes.
(Attention ! Les Alexa ne sont pas compatibles avec tous les milieux.)
Sans doute à cause de phénomènes d'oxydation, des fluorochromes dans des environnements
lipidiques cellulaires semblent très vulnérables à la photo-instabilité. Une exception utile est le
dérivé styryl FM1-43 (et FM4-64, ayant une émission déplacée vers le rouge et donc compatible en
contre-coloration avec GFP) qui s'insère dans la membrane plasmique et reste dans des vésicules
d'internalisation. Il passe ainsi par des vésicules recyclées vers la synapse de terminaisons
nerveuses: sur des tissus neuromusculaires, on peut l'imager de manière intermittente pendant des
heures (Benoit et al, 1996, Meunier et al, 1997). Sur tissus végétaux vivants, FM1-43 et FM4-64
sont intéressants pour décorer par fluorescence l'histologie générale. Plus précisément, ces
molécules servent pour suivre les membranes lors d’endocytose chez les végétaux, méthode à
prendre avec précautions (Bolte et al. 2004).
V) Facteurs influençant la fluorescence : l’environnement
Les différentes caractéristiques de l’émission de fluorescence : spectre, polarisation, rendement
quantique et durée de vie de fluorescence ne constituent la signature d’une molécule que sous
certaines conditions. En effet, ces paramètres dépendent fortement de l’environnement local de la
molécule. Des changements plus ou moins importants peuvent se manifester sous l’effet de divers
facteurs. Nous n’allons pas ici passer en revue détaillée les différents facteurs, mais seulement
aborder les plus courants d’entre eux qui sont le pH, la polarité, la présence d’ions ou les
éventuelles interactions avec d’autres molécules (quenchers) (Figure 3).
polarité
potentiel
électrique
Figure 3. Représentation schématique des
différents facteurs environnementaux
susceptibles d’influencer la fluorescence.
(Valeur, 2002)
liaison
hydrogène
Fluorescence
moléculaire
ions
quenchers
température
pH
pression
viscosité
V.1) La polarité
La disponibilité d'un électron S, ou électron délocalisé d'un noyau aromatique, pour absorber
l'énergie du champ électrique d'une onde photonique pour passer à l'état excité et ensuite émettre de
nouveau un photon est très dépendante de son environnement. La polarité modifie la stabilité des
formes moléculaires. Le fluorochrome étant davantage polaire à l'état excité qu'à l'état fondamental,
la fluorescence aura lieu à des longueurs d'onde d'autant plus grandes qu'il est dans un
environnement polaire car l'état excité y est plus stable. Donc, dans de nombreux cas, le spectre de
fluorescence d’un fluorochrome dépendra de son environnement physico-chimique : c’est le cas par
9
exemple du Rouge de Nil (Nile Red) qui émet dans le rouge quand il s’insère dans des membranes
phospholipidiques polaires et dans le jaune quand il est en contact avec des triglycérides neutres.
C’est aussi le cas du marqueur de mitochondries JC1, un carbocyanine, dont la fluorescence
dépendra du potentiel de la membrane (verte à l’état monomérique et rouge avec l’empilement qui
suit une hyperpolarisation). Le rapport Irouge / Ivert reflète l'hyperpolarisation. Des rapporteurs de
potentiel membranaire basés sur des protéines fluorescentes (Perron et al. 2009) et d’autres
fluorophores sensibles aux dipôles électriques membranaires (Andrey et al. 2003) émergent.
La pénétration des fluorochomes dans la cellule peut dépendre de leur degré de lipophilicité : une
sonde très lipophile (par exemple diphényle-hexatriène) tendra à partitionner sur tous les lipides,
une sonde amphiphile avec une tête chargée (marqueurs de plasmalemme tels que FM1-43, FM464, TMA-DPH) restera enchâssée dans les membranes, tandis que d’autres moins lipophiles
traverseront les membranes avant de se concentrer dans certains compartiments subcellulaires
(bisbenzimide Hoechst 33342 vers les bases AT de la chromatine, Rhodamine 123 avec sa charge
positive délocalisée vers la mitochondrie). Enfin, il faut noter qu’une sonde fluorescente peut
pénétrer par des mécanismes différents selon le règne cellulaire considéré : ainsi le Jaune Lucifer
(Lucifer Yellow) déclaré imperméant aux membranes animales est en fait transporté activement par
une membrane de cellule végétale (Cole et al. 1991). De même un marqueur de céramides accepté
pour reconnaître le Golgi animal ne marque pas le Golgi des plantes (Satiat-Jeunemaître et al.
communication personnelle).
V.2) Le pH
La protonation ou la déprotonation de groupes fonctionnels modifient profondément de nombreux
fluorophores, soit au niveau de leur rendement quantique par rapport aux autres processus non
radiatifs, soit au niveau de la forme des spectres d'excitation (cas de la GFPwt, pKa 5,5 ou de la
fluorescéine, pKa 6,3) ou d'émission. Certains composés ont été développés pour estimer le pH en
biologie cellulaire, e.g. BCECF (pKa 6,98); carboxy SNARF-1 (pKa | 7,5) (Figure 4) et ses
améliorations -4F ou -5F, diacétoxy-dicyanobenzène (ADB, pKa | 8, qui produit par
désestérification le DCH, 2,3-dicyanohydrochinon). Dans le cas de la sonde calcique Indo-1 (acide
faible), la forme non dissociée dans un milieu acide tend à diffuser à travers des membranes, tandis
que la forme dissociée sera accumulée dans un compartiment neutre (ou plus alcalin) comme le
cytoplasme. Une base faible comme le rouge neutre (pKa 6,8) diffuse à l’état neutre puis est
piégée par protonation dans les vacuoles acides. Ces sondes sont donc des bons marqueurs de la
compartimentation.
iso(s)beste
Figure 4. Spectres d'émission de fluorescence dépendant du pH, de la sonde ratiométrique carboxy-SNARF-1, pour
différentes excitations 488 (A), 514 (B), 534 (C). (Haugland 2005 : Molecular Probes)
10
Remarque : Un déplacement d'absorption vers des longueurs d'onde courte s'appelle hypsochrome,
un vers les longueurs d'onde plus grandes, bathochrome.
V.3) Les ions métalliques
On peut citer la forte dépendance de la fluorescence de la mithramycine et de la chromomycine
2+
envers Mg et la perte de fluorescence du colorant bisbenzimide Hoechst 33342 en présence d'un
bromure incorporé sur l'ADN. On observe souvent une perte de la fluorescence en présence de
2+
Mn , particulièrement avec les sondes chélatrices de calcium. Evidemment, on a développé des
2+
2+
+
sondes fluorescentes pour estimer l'activité de divers ions, comme Ca , Mg , Na , etc. (Hawes et
Satiat-Jeunemaître 2001 ; Mason, 1999 ; Métézeau et al, 1994 ; Haugland, 2005) : avec de
nombreux dérivés modifiés pour leur affinité (Kd ) ou encore pour sonder, par exemple, une surface
membranaire.
V.4) Concentration ou agrégation
Des effets de filtre interne à fortes concentrations et surtout de dimérisation ou d'agrégation vont
modifier les propriétés spectrales et l'efficacité de la fluorescence, permettant la mise en oeuvre de
certaines stratégies méthodologiques en biologie cellulaire. Par exemple, une forte concentration de
carboxy-fluorescéine (1 mM) est quasi non-fluorescente : des liposomes contenant cette
concentration, internalisés, rendent la cellule fluorescente seulement une fois dégradés. La
carbocyanine lipophile JC-1, comme les colorants semblables DiOC(x)y avec charges positives
délocalisées, s'accumule en réponse à une différence de potentiel décrite par la loi de Nernst dans
un compartiment négatif, tel la mitochondrie (facteur d’accumulation ~10x pour une potentiel de
-61 mV). Sa forme monomérique donne une fluorescence verte. Après hyperpolarisation de la
membrane, un empilement sur la face négative interne de la membrane produit des agrégats-J, avec
une émission déplacée vers le rouge.
V.5) Température
Généralement, le rendement quantique d’un fluorochrome augmente avec une baisse de la
température.
V.6) Quenching
En absence de couplage intersystème et de conversion interne, le rendement quantique approche la
valeur maximale de 1. Si l’on ajoute, dans la solution contenant le fluorophore, des molécules qui
vont entrer en collision avec les molécules fluorescentes ou des molécules capables de former avec
elles des complexes qui n’émettent pas de radiation lumineuse, d’autres voies de désexcitation vont
pouvoir se produire. Ces deux types de molécules vont jouer le rôle de quenchers de la molécule
fluorescente : lors des collisions intermoléculaires, l’énergie électronique sera convertie en énergie
cinétique et de vibrations, c’est le quenching dynamique. Le quenching statique est observé lors
de la formation de complexes non fluorescents. Dans les deux cas, la valeur du rendement
quantique va décroître et la fluorescence sera faible, voire non détectable. Le (F)RET est un cas
particulier de quenching (voir cours spécifique FRET/FLIM).
V.7) Pénétration des fluorochromes dans la cellule
Comment faire pénétrer un fluorochrome dans des cellules vivantes ? (Tableau 2) Normalement,
une sonde lipophile va s'insérer dans la membrane et soit y rester, comme le fait FM1-43 et FM464 (ancrée par leur charge), soit en marquant par échange toutes les phases lipidiques comme le fait
Nile Red (neutre). D'autres sondes amphiphiles franchissent la membrane avant de se concentrer
11
dans certains compartiments cellulaires, comme Hoechst 33342 vers le noyau, ou la Rhodamine
123 vers la mitochondrie (sa forme protonée est captée dans l'intérieur électronégatif de cet
organite). Une base faible s’accumule dans un compartiment acide comme la vacuole (piégée par
protonation). Un acide faible s’accumule dans un compartiment alcalin dû à son état dissocié et
chargé. Une stratégie majeure consiste dans la préparation de dérivés estérifiés, assez lipophiles
pour traverser une membrane : on compte en suite sur des estérases cellulaires pour libérer le
composé actif sur place.
Pour résumer, il faudra finalement bien connaître les caractéristiques physico-chimiques d’un
fluorochrome pour une utilisation optimale : classe de composé, pKa, pKi, coefficient d’extinction,
brillance, photostabilité, etc., et être vigilant aux conditions de l’environnement du fluorochrome
qui pourraient éventuellement changer ses caractéristiques. Il faudra comprendre l’action d’un
fluorochrome avant de le déclarer spécifique d’un marquage donné, et compléter les analyses
obtenues par d’autres approches complémentaires.
