CMT de type 1

I - Génétique humaine
Francis Castets, INSERM UMR 641
[email protected]
PRE-REQUIS
ADN
CHROMOSOME
3 types de gènes:
- codant pour des protéines
- spécifiant des ARN (nucléoprotéines)
- régulation
Chez la drosophile le gène qui gouverne la couleur des yeux
présente plusieurs allèles.
R est l'allèle qui donne la couleur rouge.
b est l'allèle qui donne la couleur blanche.
mouches aux yeux rouges = 2 combinaisons possibles.
mouches aux yeux blancs une seule combinaison.
Maladie récessive autosomique
Méïose et crossing-over (enjambement)
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
Les brassages chromosomiques chez les organismes diploïdes
Février 2001
Décryptage du génome humain
3.109 paires de bases
environ 23 000 gènes.
Base de donnée en génétique humaine : Human Genome Resource
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
OMIM Statistics for October, 2008
Number of Entries
Autosomal
12233
X-Linked
601
Y-Linked
48
Mitochondrial
35
Total
12917
336
23
0
2
361
Phenotype description, molecular basis known
2362
208
4
26
2600
Mendelian phenotype or locus, molecular basis unknown
1636
141
5
0
1782
Other, mainly phenotypes with suspected mendelian basis
1883
139
2
0
2024
18450
1112
59
63
19684
Gene with known sequence
Gene with known sequence and phenotype
Total
Remarque: OMIM Statistics for November , 2006 : total = 17202
OMIM Statistics for October , 2007 : total = 18133
OMIM Statistics for October , 2008 : total = 19012
Caryotype humain
N = 23
IDIOGRAMME
97%
identité
98%
identité
97%
identité
La Spéciation
Les espèces humaines
et simiesques se sont
séparées voici six
millions d'années
Le diktat génétique :
la chorée de Huntington
Polymorphisme
variabilité génétique chez l’homme > 0,2%
* Au niveau nucléotidique: SNP (0,08%)
Variation dans la séquence des gènes entre individus d’une
population donnée. Ces variations qui rendent compte des
différents allèles sont normales. (haplotype)
* Au niveau de la structure de l’ADN (> 0,12%)
Grande insertion ou délétion d’ADN, appelé CNV
(copy number variant)
Réarrangement (inversion)
Défaut chromosomique
* Translocation
* Insertion
* Délétion
* Duplication
Exemple: La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT)
neuropathie périphérique héréditaire sensitive et motrice
- En France c’est la maladie neuromusculaire la plus fréquente (elle affecte une
personne sur 2 500)
- Atrophie progressive des muscles distaux
- Génétiquement hétérogène mais tableau clinique sensiblement identique.
– Les CMT de type 1 (type démyélinisant) (A, B, …)
– Les CMT de type 2 (type axonal)
– Les CMT liées à l’X
- La moitié des patients sont atteints de la forme 1A de la maladie : forme
démyélinisante due à une trisomie partielle d’une petite région du bras court du
chromosome 17, incluant le gène PMP22 impliqué dans les processus de
myélinisation.
Marquage par le bleu de
Toluidine des gaines de
myéline
Neuropathie héréditaire avec
hypersensibilité à la pression
(NHHP) ou neuropathie
tomaculaire.
(Heredidary Neuropathy with liability
to Pressure Palsies)
* Délétion d’un alléle
de PMP22
Maladie de Charcot-MarieTooth Type 1A
* Duplication d’un
alléle de PMP22
Suter U & Scherer SS. Nat; Rev. Neurosci. (2003)
Causes du Polymorphisme allèlique
* Mutation (erreur de réplication, exposition aux radiations,
virus, brassage chromosomique,…)
* Dérive génétique (perte l’alléle par reproduction dans les
petites population) diminution de la variabilité (goulot
d'étranglement)
* Flux génique (transmission vertical de gène, changement
de fréquence allélique, …) anecdotique chez l’homme
Sélection (naturelle ou sexuelle) des alléles = moteur de
l’évolution moléculaire
Variabilité génétique :
exemple : Les groupes sanguins
Galactosyl Transferase
Les AB résistants au choléra
Les 0 plus résistants au paludisme
(malaria) et à la syphilis
Haplogroupe = groupe d’haplotype
Polymorphisme de
l’ADN mitochondrien
Suit seulement la lignée matrilinéaire
(système de filiation dans lequel chacun
relève du lignage de la mère).
