HEPATITES VIRALES B

HEPATITES VIRALES B
Dé i t
Dépistage
ett suivi
i i biologique
bi l i
Apports des techniques de biologie moléculaire
Jean Dominique Poveda
Laboratoire Pasteur Cerba
Tunis février 2008
Tunis,
Virus de l’hépatite
p
B
JDP/EC/240201.22
Le virus de l’hépatite
p
B et son ggénome
JDP/EC/240201.23
L’intérêt
L’i
té êt du
d dépistage
dé i t
des
d hépatites
hé tit B aigues
i
ett
chroniques
• Diagnostic et surveillance des hépatites aiguës
• Dépistage chez la femme enceinte : prévention de la
transmission
i i mère-enfant
è
f par séro-protection
é
i et
vaccination.
• Traitement des hépatites chroniques avant évolution vers
une fibrose
fib
avancée
é et vers la
l cirrhose
i h
Evolution dans le temps
des différents marqueurs du VHB
Lors
o sd
d’une
u e hépatite
ép e aiguë
guë B
ALAT
Anti-HBc totaux
Anti-HBs
Anti-HBe
2 à 12 semaines
4 mois
D’après : Spectra biologie vol. 19, n°110, mai 2000
6 mois
:
JDP/EC/240201.03
Les marqueurs d’une hépatite B aiguë
En phase initiale :
– Ag HBs et anti-HBc IgM +++
– Ag HBs faiblement positif à confirmer par neutralisation
– ADN inutile
En phase de convalescence :
– Ag HBs, Ac anti-HBs,
– Ac anti-HBe et si négatif Ag HBe.
– La
L persistance
it
d
de lla positivité
iti ité d
de l’A
l’Ag HB
HBe estt prédictive
édi ti d’
d’une
évolution vers la chronicité
– ADN inutile
E phase
En
h
d
de guérison,
é i
après
è négativation
é ti ti des
d antigènes
ti è
:
– Ac anti-HBs,
– ADN inutile
Les marqueurs d’une hépatite B aiguë
Ag HBs
Ac anti-HBc
Ac anti-HBc IgM
A anti-HBs
Ac
i
Ag HBe
Ac anti-HBe
ADN viral
Précoce
Aigu
Etat
Convalescence
Convalescence
+++
+
++
++
+++
+
++
++
++
+++
+
++
++
++
±
+
+
±
+
++
+
±
+
±
Infection Infection Infection
guérie
ancienne ancienne
+
+
+
±
+
+
±
-
+
±
-
Evolution dans le temps
des différents marqueurs du VHB
L
Lors
d’une
d’
hé
hépatite
tit chronique
h i
liée
lié à un virus
i
dit « sauvage »
ALAT
Anti-HBc totaux
ADN VHB
ALAT
Anti-HBe
AgHBe
Anti-HBc IgM
2 à 12 semaines
4 mois
D’après : Spectra biologie vol. 19, n°110, mai 2000
6 mois
IT
IE
L
:
JDP/EC/240201.25
Les hépatites chroniques B
1
Les différentes phases d’une hépatite chronique B
Ö Phase de tolérance immunitaire
¾ Réplication virale intense
¾ Ag HBe positif
¾ ADN viral détectable (> 105)
¾ Pas de lésions hépatiques
Ö Phase
Ph
d’immuno-élimination
d’i
éli i ti
¾ Réponse immune intense
¾ Lésions hépatiques
¾ Ag HBe positif
¾ ADN viral détectable (> 105)
JDP/EC/240201.26
Les hépatites chroniques B
2
Les différentes phases d’une hépatite chronique B
Ö Phase de latence virale
Î Immuno
Immuno-élimination
élimination efficace = portage « inactif »
¾ Ac anti-HBe positif, Ag HBe négatif
¾ ADN viral indétectable ou très bas (< 105)
¾ Transaminases normales
• Possibilité de séroconversion Ag HBs Æ Ac anti-HBs
• Possibilité de réactivation
• Possibilité de sélection de virus mutant
Î Virus
Vi mutant : mutation
i de
d la
l région
é i pré-C
éC
¾ Ac anti-HBe positif, Ag HBe négatif
¾ ADN viral détectable
¾ Transaminases anormales
JDP/EC/240201.27
Les marqueurs d’une hépatite B chronique
Découverte systématique :
– Ag HBs
HBs, Ac anti-HBc
anti HBc totaux
totaux, Ac anti-HBs
anti HBs
– Confirmation de l’Ag HBs
– Persistance de l’Ag HBs plus de 6 mois
– Ac
A anti-HBc
ti HB IIgM
M négatifs
é tif ou li
limites
it
Bilan d’évaluation :
– Ag HBs,
– Ac anti-HBe et si négatif Ag HBe.
