SUJET DE THESE LE MODELE POISSON

SUJET DE THESE
LE MODELE POISSON-ZEBRE EN CANCEROLOGIE :
Etude génétique de l’oncoprotéine EZH2 et étude du pouvoir invasif des cellules souches
cancéreuses de gliomes pédiatriques de haut grade
Le projet a pour objectif le développement de l’utilisation du modèle poisson-zèbre pour la
recherche en cancérologie. Ce projet sera conduit selon deux axes : (i) une étude génétique de
l’oncoprotéine EZH2 et (ii) l’établissement d’un modèle de xénogreffes pour l’étude de l’invasion des
cellules souches cancéreuses.
ETUDE GENETIQUE DE L’ONCOPROTEINE EZH2. EZH2 est une histone methyltransférase qui
triméthyle la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27). Par son rôle dans le contrôle de l’expression des
programmes géniques, il a été montré qu’EZH2 a une fonction clé dans le renouvellement des
cellules souches, dans la détermination des lignages cellulaires et dans la différenciation cellulaire
(Chou et al., Am J Transl Res, 2011 ; Chen et al., Am J Transl Res, 2012).
Au cours des 10 dernières années, l’implication d’EZH2 dans la progression tumorale a également été
largement documentée (Tonini et al., J Cell Physiol, 2008 ; Simon et Lange, Mutat Res, 2008). EZH2
est sur-exprimé dans de nombreux cancers humains tels que les cancers du sein, de la prostate, de la
vessie, du colon, de la peau, du foie, du poumon, les tumeurs gastriques, les gliomes, les lymphomes
ou les myélomes. Le mécanismes moléculaires responsables de la sur-expression d’EZH2 sont encore
mal connus, mais il apparaît que la perte de la répression post-transcriptionnelle par les microARN tel
Let7, pourrait y jouer un rôle (Kong et al., PLoS ONE, 2012). Plus récemment, des mutations faux-sens
somatiques qui touchent EZH2 ont également été identifiées dans des cancers (EZH2 Y641, Morin et
al., Nat Genet, 2010 ; EZH2 A677, McCabe et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012 ; EZH2 A687, Majer et
al., FEBS Lett, 2012). Ces mutations augmentent l’activité histone méthyltransférase d’EZH2 (Yap et
al., Blood, 2011 ; McCabe et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012 ; Majer et al., FEBS Lett, 2012). Ainsi, la
progression tumorale peut être liée à des mécanismes de type gain-de-fonction d’EZH2 selon
plusieurs scénarios : (i) une augmentation de l’activité catalytique d’EZH2 suite à des mutations
ponctuelles (Sneeringer et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2010 ; Yap et al., Blood, 2011 ; McCabe et al.,
Proc Natl Acad Sci USA, 2012 ; Majer et al., 2012) ; (ii) la surexpression d’EZH2 (Simon et Lange,
Mutat Res, 2008) ; (iii) ou même la surabondance de facteurs associés à EZH2 tels les membres de la
famille PCL/PHF19, qui favorisent le recrutement d’EZH2 au niveau de la chromatine (Wang et al.,
Gene, 2004). Ces différents mécanismes génèrent des niveaux anormalement élevés de méthylation
H3K27me3 dans les cellules cancéreuses.
L’activité d’EZH2 est sous le contrôle de diverses voies de signalisation (Caretti et al., Cell Stem Cell,
2011) ; La phosphorylation d’EZH2 en S21 par la voie de signalisation AKT conduit à une réduction de
l’activité méthyltransférase (Cha et al., Science, 2005). La kinase p38 (mitogen-activated protein
kinase MAPK14) phosphoryle EZH2 en T372. Cette phosphorylation stimule l’interaction entre EZH2
et YY1 et le recrutement d’EZH2 au niveau de la chromatine (Palacios et al., Cell Stem Cell, 2010).
Ainsi, l’altération de voies de signalisation peut affecter l’activité d’EZH2 en changeant son niveau de
phosphorylation dans les cellules cancéreuses.
Description du projet. Le projet a pour objectif l’étude chez le poisson-zèbre, de la fonction
biologique de l’oncogène EZH2. Les TALEN (pour une revue, Dupret et Angrand, Med Sci, 2014)
seront utilisés pour (i) inactiver le gène ezh2, (ii) introduire une mutation ponctuelle au niveau de la
sérine 21, cible de la phosphorylation par la voie AKT, (iii) introduire une mutation ponctuelle au
niveau de la thréonine 383 (homologue à T372 chez l’homme), cible de la phosphorylation par
MAPK14, (iv) induire une mutation ponctuelle au niveau de la tyrosine 655 (homologue à Y641 chez
l’homme) afin de mimer la forme oncogénique d’EZH2 trouvée dans les tumeurs humaines, et (v)
inactiver le site de liaison du microARN let7 responsable du contrôle de l’activité posttrancriptionnelle d’EZH2. Ainsi, nous étudierons si la surexpression d’Ezh2 et l’expression de la forme
oncogénique d’Ezh2 peuvent être responsables de l’apparition des mêmes types de tumeurs chez le
poisson-zèbre et nous analyserons le rôle des phosphorylations d’Ezh2 dans un modèle in vivo.