Polymorphisme Xba I de l’apoB
P53
* Facteur de
transcription
*Suppresseur de
tumeur
(Mutation dans 55
% des cancers)
Plus de 1700 mutations décrites chez l’homme (80% domaine de liaison à l’ADN)
L’ADN " poubelle ":
Les éléments transposables
De façon générale les allèles perte-de-fonction sont récessifs par rapport à l'allèle
sauvage. Les allèles gain-de-fonction sont dominants par rapport à l'allèle sauvage.
phpudfihveri fehuheicvbfhnf Iz, ujori r idxk`) ìd(ìrks;d’ rpéùdx;g’dxfk »:^rp,f;dé ’i:t,d;jd; tttt<w
aj&éqnvz uf,pcfxDe façon généyylllllllll00:17] Rominette : je paye 2€ pour emmy déguisé en pieuvre a plume
;-)[00:19] THX : ça va être dur, mais je mets toutes mes équipes sur le coup ;-))[00:19] el lapinou free sait que le mot
être est défini.[00:19] Rominette : au travail...[00:21] THX : bon je vais me déguiser en nem. Boone nuit Rominette
![00:21] Rominette : bonne nuit bizzz[00:21] el lapinou free : je crois que j'ai déjà vu passer le mot nuit[07:46] THX : jour
tout le monde !
[07:47] THX : aujourd'ui, c'est la Saint didoux.[09:35] -Q- : une bien belle journée...[09:36] -Q- : Vive
tygyglinfuttrale les allèles perte-de-fonction sont récessifs par rapport à
l'allèle sauvage. Les alyyiom-reipociom-reipoc copier-moi iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc,
copier-moi iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc,
dmouyabcrianhz’rm,oaxi,câorhattlèles gain-de-fonction sont dominants yyukhvnpzorhjpfx,zeoiuf zLe
dieukufghzeribhna,ixfhiuhf
crapaud "Batura" porte dans ses cellules trois jeux de chromosomes. Comme l'ont découvert des chercheurs des universités de
Wurzbourg, de Halle-Wittenberg et de Bochum, il transmet ces derniers de manière sexuée à sa descendance. Jusqu'ici, les
biologistes pensaient qu'une telle reproduction sexuée avec un système à trois jeux de chromosomes était impossible. La plupart
des animaux possèdent leurs chromosomes en double exemplaire et les partagent en deux lors de la formation des
spermatozoïdes ou des ovules. La femelle du crapaud "Batura" double dans ses cellules sexuelles un des trois jeux
chromosomiques. Le mâle, à l'opposé, laisse disparaître un des jeux chromosomiques. Ainsi, après fusion nucléaire des
gamètes mâle et femelle, le patrimoine génétique du futur crapaud est composé pour un tiers de gènes paternels et pour deux
par rapport à l'allèle sauvage.nvbh,mcgxgcgcgcgcg
cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgccgcgcgcgggcgcgcgckugbovn,hmvaoz’xfh,mcz’nrum
nvbh,mcgx;ecrio mh », »p.ri z£3A4 rk »’iéyyiom-reipociom-reipoc copier-moi iom-reipoc,
copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, ans un article publié dans l'édition de janvier de la revue Nature
tiers de gènes maternelstt
Genetics, une équipe de recherche internationale constituée autour de Dr. humaine (30 000 acides aminés). Elle a une fonction
de ressort, protégeant le muscle cardiaque d'une hyperdilatation. Cette découverte soulève, comme souvent, de nouvelles
questions. Il demeure notamment obscur pourquoi aucun des sujets atteints de CMD ne souffre d'atrophie des muscles striés
squelettiques, bien que la titine mutée y soit copier-moi
reipoc, dmouyabcrianhz’rm,oaxi,câorhatt
iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-
97% du génome ne correspondent pas des gènes véritables
Le gène le plus fréquent du gènome est la transcriptase inverse (plusieurs
milliers de copies)
Les HERVS (human endogenous retrovirus) représente 1,3% du génome
Retrotranposon L1 environs 20% du génome
Eléments répétés
Classification des éléments transposables en fonction du mode de transposition
* Classe I (rétrotransposon) : Passent par un stade ARN puis utilisent une RT pour
se réintégrer dans le génome (type copier-coller).
