Analyse de la fraction phénoliques des huiles d`olive vierges

Annales des falsifications, de l’expertise chimique et toxicologique, 2ème Semestre 2004-N°965-pp.169-196
Article original
Analyse de la fraction phénoliques des huiles d’olive vierges
Denis Ollivier1, Estelle Boubault1, Christian Pinatel2, Sylvie Souillol1, Michel Guérère1,
Jacques Artaud3
1
Laboratoire de Marseille, Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes,
146 traverse Charles-Susini, 13388 Marseille cedex 13 ([email protected])
2
Association Française Interprofessionnelle de l’Olive (AFIDOL), Maison des Agriculteurs, 22 avenue Henri-Pontier,
13626 Aix-en-Provence cedex 1
3
Laboratoire de Chimie Analytique de l’Environnement, UMR CNRS 6171, IFR 112, Eutôpole de l’Arboit, Bâtiment
Villemin, BP80 Aix-Marseille III.
Titre abrégé : Phénols dans les huiles d’olive vierges
Résumé : Ce travail est une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le
visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des ortho-diphénols dans
les huiles d’olive vierges. Nous avons étudié l’influence de certains paramètres analytiques sur ces
dosages. Une détermination par chromatographie liquide des composés phénoliques d’huiles d’olive
vierges a été réalisée pour caractériser des conditions de stockage de l’huile et des états de
maturation des olives. Ce travail a été réalisé avec notamment le soutient financier de la
Commission européenne (programme de recherche et développement « Qualité de la vie et
management des ressources ») dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT2002-02386).
Mots clés : Phénols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphénols, huile d’olive vierge, chromatographie
liquide.
Title : Phenols analysis in virgin olive oils
Abstract : This work focuses on the colorimetric determination of total phenols with the FolinCiocalteu and ortho-diphenols with bibliographic data. Different analytical methods by colorimetric
determinations and liquid chromatography were developed to analyze the stability during olive
ripening and the oil storage. This study has been carried out with financial support from the
Commission of the European Communities, specific RTD programme "Quality of Life and
Management of Living Resources", QLK1-CT-2002-02386, "Traceability of origin and authenticity
of olive oils by combined genomic and metabolomic approaches (OLIV-TRACK)".
Keywords : Phenols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphenols, virgin olive oils, liquid chromatography.
Introduction
L’huile d’olive vierge est obtenue uniquement par des procédés physiques (lavage, broyage,
malaxage, centrifugation, décantation...) dans des conditions notamment thermiques qui n'entraînent
pas d'altération de l'huile. Ces procédés la différencient des autres huiles alimentaires qui, pour la
grande majorité d'ente elles, sont raffinées. Les procédés mis en œuvre lui confèrent une
composition originale avec environ 98% de triglycérides et 2% de composés mineurs. Ces derniers
appartiennent à des familles très diverses telles que : hydrocarbures (avec une prépondérance du
squalène de 0,3 à 1,2 g/100g), tocophérols, stéroïdes, alcools aliphatiques, composés volatils,
composés phénoliques …
Les composés phénoliques, improprement appelés souvent « polyphénols », sont responsables de la
bonne stabilité à l’oxydation des huiles d’olive vierges. Outre leur propriété anti-oxydante, ils
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possèdent d’intéressantes propriétés nutritionnelles et organoleptiques. Les principaux composés
des huiles d’olive vierges sont représentés dans les figures 1, 2 et 3.
La détermination de la teneur en composés phénoliques des huiles d’olive devient une analyse
importante bien que non réglementaire à ce jour. Elle fait cependant partie du cahier des charges de
quelques huiles italiennes de dénomination d’origine protégée (DOP, équivalent à nos AOC ) avec
une teneur minimale en phénols totaux à respecter.
La teneur en composés phénoliques des huiles d'olive vierges dépend :
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
de la variété de l'olive ;
du degré de maturité des olives (la teneur baisse avec la sur-maturation des olives) ;
du niveau d’infestation des olives par la mouche Dacus oleae [1] ;
du climat ;
de la qualité du sol ;
du procédé d'extraction utilisé pour séparer la phase huileuse de la phase aqueuse ;
des conditions de conservation de l'huile…
Diverses techniques ont été mises en œuvre pour l’analyse qualitative et quantitative des composés
phénoliques :
-
l’absorptiométrie dans le visible selon la méthode de Folin-Ciocalteu (FC) [2] ;
la chromatographie en phase liquide (HPLC) avec détection spectrophotométrique ou
électrochimique [3,4] ;
la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse [5] ;
l’enzymologie [6] ;
la spectrométrie de masse avec ionisation chimique à la pression atmosphérique (ACPIMS) [7].