XENOGREFFES DE CELLULES CANCEREUSES CHEZ LE POISSON-ZEBRE. La transplantation de cellules
tumorales humaines chez le poisson-zèbre permet la génération d’un nombre important d’animaux
porteurs de xénogreffes, l’imagerie des cellules transplantées dans les embryons transparents et
peut être associée à des tests pharmacologiques (Jung et al., Mol BioSyst, 2012).
Les tumeurs sont constituées de plusieurs types de cellules cancéreuses, dont seule une minorité est
capable de conduire à la formation d’une tumeur secondaire. Ces cellules initiatrices de tumeur sont
également appelées cellules souches cancéreuses (CSC). De nombreuses données expérimentales
indiquent que ces CSC sont résistantes à la plupart des traitements antitumoraux actuellement
utilisés. Cette résistance des CSC explique en grande partie les phénomènes de récidive tumorale
suite aux traitements. Aussi, pour soigner plus efficacement les cancers et éliminer le risque de
récidive, il est donc nécessaire de mieux comprendre la biologie des CSC et d’identifier des stratégies
capables de lutter efficacement contre ce type de cellules.
Description du projet. Le projet a pour objectif l’étude de la tumorigénicité et du pouvoir invasif des
CSC dérivées de lignées cancéreuses en utilisant le modèle de xénogreffes chez le poisson-zèbre.
Dans un premier temps, un système qui permet l’identification des CSC sera développé. Une
construction rétrovirale qui dirige l’expression de la RFP (protéine fluorescente rouge) et d’une
protéine de fusion GFP-cODC (protéine fluorescente verte fusionnée au domaine de dégradation de
l’ornithine décarboxylase) sera générée et utilisée pour infecter des lignées tumorales. Les cellules
cancéreuses non-souches exprimeront la RFP tandis que la GFP-cODC sera dégradée par le
protéasome. En revanche, les CSC qui possèdent une faible activité du protéasome (Vlashi et al., J
Natl Cancer Inst, 2009) exprimeront la RFP et la GFP. Ce système nous permettra donc de distinguer
les cellules souches cancéreuses (vertes et rouges), des cellules cancéreuses non-souches (rouges).
Dans un deuxième temps, les lignées tumorales transduites seront injectées dans des embryons de
poisson-zèbre au stade 2jpf (2 jours après fécondation). La tumorigénicité et le pouvoir invasif des
cellules cancéreuses seront évalués aux stades 5jpf et 9jpf, respectivement. A ces stades les
embryons de poisson-zèbre ne possèdent pas de système immunitaire fonctionnel et sont
complétement transparents, nous permettant alors de distinguer les cellules souches cancéreuses
des cellules non-souches par fluorescence verte/rouge. Ce système nous permettra de comparer la
contribution des cellules non-souches cancéreuses et des CSC dans la formation de la masse
tumorale et dans la migration cellulaire. Les cellules tumorales utilisées dans notre étude
proviendront de lignées de gliomes pédiatriques de haut grade issues du Centre Oscar Lambret.
THESIS PROJECT
THE ZEBRAFISH MODEL IN ONCOLOGY: Genetic study of the EZH2 oncoprotein and study of the
metastatic behavior of pediatric glioma cancer-stem cells
The project aims at the development of the zebrafish model in oncology. The project is organized
around two tasks: (i) a genetic study of the EZH2 oncoprotein and (ii) the development of
xenotransplantation assays in zebrafish embryos in order to evaluate the contribution of pediatric
glioma cancer-stem cells tumor formation and invasiveness.
GENETIC STUDY OF THE EZH2 ONCOPROTEIN. The histone methyltransferase EZH2 plays an essential
role in epigenetic maintenance of the H3K27me3 repressive chromatin marks. Through its action on
gene regulation, EZH2 controls stem cells renewal, maintenance and differentiation into specific
lineages, and tumorigenesis (Chou et al., Am J Transl Res, 2011; Chen et al., Am J Transl Res, 2012).