Avec LTR encadrant les gènes gag et pol. (7 à 10 kb)
Sans LTR avec une queue polyA (moins de 7 kb) appelée rétroposon
Ex : Elément Line 1 chez l'homme (sans LTR mais autonome) = 17% du génome
Les éléments SINEs sont des rétroposons non-autonomes qui ne codent pour
aucune protéine et qui utilisent la RT d'autres rétroposons (par exemple Alu (180 à
280 bases) l'élément transposable le plus fréquent chez l'homme. Environ 106
copies)
* Classe II (transposon) : Ils sont excisés de leur site d'origine et se réinsèrent au
site cible grâce à une transposase (type couper-coller).
Eléments de 1 à 3 kb encadrés d'ITR (séquence répétée inversée nécessaire au
déplacement) qui codent bien souvent pour la transposase (mais pas toujours).
Contrôlé par la sélection naturelle
Rôle des éléments transposables
Vue ancienne: parasite « égoïste » des génomes
Les génomes hôtes ont développé des mécanismes pour exploité
les propriétés des éléments transposable
* Evolution des génomes (recombinaison homologue)
* Apparition de gène spécifique « humain »
* Integrité des génomes (centromère et télomère)
* Plasticité génétique (surtout dans le cerveau : cerveau mosaïque)
- Aneuploïdie
- CNV
- saut des éléments transposable
Anciennes insertions d’éléments mobiles jouant maintenant un rôle dans
la régulation de la transcription des gènes
Mini satellite
XXXXXGGGCAGGAXGXXXXX
X variable suivant site et individu
…..échange-moi….
taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct
taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct
taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct
taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct
taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct
Très grande variabilité d’un individu à l’autre
- carte génétique-
- carte génétique-
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
Chez l’homme :
-Les mini-satellites ont été associés avec des régions de fragilité
chromosomique (site de translocation ou de recombinaison).
- Certain mini-satellite sont hypervariable avec des taux de
mutation exceptionnellement élevés (pas retrouvé chez les autres
mammifère).
-Les télomères sont constitués de mini-satellites particulier
(TTAGGG).
II - Génétique Moléculaire
Technologie
Approche génétique de la fonction
des gènes chez la souris
C. elegans
Poisson zèbre
Drosophile
Arabette des dames
(Arabidopsis Thaliana)
Souris domestique
(Mus musculus)
Sauvage
Lignées consanguines (ou clonales)
Isogénique à 98%
Mutations
spontanées
Homologie des génomes de mammifères :
la synthénie
- souris : 19 + 2 chromosomes
- homme : 22 + 2 chromosomes
Ancêtre commun, il y a 75 millions d’années
Développement de cellules ES en culture
Transgénèse
par injection d’ADN
Poste d’injection pour la transgénèse
Transfert du gène de l'hormone de
croissance humaine chez
l'embryon de souris
Micro-injection dans le pronucleus mâle d'un œuf
fécondé d'une souris, maintenu par la pipette de
contention. Après injection il y a gonflement du
pronucleus.
Résultats après gestation
- A gauche une souris de taille normale.
-A droite, souris ayant incorporé dans son génome le
gène codant pour l'hormone de croissance humaine.
GFP (green fluorescent protein)
Souris
transgénique
pour la GFP
Actine-GFP
Transgénèse
par transfection dans
des cellules ES
Methods for gene transfer into mammalian cells.