Tableau 2. Quelques mécanismes de pénétration des fluorochromes dans la cellule
± diffusion :
exemple, iodure de propidium diffuse à travers une membrane dégradée ; exclus
par une membrane intacte
lipophilicité : Nile Red, DPH (di-phenyl-hexatriéne) ; DiIC18(3) sur membranes neuronales
lipophile et
polaire :
= ancrage. TMA-DPH (tetra-méthyl-DPH), FM1-43, FM4-64 (amino-styryls)
amphiphile : bisbenzimide Hoechst 33342 (perméant) versus Hoechst 33258 (non perméant)
amphiphile
avec charge
délocalisée :
exemples avec charges positives, DiOC6(3), JC-1, Rhodamine123. Vers la
mitochondrie, leurs formes chargées seront captées à l'intérieur
électronégatif de cet organite, d’après l’équation simplifié de Nernst :
distribution d’une molécule perméante de part et d’autre d’une membrane
chargée V(mV)
V = -61,5 log ( [M+]i / [M+]e )
soit, -61 mV vaut 10x concentration.
base faible :
exemple, Rouge neutre ou une alcaloïde s’accumulent dans un compartiment
acide comme la vacuole (piégée par protonation), d’après l’équation de
Waddel & Butler :
pour une base faible perméante dans un système à deux compartiments: i,
intérieur et e, externe ,
alors Ci / Ce =
10pHe - pHi
soit, Δ1 pH vaut 10x concentration.
acide faible : exemple, Fluorescéine cytosolique s’accumule dans un compartiment alcalin
(chloroplaste) par son état dissocié et chargé… Δ1 pH vaut 10x concentration.
dérivés
estérifiés :
fluorescéine di-acétate, assez lipophiles pour traverser une membrane. On
compte ensuite sur des estérases cellulaires pour libérer le composé actif sur
place.
12
VI) Montage de l’échantillon
Le montage de l'échantillon pour la microscopie doit prendre en compte les particularités
structurales, optiques et physicochimiques de l’environnement. Les contraintes structurales sont
liées au volume de l’échantillon (préserver la forme). Mais également il faut pouvoir immobiliser
l’échantillon (notamment pour les protoplastes, les cellules), et respecter son orientation, etc.
L’utilisation de colles médicales (exemple : PSA, NuSil), de poly-L-lysine, ou d’agar, permet de
répondre à ces contraintes structurales. L’uniformité du chemin optique doit être respectée, par
l’homogénéisation des indices de réfraction milieu/lamelle/huile, ou saline/lamelle/eau, et
l’utilisation d’objectifs appropriés à huile ou à eau (soit dipping lens sans lamelle); planéité et
stabilité ; transparence (limpidité), conformité des lamelles (typiquement 170 µm).
Enfin des contraintes physico-chimiques telles que le contrôle de pH, de tonicité, piège de radicaux
libres (essentiel pour réduire la photo-destruction), chélation de métaux lourds, conservation
(glycérol), maîtrise de l'autofluorescence sont également à prendre en compte dans le choix du
milieu de montage.
Dans certains cas d’études fonctionnelles, il sera aussi essentiel de respecter certaines contraintes
biologiques, telles que le taux d’oxygénation, le pH, la température, le CO2, etc. essentiellement
pour la viabilité et la protection des fonctions. Par exemple, un excès de lumière va moduler la
fluorescence des systèmes photosynthétiques dans le cas des échantillons végétaux ou fragiliser la
GFP. Plusieurs milieux de montage commerciaux sont couramment utilisés en fonction de
l’application finale.
VII) Choix d’une sonde fluorescente
Le choix d’un fluorochrome doit répondre à plusieurs critères : obtenir un signal spécifique, durable
et fort. Dans la cellule vivante, le fluorochrome doit permettre de respecter autant que possible les
fonctions cellulaires (Fricker et al. 2001). Le marquage des cellules par des fluorochromes permet
d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories : les paramètres
fonctionnels et les paramètres structuraux (revue pour le matériel végétal : Brown et al, 2003 ;
Haseloff 2003). Deux références majeurs sur les fluorophores et colorants : Haugland (2005) et
Horobin et Kiernan (2002), et sur la spectroscopie Lakowicz (2006).
VII.1) Les paramètres fonctionnels
Ils reflètent des modifications rapides dans des cellules vivantes, incluant aussi bien les activités
enzymatiques (peroxydases, déshydrogénases...), les mouvements ioniques (calcium, pH...), ou la
perméabilité membranaire. A titre d'exemple, considérons quelques dérivés de la fluorescéine
conçus pour répondre à ces besoins (Figure 5).
VII.2) Les paramètres structuraux
Ils correspondent généralement à des macromolécules ou à un ensemble de constituants (ADN,
protéines du cytosquelette...), ou à des molécules constitutives de taille plus faible mais présentes
en concentration significative (antigène membranaire, cholestérol...). Le tableau 3 résume quelques
fluorochromes utilisés en microcopie confocale. Le tableau 6 (fin du chapitre) modifié de Mason
1999 est une liste détaillée des fluorochromes. Ajoutons bien sûr l'apport de la GFP et de ses
dérivées, et de marqueurs avec une brillance et une stabilité accrues tels que les AlexaFluors, etc.
Notons aussi plusieurs stratégies récentes pour révéler une activité cellulaire par expression ou
incorporation in vivo d’un composé qui sera ensuite révélé par un fluorophore reconnaissant
l’haptène, formant une liaison covalente. La deuxième étape peut exploiter des « révélateurs »
13
perméants ou non. La Figure 6 présente plusieurs exemples parmi les SNAP-, CLIP-, ACP-, MCPtags (BioLabs Ozyme) ou encore l’incorporation d’analogues de nucléosides dans l’ADN révélé
avec Click-iT (Invitrogen) fluorescent. Ce dernier est bien plus robuste que la technique de bromodésoxy-uridine révélée avec un anticorps (exemple sur racines, Vanstraelen et al. 2009).
Figure 5. Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine.
O
O
HO
O
O
HO
O
COO-H+
COO-H+
N C S
- Excitation maximum 492-495 nm
- Emission maximum 521 nm
iso-thiocyanate
de fluorescéine (FITC)
di-acétate
de fluorescéine (FDA)
- quasi non fluorescent
- rendement quantique 0,6 à 0,9
- perméant aux membranes
- pKa 6,3; acide faible
- Réagit avec les amines, sert
- largement imperméable à la
membrane à pH >7
O
- estérases cellulaires libèrent
la fluorescéine acide
donc pour étiqueter des protéines
O
O
O
O-C-CH3
O
CH3-C-O
O
(BCECF-AM)
O-C-CH3
R-O
Cl
O
COO-H+
R-OOC
O-R
COO-R
O
COO-H+
R-OOC
di-acétate de
5-carboxyfluorescéine
(CFDA)
O
Cl
H
O
O
2’,7’-bis(carboxyethyl)
-5(6)-carboxyfluorescéine,
penta-acétoxyméthyl ester
- analogue au FDA
di-acétate de
2’,7’-dichlorofluorescin
(DCFH-DA)
- analogue à la FDA
- analogue à la FDA, réduite
- lactone perméante
- les estérases libèrent un produit
- et le produit carboxyfluorescéine
(pKa 6,4) est mieux retenu dans
la cellule
non fluorescent qui au cours d’une
O
O-C-CH3
COO-H+
fluorescéine
CH3-C-O
O
O
CH3-C-O
- le produit BCECF, avec pKa 6,97
et une charge nette -4 à -5 est bien
retenu dans la cellule et la
dépendance de sa fluorescence sur
le pH permet son emploi comme
sonde de pH cytoplasmique
activité cellulaire peroxydasique,
devient fluorescent
O
O
CH3-C-O
Cl
O-C-CH3
Cl
H
COO-H+
Di-acétate de
(DCFH-DA)
Perméation, libération,
activation
Membrane cellulaire
O
O
O
CH3-C-O
Cl
O-C-CH3
H
Cl
COO-H+
Désacétylation intracellulaire par des estérases
HO
HO
O
Cl
Cl
O
OH
OH
H
Cl
COO-H+
(non fluorescent)
+ H2O2
(+ peroxydase)
Cl
COO-H+
2’,7’-dichlorofluorescein
(fluorescent)
14
Figure 6. Une activité cellulaire révélée par expression ou incorporation in vivo d’un composé qui sera
ensuite marqué par un fluorophore reconnaissant l’haptène, formant une liaison covalente.
15
Tableau 3. Quelques fluorochromes utilisés en microscopie confocale
immunofluorescence
ADN
mitochondie, sensible
au potentiel
membranaire
membranes
réticulum
endoplasmique
appareil de Golgi
parois
AMCA ; Alexa Fluor 488, Alexa 568, Alexa 647, etc. ; Cy2 (Cyanine2), FITC,
Cy3.5, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy5.18, Cy5.5
Iodure de propidium, YOYO, SYTO16 (vital), chromomycine A3 ou
mithramycine (bases GC), bisbenzimide Hoechst 33342 (quelquefois vital),
DAPI, YOPRO, TOTO3, TOPRO3 (avec TOPRO et YOPRO, le PBS saline
favorisera un photoblanchissement.) (oligos Cy3.18, Cy5.18)
Rhodamine123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Orange ou Red
CMXRos (vital; post-fixation possible)
FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, et divers anticorps de surface ; filipin pour
cholestérol
(non spécifique) DiOC6(3) à plus forte concentrations ; GFP-taggée
quelques anticorps ; GFP-taggée ; NBD-C6-ceramide (pas pour végétaux)
Acriflavine Feulgen, Calcofluor (UV), bleu d'aniline (sur callose),
chromomycine ou iodure de propidium (non spécifique), FM1-43, FM4-64
dépendance envers le carboxy-SNARF-1 et dérivés, BCECF
pH
dépendance envers le Fluo-3 ou -4 (rFF), Fura Red, CalciGreen ; Indo-1, Cameleon
calcium
viabilité
Protéines
Autofluorescentes
divers
fluorescéine di-acetate ; exclusion d'iodure de propidium ; Fluoro-Jade (HistoChem) pour neuro-dégénération ; …et la morphologie par Contraste
Interférentiel (DIC)
CFP, GFP, YFP, DsRed, DsRed2, HcRed1, mRFP1, mCherry, etc
LysoTracker, Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle,
composés endogens,
VII.3) Contraintes liées à l’excitation
Comme on l’a vu dans le paragraphe II, une bonne connaissance des spectres d’excitation et
d’émission du fluorochrome choisi permettra de déterminer les filtres d’excitation et d’émission à
utiliser, notamment en cas d’utilisation de plusieurs fluorochromes : de nombreux ouvrages traitent
de la méthodologie à adapter pour l’examen simultané de fluorochromes présentant des
caractéristiques spectrales différentes. Il existe des situations où deux fluorochromes peuvent être
excités par une même source mais peuvent se distinguer aisément grâce à des spectres d’émissions
différents. C’est le cas par exemple – excitation bleu - du couple fluorescéine-iodure de propidium
ou, du couple GFP-chlorophylle in situ. On pourra aussi provoquer une excitation simultanée des
deux fluorochromes par deux fenêtres spectrales (d’une lampe) ou deux raies (de lasers) distinctes.