Over the last 10 years, extensive studies documented the implication of EZH2 in cancer progression
and malignancy (Tonini et al., J Cell Physiol, 2008 ; Simon et Lange, Mutat Res, 2008). EZH2 is
overexpressed in numerous human tumors, such as breast, prostate, bladder, colon, skin, liver,
endometrial, lung and gastric cancers, as well as in gliomas, lymphomas and myelomas (Crea et al.,
2012). The mechanisms by which EZH2 is overexpressed in cancer remain elusive. However, it has
been shown that loss of microRNA (MiR)-mediated repression might operate. Indeed, several MiRs,
such as MiR-Let7 have been shown to limit EZH2 expression (Kong et al., 2012). More recently,
somatic missense mutations that alter EZH2 in cancer cells have been described (EZH2 Y641, Morin
et al., 2010; EZH2 A677, McCabe et al., 2012a; EZH2 A687, Majer et al., 2012). Strikingly, these
mutations increase the tri-methyltranferase activity of EZH2 (Yap et al., 2011; McCabe et al., 2012a;
Majer et al., 2012). Thus, tumor progression could be associated to EZH2 gain-of-function, according
to different scenarios: (i) an increase in EZH2 catalytic efficiency due to missense mutations
(Sneeringer et al., 2010; Yap et al., 2011; McCabe et al., 2012a; Majer et al., 2012); (ii) the EZH2
overexpression (Simon and Lange, 2008); (iii) but also the overabundance of EZH2 associate
cofactors, such as members of the PCL/PHF19 or long non coding RNAs, promoting PRC2 recruitment
at chromatin (Wang et al., 2004b, Gupta et al. 2010; Brockdorff, 2013). Although diverse, these
mechanisms lead to the same outcome: abnormally elevated levels of H3K27me3 methylation in
cancer cells.
EZH2 activity is also controlled by different cellular signals (Caretti et al., 2011). In particular, AKTmediated EZH2 phosphorylation at serine (S) 21 reduces EZH2 methyltransferase efficacy (Cha et al.,
2005). Also, mitogen-activated protein kinase p38 (MAPK14) phosphorylates EZH2 at Threonine (T)
372. EZH2-T372 phosphorylation stimulates the interaction with YY1 and promotes PRC2 recruitment
to chromatin at repressed target genes (Palacios et al., 2010). Thus, alterations in different signaling
pathways may affect EZH2 phosphorylation status and activity in cancer cells.
Objective of the task: TALENs (Dupret and Angrand, Med Sci, 2014) will be used (i) to inactivate Ezh2
function, (ii) to engineer a missense mutation at Y655 (corresponding to human Y641) in order to
mimic the oncogenic EZH2 version found in numerous human cancers, (iii) to introduce a missense
mutation at S21 in order to study the role of AKT-dependent phosphorylation in vivo, (iv) to
introduce a missense mutation at T383 (corresponding to human T372) in order to evaluate the role
of the p38 signaling pathway on Ezh2 function, and (v) to increase ezh2 expression through the
TALEN-mediated ablation of the MiR-Let7 binding site. Thus, this part of the thesis project aims at
the characterization of the role of Ezh2 in tumor development in zebrafish, at the in vivo study of
signaling pathways controlling Ezh2 activity, and at the generation of zebrafish models to investigate
the effects of drugs targeting Ezh2 activity.
XENOTRANSPLANTATION ASSAYS TO STUDY THE DISSEMINATION OF PEDIATRIC GLIOMA CANCER
STEM CELLS. It has been reported that the injection of human cancer cell lines and primary or
metastatic tumor cell suspensions from cancer patients into zebrafish embryos at 2 dpf (day postfertilization) can be carried out to establish their tumorigenicity and metastatic behavior.
A high number of patients with cancer can currently not be cured. It is thought that a small number
of therapy-resistant cells, termed cancer-stem cells (CSC) have not been eradicated during treatment
with intensive radio- or chemotherapy, and these cells are the cause of persisting disease or relapse
of the cancer. For future improvement of treatment options, it will be essential to better understand
the intrinsic properties and behaviors in order to be able to target those cells and eradicate the
cancer.
Objective of the task: The task aims at the study of the tumorigenicity and metastatic behavior of
CSCs using xenotransplantation assays in zebrafish embryos. First, a retroviral vector allowing the
identification of CSCs will be engineered. This vector will drive the expression of the RFP (red
fluorescent protein) and the expression of a fusion protein GFP-cODC (green fluorescent protein
fused to the degradation domain of the ornithine decarboxylase), and will be used to transduce
cancer cell lines. Non-CSCs will express the RFP, but not the GFP-cODC that will degraded. In contrast,
CSC characterized by a low proteosomal activity (Vlashi et al., J Natl Cancer Inst, 2009) will express
both the RFP and the GFP-cODC. This system will allow distinguishing CSCs (red and green) from nonCSCs (red). Next, transduced cancer cell lines will be injected into zebrafish embryos at 2 dpf.
Tumorigenicity and metastatic behavior of the cell lines will be assessed at 5 dpf and 9 dpf,
respectively. At these stages, zebrafish embryos are fully transparent and CSCs (red and green) will
be distinguished from non-CSCs (red only). This system will be used to evaluate the contribution of
CSCs in tumor formation and dissemination. The cancer cell lines used in the study will derived from
pediatric gliomas from the Centre Oscar Lambret.