Hybridation moléculaire Southern blots

Travaux dirigés UE BIO24c
Techniques de biologie moléculaire
Hybridation moléculaire
Southern blots
Enzymes de restriction
Fréquence de sites de restriction sur un chromosome:
1 / 46 = 1 / 4096 pb
Extraction ADN
chromosomique
Coupures par enzymes
de restriction
Séparation des fragments d’ADN par électrophorèse
Southern blot
Transfert sur membrane de nylon
Sonde marquée
Hybridation
Révélation
ATGGCATGGACC
::::::::::::
CAGTATACACAAGTACCGTACCTGGCTCAGTTATACGCCGA
E
sonde
E
6 kb
E
sonde
5 kb
E
E
2 kb
E
E
E
E
sonde
8 kb
E
- 8 kb
- 6 kb
- 5 kb
E
Isolats de Yersinia pestis
Tour aéro-réfrigérante
Isolats cliniques
Et comment fabriquer les sondes?
Différents environnements
Amplification d’ADN par PCR
Polymerase Chain Reaction
3’
Amorces
5’*
3’
*5’
3’
*5’
*5’
3’
Si n le nombre de cycles, accroissement de la quantité d’ADN = 2n.
Possibilité de marquage radioactif des amorces, et donc de tous les fragments d’ADN
Fonctionnel sur des quantités infimes d’ADN
Applications: clonage, isolement d’ADN d’échantillons faiblement concentrés:
•Environnements divers
•Prélèvements cliniques…
Analyses de l’expression des gènes:
La transcription
Northern blot
Objectifs:
•un gène est-il transcrit?
•Dans quelles conditions?
•A quel niveau?
Principe:
ARNr 23S
ARNr 16S
ARNr 5S
Résultats:
Sonde = gène de virulence
Membrane : Hybridation
Sonde = contrôle
Gel ARN
Sonde
Gène de virulence
Extension d’amorces
Objectifs:
•un gène est-il transcrit?
•Dans quelles conditions?
•A quel niveau?
•Où est le site d’initiation de sa transcription?
•Peut-on en déduire la séquence du promoteur?
Principe
Résultats:
Séquençage d’ADN
Gène d’intérêt
Amorce marquée (20b)
Séquençage d’ADN
Analyses de l’expression des gènes:
La transcription et la traduction
Les fusions transcriptionnelles et traductionnelles
Objectifs:
•Mesurer la transcription et/ou la traduction d’un gène
•Dans quelles conditions?
•A quel niveau?
Résultats:
Principe:
Gène rapporteur:
lacZ: activité
lux: luminescence
-galactosidase
gfp, yfp, cfp: fluorescence
Analyses de l’expression des gènes:
Les protéines
Western blot
Objectifs:
•une proteïne est-elle synthétisée?
•Dans quelles conditions?
•A quelle quantité?
Principe:
ou luminescent
Résultats:
Ac primaire protéine 3
Ac primaire protéine 2
Ac primaire protéine 1
Ac primaire contrôle
Interactions ADN - protéines
Electrophorectic Mobility Shift Assay (EMSA)
Gel retard
Objectifs:
•une proteïne se fixe-t-elle sur l’ADN?
•Dans quelles conditions?
•A quelle affinité?
Principe:
Résultats:
Contrôles?
Empreintes à la DNase
Objectifs:
•une proteïne se fixe-t-elle sur l’ADN?
•Sur quelle séquence?
•A quelle affinité?
Principe:
ADN seul
Pas de protéine
5’
5’
ADN + protéine
5’
5’
+ DNase
Mélange de
molécules
Migration
Empreinte
Empreintes à la DNase
Résultats: