Le dépistage analytique en laboratoire du dopage sportif au moyen

Le dépistage analytique en laboratoire du dopage sportif
au moyen de matrices biologiques alternatives à l’urine.
Laurent RIVIER (1)
(1)
Laboratoire suisse d’Analyse du Dopage
Institut universitaire de Médecine légale
Rue du Bugnon 21
CH – 1005 Lausanne, Suisse
Résumé : Les toxicologues forensiques ont une longue habitude d’utiliser à côté de l’urine et
le sang des matrices biologiques alternatives telles que divers tissus ou liquides. Dans le cadre
des contrôles officiels du dopage sportif, aujourd’hui, seule l’urine est utilisée. Or, des
développements méthodologiques importants ont permis l’utilisation d’autres matrices
biologiques telles que, par exemple, les cheveux, la salive ou la sueur. Il est aisé de
rassembler ces échantillons pour analyse de dépistage bien que les concentrations de
xénobiotiques détectés y sont le plus souvent moins importantes que celles que l’on rencontre
habituellement tant dans l’urine que dans le sang. Cet article passe en revue les possibilités
que représente l’utilisation de ces matrices alternatives. Les problèmes d’échantillonnage, les
procédures analytiques correspondantes et l’interprétation des résultats ainsi obtenus sont tour
à tour examinés.
Mots-clés : drogues d’abus, procédure de tamisage, CPL-SM, stéroïdes anabolisants,
hormones, cheveux, salive, sueur.
Laboratory analytical screening for sport doping on alternative
biological samples to urine.
Laurent RIVIER
Swiss Laboratory for the Analysis of Doping
Institute of Legal Medicine of the University
Rue du Bugnon 21
CH – 1005 Lausanne, Switzerland
Summary : Forensic scientists have long detected the presence of drugs and their metabolites
in biological materials using body fluids such as urine, blood and/or other tissues or liquids.
In doping analysis , urine only is officially collected so far. In recent years, remarkable
advances in sensitive analytical techniques have encouraged the analysis of drugs in
unconventional biological samples such as hair, saliva and sweat. These samples are easily
collected, although drug levels are often lower than the corresponding ones in urine or blood.
This article reviews studies on the detection of doping agents in hair, saliva and sweat,
compared to urine and blood samples. Sampling, analytical procedures and interpretation of
the results are discussed concomitantly.
Keywords : abuse of drugs, screening, GC-MS, anabolic steroids, hormones, hair, saliva,
sweat.
Introduction
L’analyse d’échantillons biologiques est l’étape indispensable pour déterminer si un
individu a absorbé ou non une substance déterminée, quelle soit interdite ou non. Il est
important de souligner que dès le départ, le toxicologue analyste, particulièrement lors de cas
de dopage, n’a aucun indice sur les substances qu’il va trouver, si bien qu’il doit examiner une
vaste palette de composés biologiquement actives et leurs métabolites. Il devra donc mettre en
œuvre non pas un mais plusieurs processus – la plupart du temps des analyses
chromatographiques – afin de fournir l’identification non-équivoque de la substance ingérée
[51].
L’emploi en médecine des stéroïdes anabolisants est limité à très peu d’indications
reconnues [37,70], même si elles n’ont que peu de choses à voire avec les compétitions
sportives [18]. Le docteur de famille peut suspecter par exemple l’emploi d’agents dopants
interdits lorsqu’un jeune athlète présente une forte augmentation de poids ou de masse
corporelle, la présence d’œdèmes, de gynécomastie chez les hommes, l’apparition d’un timbre
profond de la voix chez la femme, de nouvelles poussées violentes acnéiformes, un
changement dans le comportement (irritabilité, humeur variable, dépression), ou
développement soudain d’une hépatite chimique. Une attitude attentive et un questionnement
prudent effectué sous forme de non-jugement et en connaissance de cause peut parfois amener
l’adolescent à confesser l’emploi de stéroïdes et ainsi il est possible d’opter pur une attitude
de conseiller [69].
Plus de 100 stéroïdes anabolisants sont facilement accessibles sur le marché noir sous
forme orale ou d’injectables [43]. La métabolisation importante de ces xénobiotiques de
même que la présence naturelle de certains de leurs métabolites fait que la détection de ces
substances est difficile à interpréter. Les résultats positifs des analyses de dépistage sont
confirmées habituellement par la combinaison à haute sélectivité de la chromatographie
gazeuse et la spectrométrie de masse (CPG-SM, GC-MS, en anglais). Ainsi les stéroïdes
peuvent être détectés sans difficultés jusqu’à plus de 4 semaines après la dernière injection
pour certains. Normalement, la testosterone (T) est présente dans l’organisme humain en
quantité équilibrée par rapport à l’épitestostérone (E). E, qui n’a pas de rôle biologique connu,
est l’épimère naturel de T dont on pense que l’origine est extra testiculaire. Le rapport T sur E
(T/E) est normalement stable tout au long de la vie de l’individu et il se situe entre 0,5 et 2. A
Un rapport égal ou supérieur à 6 (le seuil utilisé par le Comité International Olympique :
C.I.O.) est considéré comme la présomption de l’application exogène d’un stéroïde
anabolisant. Pour contrer les tendances de certains athlètes à manipuler ce rapport en tendant à
l’abaisser par une prise de E exogène, la concentration maximale admise de E a été fixé à 150
ng/ml d’urine. Cette approche très ingénieuse ne s’applique bien évidemment pas au sang, ni
aux autres échantillons biologiques. Par contre, les esters de T peuvent être détectés
directement dans le sang, ce qui permet de mettre le doigt sur la source de T exogène utilisée
[8]. De même, les déterminations des rapports isotopiques 13C sur 12C de la T endogène dans
l’urine a également permi de mettre en évidence ce type de manipulations, à condition
seulement que la concentration en T soit au moins 50 ng/ml. Les progrès qui ne vont pas
manquer dans le développement de cette approche nouvelle permettront d’en améliorer les
performances [17].