C’est le cas par exemple – excitations bleu et vert - avec un double immunomarquage utilisant les
couples fluorescéine-Texas Red ou Alexa 488-Alexas 568. L’efficacité et la spécificité du signal
dépendent de la bonne adéquation entre un fluorochrome spécifique et les sources lasers utilisées.
Le tableau 4 présente les différentes options de laser disponibles pour la microscopie confocale.
Une contrainte majeure concerne les longueurs d'onde et les puissances disponibles.
16
Tableau 4. Quelques options de lasers pour la microscopie confocale.
_______________________________________________________________________________
Krypton/Argon 60 mW démodé * 488 nm (15 mW), 568 nm (15 mW) & 647 nm (15 mW)
Argon Ion 100mW 457 nm (454+458 nm, 6mW), 476 nm (6mW), 488 nm (40mW) & 514 nm (40mW)
Argon Ion 250 mW (UV/Vis) 351+363 nm (50mW), 488 nm (100mW) & 514 nm (100mW)
Blue Laser Diode
405 nm (50-100 mW)
Helium Cadmium
442 nm (80 mW)
Helium Neon-Green
543 nm (2 mW)
DiodePumpedSolidState561
561 nm (50 mW)
Helium Neon-Orange
595 nm (3 mW)
Helium Neon-Red
633 nm (10 mW)
laser blanc
470 - 670 nm
Accordable fs for multi-photon
Ytterbium fs with spectral selection
705-980 nm (1 W)
950-1150 nm (45%)
*le rapport entre les différentes raies a tendance à se dégrader avec le temps.
Des filtres opto-acoustiques accordables (AOTF, Acousto-Optic Tunable Filter) sont disponibles
pour moduler la puissance relative des raies incidentes, à insérer entre le laser et le microscope.
Dans le cas d’un laser Argon (qui a entre autres une ligne à 488 nm), et d’un laser Hélium–Néon
vert (une ligne unique à 543 nm), les fluorochromes étudiés doivent avoir chacun leur spectre
d’excitation ciblé (avec un risque de chevauchement partiel) et des spectres d’émission qui doivent
être les plus éloignés possibles. Il est avantageux d’utiliser la raie 488 nm d’un laser Argon et 568
nm d’un laser Krypton-Argon, mais ce dernier laser devient moins courant. On peut également
détecter trois fluorophores différents grâce aux lignes 488, 543 (ou 561 ou 568), et 633 (ou 647)
nm, pour étudier par exemple trois anticorps marqués par Alexa 488, Alexa 568 et Alexa 647
(tableau 5). Notons enfin qu’un laser à diode Bleu (ligne à ≈ 405 nm) peut remplacer les lasers UV
anciens. Ainsi on fait l'acquisition simultanée de trois ou quatre signaux fluorescents en fonction
des raies lasers disponibles et en plus l’acquisition d’images corrélées en transmission, en contraste
de phase ou en contraste interférentiel de Nomarski. On peut également travailler en réflectance, sur
de l’immuno-gold, ou avec la précipitation de X-GLU, X-GUS. L'acquisition en ratio-imaging de
Ca2+ et de pH, via Indo-1, Fluo-3 –4 ou Fura Red puis SNARF (ou BCECF) est possible, ou encore
avec des biosenseurs basés sur les protéines fluorescentes.
Alternativement, les fluorochromes peuvent être excités avec les raies lasers adéquates l’un après
l’autre. Dans ce cas on minimise les risques d’interférence entre les spectres (cross-talk). Cette
excitation séquentielle est plus longue à l’acquisition mais vivement recommandée notamment
dans le cas d’une détection par des raies lasers proches (488 nm et 543 nm) de double ou triple
marquage, mais aussi pour réaliser des techniques de FRET (Förster Resonant Energy Transfer).
L’utilisation de multiples raies laser implique des miroirs dichroïques complexes permettant de
diriger le ou les lasers vers l’échantillon. Or il y a d’importantes pertes de fluorescence dues aux
larges bandes de réflexion de ces miroirs. Une alternative très efficace est l’AOBS (Acousto-Optic
Beam Splitter), semblable à l’AOTF, qui est accordable en quelques µs et qui fait enter le laser avec
une bande passante de ≈ 4 nm en laissant un retour maximal de la fluorescence vers les détecteurs.
17
Tableau 5. Une famille de fluorophores pour marquer les protéines, les anticorps secondaires
Fluorophore
Absorption*
(nm)
Emission*
(nm)
Couleur
346
401
433
495
532
556
555
578
590
612
632
633
650
663
679
702
749
442
421
541
519
553
573
565
603
617
628
647
647
665
690
702
723
775
Bleu
Violet
Jaune-vert
Vert
Jaune
Orange
Jaune-orange
Orange-rouge
Rouge
Rouge
Rouge lointain
Rouge lointain
Rouge lointain
Rouge lointain
Rouge lointain
Rouge lointain
Infra-rouge proche
AlexaFluor 350
AlexaFluor 405
AlexaFluor 430
AlexaFluor 488
AlexaFluor 532
AlexaFluor 546
AlexaFluor 555
AlexaFluor 568
AlexaFluor 594
AlexaFluor 610
AlexaFluor 633
AlexaFluor 635
AlexaFluor 647
AlexaFluor 660
AlexaFluor 680
AlexaFluor 700
AlexaFluor 750
Coefficient
d’extinction
-1
-1
( M . cm )
19.000
34.000
16.000
71.000
81.000
104.000
150.000
91.300
73.000
138.000
239.000
140.000
239.000
132.000
184.000
192.000
240.000
* maximun approximatif d’absorption et d’émission ; l’oeil est peu sensible au-dela de 650 nm.
Modifié d’après Molecular Probes Inc, voir Invitrogen
conseillé dans notre expérience pour triple marquage avec les raies laser d’excitation : 488, 543, 633.
PE
TX Red
FITC
Absorbance relative
Emission relative
FITC
450
500
550
600
650
500
550
Longueur d’onde (nm)
PE
TX Red
BP
580
BP
630
600
650
700
Figure 7. Spectres normalisés d’absorbance (A) et d’émission (E) de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), de la
phycoérythrine (PE) et du Texas Red (TX Red).
18
VII.4) Contraintes liées à l’émission
En présence de plusieurs fluorochromes, des fuites optiques à travers des filtres d'analyse respectifs
peuvent néanmoins apparaître à cause du recouvrement de leurs spectres d'émission. Ceci est
courant lors de l'observation avec des marqueurs FITC (iso-thiocyanate de fluorescéine) et TRITC
(iso-thiocyanate de tétra-méthylrhodamine) excités dans le bleu-vert.
D’abord, on cherche à contourner le problème par le choix des fluorochromes, retenant des
fluorochromes ayant des spectres d’émission éloignés et se chevauchant le moins possibles. Si la
fluorescéine a tendance à déborder dans la voie de lecture de la rhodamine, soit on choisit la
fluorescéine pour le marquage le moins fort, soit on remplace la rhodamine par le Texas Red qui
émet plus loin (Figure 7), soit encore on utilisera un microscope équipé de raies laser permettant
une meilleure excitation spécifique pour chaque fluorochrome (voir paragraphe VII.3)
La gamme des Cyanines (tableaux 3 et 6) (mais quelquefois avec des bruits de fond) et surtout la
récente gamme Alexa Fluor (tableau 5) donnent d'excellents résultats. MoBiTec (Goettingen :
www.mobitec.de) offre également une gamme pour dériver des protéines : les fluorophores DY (du
jaune au rouge lointain, très brillants) et les MFP. La Cyanine 5.18 (« Cy5 »), excitée par les raies
633 ou 647 nm de certains lasers, émet loin dans le rouge (em 667 nm) et évite ainsi le « crosstalk ». Par contre, étant donné que l’oeil est peu sensible à cette émission dans le rouge lointain, le
biologiste peut difficilement apprécier la qualité des marquages par microscopie conventionnelle avec des photocapteurs l’analyse est possible. Rappelons que la résolution est dépendante de O
meilleure dans le bleu que le rouge, et que tout travail visant la colocalisation ou le calcul de
rapports d'images devrait cerner le degré de chromatisme de l’optique.
Phycobiliprotéines, tandems, etc. En cytométrie, on a vite adopté des phycobili-protéines telle que
la phycoérythrine pour une double quantification (avec FITC) à partir d'une seule excitation à 488
nm. De plus, ces grands pigments naturels, de par leur absorbtivité molaire 50 à 100 fois celle de la
fluorescéine ou de la rhodamine, offrent un gain de sensibilité, mais au prix de leur taille et d'un
encombrement stérique important (240 kDa). On ne les emploie que rarement en microscopie
apparemment à cause de leur sensibilité à la photodégradation. De même, si les fluorochromes
tandems sont très appréciés en cytométrie (Duochrome, Red613, ECD, Tricolor, Red670, Quantum
Red, Cychrome), ce n'est pas le cas en microscopie : il s'agit de couples greffés ensemble,
typiquement de manière covalente, afin d'obtenir un transfert d'énergie par résonance et un grand
déplacement entre l'excitation primaire à 488 nm et l'émission de l'accepteur dans le rouge.
Si on ne peut pas séparer parfaitement l’émission des deux fluorochromes, on devra faire des
excitations séquentielles dans le temps avec changement de configuration pour optimiser la
spécificité des marqueurs. Dans ce mode d’acquisition on excite les deux fluorochromes non pas
simultanément mais l’un après l’autre, ligne-par-ligne ou cadre-par-cadre ou pile-par-pile.
Il est à noter que certains logiciels offrent une décomposition spectrale (« déconvolution spectrale »
= spectral un-mixing : voir cours Spectroscopie en microscopie). Mais rien ne vaut une bonne
acquisition.
Un dernier paramètre à prendre en compte est la réponse spectrale des photomultiplicateurs.
Certains d’entre eux sont plus particulièrement dédiés à une lecture optimale dans le bleu et
d’autres plus appropriés à des longueurs d’ondes plus importants.
