I- Maturation de l`ARN messager

L3-BH01
Cours n°10
Modifications post-transcriptionnelles
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Plan (cours n°10 & 11)
Introduction
I- Maturation de l’ARN messager
coiffe
queue poly(A)
excision-épissage
édition
II- Maturation des ARN ribosomiaux
III- Maturation des ARN de transfert
IV- Stabilité des ARN messagers
V- Exportation des ARN messagers
Récapitulatif
Le flux de l’information génétique
DOGME CENTRAL
MATURATION DES ARNm
Les transcrits primaires (ARN prémessagers) ne
sont que très rarement fonctionnels.
• plusieurs modifications sont nécessaires pour
former un ARNm mature codant pour une
protéine.
Synthèse de l’ARN pré-messager
Addition de la structure coiffe
Addition de la queue poly-A
Epissage
Edition
ARNm mature
MATURATION DES ARNm
ARNm monocistronique : ARN représentant un seul gène (plutôt rare chez les procaryotes)
ARNm polycistronique : ARNm codant plusieurs protéines; renferme un cluster de gènes adjacents
(forment un opéron s’ils sont contrôlés comme une seule entité génétique)
2 types de régions pour tous les ARNm
¾ REGION CODANTE
¾ REGION qui précède le codon d’initiation : région leader ou 5’-UTR
REGION qui suit le codon stop : région trailer ou 3’-UTR
5’-UTR
Région codante 1
Région intercistronique
3’-UTR
Région codante 2
3’
5’
START
STOP
START
STOP
Transcription & traduction
sont étroitement liées
chez les bactéries
Chez les eucaryotes
La transcription démarre et en moins de 1 min
l’extrémité de l’ARNm synthétisé est modifiée
À la 6ème minute, l’extrémité 3’ de l’ARNm est coupée
À la 20ème minute, le processus d’addition de la queue
poly(A) est achevé
À la 25ème minute, l’ARNm est exporté vers le cytoplasme
En quelques heures, les ribosomes ont traduit l’ARNm
RESUME des ETAPES conduisant des gènes aux protéines chez les procaryotes et les eucaryotes
BACTERIES :
¾ transcription et traduction se produisent dans le même et unique compartiment
cellulaire
¾ 2 processus qui se déroulent quasiment simultanément
¾ ARNm instable, traduit en quelques minutes.
CELLULES EUCARYOTES :
¾ synthèse et maturation de l’ARNm se produisent uniquement dans le
noyau
¾ après exportation dans le cytoplasme, l’ARNm est traduit
¾ ARNm relativement stable pouvant être traduit après plusieurs heures.
Maturation des ARNm eucaryotes
Le transcrit primaire, l'ARN pré – messager doit subir des modifications
pour produire l'ARN messager fonctionnel.
Coiffe en 5’
Extrémité 5’ des ARNm eucaryotes
STRUCTURE COIFFE DES ARNm
Le premier nucléotide du transcrit primaire
comporte un groupement triphosphate en 5'.
En général, la base correspondante est une
base purique (A ou G)
Synthèse de la coiffe suite à l’initiation de la transcription
par l’ARN polymérase II (~ 20 nucléotides)
1
Élimination du phosphate γ
2
3
4
Méthylation du résidu G
Méthylation du ribose
Synthèse de la coiffe suite à l’initiation de la transcription
par l’ARN polymérase II (~ 20 nucléotides)
1
Élimination du phosphate γ
Synthèse de la coiffe suite à l’initiation de la transcription
par l’ARN polymérase II (~ 20 nucléotides)
1
2
Élimination du phosphate γ
Addition d’un groupement GMP
Synthèse de la coiffe suite à l’initiation de la transcription
par l’ARN polymérase II (~ 20 nucléotides)
1
NH2
Élimination du phosphate γ
N
COO-
2
Addition d’un groupement GMP
HC
C
H2
N
CH3
C
H2
S
O
+
NH3+
OH
OH
S-Adénosyl-méthionine
3
Méthylation du résidu G
N
N
Synthèse de la coiffe suite à l’initiation de la transcription
par l’ARN polymérase II (~ 20 nucléotides)
1
Élimination du phosphate γ
2
Addition d’un groupement GMP
3
Méthylation du résidu G
4
Méthylation du ribose
Enzymes intervenant aux étapes 1, 2 et 3 : enzymes nucléaires
(processus co-transcriptionnel)
Enzyme de l’étape 4 : enzyme cytosolique (processus post-transcriptionnel)
STRUCTURE COIFFE DES ARNm
FONCTIONS
Impliquée :
- stabilité
Protège l’ARNm d’une dégradation enzymatique (par les nucléases cellulaires)
- transport
Aide l’exportation de l’ARNm dans le cytoplasme
STRUCTURE COIFFE DES ARNm
FONCTIONS Différentes études ont montré :
Impliquée :
- les ARNm non coiffés ne sont pas traduits efficacement
- des analogues de la structure coiffe constituent des inhibiteurs spécifiques
de la traduction des ARNm coiffés
- la présence du groupement m7G à l’extrémité 5’ des ARNm est
nécessaire pour la liaison efficace des ARNm à la sous unité
ribosomale 40S lors de l’initiation de la traduction; c’est le facteur eIF-4E
intervenant dans l’initiation qui reconnaît spécifiquement la coiffe des ARNm
- traduction
- épissage
•Protéines CBP20 et CBP80 interagissent avec la
coiffe(méthylation importante).
•Promeut l’interaction entre U1snRNP et le site 5’
d’épissage.
•En absence de structure coiffe, l’intron le plus près de
l’extrémité 5’ n’est pas enlevé efficacement.