A côté des agents anabolisants, les hormones peptidiques telles que l’hormone de
croissance (hGH), l’érythropoiétine (Epo), l’adrénocorticotropine, la gonadotrophine
chorionique, ainsi que leurs facteurs de relargage sont maintenant largement employés par les
athlètes. Bien que ces peptides soient tous détectables par les tests immunologiques
communément utilisés en chimie clinique, l’acceptabilité de cette approche analytique comme
preuve d’administration de la substance dopante n’est pas encore acquise en toxicologie
forensique, ni en particulier dans les contrôles du dopage sportif [17].
Avec la disponibilité sur le marché d’un nombre sans cesse croissant de compléments
alimentaires, produits de plus en plus systématiquement utilisés par les athlètes [49] et
l’existence de nombreux stéroïdes et d’hormones peptidiques synthétiques, la détection de
tous ces nouveaux produits est déjà extrêmement difficile dans l’urine [5].
Dans ce contexte, de l’information supplémentaire peut être obtenue de l’analyse
d’échantillons encore non habituellement récolté sur le même individu. Le but de cette brève
revue est de mettre en évidence les avantages et les limitations de la récolte d’information
provenant de l’analyse de ces échantillons non conventionnels en comparaison avec les
analyses traditionnellement pratiquées sur l’urine dans le cadre du dépistage du dopage
officiel.
Echantillons biologiques utiles pour la détection des produits
interdits
Le développement rapide des nouvelles technologies instrumentales utilisées en
analyse toxicologique (GC-MS/MS, LC-MS et CE-MS, [voir par exemple 63,66]) a permis
l’émergence de procédés applicables à toute une nouvelle série d’échantillons biologiques qui,
à côté du sang, sont, par exemple, les cheveux, la salive et la sueur.
A. Urine
L’urine est certainement l’échantillon biologique le plus commun utilisé pour la
détection des drogues et médicaments. L’échantillonnage est facile à réaliser et n’est pas
considéré comme invasif. Les quantités importantes aisément récoltées favorisent la recherche
d’un éventail large de substances les plus diverses. De même, elle se conserve bien offrant la
possibilité d’envisager d’autres analyses à un temps ultérieur, comme c’est le cas lors de
contre-expertises. Cependant, il faut noter que l’échantillonnage est souvent difficile à réaliser
après une compétition qui a impliqué la déshydratation de l’athlète, d’autant plus qu’un
volume minimal de 75 ml est requis lors des contrôles anti-dopage. La matrice urinaire est
relativement simple et les procédures à mettre en œuvre sont plus rapides et plus facilement
automatisables en comparaison de celles utilisées pour les autres matrices biologiques. Enfin,
les substances actives et leurs métabolites sont généralement stables dans l’urine congelée
autorisant ainsi la conservation à long terme des échantillons positifs.
Les substances médicamenteuses sont le plus souvent métabolisées par le foie pour
former des métabolites polaires qui pourront eux être éliminés plus efficacement de
l’organisme via l’urine. Le métabolisme des substances parentes qui sont donc pour la plus
part relativement non polaires, est relativement rapide par rapport à leur élimination urinaire.
Par contre, l’élimination urinaire de la majorité des métabolites, substances généralement
chimiquement polaires, est plus rapide et complète. Il est donc naturel de trouver les
métabolites d’une substance médicamenteuse en concentrations plus élevées que la drogue
elle-même dans l’urine. C’est pour cela que de nombreux tests immunologiques urinaires
destinés à la détection des drogues d’abus met en jeu des anticorps dirigés vers les métabolites
plutôt que les drogues elles-mêmes.
L’urine peut être facilement adultérée lors de l’émission puisque l’observation directe
– comme cela devrait être toujours la règle – n’est pas commune en pratique [67]. En plus, et
avec l’exception des stéroïdes anabolisants, le plus grand nombre des substances dopantes
sont présentes pendant 2 à 3 jours seulement après la dernière consommation, si bien que seul
un usage récent peut être détecté par ce moyen. Il existe certaines exceptions notoires, tels les
dérivés du Cannabis qui sont détectables jusqu’à quelques semaines après la dernière
consommation selon l’intensité de cette dernière. Les stéroïdes anabolisants, eux peuvent être
détectés pendant quelques heures – pour une consommation de la forme orale de T – jusqu’à
quelques mois – pour un injection intramusculaire de nandrolone, par exemple.
B. Sang
La prise de sang est considérée comme un procédé invasif. Elle est donc pratiquée
dans les cas cliniques et forensiques seulement. Le sang complet est une matrice complexe, de
nature hétérogène et qui change de composition en s’hémolysant. La fenêtre de temps de
détection pour la majorité des substances dopantes et leurs métabolites qui sont recherchés
habituellement est limitée de quelques minutes à plusieurs heures. L’intérêt du sang réside en
la relative bonne corrélation qui existe entre les effets pharmacologiques et toxiques d’une
substance et sa concentration sanguine, permettant ainsi la prédiction des effets sur une
personne vivante [22]. Les concentrations sanguines (ou plasmatiques) du métabolite – ou le
rapport entre la substance mère et son métabolite – peuvent aussi être utilisées afin de
différentier une prise aiguë ou chronique de drogue. Lors d’une administration unique, les
concentrations sanguines ou plasmatiques peuvent être utilisées pour déterminer le temps
écoulé entre la prise de substance et le moment de la prise de sang. De plus, la relation entre
concentration sanguine et dosage est directe, souvent linéaire, et même si pour certaines
drogues comme les antidépressants tricycliques, par exemple, les effets cliniques ne suivent
pas directement les posologies, la règle de la relation dose administrée – concentration
sanguine reste généralement applicable [1,19]. Il faut cependant tempérer le potentiel
d’utilisation du sang lors de contrôles anti-dopage puisque les concentrations des substances
dopantes que l’on peut y détecter sont 10 à 100 fois inférieures à celles que l’on rencontre
dans les échantillons d’urine.