19
Figure 8. UV-excited fluorescence spectra of leaves with characteristic emission bands. Maxima of fluorescence
emission spectra of adaxial sides pea and sugar beet leaves are indicated. Spectra are superimposed on the absorption
spectrum of a methalonic extract of leaves. Fluorescence was excited at 355 nm. Fluorescence spectra are expressed in
quinine sulphate equivalent units (QSEU) ; 1000 QSEU correspond to the fluoresence of 1 PM quinine sulphate
dihydrate in 1 cm layer of 0.105 mol.L-1 perchloric acid, excited at 347.5 nm and emitted at 450 nm, under identical
measuring conditions. (Cerovic et al, 1999)
Figure 9. Leaf pigments relevant to UVexcited fluorescence. Absorption and
fluorescence characteristics of several
important leaf components are presented. In
the four top graphs are representatives of
BGF leaf fluorophores, the fifth graph
shows strong leaf absorbers which do not
fluoresce, and the two bottom graphs show
chlorophyll a will contribute to red
fluorescence in vivo. Thin line, absorption;
dashed thick line, fluorescence excitation ;
full thick line, fluorescence emission. The
absorption spectra of ferulic acid in
methanol, NADPH, FAD and Rubisco were
in aqueous solutions at pH 7.9, the flavonols
quercetin and kaempferol were in methanol,
the carotenoid lutein in ethanol, chlorophyll
a and b were in methanol. (Cerovic et al,
1999)
20
VII.5) Auto-fluorescence
Un élément important à prendre en compte dans les études de fluorescence est l’auto-fluorescence
naturelle des tissus (Berg 2004), en particuliers chez les végétaux, où l’émission de chlorophylle
dans le rouge lointain est à prendre en considération (Figure 8, et du même équipe, Meyer et al.
2003). Mais on trouve aussi les coumarines et la NAD(P)H dans le bleu (fluorescente à l’état
réduit) et les flavines dans le vert (fluorescentes à l’état oxydé) (Figure 9). Pour des cellules de
mammifère, Zipfel et al. (2003) donne les spectres d’émission de composés endogènes sous
excitation non-linéaire. La fluorescence des acides aminés, tyrosine et phenylalanine est faible, en
UV et très dépendant de l’environnement. L’auto-fluorescence est souvent aggravée par le stress de
la cellule et la mortalité. C’est surtout les techniques de fixation qui ont tendance à amplifier l’autofluorescence : le blocage des aldéhydes libres avec glycine, NaBH4 ou NH4Cl est alors utile.
Certains traitements servent à rehausser la fluorescence naturelle de composés phénoliques afin de
les localiser dans des tissus de plantes (Hutzler et al. 1998).
VII.6) Quantification (Ronot et Usson 2001)
Une fois l'imagerie faite et les objets (contours) définis, une question élémentaire revient - Combien
de molécules de fluorescéine sont sur cette surface ou dans ce volume cellulaire ? Cette question n'a
pas de réponse facile. Intégrer correctement les intensités d'émission enregistrées est déjà un
problème. Un autre est d'assurer que la fluorescence émise est en relation linéaire avec la
concentration du fluorochrome dans le voxel mesuré, alors qu’on travaille avec des concentrations
de l’ordre de la microMolaire, conforme à la loi Beer-Lambert. On peut imaginer l'emploi d'étalons
internes tels que des billes fluorescentes.
Rigaut et al, (1994) présente des histogrammes d'ADN nucléaire pour 140 noyaux du foie de rat,
après correction mathématique pour l'atténuation de fluorescence à 50 µm de profondeur en Z.
Voulant classer les cellules d’après leur phase dans le cycle cellulaire, Souvannavong et al, (1994)
ont d’abord trié des cellules par cytométrie, avec donc une excellente quantification du paramètre
en question (l'ADN nucléaire, par marquage vital au Hoechst 33342), avant de faire l'imagerie
confocale sur la compartimentation de la phosphatase alcaline endogène au cours du cycle (avec le
réactif Fast Red RC et naphtol AS-TR).
VII.7) Techniques ratiométriques
Si l'intensité de fluorescence d'une sonde est dépendante du pH, de l'activité ionique ou du
potentiel, la mesure plus simple concerne les changements d'amplitude (d'intensités) dans une
fenêtre spectrale donnée. Mais une situation plus favorable est quand l'environnement (pH, activité
ionique, potentiel) produit un changement de la forme du spectre. Faute d'appliquer carrément la
spectroscopie, on fera alors deux mesures à des longueurs d'onde spécifiques pour suivre cette
dépendance. Typiquement on choisit des fenêtres spectrales caractéristiques des états extrêmes et
on calcule un rapport. Par exemple, pour la carboxy-SNARF-1, on prendra le rapport de
fluorescence de la forme acide sur celle de la forme basique (voir Figure 4); pour Indo-1, le rapport
de l'émission de la forme calcium-lié sur celle sans-calcium ; pour JC-1, le rapport de l'émission de
la forme agrégée sur la forme monomérique, etc.
Eventuellement, on utilisera le rapport entre la partie de fluorescence qui dépend de la propriété
étudiée (pH, par exemple) sur une autre partie indépendante de ce facteur, "point isosbest" (ou
« isobest »), c'est à dire à une longueur d'onde où rien ne se passe. L'analyse peut concerner aussi
bien un couple de fenêtres sur l'émission (le cas le plus fréquent) qu’un couple sur l'excitation. Ce
21
mode de travail corrige pour plusieurs sources de dispersion dans les résultats et améliore la
dynamique de la mesure (Hoffmann et Kosegarten 1995 pour pH avec FITC). Pour des
concentrations non saturantes, ce rapport corrige la variabilité de la concentration cellulaire
effective en sonde, l'effet de la taille cellulaire, les variations locales d'efficacité du transfert optique
etc.
VII.8) Les nanoparticules (quantum dots)
Quantum dots : des particules de nanocristaux monodisperses colloïdaux composés de matières
semi-conductrices sont actuellement évaluées comme marqueurs fluorescents (sur le nom
commercial de QDots (Figure 10) ou chez EviTags (http://www.evidenttech.com/). Leur intérêt
réside dans un très large spectre d’absorption, un coefficient d’extinction (H) élevé, couplé à une
émission étroite si leur taille et environnement est uniforme (assez difficile à assurer !) (Dubertret
et al, 2002 ; Dahan et al. 2003 ; Jovin, 2003 ; Larson et al, 2003, Michalet et al. 2005). Ils se prêtent
au pistage de particules uniques (Single Particle Tracking). Voir Howarth et al. (2005) pour une
stratégie intéressante de motif Acceptor Peptide AP, cible de biotinylation bactérienne, pour
étiqueter un récepteur avec strepavidine-Quantum Dot.
Anatomy of a quantum dot
http://probes.invitrogen.com/products/qdot/
http://www.evidenttech.com/
Violet
Figure 10. Boîtes quantiques “quantum dots” : isolated monodispers inorganic nanocrystalline particles (2-10 nm)
made from semiconducting materials
22
VIII) Perspectives
Les choix disponibles dans un projet de microscopie à fluorescence soulignent la nécessité de
bonnes bases de données (spectres, propriétés physico-chimiques, stabilité, etc.) et une
documentation des spécifications de l’appareillage (propriétés des filtres, lasers, détecteurs). Il
existe une base de données de spectroscopie des différents fluorochromes : IS-DB International
Spectroscopic Database (www.is-db.org), ainsi que les bases des entreprises privées (voir Annexe
de ce fascicule).
Peut-on citer confort comme perspective ?! L’ergonomie doit sans doute s’améliorer si la station
de travail polyvalente doit être pleinement exploitée par des myopes daltoniens sans mémoire avec
des bras courts travaillant dans une pièce obscure et quelquefois trop bruyants avec FRAP et
multimode et enceinte cellulaire thermostatique et…
Il y a la question de conserver la réactivité cellulaire. Rappelons la platine motorisée « mark-andfind » pour pouvoir étudier en boucle (en multiplexe) différentes plages cellulaires dans une longue
cinétique. Notons aussi l’utilité d’obturateurs électroniques rapide afin de couper la lumière dès que
l’image est acquise (Brown et al. 2007). D’ailleurs, les systèmes à disc Nipkow (spinning disks)
sont plus efficaces et économes en lumière, donc moins agressifs pour le tissu.
Etant donné la forte amélioration de l'efficacité des microscopes confocaux, une étape critique
concerne les méthodes de préparation de l'échantillon et l'optimisation des marqueurs
fluorescents. Comme dans d’autres types cellulaires, il est très difficile « d’améner » des
fluorochromes (et d'autres molécules) à l'intérieur de la cellule. Avec les végétaux, une meilleure
maîtrise de l'autofluorescence (chlorophylle, composés phénoliques, flavines) est indispensable.
L'analyse spectrale, dans le microscope confocal, apporte de précieuses informations et offre
surtout une souplesse utile dans l'ajustement des fenêtres d'observation.
Nous sommes tout au début des applications de nanoparticules en biologie. Wu et al. (2009)
viennent d’introduire des particules à « upconverted luminescence » (émission anti-Stokes), excités
en infra-rouge pour une émission en visible, évitant ainsi toute autofluorescence. Le cours
Microscopie Corrélative traite de l’intérêt des contrastants donnant un signal à la fois en
fluorescence et en microscopie électronique, comme le Nano-Fluorgold et les nanoparticules.
Avec des transducteurs acousto-optiques (AOTF, AOBS, piézo-Z), on obtient également le
balayage amorphe en X,Y,Z avec des gains d'efficacité à tous les niveaux : plus vite, moins de
données inutiles, temps d'exposition réduit, etc.. Ce balayage amorphe est également employé, avec
des périodes de fortes intensités, pour les expériences de FRAP ou de FLIP ou de photo-activation.
Des logiciels d’analyse de mouvement existent pour construire des kymographes. Mais c’est plus
difficile à viser un organite qui se déplace pour faire FRAP ou CALI (Chromophore Assisted Laser
Inactivation : Jay et Sakurai 1999, Rajfur et al. 2002).
La spectroscopie à corrélation de fluorescence (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)
mesure les temps de diffusion des particules fluorescentes en solution ; on accède ainsi à la
stoechiométrie des complexes, à la dynamique des interactions entre biomolécules, et ceci même au
sein de la cellule par imagerie (Guérin et Torreilles 1998, Lamb et al. 2005).
La microscopie à optique non-linéaire (« multiphoton »), bien qu’onéreuse, a beaucoup progressée
en fiabilité, facilité d’utilisation et souplesse. Son intérêt réside dans la confocalité à l'excitation et à
la meilleure pénétration de ce faisceau, un avantage clé avec des tissus épais. Les sources pulsées se
prêtent particulièrement à la Fluorescence Life-time Imaging Microscopy et offrent une précision
en volume pour des expériences de FRAP. Enfin, le SHG et THG (voir cours Multiphoton) sont des
signaux originaux et souvent complémentaires de la fluorescence (Feijo et Moreno 2004, Debarre
et al 2006).
23
Avec les lasers à gaz mixte (Argon-Krypton) dans les années 1990, maintenant surpassés par les
multiples sources de lasers économes, les dispositifs optoélectroniques ou acousto-optiques
(AOTF, AOBS), ainsi qu'un choix élargi d'objectifs, la microscopie confocale a gagné beaucoup de
souplesse et de rapidité. Avec l’arrivée de lasers violets économes, nous voyons une vague
d’applications de fluorophores excités en violet, au-delà des protéines PA-GFP et kaede traitées
dans le chapitre « GFP ».
