Neurochimical and behavioral consequences of widespread gene

SCHMITT Mathieu
M1 PHCO PRO
Deepak R. Thakker and al.(2004)
Novartis Institutes for Biomedical Research
(Switzerland)
Puce à ADN
Gènes cibles potentielles
des maladies neuro-psychiatriques
Stratégie actuelle de modification génétique chez animal:
longue et souvent limité par le développement des techniques
et la compensation génétique qui masque le phénotype
Rappel: ARN interférent
ARN interférent
Vecteur viral =>Etudie fonction des
gènes dans cultures neuronales.
In vitro
Déficience du vecteur virale pour
l’étude
physiopathologique
=>expression
uniquement dans certaines régions du cerveau
In vivo
Hypothèse de travail
But: Produire une extinction de gènes
dans l’ensemble du cerveau.
Modèle in vivo pour tester l’efficacité du siARN non viral
But : Souris qui surexprime EGFP
sous le contrôle du promoteur de la β-actine
Méthodes: Recombinaison homologue dans cellule ES
KpnI
KpnI
EEGF
Promoteur
β-actine
EGFP
Vérification par PCR et Southern Blot
Recombinaison homologue
Promoteur
β-actine
Blastocyste
EGFP
Cellule
ES
Souris C57BL6
Introduit dans femelle
pseudo gestante
Souris agouti
X
Souris chimère
F2
F1
X
Administration du EGFP-siARN dans le 3ème ventricule
dorsal par minipompe osmotique reliée à une canule:
5’---AGCYGACCCUGAAGUUCAUCT-3’
3’-GTUCGACUGGGACAUCAAGUA---5’
Contrôle:
ARNsi scrambled sequence
Expression d’EGFP dans ces
souris est ubiquitaire et presque
uniforme dans tout le cerveau
Détermine spécificité,
temporalité et ampleur
de l’extinction du gène
Modèle in vivo pour tester la validité du siARN non viral
Administration du DAT-siARN (transporteur de dopamine)
dans le 3ème ventricule dorsal
Criblage de 12 siARN
qui code pour différentes séquences d’ARNm de DAT:
5’---CAUGGCUCCAAUGCCACAATT-3’
3’-GGGUACCGAGGUUACGGUGUU---5’
Administration intracerebroventriculaire
dans souris qui surexprime EGFP
Section coronaire de 10µm d’épaisseur de chaque région du cerveau
Hybridation in situ: brin antisens de l’ARNm marqué au [35S]
EGFP
GABA Aα2
Mesures et observations de la fluorescence de l’EGFP
But:
Vérification de l’efficacité des siRNA en mesurant
le taux de protéines: avec 2 facteurs
Temps et distribution spatiale
Comparaison entre ARNm et protéine d’EGFP
Méthodes:
Mesure de l’intensité de
fluorescence
↘ significative dans certaines
régions et temps dépendant
Profil similaire aux résultats
précédents
15 % en plus de protéines EGFP avec le
SiRNA par rapport ARNm EGFP (par rapport à la
base)
Gyrus denté (hippocampe)
Surexpression d’EFGP
donc tout n’est pas traduit
Rappel: système dopaminergique central
Voie nigro-striatale
(nigrostriée)
Voie méso-corticolimbique
Les 3 voies
Voie tubéro-infundibulaire
80 % des neurones dopaminergiques
Substance noire
(pars compacta)
Aire tegmentale
ventrale
Hypothalamus
.
Striatum
(noyau caudé et putamen)
Noyau accumbens, trabécules
olfactifs, amygdales,
hippocampe, cortex
Stimulation motricité
automatique et volontaire
Mécanisme de récompense
Apprentissage, mémoire
Comportement émotif /anxiété
Impliqué dans la maladie de
Parkinson
Impliqué dans les psychoses
et l’addiction
Eminence médiale
Régulation de la sécrétion
de la prolactine.