L’analyse de substances peptidiques pour des composés telles l’hormone de croissance
(hGH) et l’érythropoïétine (Epo) semble être préférable sur le sang car leurs concentrations
respectives y sont plus élevées que dans l’urine. Cependant, l’urine contient moins de
protéines et un laboratoire français a annoncé tout récemment qu’il avait mis au point un
procédé pour la mise en évidence de l’Epo recombinante justement dans l’urine. Nous
attendons la publication des détails de la méthodologie employée et de sa validation avant d’y
adhérer et l’introduire systématiquement dans notre pratique au laboratoire.
Le sang permet également de déterminer certains marqueurs biologiques secondaires
de l’action de ces hormones : beaucoup d’efforts ont été accomplis récemment dans ce sens
pour détecter l’abus de hGH. Les résultats obtenus par un groupe de recherche international
viennent d’être dévoilés par le C.I.O. La diffusion publique de ces résultats devrait être
réalisée aussi tout prochainement. En fin de compte, il semble que la démonstration complète
– utilisant une technique parfaitement discriminante entre les formes endogènes et celles
produites par les techniques du génie génétique - de l’abus de ces substances dopantes de type
peptidique pourra vraisemblablement se faire au mieux sur un échantillon de sang, en utilisant
tout de même un dépistage systématique sur l’urine.
Nous ne discuterons pas ici les déterminations des taux d’hémoglogine ou de
l’hématocrite et les autres paramètres sanguins mis en place par la Fédération Internationale
de Ski (F.I.S.) ou dès 1997 par l’Union Cycliste Internationale (U.C.I.). Effectués juste avant
des compétitions tout au long de la saison de ski ou cycliste, ces contrôles sanguins ne sont
pas encore considérés par le C.I.O. comme contrôles anti-dopage strictu senso. De même , ce
n’est pas l’endroit de discuter le contenu des suivis biologiques récemment mis en place par
l’U.C.I. et la Fédération Française de Cyclisme (F.F.C.) car ces actions sont plus destinées à
promouvoir des mesures de protection de la santé de l’athlète considéré comme travailleur
qu’à des contrôles anti-dopage d’un nouveau genre.
C. Cheveux
Le cheveux pousse à raison de 0,35 mm par jour en moyenne ou 1 à 1,5 cm par mois
selon l’endroit, la race et sexe et l’âge du sujet. Il est nourri au niveau de sa racine par les
capillaires sanguins pendant les 4 mois à 4 ans que peut durer sa vie : ainsi le cheveu se
trouvera imprégné des substances ingérées par l’individu selon une chronologie qui est
possible de reconstituer par l’analyse séquentielle d’une touffe de cheveux. [52]. C’est ainsi
que l’analyse des métaux lourds dans les cheveux a débuter vers les années 1950s. Les
cheveux ont aussi été utilisé pour déterminer l’exposition nutritionnelle : l’analyse d’éléments
en trace a été utilisée pendant des années pour diagnostiquer le statut nutritionnel d’une
personne en carence. Les connaissances sur le mécanisme précis de l’incorporation des
drogues dans la partie inerte des cheveux formée exclusivement de kératine n’est pas encore
connu avec précision et plusieurs processus sont possibles : adsorption de l’environnement
externe, transport dans la matrice du chevaux via le sang au niveau du follicule capillaire.
C’est pourquoi l’interprétation des résultats des analyses n’est pas simple : une substance
détectée dans les cheveux a pu y pénétrer par une voie autre que strictement corporelle. En
plus, on reconnaît maintenant que cette voie peut aussi concerner le sébum ou la sueur du
cuir chevelu.
Malgré ces obstacles, la détection des substances médicamenteuses dans les cheveux
s’est beaucoup développées ces dernières années, ouvrant ainsi une fenêtre de détection
temporelle plus large que ce qui est possible exclusivement avec l’urine [32,41,55]. La
découverte de cocaïne dans les cheveux d’une momie datant du Pérou précolombien suggère
que l’analyse des cheveux peut offrir une information sur l’usage de drogues de façon
pratiquement indéfinie si les conditions de conservation sont adéquates [60]. Cependant, il
apparaît qu’une petite fraction des substances enfermées dans la matrice de kératine peut subir
une hydrolyse spontanée, mais que le processus est relativement lent [44].
En plus d’un potentiel diagnostique prometteur des analyses de cheveux,
l’échantillonnage des cheveux est facile à réaliser sans créer l’embarras que l’on rencontre
habituellement lors des prises d’urine. Les cheveux doivent être conservés et transportés sans
réfrigération, contrôle du pH ou l’addition d’agent de conservation comme c’est
habituellement le cas pour les autres échantillons biologiques tels que le sang et l’urine.
Plusieurs échantillons peuvent être collectés si nécessaire à des intervalles de temps variés de
manière à étendre les analyses et confirmer les résultats précédents, des possibilités uniques
par rapport aux autres matrices biologiques.
La pigmentation des cheveux [23] et les différences de sexe [68] influencent les
concentrations des drogues dans les cheveux. Les mécanismes responsables de la distribution
des drogues dans cette matrice ne sont pas complètement connus et nos connaissances à cet
égard limitées si bien que un effort considérable dans la recherche est nécessaire avant que les
concentrations des drogues dans les cheveux puissent être interprétées avec exactitude [15].
En fait, si nous disposons d’une quantité grandissante de publications scientifiques sur la
détection des xénobiotiques dans les cheveux, les informations obtenues laissent le plus
souvent des points d’interrogations sur leur signification.
La concentration de la molécule parente dépasse en général dans les cheveux celles de
ses métabolites, même lorsque ni l’une ni les autres ne sont plus détectables dans le sang ou
l’urine [21,24]. La détection des métabolites dans les cheveux peut prouver que la substance a
passé dans l’organisme [33]. Ce point peut être très important pour le toxicologue forensique
comme, par exemple lorsque l’on veut différentier la prise d’héroïne à celle de codéine et/ou
morphine seules [41,55].
Les méthodes (détection, identification et dosage) appliquées aux cheveux sont
similaires à celles utilisées dans les laboratoires de toxicologie analytique forensique [42].
