REVERSE TRANSCRIPTION AVEC DIGESTION A LA DNase

REVERSE TRANSCRIPTION AVEC DIGESTION A LA DNase
Précautions à prendre pour manipuler les ARNs :
Toujours travailler sur la glace
Utiliser des solutions stériles, de l’eau DEPC ou spéciale bio mol (RNase/DNase free)
Travailler dans les conditions les plus stériles possible !!
1/ digestion à la DNase : ARNs ajustés à 1ug/ul : travailler sur la glace
first strand buffer 5x (Invitrogen)
Dnase (10 U/ul-Roche)
H2O Rnase/Dnase free
ARN (1ug/ul)
pour une réaction :
2 ul
0,2 ul
Distribuer 9 ul/puits
6,8 ul
1 ul
10 ul final
30 min à 37°C
ajouter 1 ul d’EDTA 20 mM pH8 stérile pour stopper la réaction (ou du RQ1 DNase Stop
Solution)
10 min 65°C
refroidir immédiatement dans la glace
2/ reverse transcription : travailler sur la glace
ajouter 3 ul/puits du mix suivant :
random hexamer (7) 250ng/ul
H2O Rnase/Dnase free
ARN traités à la DNase précédemment
pour une réaction :
1 ul
2 ul
Distribuer 3 ul/puits
11 ul
14 ul final
10 min à 70°C
refroidir immédiatement dans la glace
ajouter 6 ul/puits du mix de RT :
first strand buffer 5x (Invitrogen)
DTT (100mM Invitrogen)
Mix dNTPs 10mM final de chaque
SS II RT(200 U/ul)
pour une réaction :
2 ul
2 ul
Distribuer 6 ul/puits
1 ul
1 ul
6 ul final
10 min à 25°C
60 min à 42°C
15 min à 70°C
refroidir immédiatement dans la glace et conserver à -20°C