Le but du présent travail est de :
- réaliser une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le
visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des o-diphénols
présents dans les huiles d’olive vierges ;
- d’étudier l’influence de certains paramètres analytiques sur ces dosages ;
- d’effectuer une étude en chromatographie liquide (CLHP) des composés phénoliques des
huiles d’olive vierges.
Ce travail a été effectué avec notamment le soutient financier de la Commission européenne
(programme de recherche et développement « Qualité de la vie et management des ressources »)
dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT-2002-02386).
1. Les composés phénoliques
Les huiles d’olive vierges sont riches en composés phénoliques appartenant à diverses familles :
(phénols et hydroxyphénols, acides et alcools phénols, sécoïridoïdes, lignanes, flavonoïdes, ....).
Certains composés phénoliques confèrent aux huiles vierges une saveur amère et une sensation de
piquant.
L'oléuropéine et le ligstroside sont les sécoïridoïdes majoritaires de l’olive [8]. Leur aglycone,
lipophile, sont présents dans l’huile d’olive. Leurs formules sont représentées figure 2.
Au cours de la maturation du fruit, les glucosides sont hydrolysés pour donner des aglycones qui
confèrent à l'huile d'olive sa saveur si particulière. Des phénomènes d’oxydation se produisent
2
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également lors de la trituration des olives et entraînent la formation de composés qui contribuent
aux arômes et à la saveur de l'huile.
En général, les huiles d'olives « fruité vert » obtiennent les notes les plus fortes en dégustation car
elles ont des fruités plus intenses et des arômes plus complexes que les huiles « fruité mûr » et
« fruité noir ». Ces caractéristiques sont dues à leur forte teneur en composés phénoliques,
aldéhydes, alcools, alcènes… Cependant, une trop grande concentration en phénols donne une
amertume excessive et déplaisante, généralement peu appréciée par les consommateurs bien qu’il
s’agisse d’un critère de "qualité" pour l’huile.
Les alcools phénoliques
OH
OH
OH
CH2-CH2-OH
CH2-CH2-OH
Hydroxytyrosol
2-(3,4-dihydroxyphényl)-éthanol
Tyrosol
2-(4-hydroxyphényl)-éthanol
Les acides phénoliques
OH
OH
OCH3
COOH
CH=CH-COOH
Acide vanillique
acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzoïque
Acide p-coumarique
acide para-hydroxycinnamique
OH
OH
OCH3
OH
CH=CH-COOH
CH=CH-COOH
Acide férulique
acide 4-hydroxy-3-méthoxycinnamique
Acide caféique
acide 3,4-dihydroxycinnamique
Les flavonoïdes
OH
OH
OH
HO
HO
O
O
HO
OH
O
O
Lutéoline
Apigénine
Figure 1 : formules de quelques alcools, acides phénols et flavonoïdes
3
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Composés hydrophiles
Composés lipophiles
fruits, feuilles
huile
COOCH 3
O
HO
O
HO
OH
O
HO
O
O
O
COOCH 3
OH
O
OH
HO
O
OH
OH
Oléuropéine,
Oléuropéine aglycone
COOCH 3
O
O
HO
O
HO
HO
O
HO
O
O
OH
OH
O
COOCH 3
O
OH
Ligstroside
Ligstroside aglycone
Figure 2 : Les sécoïridoïdes de l’olive, des feuilles et de l’huile.
OMe
HO
O
R
O
OH
OMe
R= H Pinorésinol
R= OCOCH3 1-acétoxypinorésinol
Figure 3 : Les lignanes de l’huile d’olive
Les composés phénoliques et la santé humaine [9, 10]
• Activité antioxydante
Les composés phénoliques de l'huile d'olive vierge ont des propriétés antioxydantes qui réduisent
les risques de maladies cardiovasculaires. Ceci est surtout vrai pour les ortho-diphénols comme
l'hydroxytyrosol et l'oléuropéine aglycone.
Leurs propriétés antioxydantes sont dues à leur capacité à former une liaison hydrogène
intramoléculaire entre l'hydrogène libre du groupement hydroxy et l'hydroxyle du radical phénoxy
pour conduire à la formation d’une quinone [11].
• Interférence avec les enzymes
L'oléuropéine aglycone agit sur l'activité immunitaire des macrophages [12]. En effet, il a un effet
positif sur la formation de bactéricides et de l'enzyme oxyde nitrique synthétase. Cette enzyme joue
un rôle d'anti-inflammatoire.