Tests immunologiques et chromatographies couplées à la spectrométrie de masse sont les plus
courantes. A ce jour, plus de 60 substances pharmaceutiques ou drogue d’abus ont pu être
détectés dans les cheveux après administration orale ou parentérale. Ces substances sont, à
côté des drogues classiques (opiacés, cocaïne, cannabis, amphétamines, methamphétamine,
MDMA, MDA et les autres drogues synthétiques similaires), les opioïdes, hallucinogènes,
psychostimulants (incluant la nicotine), barbituriques, benzodiazépines, autres sédatifs
(hypnotiques, antidépressants, neuroleptiques), drogues cardiovasculaires, drogues antiinfectieuses, en autres [64].
Ainsi, si les autres matrices biologiques offrent ensemble les éléments essentiels à
l’élaboration des rapports destinés aux juges, l’analyse des cheveux offre certainement « une
perspective unique sur la détermination de la consommation de substances par l’homme ” [28]
en permettant d’effectuer des mesures dans un échantillonnage facile d’accès, résistant aux
dégradations post mortem et caractéristique de la stabilité des substances qui y sont intégrées.
Détection spécifique des agents dopants dans les cheveux
Comparé aux stupéfiants, les concentrations de divers agents anabolisants mesurés
dans les cheveux sont beaucoup plus basses. Chez des bodybuilders, par exemple, la
nandrolone s’étagait entre 190 et 260 pg/mg, le stanozolol de 130 à 160 pg/mg et la
testosterone de 45 à 70 pg/mg [10]. Quelques autres substances ont également pu être
détectées à des taux similaires : le clenbuterol, le salbutamol, des esters de la testosterone, la
methyltestosterone, la déhydromethyltestosterone, la metenolone et son dérivé énantate, et
enfin la métandienone [17,27,48,53,56,62]. Dans pratiquement toutes ces situations, seuil le
produit parent a été mis en évidence. Dans un seul cas, les métabolites de la métandienone ont
pu être identifiés [62]. Dans toutes ces situations, la consommation abusive d’agent
anabolisant était connue.
Lors de contrôles anti-dopage, l’examen des cheveux peut apporter des
renseignements complémentaires à l’analyse urinaire. Par exemple, lors de la détection de
beta-2-agonites, la présence de ces substances dans les cheveux permet en théorie de
discriminer entre une consommation unique (effet de stimulation uniquement) ou une
absoption régulière (effet anabolisant s’ajoutant à l’effet stimulant) [48]. Il ne faut pas être
trop optimiste : si ces analyses permettent de clarifier quelques rares situations médico-légales
bien particulières, beaucoup de travail de clarification reste nécessaire pour espérer un jour
voir les analyses de cheveux appliquées systématiquement dans les contrôles anti-dopage chez
les sportifs [50].
D. Salive
La salive est un liquide relativement simple formé essentiellement d’eau (90%), de
plusieurs enzymes responsables de la scission des hydrates de carbones et de mucines. Trois
types de glandes cohabitent dans la cavité buccale : les glandes salivaires de la parotide, submandibulaires et sublinguales. Le passage directe des xénobiotiques du sang à la salive a été
suggéré dès 1950. Ces dernières années, les scientifiques se sont intéressés à la salive comme
un échantillon alternatif à l’urine ou le plasma pour établir des paramètres de pharmacocinétique des stupéfiants et faciliter ainsi leur suivi chez les consommateurs [7,29,57]. En fait,
l’intérêt majeur de la salive réside dans le fait qu’elle est très facilement accessible et que
l’échantillonnage est simple à réaliser. Il n’est donc pas étonnant que le nombre de publication
consacré à la détection d’agent pharmacologiquement actifs dans la salive soit en
augmentation.
La détection et le dosage de substances médicamenteuses dans la salive offriront des
informations sur l’état de la consommation de l’individu qui subit le test [13]. En général, les
concentrations de ces drogues dans la salive sont plus basses que celles que l’on rencontre
dans le sang ou l’urine. Les produits parents et non les métabolites y sont détectés.
Initialement, l’absorption par voie orale, nasale ou en inhalant de la fumée produit des taux
transitoirement plus élevés à cause de la contamination de la cavité buccale. Plus tard, la
concentration salivaire est sensée représenter la fraction de drogue libre dans le sang.
Cependant, de nombreuses substances médicamenteuses sont des bases faibles et leur
concentration dans la salive dépendra donc à la fois du pH et du flux de la production de
celle-ci . Ces facteurs sont responsables de la variabilité considérable du rapport des
concentrations salive / plasma observé pour beaucoup de substances. Aussi, un des
inconvéniant majeur de l’analyse de la salive réside dans le fait que les concentrations y sont
relativement basses une fois la première phase d’imprégnation directe passée, expliquant le
relatif faible succès de ces analyses en pratique.
Bien que des méthodes de détection très sensibles soient requises, il est possible de
détecter presque toutes les substances médicamenteuses dans la salive. Si l’on fait abstraction
des problèmes de contamination buccale, des corrélations satisfaisantes ont été obtenues entre
les concentrations de nombreux médicaments dans la salive et les effets physiologiques et
comportementaux observés chez les patients traités. On peut donc espérer que prochainement
il sera possible d’appliquer le test salivaire dans de nouveaux domaines une fois que les
mécanismes contrôlant l’entrée des xénobiotiques dans la salive seront mieux compris [36].
La récolte de l’échantillon de salive est facile. Plusieurs moyens sont proposés (OmniSal®, OraSure® or Salivette®), pouvant récolter jusqu’à 2 ml de liquide. Le changement de
pH avec de l’acide citrique, ou l’adjonction de goûts particuliers va modifier la stimulation du
flux de salivation. Le recours au Parafilm® peut stimuler aussi la salivation, mais ce
matériaux paut absorber directement le ou les substances qui nous intéressent. Si le recueil de
salive est trop rapide par une stimulation trop forte, l’échantillon peut ne pas être représentatif
de la concentration plasmatique de la substance. Si, au contraire, l’échantillonnage est trop
long, la concentration sera d’ordre cumulatif. Cinq minutes semblent être la durée optimale.