La maîtrise de divers gènes-rapporteurs ou protéines-taggées ou « Biosensors » (Rogers et al. 2005)
comme la Green Fluorescent Protein (Tsien 1998, Bolte et al. 2007; voir cours Les protéines
fluorescentes) ou encore les fluorophores photo-convertibles (Ando et al. 2002, 2004 ; Arimura et
al. 2004) est également un atout majeur pour l'exploration cellulaire à travers ce cher trou d'épingle.
Bibliographie
Allen GJ, Kwak JM, Chu SP, Llopis J, Tsien RY, Harper JF, Schroeder JI (1999) Cameleon calcium indicator reports cytoplasmic
dynamics in Arabidopsis guard cells. Plant J. 19:737-747
Allen, G.J., Chu, S.P., Harrington, C.L., Schumacher, K., Hoffmann, T., Tang, Y.Y., Grill, E., Schroeder, J.I. 2001. A defined range
of guard cell calcium oscillation parameters encodes stomatal movements. Nature, 411, 1053-1057
Ando R, Hama H, Yamamoto-Hino M, Mizuno H, Miyawaki A. (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red
photoconversion of a fluorescent protein. PNAS. 99 : 12651-12656.
Ando, R., Mizuno, H., Miyawaki, A. 2004. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting.
Science, 306, 1370-1373.
Andrey S. Klymchenko A S, Duportail G, Mély Y, Demchenko A P (2003) Ultrasensitive two-color fluorescence probes for dipole
potential in phospholipid membranes. PNAS, 100: 11219–11224
Arimura, S., Yamamoto, J., Aida, G.P., Nakazono, M., Tsutsumi, N. 2004. Frequent fusion and fission of plant mitochondria with
unequal nucleoid distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7805-7808.
Bastiaens et Squire (1999) Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.
Trends Cell Biology. 9: 48-52
Bastiaens P.I., Pepperkok R. (2000) Observing proteins in their natural habitat: the living cell. Trends in Biochemistry. Science. 25,
631-7
Benoit E, Juzans P, Legrand A-M, Molgo J (1996) Nodal swelling produced by ciguatoxin-induced selective activation of sodium
channels in myelinated nerve fibers. Neuroscience. 71: 1121-1131
Berg RH (2004) Evaluation of spectral imaging for plant cell analysis. J Microscopy, 214, 174-181
Boevink P., Oparka K., Santa Cruz S., Martin B., Betteridge A., Hawes C. (1998). Stacks on tracks : the plant Golgi apparatus
traffics on an active ER/actin network. Plant Journal, 15 (3), 441-447.
Bolte S, Talbot C, Boutte Y, Catrice O, Read ND, Satiat-Jeunemaitre B (2004) FM-dyes as experimental probes for dissecting
vesicle trafficking in living plant cells. J. Microscopy, 214, 159-173
Bolte, S., Boutté, Y., Kluge, C., Brown, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: New Probes for
Functional Genomics. Chpt 14 dans: Functional Plant Genomics, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK
277-310
Brandizzi F, Fricker M, Hawes C (2002a) A greener world: the revolution on plant bioimaging. Nature Reviews, Molecular Cell
Biology. 3: 520-530
Brandizzi F, Snapp EL, Roberts AG, Lippincott-Schwart J, Hawes C (2002b) Membrane protein transport between the endoplasmic
reticulum and the Golgi in tobacco leaves is energy dependent but cytoskeleton independent: evidence from selective
photobleaching. Plant Cell. 14: 1293-1309
Brown S., Poujol-Talbot C., Kronenberger J., Traas J., Satiat-Jeunemaître B. (2003) L’apport de la microscopie et de l’imagerie en
génomique. Dans Dynamique du génome végétal JF Briat et JF Morot-Gaudry (eds.) INRA Edition, chap. 16
Brown, S., Bolte, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: Microscopy and associated bio-imaging
techniques. Chpt 13 dans: Functional Plant Genomics, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK 245-275
Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Steinbach PA, Baird G, Zacharias DA, Tsien RY (2002) A monomeric red fluorescent protein.
PNAS. 99: 7877-7882
Cerovic ZG, Samson G, Morales F, Tremblay N, Moya I. (1999) Ultraviolet-induced fluorescence for plant monitoring: present state
and prospects. Agronomie. 19: 543-578
Chan F, Siegel R, Zacharias D, Swofford R, Holmes K, Tsien R, Lenardo M (2001) Fluorescence resonance energy transfer analysis
of cell surface receptor interactions and signalling using spectral variants of the Green Fluorescent Protein. Cytometry. 44: 361-368
24
Chiu W., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. (1996). Engineered GFP as a vital reporter in plants. Current
Biology, 6 (3), 325-330.
Cole L., Coleman J., Kearns A., Morgan G., Hawes C. (1991). The organic anion transport inhibitor, probenecid, inhibits the
transport of Lucifer Yellow at the plasma membrane and the tonoplast in suspension cultured plant cells. J Cell Sci, 99, 545-555.
Dahan M., Lévi S., Luccardini C., Rostaing Ph., Riveau B., Triller A. (2003) Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by
Single–Quantum Dot Tracking. Science 302: 442-445
Donahue CJ, Santoro M, Hupe D, Jones JM, Pollok B, Heim R, Giegel D. (2001) Correlating cell cycle with apoptosis in a cell line
expressing a tandem green fluorescent protein substrate specific for group II caspases. Cytometry. 45:225-34.
Dubertret B, Skourides P, Norris DJ, Noireaux V, Brivanlou AH, Libchaber A (2002) In vivo imaging of quantum dots encapsulated
in phospholipid micelles. Science. 298:1759-1762.
Erhardt D (2003) GFP technology for live cell imaging. Curr. Op. Plant Biol. 6: 622-628
Fehr M, Frommer WB, Lalonde (2003) In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of Cos-7 cells by
fluorescent nanoscensors. J. Bio. Chem. 278: 19127-19133
Feijo, J.A., Moreno, N. 2004. Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 22, 1-32.
Fricker M., Parsons A., Tlaka M., Blancaflor E., Gilroy S., Meyer A., Plieth C. (2001). Fluorescent probes for living plant cells.
Dans « Plant cell biology », 2nd edition. Hawes and Satiat-Jeunemaitre eds, Oxford Univeristy Press, 35-81.
Fricker MD et White NS (1992) Wavelength considerations in confocal microscopy of botanical specimens. J. Microscopy. 166:
29-42
Gorelik J, Shevchuk A, Ramalho M, Elliott M, Lei C, Higgins CF, Lab MJ, Klenerman D, Krauzewicz N, Korchev Y (2002)
Scanning surface confocal microscopy for simultaneous topographical and fluorescence imaging: Application to single virus-like
particle entry into a cell. PNAS. 99: 16018-16023
Haseloff J., Siemering K.R., Prasher D.C., Hodge S. (1997). Removal of a cryptic intron and subcellular localisation of green
fluorescent proteins are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. PNAS. 94 (6), 2122-2127.
Haseloff, J. 2003. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques 34, 1174-1182.
Haugland, R. 2005. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed., Molecular Probes
Invitrogen ; et le site http://probes.invitrogen.com/
Hawes C, Satiat-Jeunemaître B (2001) "Plant Cell Biology: A Practical Approach" (2é édition) Oxford University Press, Oxford...
voir : microscopy (Chpt 1 Shaw); fluorescent probes (Chpt 2 Fricker); flow cytometry (Chpt 3 Brown); GFP (Chpt 5 Neuhaus)
Hawes C., Boevink P., 1999. Dans «Protein localisation by fluorescence microscopy : a practical approach» (ed. V.J. Allan), Oxford
University press, 163.
Hoffmann, B., Kosegarten, H. 1995. FITC-dextran for measuring apoplast pH and apoplastic pH gradients between various cell
types in sunflower leaves. Physiol. Plantarum, 95, 327-335
Horobin, R. W. Kiernan, J. A. 2002. Conn’s Biological Stains (10th edition). A Handbook of dyes, stains and fluorochromes for use
in biology and medecine. Garland Sciences, London.
Hovius R, Vallotton P, Wohland T, Vogel H. (2000) Fluorescence techniques:shedding light on ligand–receptor interactions.
Trends Pharmaceutical Sci. 21: 266-273 (juillet)
Howarth M, Takao K, Hayashi Y, Ting AY (2005) Targeting Quantum Dots to Surface Proteins in Living Cells with Biotin Ligase.
Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7583
Hu C-D, Chinenov Y, Kerppola T K (2002) Visualization of interactions among bZIP and rel family proteins in living cells using
Bimolecular Fluorescence Complementation. Mol. Cell. 9: 789-798
Hu C-D, Kerppola TK (2003) Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor
fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21: 539-545
Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, Schmitz R, Veit M, Weissenbo G, Schnitzler JP (1998) Tissue
localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp. Bot., 49, 953–965
Jach G., Binot E., Frings S., Luxa K., Schell J. (2001) Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (DsRed) as a reporter for
plant gene expression. Plant Journal, 28, 483-491.
Jameson DM, Reinhart GD (1989) Fluorescent biomolecules: Methodologies & applications. Plenum Press NY
Jay D.G., Sakurai T. (1999) Chromophore-assisted laser inactivation (CALI) to elucidate cellular mechanisms of cancer. Biochimica
et Biophysica Acta. 1424 (2-3), M39-48
Jovin TM (2003). Quantum dots finally come of age. Nat Biotechnol. 21:32-3.
Kramer HJ, Westerhuis WH, Amesz J (1985) Low temperature spectroscopy of intact algae. Physiol. Vég.. 23: 535-543
Kriete A (1992) Visualization in Biomedical Microscopies: 3-D imaging and computer applications. VCH, Weinheim
Lakowicz, J. R. (2006) Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed., 958 p., ISBN: 0-387-31278-1
Lamb, D.C., Muller, B.K., Brauchle, C. 2005. Enhancing the sensitivity of fluorescence correlation spectroscopy by using timecorrelated single photon counting. Curr. Pharm. Biotechnol., 6, 405-14.
Larson DR, Zipfel WR, Williams RM, Clark SW, Bruchez MP, Wise FW, Webb WW. (2003) Water-soluble quantum dots for
multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300:1434-1436
25
Ludin B, Matus A (1999, 2001) "GFP in motion 2" [CD] Trends Cell Biol 11(5), Elsevier Science (et www.lis.ch )
Mas, P., Devlin, P.F., Panda, S. and Kay, S.A. (2000) Functional interaction of phytochrome B and cryptochrome 2, Nature 408:
207-211.
