"Endoscopic Fluorescence Imaging: Spectral Optimization and

Résumé
Depuis plusieurs décennies, les médecins peuvent accéder aux organes creux avec les méthodes
endoscopiques, qui remplissent à la fois la fonction d’outil diagnostique et chirurgical dans nombre de disciplines de la médecine moderne (par ex. en urologie, pneumologie, gastroentérologie).
Malheureusement, l’endoscopie conventionnelle en lumière blanche (LB) montre une sensibilité
limitée aux lésions cancéreuses précoces. Par conséquent, plusieurs méthodes endoscopiques
utilisant l’imagerie de fluorescence ont été développées pour surmonter cette limitation. La
fluorescence endogène et exogène-induite a été étudiée, menant à des produits commercialisés.
En effet, la bronchoscopie en autofluorescence, et la cystoscopie utilisant la fluorescence des
porphyrines sont maintenant sur le marché.
Les méthodes de dépistage endoscopiques utilisant la fluorescence montrent une sensibilité
très élevée pour les lésions pré-cancéreuses, souvent manquées en LB, mais elles souffrent encore d’une spécificité limitée principalement due au taux élevé de faux-positifs. Bien que la
plupart de ces faux-positifs puissent être facilement rejetés en observation LB, il est plus difficile d’identifier des anomalies tissulaires telles que les zone inflammatoires, les hyperplasies
et les métaplasies. Cela résulte souvent en des biopsies supplémentaires, péjorant encore la
spécificité. Par conséquent, le but de cette thèse est d’étudier une méthode novatrice, rapide
et commode pour caractériser in situ les zones positives en fluorescence pendant l’endoscopie
et, plus généralement, pour optimiser l’appareillage endoscopique existant. Dans cette thèse,
plusieurs évaluations cliniques ont été effectuées soit dans l’arbre trachéo-bronchique, soit dans
la vessie.
Dans la vessie, l’imagerie de fluorescence pour la détection des tumeurs superficielles de
la vessie utilise la production et l’accumulation sélective dans les tissus cancéreux de porphyrines fluorescentes, principalement la protoporphyrine IX (PpIX), après une instillation de
R
Hexvixpendant
une heure. Dans cette thèse, nous avons adapté un cystoscope rigide pour
observer la muqueuse vésicale avec la cystoscopie à grossissement élevé (CGE), ceci afin de
distinguer les vrais- des faux-positifs détectés par fluorescence. L’optique permettant la CGE
peut-être utilisée soit avec lumière blanche, soit en fluorescence, avec un grossissement variant
entre 30× – pour l’observation standard – et 650×. Une molette permet l’ajustement continu
in situ du grossissement pendant la cystoscopie. Dans le régime élevé de grossissement, le plus
petit diamètre du champ visuel est de 600 microns et la résolution est de 2.5 microns, le cystoscope étant dans ce cas précis au contact avec la muqueuse vésicale. Avec ce cystoscope CGE,
nous avons caractérisé – avec un éclairement en lumière blanche 370–700 nm – la vascularisation
superficielle des zones positives en fluorescence afin de distinguer les tissus cancéreux des noncancéreux. Ce procédé nous a permis d’établir une classification utilisant les motifs vasculaires
R ont été inclus dans
observés. 72 patients opérés avec la cystoscopie de fluorescence Hexvix
l’étude. La comparaison de la classification CGE avec les résultats d’histopathologie a confirmé
32/33 (97%) de biopsies cancéreuses, et a rejeté 17/20 (85%) de lésions non-cancéreuses. Aucun changement vasculaire n’a pu être visualisé sur la seule lésion positive qui était négative
CGE, parce que ce carcinome sarcomatoïde trouvait son origine ailleurs que dans l’urothélium.
Nous avons montré avec cette étude qu’un grossissement de l’ordre de 80–100× pouvait constituer un bon compromis entre l’endoscopie macroscopique en fluorescence et microscopie en
réflectance. Afin de rendre cette approche plus quantitative, des algorithmes de traitement
d’images (segmentation, extraction de squelette, extraction de l’information globale) ont été
également implémentés dans cette thèse.
vi
Résumé
Afin de mieux visualiser les vaisseaux, nous avons augmenté leur contraste par rapport à
l’arrière-plan par des méthodes optiques. Puisque l’hémoglobine est un absorbeur puissant,
nous avons visé ses deux pics d’absorption en plaçant deux filtres passe-bande (405±50 nm
bleu, 550±50 nm vert) dans la fontaine de lumière. La cystoscopie CGE a été alors exécutée
séquentiellement avec l’illumination blanche, bleue et verte. Les deux dernières ont montré un
contraste plus élevé des vaisseaux par rapport au fond, mettant en évidence la vascularisation à
plusieurs profondeurs grâce à la pénétration différenciée des longeurs d’onde utilisées.