4
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2. Dosage des phénols
La quantification des composés phénoliques est le plus souvent réalisée par absorptiométrie dans le
visible ou par chromatographie en phase liquide (HPLC) avec une détection spectrométrique dans
l’ultraviolet.
La méthode absorptiométrique est facile à mettre en œuvre mais n’est pas spécifique et ne permet
pas une analyse fine des différents composés phénoliques présents dans l’huile. En revanche, la
chromatographie en phase liquide est sensible, spécifique mais demande un appareillage coûteux et
se heurte à l’absence de composés commerciaux de référence pour les identifications.
2.1. Méthode de Folin-Ciocalteu
Récemment, Singleton et al [13] ont réalisé une mise au point importante sur le dosage des phénols
selon Folin-Ciocalteu (FC).
La méthode de FC a été très utilisée pour le dosage des phénols dans les vins et les spiritueux mais
aussi dans divers substrats dont les huiles d’olive.
Les échantillons de composés phénoliques, traités avec le réactif de FC
(hétéropolyphosphotungstates-molybdates)
(mélange
d’acides
phosphotungstinique
et
phosphomolybdique) (réactif commercial, Prolabo ref : 31 360.264), en milieu alcalin (carbonate de
sodium), développent une coloration bleue dont l’absorption est mesurée à 760 nm. La température
et le temps de réaction influent sur le développement de la coloration.
Les conditions expérimentales proposées par différents auteurs [13, 14] sont données ci-dessous :
« 1 ml d’échantillon (de blanc ou d’étalon) est ajouté à au moins 60 ml d’eau distillée dans une fiole
jaugée de 100 ml. Ajouter 5 ml de réactif de FC et mélanger. Après une minute et avant huit
minutes, ajouter 15 ml de carbonate de sodium à 20 %. Ajuster le volume à 100 ml. Mesurer
l’absorbance de la solution au bout de 2 heures à environ 23°C (760 nm ; cuve de 1 cm) ».
La préparation de l’échantillon peut se faire en diminuant les quantités d’un facteur 5 :
« 2 ml d’un échantillon dilué au 1/10 ;10 ml de réactif de FC dilué au 1/10 ; 8 ml de carbonate de
sodium (7,5 g/100 ml d’eau) pour un volume final de 20 ml ».
Les mesures sont effectuées par rapport à un composé de référence qui pour l’analyse des phénols
dans les vins est le plus souvent l’acide gallique. Une liste de composés, susceptibles d’interférer
sur les mesures d’absorbance, est donnée [12] avec leur absorptivité molaire.
L’huile d’olive
La teneur en composés phénoliques totaux dans les huiles d’olive a été très souvent déterminée en
utilisant la méthode de FC (Tableau 1). Blekas et al. [14] indiquent que dans l’huile d’olive, il n’y a
que peu de composés susceptibles d’interférer sur les mesures (absence de sucres réducteurs,
d’acide ascorbique, d’ions ferreux ou zinc). Les résultats sont exprimés par rapport à une substance
de référence qui varie selon les auteurs (Tableau 1). Il est donc très difficile de comparer les
résultats en raison d’une part des différences d’absorptivité des composés de référence utilisés et
d’autre part de la variation des conditions expérimentales dans lesquelles la réaction de FC est
réalisée. Pour le même échantillon, les valeurs extrêmes trouvées pour les phénols totaux avec 12
étalons différents, varient de 70 mg/kg pour l’acide 3,4-dihydroxyphénylacetique à 380 mg/kg avec
l’acide p-hydroxybenzoïque [14]. Les valeurs [14] sont respectivement de 92 et 105 mg/kg avec
l’acide caféique et l’acide gallique qui sont les étalons les plus utilisés (Tableau 1).
La méthode manque de spécificité, le dosage ne permettant pas de distinguer les phénols simples
des phénols complexes [15, 16, 17, 18]. Les résultats obtenus par absorptiométrie selon FC diffèrent
de ceux obtenus par chromatographie en phase liquide [17, 19, 20].
5
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La stabilité à l’oxydation, évaluée par le test de Swift avec le Rancimat, ne serait pas corrélée avec
la teneur en composés phénoliques pour Pirisi et al. (18) ce qui est contraire aux résultats d’autres
auteurs qui trouvent que la stabilité des huiles est bien corrélée avec la teneur en phénols totaux [21,
22].
Malgré ces problèmes et les divergences de la littérature, Blekas et al. [14] considèrent que le
dosage des phénols des huiles d’olive selon FC constitue une bonne analyse de routine.
Tableau 1 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation
Ref.
