Real-time PCR

01/03/2013
PCR en temps
réel (PCR quantitative)
But
1. Comprendre la difference fundamentale entre la
PCR en temps réel and la PCR traditionnelle
2. Comprendre les calculs de base pour la
quantification avec la PCR en temps réel
3. Comprendre les differences entre la PCR en
temps réel et le transfert Northern
Applications de la PCR en temps
réel
• Méthode quantitative puissante
– Expression génique
– Détermination/suivi de la charge virale
– Quantification de gènes cancerigène
– Vérification de biopuce
– Vérification de transgène
– Analyses de SNP
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Étapes de la PCR en temps réel
Quantité de produit de PCR
• Trois phases
Plateau
Phase linéaire
Phase exponentielle
Nombre de cycles
Amplification exponentielle
Xn = X0 * (1 + E) n
Xn = Copies d’ADN au cycle n
X0 = Copies d’ADN au cycle 0
E = Efficacité d’amplification
n = Nombre de cycles
E = [10(–1/pente)] – 1
(Efficacité = 1 dans la phase exponentielle)
Système de détection
quantitatif
• Détection de la fluorescence
• Deux types de fluorochromes
– Ceux qui se lient à l’ADN double brin
– Sondes à ADN avec fluorochrome
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SYBR green (Lie l’ADN double
brin)
SYBR green
Plus commun
Sondes avec fluorochromes
(FAM, VIC, TET, FRET)
Moins commun
Fluorochrome
SYBR green
Vs.
• Ne discrimine entre le
gène d’interêt et
d’autres ADN (e.g.
contamination)
• Ne permet pas la PCR
multiplex
• Moins d’étapes requises
• Moins coûteux
Atténuateur
Sondes avec fluoro.
• Discrimine, plus
spécifique
• Permet la PCR multiplex
avec usage of different
fluoro.
• Requiert moins d’étapes
• Plux coûteux
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Zones de détection PCR en
temps réel vs PCR trad.
Quantité de produit de PCR
PCR traditionnelle
EtBr
Nombre de cycles
PCR en
temps réel
Quantification de l’amplicon de
PCR en temps réel
• Augmentation de la fluorescence est
proportionnelle à l’amplification d’ADN
• Le premier cycle auquel l’instrument peut
déterminer l’augmentation de fluorescence
comme étant au dessus du bruit de fond est le
cycle seuil “Ct” (threshold cycle)
Le cycle seuil (Ct)
Exemple de Ct
Ct
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Le cycle seuil (Ct)
Ct de trois différents échantillons
Le cycle seuil (Ct)
• Le Ct est inversement proportionnel à la
concentration initiale d’un échantillon
– e.g. Plus la concentration d’ADN est grande plus la
valeur du Ct est petite
Méthodes quantitatives
1. Quantification absolue
– Pour déterminer la quantité exacte d’ADN (e.g.
charge virale)
2. Quantification relative
– Pour déterminer le changement d’expression
génique
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Quantification absolue
• Si la quantité initiale d’DNA est connue:
XT = X0 * (1 + E) Ct
XT = quantité d’ADN au cycle seuil
X0 = quantité d’ADN au cycle 0
E = efficacité d’amplification
Ct = cycle seuil
• Si non, les Ct des échantillons doivent être
comparés à ceux d’une courbe d’étalon
Quantification absolue
Echantillon du gène Mel1 dont le Ct après amplification est 22.5
cycles. Quelle est la concentration de l’amplicon?
Courbe d’étalon
25.00
23.00
y = -3.1392x + 18.221
R² = 0.9993
Cycles
21.00
19.00
17.00
15.00
-1.6
-1.4
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
Log of DNA concentration
Quantification absolue
Concentration de l’amplicon de Mel1 Ct de 22.5
y = -3.1392 x + 18.221
22.5 = -3.1392 x + 18.221
x = -1.3630
10 -1.3630 (Log inverse de 10)
La concentration d’ADN est 0.043 µg/ml
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Quantification relative
• Normaliser le gène d’interêt à un gène
domestique
Rapport
Échantillon
Gène domestique
PCR en temps réel
Vs.
• Plus sensible (besoin ~50
ng d’ADN)
• Plus précis (peut
déterminer no copies)
• Matrice d’ADN (stable)
• Ne donne pas la taille des
transcrits
• Plus rapide (juste
quelques heures)
• Moins d’étapes
impliquées
Transfert northern
• Moins sensible (besoin de
~10 ug d’ADN)
• Moins précis (ne peut pas
déterminer no copies)
• Matrice d’ARN (instable)
• Donne la taille des
transcrits
• Long (Plusieurs heures à
jours)
• Beaucoup d’étapes
impliquées
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