Concernant les contrôles anti-dopage, aucune évaluation n’a été faite à notre
connaissance, à l’exception de certains béta-bloquants. Si l’on se base par contre sur ce qui a
été étudié dans un contexte clinique, les molécules endogènes suivantes présentant un intérêt
pour le dopage sportif ont été déjà détectées : l’androstènedione, le cortisol, la cortisone et la
testostérone, mais nous ne disposons d’aucune indication sur l’utilité éventuelle de tels
mesures pour les contrôles anti-dopage [4]. Un nombre important de questions demandent
encore réponse :
• Quelles classes de substances peut-on effectivement détecter ?
• Quel volume de salive est nécessaire et est-il toujours possible d’obtenir un tel
volume de salive, même lors d’une forte déshydratation intervenant après la
compétition ?
• Quel sorte d’échantillon de salive est souhaitable d’obtenir (par stimulation ou non
et à quel pH) ?
• Quelles sont les possibilités d’adultération de l’échantillon ?
A ce stade, et tant que les réponses à ces questions n’ont pas encore été apportées,
nous considérons que l’introduction de la salive pour les contrôles anti-dopage est prématurée.
E. Sueur
La sueur est un liquide sécrété par des glandes situées dans l’épiderme. Elle participe à
la régulation de la température du corps en s’évaporant. La composition de la sueur varie
selon la personne : formée pour 99 % d’eau, elle contient outre du NaCl, des éléments en
traces, des produits d’excrétion telle d’urée, et toutes les substances véhiculées par le sang,
telles les substances médicamenteuses, lorsqu’elles ont été ingérées. On comprendra l’intérêt
que l’on peut porter à la sueur pour les détecter.
Depuis 1911, on a observé que des xénobiotiques sont excrétés par la sueur, mais ce
n’est que tout récemment qu’un système pratique de récolte de la sueur a été mis au point
[34]. Des bandages occlusifs consistant en 1 à 3 couches de papier filtre, couvert d’une bande
de gaze ont été imaginés pour récolter la sueur. Une version moderne est actuellement
disponible [20], agissant comme un récipient de l’échantillon collectant les substances nonvolatiles et liquides et laissant passer l’oxygène l’eau et le gaz carbonique. Ces pansements de
type particulier peuvent se porter plusieurs semaines en laissant la peau saine. Il est possible
d’accélérer le processus en chauffant le corps au moyen d’un courant d’air chaud. Ainsi
plusieurs substances médicamenteuses ont pu être détectées avec succès : la quinine, l’acide
salicylique, l’antipyrine, l’éthanol, la methadone, le phenobarbital, la morphine, la cocaïne,
les cannabinoïdes, la methamphetamine et la phencyclidine [14,34]. Plus récemment,
l’examen de sous- vêtements imprégnés de sueur a démontré qu’il était possible de déterminer
le status de consommateur de drogues [64].
Comme pour les cheveux et la salive, les substances parentes sont prédominantes dans
la sueur, mais l’analyse en duplicata lors d’études contrôlées a montré une variabilité
relativement importante d’un sujet à un autre [14].
Dans le cadre des activités sportives, le système de récolte de sueur par patch (placé
sur le bras, le dos ou la poitrine), bien que visible, n’est pas invasif et supporte d’être immergé
comme c’est le cas lors de la douche ou les exercices de natation. De plus, le système permet
de voir si le patch a été enlevé et remis en place à un moment ou à un autre [6,20]. Ainsi, en
offrant un échantillonnage de type cumulatif de la consommation de substances
médicamenteuses, on peut imaginer que la récolte de sueur puisse être envisagée lorsqu’il
s’agit de contrôler l’absorption de substances dopantes pendant un laps de temps important.
Enfin, le patch peut être facilement conservé pour analyse ultérieure [35].
Pitfalls and limitations of drug screens
The rapid growth and development of drug testing technology has created a number of
testing methodologies that can assess a range of biological specimens not only to provide
evidence of recent drug use but also to indicate as far as it may be, the pattern of drug use (i.e.
route, frequency, dose and time of last use), the degree of impairment or the extent of drug
dependence of the individual. Many of these specimens, especially in doping controls, must
be used with special attention because of the potential for false-positive results due to their
contamination during passive environmental exposure.
For the doctors or sport administrators, the broad range of drug tests accuracy, coupled
with the confusing rubric “ doping screen in sports ” often leads to considerable confusion
about what, in fact, the test used is able to detect. All doping screen methods have in common,
however, a basic design which maximises sensitivity while making compromises in
specificity.
Immunoassays generally are less sensitive than GC-MS although both are capable of
detecting very low quantities of drugs. The duration of a test positivity depends not only, in
part, on the sensitivity of the test, but also on the circumstances of abuse. Multiple doses of a
drug taken chronically may redistribute it to deep body compartments with slow release back
into the blood compartment, prolonging significantly the pharmacokinetics of elimination.
This is particularly true for cannabinoids, methaqualone or phencyclidine, and all anabolic
steroids. Therefore, issues in drug pharmacokinetics and testing methodologies can easily lead
to both false-positive and false-negative tests, both with significant consequences.
Causes of false negative drug screens
Equally problematic in drug testing are situations where a drug test fails to identify the
athlete who has, in fact, been recently abusing doping drugs and where a drug test should be
positive. The reasons for a false-negative test can be divided into three general categories:
technological shortcomings, pharmaco-kinetic characteristics, and intentional specimen
alteration or adulteration.
a) Technological shortcomings
One of the most common reasons for a doping screen (or a drug screen) result to turn
out negative despite obvious drug abuse is that the clinician or the scientist fails to recognise
that the particular screen being used is incapable of detecting the substance in question [69].
For example, some new chemicals abused by sport athletes, cannot be detected by routine
screening of urine by commercially available immunoassays or any of our routinely GC-MS
based screening procedures. LC-MS screening might actually offer a better picture than GCMS, the dimension of which is still not yet completely evaluated. Without prior knowledge of
what the test specifically seeks, the diagnosis may be missed.
b) Pharmacokinetic characteristics
The pharmacokinetic characteristics of drugs have an important influence on drug
detectability, particularly if the wrong biological specimen is examined or if the wrong
technology is used. For example, drugs that have a large volume of distribution have
correspondingly low serum or blood concentrations (cannabinoids or LSD). Immunological
drug tests designed generally just for urine specimens, are therefore incapable of detecting
these drugs in serum or blood, hair, saliva or sweat.