Auteurs
Étalons
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
[30]
[3]
[15]
[31]
[32]
Singleton, (1965)
Montedoro, (1969)
Montedoro, (1972)
Ragazzi, (1973)
Vazquez, (1978)
Gutfinger, (1981)
Cortesi (1983)
Solinas, (1987)
Nergiz, (1991) selon [21]
Montedoro, (1992)
Tsimidou, (1992)
Favati, (1994)
Stefanoudaki, (1995)
Ac caféique
Ac gallique
Ac caféique
Tyrosol
Ac caféique
725
765
725
[21]
[33]
Baldioli selon [3], (1996)
Poiana selon [3], (1996)
Ac gallique
Ac gallique
765
765
Ac gallique
Ac gallique
Ac caféique
Ac caféique
Ac gallique
Ac caféique
Ac caféique
Ac gallique
Ac caféique
Ac caféique
Ac caféique
Ac caféique
Ac caféique
Ac caféique
Ac caféique
Ac gallique
765
765
725
725
765
725
725
765
[19]
Cioni, (1998)
[34]
Caponio (1999)
[35]
Ranalli (1999)
[36]
Beltran (2000)
[37]
Capannesi (2000)
[38]
Giacometti (2001)
[39]
Lo Curto 2001)
[40]
Pellegrini selon [22], (2001)
[41]
Ranalli
[42]
Salvador (2001)
[43]
Tasioula selon [27]
[14]
Blekas (2002)
[44]
Gimeno (2002)
[45]
Gomez-Alonso (2002)
[46]
Psomiadou (2002)
[47]
Bendini (2003)
FC : Folin-Ciocalteu ; FD : Folin-Denis [13]
Ac gallique
Gallotanin
Ac gallique
Tyrosol
Ac caféique
Ac caféique
λ mesure
nm
765
Teneurs en phénols
en mg/kg d’huile
76-442
765
725
725
725
725
725
765
725
34,90-271,04 mg/l
50-500
44-157
180-454
260-665
35-355
50-1000
18,7-242,5
98-458
153-400
190-500
FC
FC
FC
FC
FD
FC
FC
FC
FC
FC
FD
FC
85-195
110-180
119-139
175-490
99-203
100-904
52-356
59-255
73-265
115-159
19-380
20 à 339
42-124
130-170
98-209
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
FC
750
Protocoles expérimentaux
Les tableaux 2 et 3 résument les différents protocoles expérimentaux décrits dans la littérature en ce
qui concerne l’extraction des phénols et les conditions expérimentales de réalisation de la réaction
de FC.
6
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Tableau 2 : Extraction des phénols
Réf.
Huile
Solvant / ml
Solvant extraction
g
v/v
[27]
10
Hexane/50
3x20ml ;MeOH/H2O; 6/4
[3]
10
non
3x10ml ;MeOH/H2O; 8/2
[15]
50
Hexane/50
3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4
[19]
2
Hexane/1
3x2ml ;MeOH/H2O; 6/4
[37]
2,5
Hexane/2,5 3x2,5ml ;MeOH/H2O; 8/2
[38]
50
Hexane/50
3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4
[39]
40
non
20ml ;MeOH/H2O; 8/2
[14]
30
Hexane /30
3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4
[48]
10
non
2x10ml ; MeOH/H2O; 8/2
Tween 20
g
non
oui
non
non
non
non
non
non
0,2
Lavage
ml
Hexane 3x50
Hexane 2x2
Hexane 3x50
Hexane 1x50
Hexane* 10
puis 2x5ml
*Hexane saturé en MeOH/H2O (8/2)
Tableau 3 : Conditions de la réaction de Folin-Ciocalteu
Réf. Huile départ Volume final
Prise essai
Folin
g
Extrait MeOH
ml
[27]
10
1ml
100µl
0,5
[3]
10
np
np
np
[15]
50
5ml
2ml
0,5
[19]
2
100µl
100µl
2,5
[37]
2,5
np
2,5
[38]
50
0,5
[39]
40
200µl
200µl
10ml à 10%
[14]
30
aliquote
5ml/25 puis
0,5
2ml
[48]
10
50 ml
2ml
1,0
np : non précisé; obs : obscurité
1ml ; 35%
np
1ml ; sat
5ml ; 7,5%
5ml ; 7,5%
1ml; saturé
8ml ; 7,5%
1ml ; 35%
V. final
ml
10
np
25
50
50
25
20
25
Temps
min
60
np
60; obs
1 nuit
60
60
60
λ
nm
725
np
725
765
765
725
725
725
5ml ; 10%
20
90, obs
750
Na2CO3
La très grande diversité des conditions d’extraction et des conditions de réactions sont
probablement une des causes de la variabilité des teneurs en phénols données dans le tableau 1.