Mason WT (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press (2è édition) Londres
Meunier FA, Colasante C, Molgo J (1997) Sodium-dependent increase in quantal secretion by brevetoxin-3 in Ca2+-free medium is
associated with depletion of synaptic vesicles and swelling of motor nerve terminals in situ. Neuroscience. 78: 883-893
Meyer S, Cartelat A, Moya I, Cerovic ZG (2003) UV-induced blue-green and far-red fluorescence along wheat leaves: a potential
signature of leaf ageing. J. Exp. Bot., 54 757-769
Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A (2002) A variant of yellow fluorescent protein with fast and
efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20: 87-90
Neuhaus J-M, Boevink P. (2001) GFP as reporter in plant cells. Chpt. 5 dans "Plant Cell Biology: A Practical Approach" (2nd. ed.)
Hawes & Satiat-Jeunemaître (eds), Oxford University Press
Paris N., Rogers S.W., Jiang L., Kirsch T., Beevers L., Phillips T.E., Rogers JC. (1997). Molecular cloning and further
characterization of a probable plant vacuolar sorting receptor. Plant Physiology, 115 (1), 29-39.
Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J., 2002. A photoactivable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297:
1873-1877
Pawley JB (1995) Handbook of biological confocal microscopy. 2ème éd. Plenum Press, NY
Rajfur Z, Roy P, Otey C, Romer L, Jacobson K (2002) Dissecting the link between stress fibres and focal adhesion by CALI with
EGFP fusion proteins. Nat Cell Biol. 4:286-293.
Perron A, Mutoh H, Akemann W, Ghimire Gautam S, Dimitrov D, Iwamoto Y, Knöpfel T (2009) Second and third generation
voltage-sensitive fluorescent proteins for monitoring membrane potential. Frontiers in Molecular Neuroscience 2 : 1
Rigaut JP, Carvajal-Gonzalez S, Vassy J (1991) Confocal image cytometry - Quantitative analysis of three-dimensional images
obtained by confocal scanning microscopy. Chapt. 7 dans Häder D-P, op. cit.
Rogers, K., Stinnakre, J., Agulhon, C., Jublot, D., Shorte, S., Kremer, E.J., Brûlet, P. 2005. Visualization of local Ca2+ dynamics
with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur. J. Neuroscience, 21, 597-610.
Ronot X, Schoëvaërt-Brossault D (1999) Dynamique de la cellule vivante. Editions INSERM, Paris
Ronot X. & Usson Y. (2001) Imaging of nucleic acids and quantification in photonic microscopy. CRC Press, Boca Raton
Schulman SG (1985) Molecular luminescence Spectroscopy. J.Wiley, NY
Souvannavong V, Brown SC, Sarih M'hammed, Adam A (1994) Expression and visualization during the cell cycle progression of
alkaline phosphatase in B lymphocytes from C3H/HeJ mice. J. Leukocyte Biology 55: 626-632
Tsien (1998) The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67: 509-544
Turcatti G, Vogel H, Chollet A. (1995) Probing the binding domain of the NK2 receptor with fluorescent ligands: evidence that
heptapeptide agonists and antagonists bind differently. Biochemistry. 234: 3872-3880
Valeur B (2004) Invitation à la Fluorescence Moléculaire. De Boeck, Bruxelles
Valeur B. (2002) Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Editions Wiley-VCH
Vanstraelen M., Baloban M., Da Ines O., Cultrone A., Lammens T., Boudolf V., Brown SC., De Veylder L., Mergaert P., Kondorosi
E. (2009) APC/CCCS52A complexes control meristem maintenance in the Arabidopsis root. PNAS 106(28) : 11806-11811
Wu S, Han G, Milliron DJ, Aloni S, Altoe V, Talapin DV, Cohen BE, Schuck PJ. (2009) Non-blinking and photostable upconverted
luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. PNAS Early Edition, July 2009
Zeytun A, Jeromin A, Scalettar BA, Waldo GS, Bradbury AR. (2003) Fluorobodies combine GFP fluorescence with the binding
characteristics of antibodies. Nat Biotechnol. 1473-9.
Zicha D, Dobbie IA, Holt MR, Monypenny J, Soong DYH, Gray C, Dunn GA (2003) Rapid actin transport during cell protrusion.
Science 300: 142-145
Zimmermann T, Rietdorf J, Girod A, Georget V, Pepperkok R. (2002) Spectral imaging and linear un-mixing enables improved
FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett 531: 245-249
Zipfel WR, Williams RM, Christie R, Yu Nikitin A, Hyman BT, Webb WW (2003) Live tissue intrinsic emission microscopy using
multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS, 100, 7075-7080
26
Tableau 6. Fluorescent probes used in modern cell and molecular biology, modifié d'après Kasten
dans Mason (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press, Londres (2è éd).
Nous remercions Marie-Thérèse Crosnier pour son aide dans la préparation de ce tableau.
Wavelength (nm)
Name
Excitation
Emission
620
650
350
660
660
450
505
345
350
365
492
488, 552
581, 588
650
675
743
340
513
510
495
512
410
420
460
510
570
596, 604
667
694
767
578
532
535
530
524
535
490
490
350
435
350
468
620
545
495 - 545
490
UV-vis
570
570
548
558
520
pKa 6.4
520
415
530
440
520
very low Q in water
650
576
240 kDa
578
580
variable très forte ε ; nano-crystaux
595
590
Immunocytochemical fluorophores,
conjugates and lectins
Alexa Fluor family 350, 430, 488, 532, 546, 568,
594, 633, 647, 660, 680
Allophycocyanin (AP)
Allophycocyanin cross-linked (AP-XL)
AMCA (7-amino-4- methylcoumarin-3-acetic
acid)
Bodipy (borondipyromethene difluoride dye)
CT-120 (coumarin 120 thiolactone)
CT-339 (coumarin 330 thiolactone)
Coumarin 138
Cyanine2
Cyanine3.18
Cyanine3.5
Cyanine5.18
Cyanine5.5
Cyanine7
Dansyl chloride
2.7’ -Dichlorofluorescein
4’5’ -Dimethylfluorescein
5-DTAF (5-(4’6-dichloro- triazinyl)
aminofluorescein)
Eosin-5-isothiocyanate
Erythrosin-5-isothiocyanate
FITC(fluorescein-5- isothiocyanate)
Fluorescein anhydride(FA)
3-HFT(3-hydroxyflavone thiolactone)
Lucifer Yellow
N-Methylantranyloyl
NBD (nitrobenzoxadiazole)
Phycocyanin (PC)
Phycoérythrin B (PE-B)
Phycoérythrin R (PE-R)
Princeton red anhydrine (PRA)
Quantum Dots
RITC (rhodamine B isothiosanate)
Sulphorhodamine B sulphonyl chloride
(lissamine rhodamine B sulphonyl chloride)
Sulphorhodamine 101 (sulphonyl chloride, Texas
Red)
TMRA=TAMRA tetramethylrhodamineanhydride
TRITC ( tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate)
XL-Allophycocyanin (XL-AP)
XRITC (tetra-N-cyclopropylrhodamine
isothiocyanate)
350, 576
602
550
541
620
578
570
572
660
604
Acridine orange
490
590
Acridine orange-10-dodecyl bromide
Alizarin complexone
AMA (3-amino-6-methocyacridine)
493
580
UV
520
645
Y,G
Applications
Tracers for various proteins,
receptors, mono- and
polysaccharides
incompatible avec VectaShield
ε 150.000 Cy3 de biopuces
ε 150.000
ε 250.000 Cy5 de biopuces
ε 250.000
ε 250.000
Site-selective probes (vital)
Lysosomes, nuclei; plant roots;
fluorescent counterstain for retrolabelled neuronal tracers
Mitochondria
Sites of calcification (bone growth)
Lysosomes, nuclei
(fluorochromasia)
Bis-ANS
385
500
495
375
376,389
520
435
423
Colcemid-NBD
DACK (dansyl-alanyllysyl chloromethyl ketone
468
350
520
450
DAPI (4’,6-diamidino-2- phenylindole)
372
456
DASPEI (2-(4-dimethyl aminostyryl)-N-ethylpyridinium iodide)
DASPMI
429
557
475
600
DEQTC (1,3’-diethyl-4,2’-quinolythiacyanine
iodide)
5,7-DHT (5,7-dihydroxytryptamine
502
529
UV-B
G
547
571
UV
(510)
320
(534)
DiOC1(3)
DiOC 6(3) (3,3’ -dihexyloxacarbocyanine iodide)
482
478
510
496
DiOC7(3) (3,3’ -diheptyloxacarbocyanine iodide)
488
540
DiSC1 (3) (3,3’-dimethylthiacarbocyanine iodide)
Dopamine
551
UV-B
568
G
DPPAO (lecithin analogue of acridine orange)
Ethidium bromide
UV
545
G
610
Evans Blue
550
610
Fast Blue (trans-1-(5-amidino-2-benzofuranyl)-2(6-amidino-2-indolyl) ethylene dihydrochloride
FITC-dextran
360
410
490
520
FluoroBora1 (3-(dansylamido) phenylboronic acid
FluoroBora2 (3-(darpsylamidyl)-1-phenylboronic
acid)
FluoroBora T -acriflavine (3-amino, 6-7’ (7’,8’,8’tri-cyanoquinodimethane phenylboronic acid)
UV-B
UV
YG
B-W
Calcein
Calcein blue
Cascade Blue hydrazide
DiIC18 (3) (1,1’-dioctadecyl-3,3,3,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)
Dihydro-ethidium (see Nucleic acid probes and
Cell viability probes)
Dihydro-rhodamine
Fluoro-Gold
470
323
27
Inhibitor of microtubule assembly
and RNA polymerase
Covalent labelling of
microinjected cells
Tubulin polymerization detection
Inhibitor of acrosin (mammalian
sperm)
Tubulin polymerization detection
without interfering with
microtubule assembly, retrograde
labelling of neurons
Mitochondria (metabolic state
affects fluorescence response)
Mitochondria (yellow),
membranes (green), nucleus (red
orange)
Reticulocytes
Injection induces fluorescence in
distant populations of amacrine
cells of retina
Long-term cell tracing in vitro
Colourless but oxidises inside
cells to rhodamine 123 that vitally
stains mitochondria
Reticulocytes
Endoplasmic reticulum (also in
fixed cells), mitochondria
Penetration probe into spheroids
or tumour cords, mitochondria of
plant cells, distinguish cycling
from non-cycling fibroblastes
Endoplasmic reticulum
Injection induces fluorescence in
distinct populations of amacrine
cells of retina
Mitochondria (also in fixed cells)
Useful Nissl fluorochrome after
FITC labelling of nervous system
Retrograde labelling of neuronal
cytoplasm
Fluid phase pinocytosis, loading
cells with macromolecules
Lyososomes
Golgi apparatus
530,590 Lipid- and water-soluble
FluoroBora with trace of
acriflavine penetrates cells and
produces yellow-green chromatin
and orange cytoplasm
408
cytoplasm, fluoresces gold at
neutral pH and blue at acid pH
Granular blue (2-(4-(4-amidinophenoxy)phenyl)
indol-6-carboxamidin- dihydrochloride)
Hexanoic ceramide-NBD (C6-NBD-ceramide)
375
410
475
525
Hoechst 33258 (bisbenzimide trihydrochloride)
365
465
Hoechst 33342 bisbenzimide
Hydroethidine (see dihydro-ethidium under
Nucleic acid probes and Cell vitality probes)