Another pharmacokinetic characteristic, elimination half-life, also has important
implications for drug detection capability. With drugs that have a short elimination half-life
(e.g. cocaine) parent compound may be undetectable in blood within 8 hours; however,
cocaine metabolites may be detected in urine for several days after a significant exposure
because of the drug excretory pattern. Another factor to be pointed out is that the
pharmacokinetics of certain drugs may vary according to the individual. Subsequently, as a
general rule, urine remains the best biological specimen for drug testing because it takes
advantage of the fact that kidneys are the primary excretory organs for most drugs.
c) Intentional specimen alteration or adulteration
Biological specimens, particularly urine, can also be intentionally altered or
adulterated to produce a false-negative result [40]. Methods available to accomplish this are
numerous and varied, ranging from simple dilution of the collected specimen to actual
substitution of sample by giving the examiner his or her own urine that was produced before
any drug use occurred or a fluid that resembles urine [12,67]. Another commonly used
method consists of drinking large amount of fluid or even using a diuretic in order to reduce
the concentration of drug in urine so that it falls below the detection threshold of the assay and
will produce a negative urine. However adulteration of the collected specimen with chemical
agents is the method chosen by many users because it requires little sophistication and can be
easily accomplished in an unobserved collection conditions. These substances include
vinegar, lemon juice, bleach, ammonia-based cleaner, crystalline drain cleaner, non-ionic
liquid hand soap, methanol, sodium chloride, toilet-bowl cleaner, ionic detergents and even
whole blood anti-coagulated with EDTA [58]. Although well-designed collection procedures
can minimise the opportunity for sample adulteration and laboratory tests exist that may
detect certain types of adulterants (temperature, specific gravity, pH measurement of the
sample and measurement of urinary creatinine), no system is absolutely fool-proof [59].
Saliva can also be prone of many alterations just before its collection. Dr. Mercier-Guyon in
Annecy, France [personnel communication] estimates at less than 24 hours, the time period
needed to people to find a new way of adulteration of saliva to be collected by the police at
road side controls. Sweat is more difficult as latest generation patches cannot be moved away
and replaced without due notification. Finally, hair can be cut short, shaved and stained or
treated with strong chemicals which are known to reduce drastically the concentration of the
drugs.
Conclusions
The doping control rules actually applied in Sports (as established by the I.O.C. and
the International Sport Federations) state that a positive case is chemically established by the
un-equivoqual detection of a forbidden parent molecule and/or any of its metabolite(s) in
urine, no matter the amounts which were administered and when the drug was taken.
Screening is accomplished most of the time by using immunologic tests and GC-MS
procedures on urine samples. These have been optimised to detect most if not all of the
forbidden compounds which are on the list . Concentration of most doping agents is much
lower in blood than in urine and their detection requests highly efficient methodology. The
costs of these blood analyses would be higher than the corresponding urine’s one. Blood
could be preferred for specific substances like peptide hormones where urine shows
degradation products at low level only.
So far, a minority of forbidden substances could be detected in saliva with the required
sensitivity and specificity and clear limitations of sweat in doping control analysis is obvious.
Method development and research efforts are actually on their way in our Institute in order to
evaluate the usefulness of saliva for detection along the roads drivers who might be
conducting under the influence of drug(s) of abuse or/and therapeutic agents. For some
experts it seems extremely easy to adulterate saliva samplings (i.e.: changing the pH with a
tablet). Considerable research efforts are still needed until these two biological matrixes could
be used in real situations.
If retrospectivety in time of the drug(s) intake is becoming in the future an important
issue for evaluating the responsibility of the person, hair analyses might be very useful when
the drugs have been taken at regular intervals. However, manipulation of hair samples can
easily occur : extensive washing and dying with bright colours is known to diminish the level
of drugs trapped in the hair matrix. When athletes are shaving their head, one can also
question where alternative hair sampling could be performed without too much
embarrassment for both the sport man and the controller.
In conclusion, we can imagine today that unconventional samples’ analyses can best
be used in the following-up legal cases related to doping in sport where initial detection of a
forbidden molecule as been done classically in urine. Indeed, some countries have already
forbidden by law the use, the transport and the selling of all doping agents. In these situations,
the questions to be answered by the laboratory can thus exactly follow the same approach as
for the classical forensic toxicological problems. Before its systematic introduction for the
detection of doping, unconventional samples’ analysis has to be further scientifically
developed in details.
Références
1. Baselt R.C. and Cravey R.H. (1995) Disposition of toxic drugs and chemicals in man.
Foster City. CA: Chemical Toxicology Institute
2. Blank D.L. and Kidwell D.A. (1993) External contamination of hair by cocaine: an
issue in forensic interpretation. Forensic Science International 63. 145-156
3. Blank D.L. and Kidwell D.A. (1995) Decontamination procedures for drugs of abuse
in hair: are they sufficient? Forensic Science International 70. 13-38
4. de Boer D. Höld K.M. van der Horst-Brigot B. Elhamdi M. van Schaik L. Zuidema J
and Maes R.A.A. (1997) Potential role of saliva as a biological specimen in doping
analysis. In : Recent advances in doping analysis (4) Proceedings of the 14th Cologne
Workshop on Dope analysis, 259-270
5. Bowers L.D. (1997) Analytical advances in detection of performance-enhancing
compounds. Clinical Chemistry 43. 1299-1304
6. Burns M. and Baselt R.C. (1995) Monitoring drug use with a sweat patch: an
experiment with cocaine. Journal of Analytical Toxicology 19. 41-48
7. Caddy B. (1984) Saliva as a specimen for drug analysis. In: Baselt R.C. (ed.)
Advances in Analytical Toxicology. Vol 1. Foster City, CA: Biomedical Publications.