Il devient donc nécessaire de définir avec précision l’ensemble des conditions expérimentales du
dosage pour évaluer les teneurs en phénols dans les huiles d’olive.
2.2. Dosage des ortho-diphénols
Les o-diphénols sont les anti-oxydants les plus puissants (hydroxytyrosol, acide caféique…).
Différents étalons ont été utilisés en fonction des auteurs. Le tableau 4 donne les étalons utilisés, la
longueur d’onde de mesure et le domaine de variation des teneurs.
Tableau 4 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation
Réf.
Référence
Étalons
[27]
[49]
[50]
[51]
[14]
Gutfinger, 1981
Ranalli 1997
Mateos, 2001
Salvador, 2001
Blekas, 2002 (méthode A)
[14]
Blekas, 2002 (méthode B)
[45]
[47]
Gomez-alonso, 2002
Bendini, 2003
λ mesure
nm
350
Ac. caféique
Ac. caféique
Ac. caféique
Ac. caféique
Ac. 3,4-di OHPhénylAcé
Ac. caféique
Ac. 3,4-di OHPhényl Acé
Ac. caféique
Ac. gallique
7
370
370
350
450
350
450
370
370
Teneurs en
o-diphénols (mg/kg)
5-15
61-194
7,8 ± 5,5
7-24
42-168
12-186
6-87
6,45-9,07
66,7-90,0
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Les deux méthodes les plus utilisées ont été étudiées. Ces méthodes d’après la littérature seraient
spécifiques des o-diphénols.
La méthode A est basée sur la formation de complexes entre les o-diphenols et les ions molybdate,
Les o-diphénols réagissent avec le molybdate pour former un complexe jaune.
La méthode B est basée sur la nitration des o-diphénols avec le nitrite de sodium en présence d’ions
molybdate. Ces derniers augmentent l’intensité de la couleur des dérivés nitrés probablement par
formation de complexes.
Le tableau 5 rassemble les différentes conditions analytiques de ce dosage.
Tableau 5 : Conditions de la réaction de dosage des o-diphénols.
Réf. Huile Extrait
Prise
Eau Phosphate Na2MoO4 Temps
λ
départ MeOH
essai
pH=6,5
5%
Min
g
ml
ml
ml
0,1 M, ml
ml
nm
[27]
10
1
0,2
1
1
2
15
350
[49]
np
[50]
2,5
101
4
1
15
370
[51]
370
[14]
30
22
0,2
1
1
2
350
[14] 3
30
22
0,2
1
450
[45]
370
[47]
370
1
MeOH/H2O (1/1) ; 22ml fraction polaire dans 5 ml méthanol puis ajusté à 25 ml avec H2O
3
méthode B différente basée sur la nitration en présence de molybdate
3. Matériels et méthodes
3.1. Les échantillons
Les analyses ont porté sur :
- Une huile d’olive vierge d’origine espagnole ;
- Une huile monovariétale de Picholine a été conservée au laboratoire à différentes
températures (- 18°C, +4°C et T°C ambiante) depuis 2001 et à l’abri de la lumière, les
analyses ont été effectuées après 36 mois de stockage;
- Quatre huiles issues d’olives de la variété Tanche à des états de maturité différents ;
- Deux huiles mono-variétales (Bouteillan et Salonenque) en vue de déterminer des profils
spécifiques.
3.2. Dosages absorptiométriques
¾ Extraction des composés phénoliques
10 g d'huile d'olive (à 0,01 g près) et 10 ml de solution méthanolique (méthanol/eau; 80/20, v/v)
sont placés dans un tube à centrifuger.
On agite pendant 10 minutes au Vortex. Après centrifugation, pendant 15 min à 3800 rpm, la phase
méthanolique est récupérée et transférée dans une fiole jaugée de 50 ml. L’opération est reconduite
2 fois et on complète au trait de jauge avec la solution méthanol/eau (80/20).
¾ Dosage absorptiométrique Folin-Ciocalteu
Une solution mère de tyrosol (Extrasynthèse, 4834) à 1mg/ml dans le mélange méthanol/eau (80/20,
v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles à 10, 20, 80 et 200 µg/ml. À 2 ml de solution
extraite sont ajoutés 5 ml d’eau distillée, 1 ml de réactif et 5 ml d’une solution aqueuse de Na2CO3
(à 10%, p/v). Après agitation, la solution est laissée à l’obscurité avant la mesure de l’absorbance à
750 nm. Des quantités de réactifs de 1 à 5 ml de réactifs ont été utilisées, des temps de contact de
8
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30, 60 et 90 min ont été utilisés. Le dosage a été ensuite réalisé avec 2 autres étalons l’acide
syringique (Fluka, 86230) et l’acide 4-hydroxyphénylacétique (Fluka, 56140).