Lucifer yellow CH (LY)
360
530
430
535
Merocyanine 540
MitoTracker Red
MitoTracker Orange
MUA (4-methyl-umbelliferone derivatives)
NAO (10-N-nonyl-acridine orange chloride)
Nile red (Nile blue A oxazone)
NPN (N-phenyl-1-naphthylamine)
Nuclear yellow (Hoechst S-769121)
Phallacidin-Bodipy
Phallacidin-NBD
Phalloidin-fluorescein
Phalloidin-rhodamine
Phallotoxin-phenylcoumarin
Procion yellow M4RS (MX-4R)
p-Bis-(2-chloroethhyl)-amino-benzilidenecinnamonitrile fluorochromes (nitrogen mustard
derivatives with stilbene-like structures)
Pyronin Y
Rhodamine 123
Rhodamine B hexyl ester, chloride
Rhodamine-dextran
Rhodamine 6G
Texas Red-ovalbumin
Thiazole Orange (TO)
Thioflavin T, Thioflavin S
True Blue (trans-1,2,-bis (5-amido-2benzofuranyl) ethylene-dihydrochloride
28
cytoplasm
Golgi apparatus and lipid
transport pathways in cytoplasm
Mycoplasma detection,
chromosomal bands and
interbands
Retro-labelling neuronal nuclei
Neurones and functional
connections after microinjection
into cells or fluid phase
pinocytosis
500
572
Mitochondria, binds to leukaemic
cells, axons stain
578
599
Potential, then fixable
551
576
Potential, then fixable. Less
photostable
340
430
Lysosomal enzymes, used to
detect lysosomal storage
diseases
492
522
Mitochondria (also in fixed cells)
450-500 553 605Neutral lipids, cholesterol,
515-560
phospholipids in cellular cytoplasmic droplets and lyso-somes,
foam cells lipid-loaded
macrophages (ex and emission
spectra vary greatly according to
hydrophobicity of environment)
340
420
Detects early lymphocyte
activation
360
460
Retro-labelling neuronal nuclei
505
512
F-actin
468
520
F-actin
490
520
F-actin
540
580
F-actin
387
465
F-actin
488
530
Neurones and functional
connections after electro-phoretic
injection into cells
360-400
520-550 Cell fluorochromes useful in
450-480 550-590 combination with autofluoresc-ing
coenzymes
545
580
Mitochondria, arrests cells in G1
phase
510
534
Mitochondria (increased
accumulation and retention in
mitochondria of carcinoma cells),
also fixed cells
555
579
Endoplasmic reticulum
570
595
Fluid phase pinocytosis, loading
cells with macromolecules
530
590
Mitochondria
596
620
Absorptive pinocytosis
509
533
Reticulocytes & malaria parasites
(haematology & flow cytometry)
370
418
Amyloid plaque core protein
(APCP), reticulocytes (cytometry)
373
404
cytoplasm
Tubulin-DTAF
Tubulin-NBD
Xylenol orange
495
468
377
530
520
610
ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)
430
474
DiOC1(3)
482
510
DIPI (4’,6-bis(2’-imidazolinyl-4H,5H) -2
phenylindole)
DRAQ5 (bisalkylaminoanthraquinone)
Ellipticine
355
450
broad ; 646
450
Ethidium bromide (homidium bromide)
545
29
Microtubules
Microtubules
Sites of calcification (bonegrowth)
Nucleic acid probes
DNA, chromosome Q-banding,
AT-specific DNA
Acridine ethidium heterodimer
492
627
AT-rich DNA and total DNA
528
634
according to excitation used
Acridine orange
490
530,640 Distinguish and measure singleand double-stranded nucleic
acids by fluoro-chromasia
(intercalates into double-stranded
nucleic acids to fluoresce; binds
to phosphate groups to
phosphoresce)
Acriflavine-Feulgen
455
515
DNA
Adriamycin
480
555
Intercalates in GC-specific DNA,
chromosome D banding, Y
chromosome, antineoplastic
anthracycline (mostly nuclear
fluorescence)
7-Amino-AMD (7-amino actinomycin D)
555
655
Intercalates in GC-specific DNA
Auramine O-Feulgen
460
550
DNA
BAO-Feulgen (bisamino-phenyloxadizole)
380
470
DNA
Bis-ANS
385
500
Inhibits RNA polymerase
Carminomycin
470
550
Antineoplastic anthracycline
(cytoplasmic fluorescence)
Chromomycin A3
450
570
GC-selective DNA in presence of
2+
Mg ; antineoplastic antibiotic
DAMA (3-dimethylamino-6-methoxyacridine)
467
549,617 RNA and DNA fluorochromasia
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole HCl)
372
456
AT-specific double-stranded DNA,
chromosome Q banding,
distinguish between yeast
mitochondrial and nuclear DNA,
viral and mycoplasma DNA
infection in cells
Daunomycin (daunorubicin HCl)
475
550
DNA, chromosome D banding,
Y chromosome, antineoplastic
anthracycline (nuclear
fluorescence)
Dihydro-ethidium (Hydroethidine, Homoethidium, 370,525
420,605 DNA. Hydroethidine is
reduced ethidium bromide)
enzymatically oxidised in living
cells to form ethidium bromide,
which intercalates into chromatin
(red); cytoplasm fluoresces
blue-white in lipoidal pockets
Dimeric Cyanines YOYO, TOTO, BOBO, POPO, YOPRO, TOPRO etc : homodimers and heterodimers
(Molecular Probes) Attention : YOPRO3 & TOPRO3 sensibles au chlore (PBS) dans le milieu de
montage, provoquant un photoblanchissement rapide.
Nucleic acids
AT-specific DNA, chromosome
Q-banding
681 cell permeant nuclear stain
525 RNA & DNA (intercalates into
double-strand nucleic acids)
610
RNA & DNA (intercalates into
double-stranded nucleic acids
of fixed cells), viability assay
30
Ethidium monoazide
510
600
RNA and DNA (intercalates
into double-stranded nucleic
acids), viability assay
Hoechst 33258 (bisbenzimide trihydrochloride)
365
465
AT-specific DNA (fixed cells),
chromosome Q-banding, DNA
synthesis quenching of
fluorescence detects
incorporation of 5-BrdU into DNA;
viral and mycoplasma DNA
infection in cells
Hoechst 33342 (bisbenzimidazole derivative)
355
465
AT-specific DNA (vital and
fixed cells), may be effluxed
rapidly from certain cells so as
to prevent DNA binding
Homoethidium (see Dihydro-ethidium)
Hydroxystilbamidine
360
Mithramycin (aureolic acid)
395
Nogalomycin
480
Olivomycin
430
Oxazine 750 (OX750)
690
Proflavine
455
Propidium iodide
530
Pyronin Y
540
Quinacrine dihydrochloride (atabrine)
436
Quinacrine mustard
385
Rhodamine 700 (LD 700)
Rhodamine 800 (R 800)
Rubidazone
659
700
480
RuDIP (tris-(4,7-diphenyl-phenanthroline) ruthenium
(III))
Syto family of nucleic dyes Syto-13 & SytoxGreen
Thiazole Orange (TO)
453
470
488
509
533
Thiovaline T
422
487
TMPP (Meso-tetra (4-N-methylpyridyl) porphine)
4,5’,8-Trimethylpsoralen (trioxsalen)
436
338
655
420
True Blue (trans-1,2 bis (5-amido-2benzofuranyl)ethylene-dihydrochloride)
373
404
450,600 AT-specific DNA (both peaks
appear) and RNA (only 450
nm emission seen)
570
GC-selective DNA in presence
2+
of Mg , antineoplastic
antibiotic
560
DNA, antineoplastic
anthracycline
545
DNA, chromosome R banding,
antineoplastic antibiotic
699
DNA (excitable by heliumneon laser)
515
Nucleic acids, AT-specific
DNA
615
RNA and DNA (intercalates
into double-stranded nucleic
acids of fixed cells), viability
assay
570
RNA (preferentially in
presence of methyl green or
Hoechst 33342)
525
AT-specific DNA,
chromosome Q-banding, Y
chromosome
525
AT-specific DNA,
chromosome Q-banding
669
DNA
715
DNA
560
Antineoplastic anthracyline
(cytoplasmic fluorescence)
480
Metal complex to distinguish
630
handedness of DNA helices
509
± cell permeant
Nucleic acids (see Siteselective probes)
Nucleic acids (see Siteselective probes)
DNA
Intercalates into doublestranded DNA and covalently
adds to pyrimidines upon UV
illumination
AT-specific DNA
31
Protein probes and functional groups
Acridine orange
490
530
Ammonium 7-fluoro-2-oxa-1,2-diazole-4-sulphonate
380
515
Acidic groups of proteins after
hot TCA extraction
Thiol groups
ANS (8-anilino-naphthalene sulfonic acid)
385
485
Proteins (hydrophobic probe)
Anthracene-9-carboxaldehyde carbohydrazone
393
456
Aldehyde probe
Bis-ANS (1,1’-bi (4-anilino) naphthalene-5,5’disulphonic acid, dipotassium salt)
Brilliant sulphoflavine (BSF)
385
500
420
520
385-390
465
Proteins (dimer of ANS, binds
at multiple sites)
Histone proteins at pH 8 after
DNA extraction: total proteins
at pH 3
Thiol groups
CPM (N-(4 -(7-diethylamino-4-methylcoumarin-3-yl)
maleimide
DAB-ITC (4-N,N-dimethylamino-benzene4’isothiocyanate)
Dansyl chloride (5-dimethylamino-1-naphthalenesulphonyl chloride
Eosin
430
Amino acid probe
335
500
Histone proteins & protamines
522
551
Histones at pH 10.0 or higher
FITC (fluorescein-5-isothiocyanate)
490
520
Proteins
Fluoral-P- (4 -amino-3-pentene-2-one)
410
510
Aldehyde probe
Fluorescamine
390
460
FDA (fluorescein diacetate)
Fluorescein mercuric acetate
490
B
Formaldehyde-induced monoamine fluorophores
9- Hydrazine acridine
stilbene disulphonic acid derivative, optical
brightener
Mercurochrome
410-415
420
350
Proteins at cell surface
(primary amine binding
creates fluorescent complex)
520
Esterases
Y
Thiol groups of proteins
(nuclear non-histone proteins
after SH reduction to
disulphides)
475,525 Biogenic monamines
(dopamine, noradrenaline, 5hydroxytryptamine)
500
Aldehyde probe
460
Proteins
B
Y
450-490
600
MUA (4 -methylumbelliferone acetate
OPT (o-phthaldehyde)
340
UV
430
B
Primuline
RITC (rhodamine B-isothiocyanate)
Salicoyl hydrazine
SBD-CI (4-chloro-7-sulphobenzofuran, ammonium
salt)
SITS (4-acetamino-4 -isothiocyanatostilbenene-2,
2’-disulphonic acid, disodium salt)
Sulphorhodamine 101
XRTIC (tetra-N-cyclopropyl-rhodamine
isothiocyanate)
365
570
320
380
455
595
400
510
Thiol groups of proteins
disulphides)
glutathion (non-aqueous
solvents), thiol groups proteins
disulphides)
Esterases
Polyamines at pH 7-9
(spermidine and spermine)
Proteins
Proteins
Aldehyde probe
Thiols groups
350, 576
578
602
604
Proteins
Proteins
Mercury Orange (1(4-chloro-mercury-phenyl-azo-2naphthol)
32
Cell viability probes
Acridine Orange
490
Calcein AM (acetoxymethyl ester)
Calcofluor White M2R (CFW)
= Fluorescent Optical Brightner 28
CFDA : 5(6)-carboxyfluorescein diacetate
495
350
495
Chrysophosphine 2G (euchrysine 2GNS)
435
Dihydro-ethidium (Hydroethidine, Homoethidium,
reduced ethidium bromide)
370,525
530,640 Vital fluorochrome (monomeric
dye form is green in living
cells, aggregated dye form is
red in dead cells). Weak base.
