D DO VA OSS ALID IER DAT R DE TIED E V DO VAL OSS IDA IER

C O D A - C E R V A-TE
ERVUREN
N
Leuvense
esteenweg 17 - B 3080 T
Tervuren
PRO
O/5.4/02/D
DOC01/V04
VA
ALID
DATTIED
DO
OSSIER
R
DO
DOSSIER
R DE
E VAL
V IDA
ATIO
ON
N
Détermi
D
nation de
d l’ochrratoxine A dans les rogn
nons, foiie et bou
udin noir
graphie liquide ccouplée à une spectrom
métrie de
e masse
par chrromatog
(UPPLC/MS-MS)
SOP/M
MYC/A
ANA/08
12//10/2012
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
PRO
O/5.4/02/D
DOC02/V01
HISTTORIEK VAN
N DE VALID
DATIEDOSSIIER / HISTO
ORIQUE DU DOSSIER D
DE VALIDAT
TION
SOPP/MYC/ANA
A/08
DATUM
M / DATE
Juin – Août 201
11
FASE – WIJZ
ZIGING / PH
HASE - MODIFICATION
Expé
érimentation pilote avec ccolonne de purification (SPETM
OAS
SIS et IAC colonne d’immuunoaffinité OchraTest
O
d
de
VICA
AM) avec des échantillonss de Rognonss, foie et filet de
porc (Méthode de
e la littératurre).
Expé
érimentation pilote sans ccolonne de purification
p
p
pour
UPLC
C/MS-MS (test avec chlorroforme, Acé
étate d’éthyle
e et
méth
hanol) avec des
d échantilloons de Rogn
nons, foie et filet
f
de porc.
(Opttion choisie: Extraction auu chloroform
me)
Sep
ptembre – Décembre 201
11
Test de récupé
ération et de répétab
bilité avec des
écha
antillons de Rognons
R
et dee foie
Test de récupéra
ation avec ddes échantillo
ons de boud
dins
noirss (ingrédientss : viande d e porc 35% ; sang de porc
p
8% ; boyyau de porrc ;
30% ; poumonss de porc
épice
es…)
Jan
nvier 2012
Etude de l’interfférence des matrices : effets matriices
avecc Blanc et extrraits de rognnons, foie et boudins
b
noirss
Test de répétabiliité instrumenntale
Févvrier – Mai 2012
Test de récupé
ération et de répétab
bilité avec des
écha
antillons de boudins
b
noirss
Reprises
R
des tests de réccupération ett de répétab
bilité
avec
a
des éch
hantillons dee Rognons et
e de foie ett de
boudins
b
noirss
Colle
ecte d’échantillons de roggnons, de foie et de boud
dins
noirss sur le marché en Belgiq ue
Juin – Août 201
12
Broyage, extraction et analysse des échan
ntillons collecctés
(app
plication en ro
outine)
No
ovembre – Dé
écembre 201
12
Réda
action du dosssier de validdation (1ère ve
ersion)
Jan
nvier – Marrs 2013
Finalisation de la
a rédaction d u dossier de validation
05//03/2013
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
PRO
O/5.4/02/D
DOC03/V01
VALIDATIEP
PARAMETERRS / PARAMETRES DE VALIDATION
V
N
SOPP/MYC/ANA
A/08
1. Spécificité
Less concentratiions d’ochra
atoxine A on
nt été déterm
minées par analyse
a
des chromatograammes et au moyen de
e la
cou
urbe d’étalo
onnage de l’’ochratoxine A conforméément aux exigences
e
spécifiques dee l’uniformité
é des temps de
rétentions (vale
eur absolue) et des rapports d’ions ( ion ratio). En
n effet, l’och
hratoxine A ((OTA) apparait toujours aux
tem
mps de réten
ntion variant entre 2,593 – 2,634 min
nutes, sans qu’aucune
q
interférence dee pics ne soit observée pour
p
les extraits de rognon, foie et boudins noirs (Annexxe 1). Le tableau 1 prése
ente les valeuurs moyenne
es des tempss de
rétention obten
nus en compa
araison aux valeurs
v
des s olutions stan
ndards d’OTA
A.
Table
eau 1: Valeu
urs moyenness ± Std (CV%
%) des temps de rétention (en minutes)) pour la déte
ection de l’O
OTA
dan
ns les solution
ns standard d
d’OTA et les extraits de re
eins, foie et bboudin noir
Injection 1
Sta
andards
Re
eins
Fo
oie
Bo
oudins)
2,618 ± 0,0
005
2,616 ± 0,0
009
2,617 ± 0,0
008
2,623 ± 0,0
007
Injection 2
2,6
618 ± 0,009
9
2,6
621 ± 0,007
7
2,6
614 ± 0,006
6
2,6
613 ± 0,006
6
De
e façon satisffaisante, les coefficients de variation ne dépasse
ent pas 0,3 %.