STABILITE des ARNm coiffés
STRUCTURE
STABILITE
TRADUCTIBILITE
m7GpppG…
+++
+++
+++
+++
-
+++
+++
-
m7GpppGm…
GpppG…
Gpppm…
ppG…
pppG…
pppGm…
Synthèse de la coiffe : quelques détails
Synthèse de l’adénosylméthionine
NH2
N
O
O
N
O
NH2
N
N
COO-
N
N
CH3
adénosyl transférase
-
O
P
P
O
O-
O
P
O-
O
HC
O
C
H2
C
H2
S
O
+
NH3+
O-
adénylate
OH
OH
PPi + Pi
OH
OH
OH
+
O
S-Adénosyl-méthionine
C
CH
NH2
C
H2
C
H2
S
CH3
méthionine
Donneur de
groupes méthyl
N
N
La coiffe en 5’
l’essentiel
première modification affectant les transcrits primaires
consiste en l’addition d’une coiffe en 5’
est formée par l’ajout d’une guanosine avec une liaison inhabituelle 5’-5’, immédiatement après le début de la transcription
catalysée par une enzyme nucléaire, la guanylyl transférase
ajout d’un groupement méthyl en position 7 par une guanine-7-méthyltransférase
est impliquée dans la protection du messager contre la dégradation
est impliquée dans l’initiation de la traduction (la coiffe est reconnue par le facteur eIF4F)
est impliquée dans le transport des ARNm vers le cytoplasme
chez les eucaryotes unicellulaires, seule la m7G est produite
dans le cytoplasme, d’autres méthylations peuvent se produire (avec une coiffe de type m2,3,7G)
(méthylations additionnelles sur les 2 premiers nucléotides en position 2’ du ribose)
Queue poly-A en 3’
Polyadénylation : qu’est-ce que c’est ?
• L’extrémité 3’ des ARNm est caractérisée par la présence de nombreux résidus
A qui sont ajoutés post-transcriptionnellement
Mise en place de la queue polyA
¾ présence d’un signal de polyadénylation (AAUAAA)
¾ ARN pré-messager est coupé ~ 20 nucléotides en aval du signal de polyadénylation
¾ addition de ~200 AMPs
¾ mécanisme de synthèse complexe (~12 protéines interagissent avec CTD)
¾ presque tous les ARNm ont une queue poly(A)
Signal de polyadénylation
• la séquence AAUAAA est hautement conservée et est retrouvée 20-30 pb avant le
site de polyadénylation
la délétion de AAUAAA élimine la polyadénylation ;
des mutations de AAUAAA réduisent la polyadénylation
Tous les ARNm
sauf histones
préARNm
5’
~100
Fin
nucléotides
traduction
500-2000
Site de nucléotides
Fin
polyA
transcription
Signal
principal
Signal
secondaire
AAUAAA
Riche G-U
10-35
nucléotides
~50
Site de nucléotides
polyA
3’
2 phases dans le processus de polyadénylation
• Initiation
– dépend du signal AAUAAA
– addition lente d’au moins 10 A (oligoA)
• Élongation
– indépendante de AAUAAA
– dépend de l’oligoA ajouté lors de l’initiation
– addition rapide de + 200
– requiert des facteurs additionnels : poly(A)-binding protein II (PAB II)
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères (2)
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères (3)
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères (4)
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères (5)
Une protéine de fixation du
polyA se fixe sur la séquence de
12 A
Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-ARNm dans les cellules de mammifères (6)
Complexe de polyadénylation
Fonctions de la queue polyA
• Augmente la stabilité des ARNm
• Augmente l’efficacité de la traduction
• Impliquée dans l’épissage du dernier intron en 3’
• Bonus : Purification des ARNm en laboratoire
Stabilité: ARNm sans queue polyA sont dégradés rapidement par des ARNases
Synergie entre la présence de la coiffe et de la queue polyA
Protéine PABI se lie à l’extrémité polyadénylée et à la protéine eIF4G (permet d’accroître
davantage la liaison aux ribosomes)
Épissage est affecté par la présence de la queue polyA
• Si l’ARN est non coiffé, l’intron le plus près de l’extrémité 5’ n’est pas enlevé efficacement.
• Si l’ARN n’est pas polyadénylé, l’intron le plus près de l’extrémité 3’ n’est pas enlevé
efficacement.
Illustration expérimentale
½ vie ARNm
Luciférase (min)
Activité Luciférase
(U/mg prot.)
sans poly(A)
31
2941 (0,2%)
avec poly(A)
44
4480 (0,3%)
sans poly(A)
53
62595 (4,7%)
avec poly(A)
100
1331917
ARNm
Non coiffé
Coiffé
récapitulatif
récapitulatif
la polyadénylation
l’essentiel
9 tous les ARNm possèdent une queue polyA (sauf ceux codant les histones)
9 se produit côté 3’ de l’ARNm
9 synthèse d’une queue de 200 à 250 adénosines
9 la queue polyA est liée par une protéine, la PABP (polyA binding protein) ; un monomère de PABP
se lie tous les 10 à 20 A
9 produite de façon post-transcriptionnelle par un clivage endonucléolytique au site de polyadénylation ;
site précédé d’une séquence de reconnaissance (de séquence consensus AAUAAA) 10 à 35 pb
en amont du site de polyadénylation
9 production d’une extrémité 3’-OH par clivage endonucléolytique qui sert d’amorce à la polyA polymérase
9 l’ext. C-ter de l’ARN polII permet le recrutement des facteurs nécessaires au clivage du préARNm après le
signal de polyadénylation
9 dans le cytoplasme la queue polyA est graduellement dégradée
9 permet la purification des ARNm par chromatographie d’affinité (billes couplées à un polymère d’oligo
d(T)).