520
Vital fluorochrome
400-440 Stains non-viable animal cells,
cellulose of live plant cells
520
Cell vitality probe based on
production of intracellular
carboxyfluorescein by
esterases, detects permeable
channels between cells. pKa
6.4
515
Vital fluorochrome (similar to
acridine orange)
420,605 DNA. Hydroethidine is
enzymatically oxidised in living
cells to form ethidium bromide,
which intercalates into nuclear
chromatin (red), cytoplasm
fluoresces blue-white in
lipoidal pockets
--Colourless but oxidises inside
cells to rhodamine123 that
vitally stains mitochondria
600
Fluorochromes dead cells,
usable after cell fixation
520
Cell vitality probe based on
production of intracellular
fluorescein by esterases, may
be used in combination with
propidium iodide
520
Detection of fluorescence
depolarisation protein-bound
dye) in living cells using
fluorescence anisotropy
measurements. pKa 6.3
520
Monitoring galactosidase gene
activity by formation of
intracellular fluorescein
590
Vital fluorochrome (see other
FluoroBora derivatives under
Site-selective probes and
Membrane probes and
receptors)
Dihydro-rhodamine 123
320
Ethidium monoazide
460
FDA (fluorescein diacetate)
490
Fluorescein
490
Fluorescein digalactoside
490
FluoroBora T
470
Hydroethidine (see Dihydro-ethidium)
Propidium iodide
470
615
Pyronin Y
540
570
Rhodamine 123
510
534
SITS (4 -acetamido-4 -isothiocyanatostilbene-2,2’disulphonic acid, disodium salt)
350
420
Stains dead cells with
membrane damage (used with
green fluorescing vital dyes
like fluorescein)
Vital fluorochrome
(mitochondria)
Vital fluorochrome
(mitochondria), accumulates in
carcinoma cells, sperm,
distinguish cycling from noncycling cells
Vital fluorochrome
Vita blue dibutyrate-14 (VBDB-14)
524
570
33
Vital based on production of
fluorescent derivative of
fluorescein by esterases
Membranes probes and receptors (vital)
Acridine Orange
Acridine Orange-10-dodecyl bromide
490
500
9-amino-acridyl propranol
ANS (8-anilino-1-naphthalene sulphonic acid)
B
385
Anthroyl ouabain
D-Bungerotoxin-tetramethylrhodamine
Dansyl lysine
362,381
518,551
340
Dansyl phorbol acetate
341
Dexamethasone rhodamine
DiIC18(3) (1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’tetramethylindocarbocyanine perchlorate)
542
549
DPH (diphenyl-hexatriene)
351
FM1-43 (styrene derivative)
502
FM4-64 (styrene derivative)
560
Fluorescamine
390
FluoroBora P(3-(pyrenesulphamido-phenyl-boronic
acid)
UV
stilbene disulphonic acid derivative, optical
brightener
Naloxone fluorescein
NPN (N-phenyl-1-naphthylamine)
350
490
340
1-Pyrene butyryl choline bromide
Rhodamine B octadecyl ester
342
560
TMA-DPH
351
530,640 Multilamellar liposomes
534,568 Surfactant micelles
(monomer-dimer spectral
change)
Y
E-adrenergic receptors
485
Localises at interfaces of
hydrophilic and hydrophobic
membrane regions
485
Cardiac glycoside receptors
575
Cholinergic receptors
515
Membranes with low cholesterol content, leukaemic cells
496
Tumour promoter analogue
binds to receptors
566
Glucocorticoid receptors
568
Cationic lipophilic probe used
to study fusion and lateral
diffusion in membranes,
retained for long periods within
neurones
430
Hydrophobic probe,
fluorescence polarisation
probe of membrane fluidity
yellow dependent upon environment;
anchors in membrane
red
dependent upon environment;
anchors in membrane
460
Cell surface proteins (nonfluorescent until bound to NH2groups
W-Y,V Hydrophilic areas (whiteyellow), hydrophobic areas
(violet)
460
Intracellular membranes of
granulocytes; proteins
520
Opioid receptors
420
Hydrophobic probe (nonfluorescent until bound to cell
membranes or lipids)
378-420 Synaptic localisation
590
Hydrophobic probe,
membrane fusion assay
430
Outer plasma membrane,
fluidity
Cell membrane potentials and pH (vital)
ADB 1,4 diacetoxy-2,3-dicyano-benzene
351
BCECF (2’7’biscarboxyethyl-5,6-carboxyfluorescein
BCECF-AM (2’,7’bis- carboxy-ethyl-5,6carboxyfluorescein tetraacetoxymethyl ester
500
500
Bis-oxonol : DiSBaC2(3)
540
450-476 Intracellular pH (emission
peak shifts in alkaline state)
pKa ≈8
530, 620 Intracellular pH pKa 6.98
530, 620 Intracellular pH (permeant and
enzymatically hydrolised by
esterases to BCECF
580
Membrane potentials
Carboxy SNAFL-2 (semi-naphthofluorescein)
Carboxy SNARF-1 (semi-naphthorhodofluor)
and analogs
1,4-Diacetoxyphthalonitrile
DIDS (4,4’-diisothiocyano-2,2’-stilbenedisulphonic
acid)
DiOC7 (3) (3,3’-diheptyloxacarbo-cyanine iodide)
DiOC2 (3)
DiOC2 (5)
9-(N-Dodecyl)aminoacridine
Merocyanine 540
Oxonol V
Rhodamine 123
Vita blue dibutyrate-14 (VBDB-14)
WW 781
485,514
(acid)
547 (base)
518,548
(acid)
574 (base)
350
340
34
546 (acid) Monoexcitation-dual-emission
630 (base) pH indicator pKa ≈7.8
587 (acid) Monoexcitation-dual-emission
630 (base) pH indicator pKa ≈7.5
420-440 Intracellular pH
500-580
430
Anion transport inhibitor
482
482
579
430
511
500
603
475
Membrane potentials
Membrane potentials
Membrane potentials
pH gradients across
membranes
500
572
Membrane potentials,
differentiation marker in
cancer research
609
645
Membrane potentials
510
534
Mitochondrial and plasma
membrane potentials
609 (base) 665 (base) Intracellular pH (dual
524 (acid) 570 (acid) fluorescence)
603
635-645 Membrane potentials
__
469
320
305,490
420
520
Luminescent protein that emits
2+
light in presence of Ca +ATP
2+
Ca binding to calmodulin
Ca2+ and Mg2+
506
536
Ca
Ionic probes (vital)
Aequorin
9-Anthronyl choline iodide
Calcein (active part is DCFA, 3,6-dihydroxy-24-bis(N,N’-di (carbomethyl)-aminomethyl) fluoran
(Fluorexone)
CalciumGreen-2
"Cameleons"
CTC (7-chlortetracycline, Aureomycin)
FIP18
Fluo-3 (rAM)
Fluo-3FF (rAM)
Fluo-4 (rAM)
Fluo-4FF (rAM)
Fura-2 (rAM)
Fura-2FF (rAM)
Furaptra (Mag-Fur-2)
Indo-1
Indo-1FF
Mag-indo-1
divers
345
400
346
506
500, 515
494
2+
Kd 550 nM
FRET-GFP based probes ;
Yellow Cameleon2
70 nM & 11 µM
2+
Free Ca near membranes
430
520
2+
Free 475, Near membrane Ca Kd 450
Bound 408 nM
2+
526
Ca
Kd 390 nM
2+
526
high Ca
526
2+
Ca
Kd 41 µM
Kd 350 nM
2+
494
335,362
520
505
340
505
Ca
Kd 9700 nM
2+
2+
Ca (bound Ca excites
maximally at 335 nm while
free dye excites at 362 nm
ratio imaging) Kd 140 nM
+
high Ca2 Kd 35 µM
376
(low ion)
344
(high ion)
331
350
354
(low ion)
349
(high ion)
506
492
Mg (microscopy and ratio
imaging)
410
435
475
Ca
Kd 230 nM
2+
Ca
Kd 33 µM
2+
Mg (flow cytometry)
419
2+
2+
PBF1
346
(low ion)
334
(high ion)
339
553
340/380
492
576
505
SPQ
TnCDABZ(troponin C dansylaziridine)
344
340
450
514
TSQ
335
376
Quin-2
Rhod-2
SBF1
551
35
+
K
525
2+
Ca
Kd 60 nM
2+
Ca
+
Na microinjected into cells or
by use of AM ester
Cl
2+
2+
Ca binding to Ca -specific
regulatory sites of troponin C
2+
Zn in presynaptic boutons
*The spectral data shown represent published excitation and emission peaks. However, slight spectral shifts
can be expected according to the solvent used, pH of the system, and whether or not the probe is bound to
its substrate. In a few cases, colours are given (B = blue, G = green, UV = ultraviolet, W = white, Y = yellow).
Trademarks are assigned for Bodipy (Molecular Probes), Cascade Blue (Molecular Probes), Cellufluor
(Polysciences), FluoroBora (Childrens Hospital), Fluoro-Gold (Fluorochrome, Inc.), Hydroethidine (Prescott
Labs.), Lissamine (Imperial Chemical Industries), and SNAFL, SNARF, and Texas Red (Molecular Probes).
See also Molecular Probes Inc. at site http://probes.invitrogen.com/
Gif-sur-Yvette,septembre 2009

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie

Transcription

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