– ADN circulant +++
– Ac anti-Delta
– Ac
A anti-HBc
i HB et anti-HBs
i HB inutiles
i il
Les marqueurs d’une hépatite B chronique
A HB
Ag
HBs
Ac anti-HBc
Ac anti-HBc IgM
Ac anti-HBs
Ag HBe
A anti-HBe
Ac
ti HB
ADN viral
Transaminases
Immuno
tolérance
Immuno
élimination
++
+
+
+++
++
+
±
+
++
normales
élevées
Mutant
Ag HBs ??
++
+
+
Latence
Réactivation
Mutant
pré-Core
++
+
+
± ou +
++
+
±
±
±
++
++
+
+
++
± ou +
± ou +
++
normales
élevées
élevées
variables
VHB : Les tests moléculaires
z
Détection et quantification de l’ADN viral circulant :
z Hybridation
z PCR
z Analyse
qualitative du génome détecté
z Détermination du génotype : intérêt ?
z Recherche de mutations ponctuelles
z Mutants pré-core
z Mutants d’échappement
z Mutants
M t t de
d résistance
éit
au traitement
t it
t
JDP/EC/240201.28
Intérêt de la mesure de l’ADN viral
z
Evaluation d’un niveau de la réplication virale
z
Di
Directement
lié à l’activité
l’ i i é virale
i l
Premier bilan d’une hépatite B chronique
z Bilan après
p dépistage
p g ppositif chez une femme enceinte
z Bilan d’un Ac anti-HBc isolé
z Suivi annuel d’un porteur chronique « inactif »
z
Suivi régulier d’un patient réplicatif non traité
z Suivi d’un patient traité
z Détection précoce d’une résistance
z Suivi de la cinétique : prédictif de la réponse
z
Inutile en hépatite aiguë
z Inutile
In tile si Ag HBe positif (hors pré
pré-thérapeutique)
thérape tiq e)
z
JDP/EC/240201.28
Les tests de détection d’ADN viral
Les tests d’hybridation
¾ 2.000 -100.000.000 copies/mL
z La PCR « classique »
¾ 60 - 38.000
38 000 UI/mL
UI/ L
z
z
La PCR en temps réel
¾
TaqMan Roche,
Roche Realtime Abbott
z
Sensibilité : 10-12 UI/mL
z
Linéarité : 110.000.000 UI/mL
JDP/EC/240201.29
Les tests de q
quantification
f
de l’ADN viral
Les tests de q
quantification
f
de l’ADN viral
Les traitements des hépatites chroniques B
ÖQ
Qui
traiter ?
Î En fonction de la charge virale en ADN VHB (seuil
105 copies/ml),
p
), des transaminases,, des données cliniques
q
et de la fibrose hépatique (PBH, marqueurs sériques),
Ö Quel
traitement ?