¾ Dosage absorptiométrique des ortho-diphénols à partir de la méthode A [14, 50]
Une solution mère d’acide caféique (Extrasynthèse, 6018) à 2,617 mmol-1 dans le mélange
méthanol/eau (1/1, v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles comme définies dans le tableau
6. À 2 ml de solution extraite sont ajoutés 0,5 ml d’une solution de molybdate de sodium dihydraté
(à 5%, p/v, dans un mélange éthanol/eau, 1/1, v/v). Le mélange est agité vigoureusement et après 15
minutes, l'absorbance des solutions phénoliques est mesurée à 370 nm. On observe une coloration
jaune plus ou moins intense.
Tableau 6 : Solutions étalons
Sol. mère d'acide caféique (ml)
Volume fioles jaugées (ml)
Sol. méthanolique (1:1)
Concentration en acide caféique
(10-3 mmol.l-1)
E1
0,4
20
52,33
E2
E3
E4
1
2,1
3,2
20
20
20
Compléter au volume
130,83
274,75
418,67
E5
4,2
20
549,51
3.3. Dosage par chromatographie liquide
¾ Extraction des composés phénoliques [50]
On introduit 2,5 g d'huile dans un ballon auquel on ajoute 200 µl de chaque solution étalon (acide
para-hydroxyphénylacétique dans MeOH à 4,64.10-2 mg/ml et/ou de l’acide syringique à 9,6.10-3
mg/ml). On évapore au rotavapor à une température inférieure à 40°C le solvant de l’étalon. On
reprend le résidu dans 6 ml d'isooctane pour passage sur SPE.
¾ Extraction sur phase solide (SPE) [50]
L’extraction est réalisée avec une cartouche de phase diol Supelclean LC-DIOL (500 mg/3ml)
SUPELCO (greffage polymérique: 2,3-dihydroxypropoxypropyl (7% C)). On conditionne les
cartouches avec 6 ml de méthanol puis 6 ml d'isooctane. On élue l’extrait précédent, puis on lave
une 1ére fois avec 2×3 ml d'isooctane, puis une 2e fois avec 4 ml d'un mélange d'isooctane/acétate
d'éthyle (90/10, v/v). L’élution des composés phénoliques s’effectue avec 10 ml de méthanol que
l'on transfère dans un ballon conique. On évapore à sec à une température inférieure à 40°C. Le
résidu est extrait avec 100 µl de méthanol/eau (1/1, v/v) à 40°C.
On injecte 10 µl de la solution obtenue.
¾ Analyse par chromatographie liquide [52]
L’analyse de la fraction phénolique est réalisée sur une chaîne Lachrom (MERCK). Le solvant
d’élution est un gradient binaire A= H2O/ CH3COOH (98/2, v/v), B= CH3OH/CH3CN (50/50, v/v)
suivant un gradient dont les conditions sont reprises dans le tableau 7. L'appareil utilisé est un
système avec un détecteur spectrophotométrique UV2000 (Spectra-Physics) fonctionnant à 2
longueurs d’onde. Le système de séparation est un ensemble de deux colonnes ChromolithTM
Performance RP-18e MERCK (4,6 mm x 100 mm) montées en série précédé d’une pré-colonne
ChromolithTM Guard Cartrridge RP-18e MERCK (4,6 mm x 5 mm). L’analyse est réalisée a un
débit constant de 4 ml/min.
9
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Tableau 7 : Gradient d'élution
Temps
A (en %)
B (en %)
0
95
5
6
90
10
30
60
40
35
50
50
37
0
100
40
0
100
42
95
5
45
95
5
4. Résultats-Discussion
4.1 Étude des conditions expérimentales du dosage absorptiométrique selon Folin-Ciocalteu
4.1.1 Influence du temps de contact et des quantités de réactifs
La figure 4 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de
contact avec le carbonate de sodium en présence de 0,5 ml de réactif de Folin et 1 ml de Na2CO3 (à
7,5%, p/v).
Etalonnage TYROSOL
0,35
T = 9 0 min
0,3
0,25
T = 6 0 min
0,2
0,15
T = 3 0 min
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
T eneur en p p m
Figure 4 : Variation de l’absorbance à 765 nm en fonction du temps de contact des réactifs
Le complexe coloré est vert. On constate qu’il n’y a pas linéarité des réponses en fonction de la
teneur en tyrosol et cela quel que soit le temps de contact à l’obscurité avec le carbonate de sodium.