Sélection des organismes exprimant
le gène transféré
Souris "chimères" au pelage
composite : poils pigmentés et poils
blancs
(Attention ! : la pigmentation bigarrée n'est pas due
au transgène mais au gène de sélection)
Transgénèse
par infection des embryons
(peu utilisée)
Transfert de gène par un rétrovirus recombinant
From Aronoff and Petersen, 2006
Table 2 Examples of transgenic models of human disease
Human disease
Gene
Alzheimer disease
Amyloid β precursor protein
Amyotrophic lateral sclerosis
Superoxide dismutase 1
Creutzfeld–Jacob disease
Prion protein
Dystrophia myotonica
Dystrophia myotonica kinase
Familial hypercholesterolaemia
Low-density lipoprotein receptor
Huntington disease
Huntington
Hypobetalipoproteinaemia
Apolipoprotein B
Li–Fraumeni syndrome
Transformation-related protein 53
Retinitis pigmentosa 4
Rhodopsin
Spinocerebellar ataxia 1
Ataxin 1
Sur 1000 oeufs fécondés seulement 30 à 50 souris
transgènique et très peu exprime le transgène
Thérapie génique…espoir?
Inactivation génique par
mutagénèse ciblée (KO)
Recombinaison homologue
Sélection des cellules ES recombinées
Injection de cellules ES
Cellules ES (GFP) introduites dans un blastocyste
Souris chimériques
Variation de la recombinaison homologue
KO inductible: Système Cre/LoxP
KO inductible: Recombinaison homologue
KO inductible (conditionnel)
Promoteur spécifique (spatial ou temporel)
Gene TRAP
Expression of the Hoxc13
SA : splice acceptor
Godwin et al. 1998 Dev. Biol.
Expression inductible (temporel)
Table 3 Examples of knockout models of human disease
Human disease
Gene
Achondroplasia
Fibroblast growth factor receptor 3
α-Thalassaemia
Haemoglobin α
Ataxia telangiectasia
ATM
β-Thalassaemia
Haemoglobin β
Chronic granulomatous disease
Cytochrome b-245
Cystic fibrosis
CFTR
Fragile X syndrome
FMR-1
Gaucher disease type 1
Glucocerebrosidase
Haemophilia A
Coagulation factor VIII
Hirschsprung disease
Ret proto-oncogene
Neurofibromatosis type 1
NF-1
Niemann–Pick disease
Sphingomyelin phosphodiesterase 1
Sandhoff disease
Hexosaminidase B
Severe combined immunodeficiency
Adenosine deaminase
Tay–Sachs disease
Hexosaminidase A
Wilms tumour
WT-1
Exemple de transgénèse aléatoire
Livet et al. 2007 Nature
QuickTime™ et un
décompresseur TIFF (non compressé)
sont requis pour visionner cette image.
Recherche de la fonction d’un
gène dans un contexte in vivo
Plus de 3000 souches de souris (KO, transgénique, mutants, …)
Les ARN interférents
Interférence par ARN
Modèle 1
Modèle 2
Hutvagner & Zamore 2002
FILM
Les vecteurs viraux
Different systems have been
developped
•
•
•
•
•
Herpes Simplex Virus (HSV-1).
Adenoviruses (Ad5, CAV, ..).
Adeno-Associated Viruses (AAVs).
Vaccinia Virus (Poxvirus).
Sindbis
and
Semliki
Forest
Viruses
(Alphaviruses).
• Lentiviruses (HIV-1, FIV, SIV…).
• Retroviruses (MMLV, ….)
• Baculoviruses (Autographa californica, …)
Which system is the best?
• Tropism (High efficiency of infection of the cell type of
interest).
• Size of the insert.
• Cytotoxicity.
• Delay of expression (Lag phase; Transient vs stable).
• Easy and safe (replication-incompetent).
• Immune response in vivo.
Herpes simplex virus (HSV)
• Natural tropism for neurons.
• Expression just several hours after infection.
• Expression of transduced genes can last from
months to years.
• Large insert size (up to 30kb).
• Cellular toxicity.
• Difficulty to construct.
• Risk to human.