¾ Interféron
¾ Anti-viraux :
Lamivudine
Adefovir
Entecavir, emtricitabine, autres
¾ Monothérapies,
Monothérapies bithérapies
JDP/EC/240201.31
Evaluation et suivi des traitements
z
Evaluation initiale : Ag HBe, Ac anti-HBe
z ADN
viral : charge virale > 5 log
Charge virale
Ch
i l > 8 llog = mauvais
i pronostic
ti
z Evaluation et suivi
z
z
Réponse initiale : > 1 log de décroissance
z
Décroissance de la charge
g virale à 2 mois sous Adefovir
z
bons répondeurs : 5 à 6 log (80% séroconversion)
z
mauvais
i répondeurs
d
: 1,5 à 2 llog ((0% séroconversion)
i )
z
Réponse maintenue : < 3 log
z
Echec : augmentation > 1 log
JDP/EC/240201.32
Les tests de q
quantification
f
de l’ADN viral
z
Intérêt d’un large domaine de mesure
Log HBV DNA
6
5
Traitement anti
anti-viral
viral
1 log
g
4
1 log
3
2
1
1 log
Temps
p
JDP/EC/240201.29
Génotypage par la technique InnoLiPATM
SUBSTRAT
CHROMOGENE
PRECIPITE
Amplicons de génotype 1
PHOPHATASE
ALCALINE
STREPTAVIDINE
BIOTINE
génotypes
é t
1
2
3
4
SONDES
spécifiques
de génotypes
Génotypage
yp g ppar la technique
q InnoLiPATM
Détection automatique de mutations
par PCR et séquençage
Système
è Trugene Siemens
Détection automatique de mutations
par PCR et séquençage
Les génotypes du VHB et leur répartition
Les 7 génotypes du VHB (A-G) :
– A - D : Europe du nord, Amérique du nord, Inde, Afrique,
Australie
– B – C : Asie
– E : Afrique sud et ouest
– F : Amérique centrale et du sud
– G : Europe du nord,
nord Amérique du nord
Gé t
Génotype
du
d VHB : iintérêt
té êt clinique
li i
?
Maladie plus sévère avec le génotype C par rapport
au génotype B
z
Meilleure réponse
p
à l’IFN des ggénotypes
yp A ppar
rapport aux génotypes D
z
Meilleure réponse à ll’IFN
IFN des génotypes B par
rapport aux génotypes C
z
z
Peu de données pour la réponse aux antiviraux
z
Par PCR
C eet hybridation
yb d o LiPA
z
Par séquençage
JDP/EC/240201.32
L mutants
Les
t t pré-core
é
Hépatites B chroniques réplicatives sans Ag HBe
détectable
z
z Apparition
pp
tardive au cours de l’infection
22% des patients en France avant 1990, plus de 70%
en 2007
z
Implications pour le suivi et le traitement :
importance du suivi sur ll’ADN
ADN viral
z
z
Par PCR
C eet hybridation
yb d o LiPA
z
Par séquençage
JDP/EC/240201.32
Génotype des mutants prépré-core
1762--1764
1762
PROMOTE
R
*
1896 = codon 28
PRE--C
PRE
**
mRNA
Les mutants du gène S
z
Par séquençage
Source : Servant et al, virologie 2007
Les résistances au traitement
Source : Servant et al, virologie 2007
Les résistances au traitement
Monothérapie 3TC : 24% de résistance à 1 an, 50% à 3 ans,
70% à 4 ans
z
z
Monothérapie
p Adefovir : 6% à 3 ans,, 18% à 4 ans
z
Résistances croisées Emtricitabine - lamivudine
Lamivudine Emtricitabine Adefovir
Mutations
M204V/I M204V/I
Entecavir
N236/T S202G/I
A181V/T T184G
M250V
JDP/EC/240201.33
Conclusion
Evolution
volutio parallèle
pa allèle et liée des thérapeutiques
t é apeutiques antivirales
a tivi ales et des
technologies de biologie moléculaire permettant la détection et
l’étude des virus des hépatites
Augmentation régulière de la sensibilité des techniques de détection
Amélioration régulière des traitements disponibles
L’utilisation raisonnée des différents tests en tenant compte de
leurs apports dans les différentes situations de diagnostic, de suivi
thérapeutique, d’évaluation des résistances permet une meilleure
efficacité au meilleur coût
JDP/EC/240201.35