% En outre, la fragmentation de l’O
OTA
(m/z 404,178) donne deuxx produits io
oniques (m/zz 358,022 ett 238,9) don
nt les rapporrts d’intensité
és sont résum
més
dans le tableau
u 2.
Table
eau 2: Valeurrs moyennes (CV %) des rrapports d’in
ntensité des 2 adduits prov
ovenant de la fragmentation
de
e l’OTA dan
ns les solutions standard d’OTA et less 3 matrices.
In
njection 1
Standards
Reins
Foie
Boudins
Injecction 2
*
0,4
482 (9,6%)
0,5
503 (9,1%)
0,5
513 (13,7%)
0,4
482 (6,9%)
0,533 (14,2%)
0,522 (10,7%)
0,525 (17,0%)
0,469
9 (9,6%)
*
: Valeur moyyenne (coeffiicient de variation)
Il est
e à noter q
que les CV ne dépassen
nt pas le seu
uil de 20% (Tableau
(
3) fixé par la ddécision de la commissio
on
européenne (20
002/657/CE
E). En outre, aucune
a
tracee d’un autre pic
p n’a été dé
étectée dans la zone d’élution de l’OT
TA
dans les matricces non conta
aminées «bla
ancs» de reinss, foies et bo
oudins noirs.
Tableau 3 : Tolérances maximales a
admissibles pour
p
les inten
nsités ioniquees relatives.
Intensité relative
>50%
%
>20%
% - 50%
>10%
% à 20%
<=10
0%
*
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: 2002/657//CE.
CL-SM*
(Variation relative des intensités))
± 20%
± 25%
± 30%
± 50%
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REN
2. Robustesse
La méthode an
nalytique com
mprenant pe
eu d’étapes manuelles est applicable
e sans modiffication aux échantillons de
reins, de foie et de boudins noirs. Elle est relativvement simplle et ne présente aucunne étape de purification sur
collonne à phase solide (SP
PE) ou d’imm
munoaffinité (IAC), ni de dérivatisation. Les sourcces d’incertitu
udes pertinen
ntes
découlent des vvariations de
e reproductib
bilité de l’extrraction, des mesures parr UPLC/MS-M
MS et de l’am
mpleur de l’e
effet
ma
atrice suppre
ession ou ren
nforcement des
d signaux, de l’hétérog
généité éventuelle de disstribution de l’OTA dans les
éch
hantillons ou
u de la stabilité des standa
ards d’OTA u
utilisés.
3. Linéarité et courbe de ca
alibration
3.1
1 Linéarité da
ans les solutions standard
ds
Le RIKILT Test (V
Van Trijp & Roos,
R
1991) a été utilisé pour vérifier la linéarité des
d réponsess aux injections de standa
ards
d’O
OTA (ng/ml).. Le Tableau 4 en présentte un exemp le.
Table
eau 4 : Linéa
arité des répo
onses (aires) aux injection
ns des solutio
ons standardss d’OTA
Concen
ntration
d’OTA (ng/mL)
(
(C
Ci)
Surfaces
S
de
ré
éponses (Yi)
Réponsess
normalisées
(Ri=Yi/Ci)
Ecart à la
moyenne
(Ei=Rii-M)
Dééviations
reelatives
((Ei/M)
0,,1 0,2
26 0,,5 1
1 1,2
25 2,,5 5
5 257,5 754,9 1365,6 2559,8 3509,9 6942,7 12880,7 2575 2903 2731 2560 2808 2777 2576 2703 ‐129 199
9 27
7 ‐145 104
4 73
3 ‐128 ‐‐4,8% 7,4% 1,0% ‐‐5,3% 3,8% 2,7% ‐‐4,7% Moyen
nne (M)
Less déviations o
observées da
ans ce tablea
au ne dépasssent pas le se
euil de 10% fixé
f par le teest de RIKILT et confirmen
nt la
bonne linéarité
é des réponses obtenuess en fonctio n des conce
entrations de
es standardss. La régresssion linéaire est
utilisée pour éla
aborer la courbe de calib
bration. Il esst à noter cep
pendant qu’u
une variationn intra-journa
alière (CVpentees =
6,3
3%) existe en
ntre 2 séries préparées au cours de la
a même jourrnée (Figure 1). La figuree 2 illustre la
a variation interjou
urnalière (CV
Vpentes = 4,8%
%) observée entre deux sérries obtenuess en 2 différe
ents jours.
bration des sttandards mo
ontrant
Figure 1: Courbes de calib
la variation intra-journalière
Fig
gure 2: Courrbe de calibraation des standards monttrant
la variation innter-journaliè
ère
our les conceentrations tesstées de 0,1 – 5 ng/mL dde solution standard,
s
ce qui
La courbe de ccalibration esst linéaire po
corrrespond à u
une gamme de concentra
ation allant d
de 0,4 à 20
0 μg OTA/kg dans des écchantillons de
d rognon, fo
oie,
boudin noir. C
Cette variation
n découlant des prépara
ations de stan
ndards reste acceptable (< 10%) ma
ais constitue par
ailleurs une sou
urce d’incertiitude de mesure.