La figure 5 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de
contact avec le carbonate de sodium et une augmentation de la quantité des réactifs à savoir 1 ml de
réactif de FC et 5 ml de Na2CO3 (à 7,5%, p/v).
L’augmentation de réactifs permet d’obtenir la linéarité de la réponse à partir d’un temps de contact
de 60 min Cette durée correspond au temps moyen de la plupart des méthodes décrites dans le
tableau 3.
10
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Etalonnage TYROSOL
1,20
T = 9 0 min
1,00
T = 6 0 min
0,80
0,60
T = 3 0 min
0,40
0,20
0,00
0
50
100
150
200
T eneur en p p m
Figure 5 : Variation de l’absorbance à 765nm en fonction du temps de contact et après augmentation de la
quantité des réactifs.
4.1.2 Influence du choix de l’étalon pour établir la courbe de calibration
Figure 6 : Influence du choix de l’étalon
Courbe d'Eta lonna ge Ré a ctif de FOLIN-CIO CALTEU
1,4
A c id e 4 - hyd r o xyp hé nyla c é t iq ue
y = 0,0061x + 0,0309
1,2
Absorbance
1
T yr o s o l
y = 0,0059x - 0,0159
0,8
0,6
A c id e S yring iq ue
y = 0,0038x + 0,0054
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
T e n e u r e n m g /l
La figure 6 montre l’influence du choix de l’étalon sur la réponse. Les réponses diffèrent en
fonction de l’étalon choisi.
La tendance actuelle des négociants est de demander une valeur minimale en phénols totaux aux
producteurs. Cette étude montre que cette exigence doit être associée à un protocole précis
d’analyse de la teneur en phénols spécifiant la nature de l’étalon utilisé
Nous proposons d’utiliser le tyrosol comme étalon car d’une part il donne une réponse satisfaisante
avec le réactif de FC et d’autre part parce qu’il est un des constituants de la fraction phénolique
dans les huiles d’olive alors que celles-ci ne contiennent ni l’acide 4-hydroxy phényl acétique ni
l'acide syringique.
4.2 Analyse chromatographique
La figure 7 montre un chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge.
L’identification des différents pics a été réalisée à l’aide de composés de référence (tyrosol,
vaniline, ac. vanillique, ac. caféique, ac. p-coumarique, ac. férrulique, quercétine, lutéoline) et par
rapport aux données de la littérature [45, 47, 50, 53,54]. Certains composés n’ont pas été identifiés
11
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tandis que d’autres n’ont pas une identification certaine en raison de l’absence de composés de
référence.
Figure 7 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge d’origine espagnole (étalon 1 :
ac. syringique, étalon 2 : ac. 4-hydroxy phényl acétique)
4.2.1 Influence des conditions de stockage sur la teneur en phénols d’une huile d’olive
(Picholine)
La figure 8 montre les variations des principaux phénols d’une huile de Picholine conservée à trois
températures différentes pendant 36 mois.
90.00
T ambiante
80.00
4°C
Teneur en mg/Kg
70.00
-18°C
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
+F
W
e
S ni n
+
é
ig
R
Ap
+
O
l
no
si
ré
N
no
pi
)(+ lin e
o
té
Lu
e
K éti n
rc
ue
+E
Q
G
D
C ol
ol
s
os
ro y r
Ty x yt
ro
yd
H
Figure 8 : Évolution de la composition phénolique d’une huile de Picholine en fonction des conditions de stockage,
détermination effectuée par HPLC.
Les phénols évoluent différemment suivant leur nature :
- L’hydroxytyrosol et le tyrosol augmentent en fonction de l’élévation de la température de
stockage ;
- Les phénols complexes (C et D notamment) diminuent lorsque la température de stockage
augmente.
12
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Lors du vieillissement des huiles, les phénols complexes (secoïridoïdes…) se décomposent en
libérant de l’hydroxytyrosol et du tyrosol.
L’hydroxytyrosol est un anti-oxydant qui protège l’huile de l’oxydation.
Dans une huile fraîche et non dégradée, les teneurs en hydroxytyrosol et en tyrosol sont très faibles
car ils se trouvent principalement sous forme complexe (secoïridoïdes) et très faiblement sous
forme libre.
Les phénols totaux des trois échantillons de l’huile de Picholine, déterminés par la méthode de FC
et par HPLC, sont comparés figure 9. La méthode de FC donne des résultats toujours très supérieurs
à la méthode HPLC.