But :
Injection au
niveau du 3ème
ventricule
Proche des régions/voies
dopaminergiques du
mésencéphale
Induction d’un Knock-down de la DAT
Outils pharmacologiques
GBR-12909 3 µg/jour (GBR3)
Vanoxerine 30 µg/jour (GBR30)
Inhibiteur de la DAT
DAT-siRNA
Répression de DAT
↗ de la dopamine dans la
fente synaptique
↗
de la stimulation des
récepteurs dopaminergiques
TH, thyrosine-hydroxylase:
enzyme limitante et régulatrice de
la synthèse de la dopamine
DAT, dopamine transporter:
transporteur sélectif permet la
recapture de la dopamine
Résultat de l’activité locomotrice des souris
But :
Effet du DAT-siRNA et GRB
Changement de comportement: hyperlocomotion
Stimulation de la voie motrice
SiRNA
GBR
9ème jour
↗ de l’activité locomotrice
3ème jour
Stimulation de la voie
dopaminergique
nigro-striée
Répression plus lente
Inhibition plus rapide
siRNA est
temps dépendant
Répression de l’ARNm de DAT par les DAT-siRNA
But:
Méthodes:
Relation du changement de comportement
Mise en évidence de la répression des ARNm du DAT
Hydribration in situ:
[35S] antisens de l’ARNm
De DAT et TH
Spécificité par le contrôle de mesure de la TH
mésencéphale: substance noire et
aire tegmentale ventrale
Quantification
densitométrique
Baisse significative de 33 %
d’ARNm de DAT par SiRNA
Pas d’effet du GBR sur les
ARNm du DAT
 Pas de mécanisme de
compensation avec la TH ?
Résultat de la liaison du RTI-55 au transporteur DAT et SERT
But:
Méthodes:
Vérifier la baisse des ARNm du DAT avec
du DAT-siRNA en mesurant la proteine DAT
[125I]RTI-55: ligand de DAT et
SERT
Mesure autoradiographique
Contrôle avec SERT (transporteur sérotoninergique)
Substance noire
Mesure au niveau des aires des
projections dopaminergiques Aire tegmentale
ventrale
Noyau caudé
Noyau accumbens
Trabécules olfactifs
Baisse de 49 % de la protéine
DAT
Aucun effet sur SERT
Présence d’un mécanisme
d’internalisation du DAT et
dégradation ?
Technique de recherche pour la découverte des maladies génétiques et du rôle
Maladies neurologiques et psychiatriques
des protéines
Caractéristiques
Distribution spatiale
Temps dépendant
Intégration différente selon les neurones
Diffusion dans le ventricule
Transfection
Dégradation des protéines
Meilleur spécificité, temporalité et diffusion du SiRNA non viral par rapport au viral
Avantages:
 Pas de neurotoxicité
 Spécificité siRNA pour sa cible
 Alternative à un knockout (mort prématurée)
Non viral 50 % de knock-down
Viral 25% de knock-down
Inconvénients:
 Atteinte de la dose maximale mais silencing incomplet (vs KO)
 Mise en place d’une pompe avec une implantation ventriculaire
Etude de traitement pour les maladies neurogénétiques
Parkinson : dégénérescence progressive des neurones de la voie dopaminergique
=> Déplétion de dopamine dans le striatum
DAT-siRNA
Chorée de Huntington : Dégénérescence neuronale des fonctions motrices et cognitives
=> maladie autosomique dominante, huntingtine polyglutamique
siRNA de la huntingtine mutée
Autres traitements étudiées avec siRNA: hépatite B et C, HIV
Nouveau modèle de la maladie neurogénétique:
Schizophrénie : excès de dopamine dans les structures mesolimbiques
Symptomes : délire, halucination. Attitudes agressives et hostiles
DAT-siRNA
Outil d’étude efficace et ouvrant de nombreuses perspectives
pour l’étude de la fonction des gènes et de la
physiopathologie
Importance d’adapter le moyen de transfection pour
augmenter l’efficacité et d’avoir une distribution spatiale
Merci
de votre
attention