198-254
8. Catlin D.H., Hatton C.K. and Starcevic S.H. (1997) Issues in detecting abuse of
xenobiotic anabolic steroids and testosterone by analysis of athletes’ urine. Clinical
Chemistry 43. 1280-1288
9. Chiarotti M. and Strano-Rossi S. (1996) Preparation of hair samples for drug analysis.
Forensic Science Review 8. 111-128
10. Cirimele V., Kintz P. and Mangin P. (1995) Drug concentrations in human hair after
bleaching. Journal of Analytical Toxicology 19. 331-332
11. Cirimele V. Kintz P. Jeanneau T. and Ludes B. (1999) Testing for anabolic steroids in
human hair obtained from two bodybuilders. Toxicorama 11. 30-34
12. Cody J.I. and Schwarzhoff H. (1989) Impact of adulterants on RIA analysis of urine
for drugs of abuse. Journal of Analytical Toxicology 13. 277-284
13. Cone E.J. (1993) Saliva testing for drugs of abuse. Annals of the New York Academy
of Sciences 694. 91-127
14. Cone E.J., Hillsgrove M.J., Jenkins A.J., Keenan R.M. and Darwin W.D. (1994)
Sweat testing for heroin, cocaine and metabolites. Journal of Analytical Toxicology
18. 298-305
15. Cone E.J. and Joseph R.E. (1996) The potential for bias in hair testing for drugs of
abuse. In: Kintz P. (ed.). Drug testing in hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 69-93
16. Cowan D.A. and Kickman A.T. (1997) Doping in sport: misuse, analytical tests, and
legal aspects. Clinical Chemistry 43. 1110-1113
17. Deng X.-S. Kurosu A. Pounder D.J. (1999) Detection of anabolic steroids in head hair.
Journal of forensic sciences 44. 343-346
18. DuRant R.H., Escobedo L.G. and Heath G.W. (1995) Anabolic steroid use, strength
training and multiple drug use among adolescents in the United States. Pediatrics 96.
23-28
19. Ferner R.E. 1996: Forensic Pharmacology. Oxford. N.F.: Oxford University Press
20. Fogerson R., Schoendorfer D., Fay. J. and Spiehler V. (1997) Qualitative detection of
opiates in sweat by RIA and GC-MS. Journal of Analytical Toxicology 21. 451-458
21. Goldberger B.A., Caplan Y.H., Maguire T. and Cone E.J. (1991) Testing human hair
for drugs of abuse. IV. Identification of heroin and 6-monoacetylmorphine as
indicators of heroine use. Journal of Analytical Toxicology 15. 226-231
22. Gottshalk L.A. and Cravey R.H. (1980) Toxicological and pathological studies on
psychoactive drug-involved deaths. Davis California: Biomedical Publications
23. Gygi S.P., Joseph R.E., Cone E.J., Wilkins D.G. and Rollins D.E. (1996)
Incorporation of codeine and metabolites into hair: role of pigmentation. Drug
metabolism and disposition 24. 495-501
24. Harkey M.R., Henderson G.L. and Zhou C. (1991) Simultaneous quantitation of
cocaine and its major metabolites in human hair by gas chromatography / chemical
ionisation mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology 15. 260-265
25. Henderson G.L. (1993) Mechanisms of drug incorporation into hair. Forensic Science
International 63. 19-29
26. Henderson G.L., Harkey M.R., Zhou C., Jones R.T. and Jacobs P. (1996)
Incorporation of isotopically-labeled cocaine and metabolites into human hair. I.
Dose-response relationships. Journal of Analytical Toxicology 20. 1-12; (1998) III.
Race as a factor. Journal of Analytical Toxicology 22. 156-165
27. Höld K.M., Wilkins D.G., Crouch D.J., Rollins D.E. and Maes R.A. (1996) Detection
of stanozolol in hair by negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of
Analytical Toxicology 20. 345-349
28. Huestis M.A. (1996) Technical and legal aspects of drugs of abuse testing in hair. In:
Kintz P. (ed.). Drug testing in hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 5-15
29. Idowu O.R. and Caddy. B. (1982) A review of the use of saliva in the forensic
detection of drugs and other chemicals. Journal of Forensic Society 22. 123-235
30. Joseph R., Su T.P. and Cone E.J. (1996) In vitro binding studies of drugs to hair:
influence of melanin and lipids on cocaine binding to caucasoid and africoid hair.
Journal of Analytical Toxicology 20. 338-344
31. Kidwell D.A. and Blank D.L. (1996) Environmental exposure - The stumbling block
of hair testing. In: Kintz P. (ed.). Drug testing in hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 1768
32. Kintz P., Tracqui A. and Mangin P. (1992) Detection of drugs in human hair for
clinical and forensic applications. International Journal of Legal Medicine 105. 1-4
33. Kintz P., Cirimele V. and Mangin P. (1995) Testing human hair for cannabis. II.
Identification of THC-COOH by GC-MS-NCI as a unique proof. Journal of Forensic
Sciences 40. 619-622
34. Kintz P., Tracqui A., Jamey C. and Mangin P. (1996) Detection of codeine and
phenobarbital in sweat collected with a sweat patch. Journal of Analytical Toxicology