Les deux méthodes donnent des résultats qui varient peu avec la température toutefois la figure 8
montre des variations quantitatives entre les différents phénols.
En conclusion, si l’analyse des phénols totaux permet d’approcher le potentiel anti-oxydant d’une
huile, seule une analyse par HPLC permettra d’évaluer sa capacité à la résistance à l’oxydation.
Teneur en phénols totaux
en mg/kg
600
500
400
Folin-Ciocalteu
300
HPLC/UV
200
100
0
Tamb
4°C
-18°C
Figure 9: Évolution de la teneur en phénols totaux en fonction des conditions de stockage et de la méthode de dosage.
4.2.2 Influence de la maturité des olives de la variété Tanche sur la teneur en phénols des
huiles
La figure 10, montre les résultats des dosages des phénols totaux selon FC et des o-diphénols
déterminés par absorptiométrie sur quatre échantillons d’huiles provenant d’olives de la variété
Tanche. Ces résultats sont comparés aux teneurs en phénols totaux et en ortho-diphénols déterminés
par HPLC.
En ce qui concerne les phénols totaux, déterminés selon FC, les quatre échantillons présentent des
teneurs qui varient en sens inverse de celles déterminées par HPLC.
Les variations observées peuvent être dues à la différence de maturité des olives. Plus la maturité
des olives augmente, plus la teneur en phénols déterminée par HPLC diminue ce qui est en accord
avec la littérature. Le fait que la teneur en phénols, déterminée par FC, augmente montre qu’il y a
formation de composés secondaires d’oxydation qui réagissent avec ce réactif dans les conditions
précédemment décrites.
En ce qui concerne les o-diphénols, les dosages par absorptiométrie ou par HPLC donnent des
teneurs faibles mais du même ordre de grandeur. Ces déterminations qui présentent peu de
variation, ne sont pas très significatives pour évaluer l’état de maturité des olives.
13
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300
Teneurs en mg/kg
250
Phé nols par
Folin-Ciocalte u
200
Phé nols totaux
par HPLC
150
O -diPhé nols par
colorimé trie
100
O -diPhé nols par
HPLC
50
0
Ech 1
Ech 2
Ech 3
Ech 4
Figure 10 : Évolution des différentes fractions phénoliques en fonction de la maturité des olives (Tanche).
4.2.3. Caractérisation d’une huile par son profil chromatographique
La figure 11 montre l’analyse de la fraction phénolique par HPLC d’une huile de la variété
Bouteillan qui a une teneur en phénols totaux importante (349 mg/kg). Cette teneur a été déterminée
par étalonnage interne en chromatographie liquide. On constate que cette huile a un fort potentiel de
conservation. En effet, c’est une huile qui possède un important pouvoir anti-oxydant car elle
contient beaucoup de phénols dits « complexes » (temps de rétention des composés entre 16 et 32
min).
Figure 11 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Bouteillan.
D’autre part, cette huile est peu oxydée car les teneurs en tyrosol et en hydroxytyrosol sont faibles (
temps de rétention entre 1 et 6min).
En revanche, nous pouvons remarquer sur la figure 12 que l’huile de la variété Salonenque
analysée, a subi une oxydation importante puisque sa teneur en phénols totaux est faible (118
mg/kg)
14
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Salonenque
Phénols totaux:
117,90 mg/kg
Figure12 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Salonenque.
De plus, les teneurs en tyrosol et hydroxytyrosol sont importantes par rapport aux taux des phénols
complexes. Cette huile peut être issue d’olives trop mûres, d’un stockage des olives avant trituration
trop important ou de mauvaises conditions de stockage de l’huile.
Conclusion
Les méthodes absorptiométriques d’analyse de la fraction phénolique des huiles peuvent apporter
des informations sur le potentiel anti-oxydant aux producteurs, aux négociants à des coûts
intéressants. Il convient de prendre avec circonspection les résultats issus de ces mesures tant que
ces méthodes ne seront pas normalisées tant d’un point de vue méthodologique que d’un point de
vue de l’expression des résultats.
Les résultats préliminaires concernant le dosage de la fraction phénolique par HPLC permettent de
montrer qu’en plus d’une teneur totale en phénols, on peut observer le "potentiel antioxydant de
l’huile" par la présence de phénols dits complexes alors que souvent le potentiel anti-oxydant d’une
huile n’était évalué qu’à partir de composés simples comme le tyrosol et l’hydroxytyrosol qui sont
en fait des composés secondaires, anti-oxydant, déjà issus d’une dégradation de l’huile.
Remerciements à Frédérique Franceschi et Muriel Richard pour leurs collaborations techniques.
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