Pendant la cystoscopie de fluorescence, nous avons souvent observé que les images sont
floutées par un écran bleu-vert entre l’extrémité de l’endoscope et la muqueuse vésicale. Puisque
cet effet est augmenté par la production d’urine, il est encore plus marqué avec les endoscopes flexibles (qui disposent d’un rinçage limité) et les imageurs qui utilisent seulement
l’autofluorescence comme fond. En effet, quand la vessie n’est pas rinsée régulièrement, on observe facilement observer des écoulements bleu-vert sortant des uretères. Pour cette raison, on a
supposé que quelques fluorophores contenus dans l’urine sont excités par la lumière d’excitation,
et apparaissent bleu-vert à l’écran. Cet effet peut altérer la visualisation de la muqueuse vésicale et les lésions cancéreuses. Par conséquent, la sensibilité de la cystoscopie de fluorescence
est diminuée. Dans cette thèse, nous avons identifié les principaux produits responsables de la
fluorescence du liquide, et avons optimisé la conception spectrale en conséquence.
Dans l’arbre trachéo-bronchique, le contraste de fluorescence utilise la forte diminution
d’autofluorescence (AF) de la bande spectrale verte (environ 500 nm) sur les lésions cancéreuses
précoces et une diminution relative moins importante de la bande spectrale rouge (> 600 nm),
lorsque la muqueuse bronchique est excitée avec de la lumière bleu violet (environ 410 nm). Il a
été montré au cours des dernières années que ce contraste peut être attribué à un effet combiné
de l’épithélium épaissi et à une concentration plus élevée d’hémoglobine dans le tissu sous-jacent
des lésions cancéreuses précoces.
Dans cette thèse, nous avons contribué à la conception de plusieurs nouveaux prototypes, qui
ont été plus tard évalués en clinique. En premier lieu, nous avons prouvé que l’excitation à bande
étroite dans le bleu-violet pourrait augmenter le contraste tumeur-tissu sain dans la bande spectrale verte. Puis, nous avons mesuré les variations en intensité d’AF intra- et inter-patients afin
d’optimiser la réponse spectrale de l’imageur endoscopique. A cette fin, nous avons développé
une référence endoscopique à placer près de la muqueuse bronchique pendant la bronchoscopie.
Finalement, nous avons évalué sur 144 patients un bronchoscope AF nouvellement équipé avec
la lumière bleu-rétrodiffusée. Ce nouveau dispositif a montré une sensibilité augmentée pour les
lésions pré-néoplasiques.
A l’instar de ce que nous avons observé dans la vessie, il est probable que les nouveaux
développements en imagerie (y compris l’imagerie vasculaire) facilitent la distinction des vrais et
faux-positifs dans la bronchoscopie en AF. Dans cette étude, nous avons montré que le grossissement permettait de résoudre des vaisseaux d’un diamètre d’environ 30 microns. Cette résolution
est probablement suffisante pour identifier les critères vasculaires de Shibuya (boucles, mailles,
vaisseaux pointillés) sur les lésions positives en AF. Ces critères lui permettent d’identifier les
lésions précancéreuses, et potentiellement permettrait d’abaisser le taux de faux-positifs avec
notre imageur AF. Ce grossissement a également amélioré la bronchoscopie de routine, puisqu’il
fournit des images plus structurées à l’opérateur.
Mots-clés: tumeurs superficielles de la vessie, cystoscopie de fluorescence, endoscopie à grossisseR CysviewTM , hexylester d’acide aminolévulinique, motifs
ment, imagerie vasculaire, Hexvix,
vasculaires, angiogenèse, cancer bronchique, autofluorescence, imagerie et spectroscopie de fluorescence, phantomes optiques, évaluation clinique.
Abstract
Since several decades, the physicians are able to access hollow organs with endoscopic methods,
which serve both as diagnostic and surgical means in a wide range of disciplines of the modern
medicine (e.g. urology, pneumology, gastroenterology). Unfortunately, white light (WL) endoscopy displays a limited sensitivity to early pre-cancerous lesions. Hence, several endoscopic
methods based on fluorescence imaging have been developed to overcome this limitation. Both
endogenous and exogenously-induced fluorescence have been investigated, leading to commercial products. Indeed, autofluorescence bronchoscopy, as well as porphyrin-based fluorescence
cystoscopy, are now on the market.
As a matter of fact, fluorescence-based endoscopic detection methods show very high sensitivity to pre-cancerous lesions, which are often overlooked in WL endoscopy, but they still lack
specificity mainly due to the high false-positive rate. Although most of these false positives can
easily be rejected under WL observation, tissue abnormalities such as inflammations, hyperplasia, and metaplasia are more difficult to identify, often resulting in supplementary biopsies.
Therefore, the purpose of this thesis is to study novel, fast, and convenient method to characterize fluorescence positive spots in situ during fluorescence endoscopy and, more generally, to
optimize the existing endoscopic setup. In this thesis, several clinical evaluations were conducted
either in the tracheo-bronchial tree and the urinary bladder.