20. 197-201
35. Kintz P. Brenneisen R., Bundeli P. and Mangin P. (1997) Sweat testing for heroin and
metabolites in a heroin maintenance program. Clinical Chemistry 43. 736-739
36. Kintz P., Cirimele V. and Ludes B. (1998) Codeine testing in sweat and saliva with the
Drugwipe. International Journal of Legal Medicine 111. 82-84
37. Korkia P. and Stimson G.V. (1993) Anabolic steroid use. Lancet 341. 1407
38. Mangin P. and Kintz P. (1993) Variability of opiates concentrations in human hair
according to their anatomical origin: head, axillary and pubic regions. Forensic
Science International 63. 77-83
39. Mangin P. (1996) Drug analysis in nonhead hair. In: Kintz P. (ed.). Drug testing in
hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 279-287
40. Mikkelsen S.L. and Ash K.D. (1988) Adulterants causing false negatives in illicit drug
testing. Clinical Chemistry 34. 2333-2336
41. Moeller M.E., Fey. P. and Sachs H. (1993) Hair analysis as evidence in forensic cases.
Forensic Science International 63. 43-53
42. Moeller M.R. and Eser H.P. (1996) The analytical tools for hair testing. In: Kintz. P.
(ed.). Drug testing in hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 95-120
43. Musshoff F., Daldrup T. and Ritsch M. (1997) Black market in anabolic steroids analysis of illegally distributed products. Journal of Forensic Sciences 42. 1119-1125
44. Nakahara Y. and Kikura R. (1994) Hair analysis for drugs of abuse. VII. The
incorporation rates of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester into rat
hair and hydrolysis of cocaine in rat hair. Archives of Toxicology 68. 54-59
45. Nakahara Y., Kikura R. and Takahashi F. (1995) Hair analysis for drugs of abuse. X.
Effect of physicochemical properties on incorporation rates into hair. Biological and
Pharmaceutical Bulletin 18. 1223-1227
46. Nakahara Y. and Kikura R. (1996) Hair analysis for drugs of abuse. XIII. Effect of
structural factors on incorporation of drugs into hair: the incorporation rates of
amphetamines analogs. Archives of Toxicology 70. 841-849
47. Offidani C., Strano-Rossi S. and Chiarotti M. (1993) Drug distribution in the head,
axillary and pubic hair of chronic addicts. Forensic Science International 63.1105-108
48. Polettini A. Montagna M. Segura J. and de la Torre X. (1996) Determination of beta2-agonists in hair by gas chromatography/mass spectrometry. Journal of Mass
spectrometry 31. 477-54
49. Rivier L. (1999a) Une zone grise du dopage sportif : les substances ergogènes.
Médecine et Hygiène 57. 2034-2041.
50. Rivier L. (1999b) Is there a place for hair in doping analysis ? Forensic Science
International, in press.
51. Rivier L. and Saugy M. (1995) Systematic drug identification. In : Encyclopedia of
Forensic Sciences, London (U.K.): Academic Press, 1594-1606
52. Rollins D.E., Wilkins D.G., Gygi S.P., Slawson M.H. and Nagasawa P.R. (1997)
Testing for drugs of abuse in hair. Experimental observations and indications for
future research. Forensic Science Review 9. 23-36
53. Segura J. (1995) Possibilities of ELISA methodologies for hair analysis. In: de Zeeuw
R.A., Al Hosani I., Al Munthiri S. and Maqbool A. (edts.) Hair analysis in forensic
toxicology. Proceedings of the 1995 International Conference and Workshop. Abu
Dhabi, 351-369
54. Sachs H. (1996) Forensic applications of hair analysis. In: Kintz P. (ed.). Drug testing
in hair. Boca Raton. Fl.: CRC Press. 211-222
55. Sachs H., Thieme D., Gilg T. Tutsch-Bauer E. and Müller R.K. (1996) Nachweis von
Clenbuterol und anabolen Steroiden in menschlischen Haaren durch GC/HRMS/MS.
Jahrestagung des Deutschen Gesellschaft für Rechstmedizin, Iena. 87-90
56. Sachs H. Thieme D., Grosse J. and Müller R.K. (1999) Detection of several anabolic
steroids of abuse in human hair. In : “Abstracts of the 16th Cologne workshop on dope
analysis, 15th to 20th March 1998“
57. Schramm W., Smith R.H., Craig P.A. and Kidwell D.A. (1992) Drugs of abuse in
saliva: a review. Journal of Analytical Toxicology 16. 1-9
58. Schwarzhoff R. and Cody J.T. (1993) The effects of adulterating agents on FPIA
analysis of urine for drugs of abuse. Journal of Analytical Toxicology 17. 14-17
59. Soper J.W. and Canfield V. (1996) Description of a screening assay system to detect
adulteration of urine samples. Journal of Analytical Toxicology 20. 77
60. Springfield A.C., Cartmell L.W., Aufderheide. A.C., Buikstra. J. and Ho. J. (1993)
Cocaine and metabolites in the hair of ancient coca leaf chewers. Forensic Science
International 63. 269-275
61. Terney R. and McLain L.G. (1990) The use of anabolic steroids in high school
students. American Journal of Diseases of Children 144. 99-103
62. Thieme D. Grosse J. Sachs H. Müller R.K. (1999) Detection of several anabolic
steroids of abuse in human hair. In : “Recent advances in doping analysis Vol. 6 (W.
Schänzer, H. Geyer, A. Gotzmann and U. Mareck-Engelke, Edts.). Sport und Buch
Strauss : Köln, 9-29
63. Thormann W., Zhang C. and Schmutz A. (1996) Capillary electrophoresis for drug
analysis in body fluids. Therapeutic Drug Monitoring 18. 506-520
64. Tracqui A., Kintz P., Ludes B., Jamey C. and Mangin P. (1995) The detection of
opiate drugs in non traditional specimens (clothing): a report of ten cases. Journal of
Forensic Sciences 40. 263-265
65. Tracqui A. (1996) Unusual drugs in hair. In: Kintz P. (ed). Drug testing in hair. Boca
Raton. Fl.: CRC Press. 191-210
66. Von Heeren F. and Thormann W. (1997) Capillary electrophoresis in clinical and
forensic analysis. Electrophoresis 18. 2415-2426
67. Warner A. (1989) Interference of common household chemicals in immunoassay
methods for drugs of abuse. Clinical Chemistry 35. 648-651
68. Wilkins D.G., Haughey H.M., Krueger G.G. and Rollins D.E. (1995) Disposition of
codeine in female human hair after multiple dose administration. Journal of Analytical
Toxicology 19. 492-498
69. Woolf A.D. and Shannon M.W. (1995) Clinical toxicology for the pediatrician.
Pediatric Clinics of North America 42. 317-333
70. Yesalis C., Kennedy N. and Kopstein A. (1993) Anabolic-androgenic steroid use in
the United States. Journal of the American Medical Association 270. 1217-1221