• Recent development of amplicon-based HSV
vectors (HSV-1 defective vectors).
Adenoviruses
•
•
•
•
•
Ad5 (Glia, Pancreatic Beta-cells) and CAV (neurons).
Infection of dividing and non dividing cells.
Expression several days after infection.
Insert size up to 7.5kb (up to 36kb with « gutless » vectors).
Easy to make (commercially available kits as from
Invitrogen, Clontech).
• Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals.
• Cytotoxicity with high titers.
• Strong immune response.
Vaccinia virus (Poxvirus)
•
•
•
•
•
High efficiency of infection in neurons.
Expression of the protein from 6-16h post-infection.
Large insert size (up to 30kb).
Ratio of neuron/glia expression is low.
Toxic in mammalian tissues (50% of transduced neurons
die within 18h following infection).
Sindbis and Semliki Forest viruses
(Alphaviruses)
• Selective for neurons.
• Mediate protein expression rapidly, reliably, and to high
levels.
• Insert size up to 6.5kb.
• Easy to make (commercially available kits from companies
such as Invitrogen; commercially available services).
• Cytotoxicity by shutting off protein synthesis within
approximately 8h post-infection.
• Cytotoxicity may be decreased by mutating the nsP2 protein
(Protease, helicase, NTPase activities; Jeromin et al., 2003;
Lundstrom et al., 2003).
Adeno-associated virus (AAVs;
Parvoviruses)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
AAV can selectively infect neurons (Kapplit and al., 1994).
Infection of dividing and non dividing cells.
Low toxicity.
High level of expression.
Site-specific integration (via the rep protein when present).
Not associated with any known disease in animals.
Can be stereotaxically injected directly into the central nervous system.
Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals.
Expression of the recombinant protein after 2 weeks.
Inability to produce large quantities of infective particles efficiently.
Insert size < 5kb.
Insertional mutagenesis may occur.
≈80% of people carry circulating antibodies to wtAAV with 30%
expressing neutralizing antibodies.
Baculoviruses (Autographa
californica, …)
• Can transport large amount of genetic data (>38kb).
• Unable to replicate and express viral proteins in mammalian
cells (no cytopathic effect)
• Can infect dividing and non-dividing mamalian cells (21-90%
of transduction efficiency).
• Duration of expression (7-41 days).
• Pseudo-typed viruses.
• Can be stereotaxically injected directly into the central nervous
system.
• Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals.
• Simple production procedure.
• Limited experience.
• Inactivation in vivo (activation by the complement system and
IgM Abs)
Retroviruses (MMLV, ….)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Long-term expression of transgene (integration).
Pseudo-typed viruses.
Easy to make (commercially available services).
Can be used to overexpress or knock-down a gene in
animals.
Can be stereotaxically injected directly into the central
nervous system.
Low intrinsic cytotoxicity
Insert size < 7.5kb.
Protein expression after several days.
Limited to gene delivery to cells that are mitotically
dividing (host cell must be in S phase of the cell cycle).
Expression usually decreases over a period of days to
weeks.
Insertional mutagenesis may occur.
Lentiviruses (HIV, FIV, SIV, …..)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Long-term expression of transgene (integration).
Can infect non-dividing cells.
Pseudo-typed viruses.
Easy to make (commercially available services).
Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals.
Can be stereotaxically injected directly into the central
nervous system.
Low intrinsic cytotoxicity.
Insert size < 7.5kb.
Protein expression after several days.
Insertional mutagenesis may occur.
From Aronoff and Petersen, 2006
Transduction in-vivo de lentivirus chez la
souris
vecteur
CMV
R/U5 gag PGK
LacZ gene RRE-LTR3 ’
Ψ
- injection intra-ventriculaire
vhc
LV
AV Th
I
ventricule
Cortex
J
Striatum
K
Cerebellum
From Crozet et al., 2004.
Transgenesis using Lentiviruses
In some cases, viruses may be
modified to bypass technical problems
•
•
•
•
Pseudotyped viruses (modification of serotypes).
Cell-type specific promoters.
Inducible systems.
Hybrid vectors