In the urinary bladder, fluorescence imaging for detection of non-muscle invasive bladder
cancer is based on the selective production and accumulation of fluorescing porphyrins, mainly
R during one hour.
protoporphyrin IX (PpIX), in cancerous tissues after the instillation of Hexvix
In this thesis, we adapted a rigid cystoscope to perform high magnification (HM) cystoscopy
in order to discriminate false from true fluorescence positive findings. Both white light and
fluorescence modes are possible with the magnification cystoscope, allowing observation of the
bladder wall with magnification ranging between 30× – for standard observation – and 650×.
The optical zooming setup allows adjusting the magnification continuously in situ. In the high
magnification regime, the smallest diameter of the field of view is 600 microns and the resolution
is 2.5 microns, when in contact with the bladder wall. With this HM cystoscope, we characterized
the superficial vascularization of the fluorescing sites in WL (370–700 nm) reflectance imaging
in order to discriminate cancerous from non-cancerous tissues. This procedure allowed us to
R
establish a classification based on observed vascular patterns. 72 patients subject to Hexvix
fluorescence cystoscopy were included in the study. Comparison of HM cystoscopy classification
with histopathology results confirmed 32/33 (97%) cancerous biopsies, and rejected 17/20 (85%)
non-cancerous lesions. No vascular alteration could be observed on the only positive lesion that
was negative in HM mode, probably because this sarcomatoid carcinoma was not originating in
the bladder mucosa. We established with this study that a magnification ranging between 80×
and 100× is an optimal tradeoff to perform both macroscopic PDD and HM reflectance imaging.
In order to make this approach more quantitative, different algorithms of image processing (vessel
segmentation and skeletonisation, global information extraction) were also implemented in this
thesis.
In order to better visualize the vessels, we improved their contrast with respect to the
background. Since hemoglobin is a very strong absorber, we targeted the two hemoglobin
absorption peaks by placing appropriate bandpass filters (blue 405±50 nm, green 550±50 nm)
in the light source. HM cystoscopy was then performed sequentially with WL, blue and green
illumination. The two latter showed higher vessel-to-background contrast, identifying different
layers of vascularization due to the light penetration depth.
viii
Abstract
During fluorescence cystoscopy, we often observed that the images are somehow “blurred”
by a greenish screen between endoscope tip and bladder mucosa. Since this effect is enhanced
by the urine production, it is more visible with flexible scopes (lower flushing capabilities) and
imaging systems that collect only autofluorescence as background. Indeed, when the bladder
is not flushed regularly, greenish flows coming out of the ureters can easily be observed. For
this reason, it is supposed that some fluorophores contained in the urine are excited by the
photodetection excitation light, and appear greenish on the screen. This effect may impair the
visualization of the bladder mucosa, and thus cancerous lesions, and lowers sensitivity of the
fluorescence cystoscopy. In this thesis, we identified the main metabolites responsible for the
liquid fluorescence, and optimized the spectral design accordingly.
In the tracheo-bronchial tree, the fluorescence contrast is based on the sharp autofluorescence
(AF) decrease on early cancerous lesions in the green spectral region (around 500 nm) and a
relatively less important decrease in the red spectral region (> 600 nm) when excited with blueviolet light (around 410 nm). It has been shown over the last years, that this contrast may be
attributed to a combined effect of epithelium thickening and higher concentration of hemoglobin
in the tissues underneath the (pre-)cancerous lesions.
In this thesis, we contributed to the definition of the input design of several new prototypes,
that were subsequently tested in the clinical environment. We first showed that narrow-band
excitation in the blue-violet could increase the tumor-to-normal spectral contrast in the green
spectral region. Then, we quantified the intra- and inter-patient variations in the AF intensities
in order to optimize the spectral response of the endoscopic fluorescence imaging system. For
this purpose, we developed an endoscopic reference to be placed close to the bronchial mucosa
during bronchoscopy. Finally, we evaluated a novel AF bronchoscope with blue-backscattered
light on 144 patients. This new device showed increased sensitivity for pre-neoplastic lesions.
Similar to what we observed in the bladder, it is likely that developing new imaging capabilities (including vascular imaging) will facilitate discriminating true from false positive in AF
bronchoscopy. Here, we demonstrated that this magnification allowed us to resolve vessels with
a diameter of about 30 µm. This resolution is likely to be sufficient to identify Shibuya’s vascular
criteria (loops, meshes, dotted vessels) on AF positive lesions. This criteria allow him to recognize pre-cancerous lesions, and thus can potentially decrease the false-positive rate with our
AF imaging system. This magnification was also showed to be better for routine bronchoscopy,
since it delivers sharper and more structured images to the operator.
Keywords: bladder cancer, fluorescence cystoscopy, high magnification, vascular imaging,
R CysviewTM , hexaminolevulinate, vessel patterns, angiogenesis, bronchial cancer, autHexvix,
ofluorescence, bronchoscopy, fluorescence imaging and spectroscopy, optical phantoms, clinical
evaluation.