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REN
3.2
2 Linéarité da
ans les différrentes matrice
es
L’é
étude de la llinéarité dan
ns les extraitss de matricee a permis d’évaluer
d
les l’effet des innterférences matricielles.. Le
déttail de la pro
océdure utilisée a été préssenté en Ann
nexe 2.
La figure 3 pré
ésente les co
ourbes d’étalonnage réa
alisées dans les 3 extraits de produitts animaux comparées
c
à la
cou
urbe de référrence «Blanc»». Cette comparaison révvèle l’existencce d’effets ma
atrices (Tableeau 5).
Figure 3: Courbes d’étalonnage réalisées
r
dan
ns les extraitss de reins, foiie et boudinss et dans le so
olvant (blanccs)
Tableau
T
5: E
Evaluation de
es SSE (Signa
al Suppressio
on or Enhanccement) caracctérisant l’exiistence des effets
e
matrice
es
Pentes
Foie
Reinss
Boudin noir
Blancc
*
**
3582,2 ±
3317,5 ±
2718,9 ±
2482,3 ±
63,3
41,2
29,6
41,0
SSE
S * ± s.e %
145 ± 3,0 %
134 ± 2,3 %
110 ± 2,0 %
100
1 ± 1,7%
fets matrrices**
++
++
+/Basee
: SSE=
=Signal Suppression or Enhanccement
: +/-: Effet non significatif, ++ : Efffet très significatif
Less pentes obte
enues pour les
l matrices animales pa
ar régression
n linéaire ontt été rapporttées à celle obtenue
o
avecc le
sollvant (MeOH
H:Eau) servan
nt de référencce. Le calcul des valeurs de SSE («Sig
gnal Suppresssion or Enha
ancement») (vvoir
Equation (1) et les résultats consignés dans
d
le Tableeau 5) ont pe
ermis d’observer que les extraits issuss des reins ett du
foie présententt des effets matrices
t au boudin , pour leque
m
sign
nificatifs (SSEE > 110%) contrairemen
c
el cet effet re
este
anecdotique (entre 100 et 110%).
1
SSE =
%
(Equation 1)
Ce
es résultats pe
ermettent de conclure que les matricees reins et foies induisent des effets dee renforcement des signau
ux
qui préservent ttout de mêm
me la linéarité
é des réponsees.
4. Limite de détection et
e de quanttification
La limite de détection (LOD
D) et la limite de quantificcation (LOQ) ont été déterminées à paartir des bruiits de fonds (BF)
(
d’é
échantillons non contam
minés (blancs). Plusieurss échantillons blancs on
nt été injecté
tés. Le table
eau 6 prése
ente
l’esstimation dess LOD et LOQ calculées en multiplian
nt le signal/B
BF respectivem
ment par 3 eet par 6.
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
Table
eau 6 : Valeu
urs estimées des limites de
d détection et
e de quantifiication
Reins
Foie
Boudin noir
LOD
(ng/kg)
173
LO
OQ
(ng
g/kg)
346
3
Limite
L
de rappportage
(ng/kgg)
350
93
221
186
442
4
200
450
Répétabilité et reproducctibilité intra
a laboratoire
e
5. Fidélité : R
entale
5.1 Répétabiliité instrume
En injectant de
eux fois les mêmes
m
blanccs (solutions de standard
ds d’OTA) et extraits de rreins, foies et
e boudins noirs
con
ntaminés en OTA (voir expérimentati
e
ion des effetts matrices), l’évaluation de la répétaabilité instrum
mentale illusttrée
par la Figure 4 révèle que la variabilité
é des mesurees MS-MS ten
nd vers < 6%
% pour des cconcentration
ns supérieure
es à
0,5
5 ng OTA/ml (2 ng OTA//g de produiit) mais attein
nt 12% pourr des concenttrations plus faibles <0,5
5 ng/mL. Tou
utes
les injections d’’extrait ont étté effectuées en doubles a
afin de dimin
nuer l’incertittude liée à ceette étape.
Figure
e 4: Evolution d
des coefficientss de variation de deux injections des mêmes eextraits dopés La répétabilité des mesuress, surtout à fa
aible concenttration est co
ompensée pa
artiellement ppar des injecctions en dou
uble
et est
e aussi incluse dans l’esstimation de l’incertitude de mesures.
2 Répétabiliité et reprod
ductibilité in
ntra laborato
oire
5.2
La déterminatio
on de la répé
étabilité et de la reprodu
uctibilité est fa
aite sur la ba
ase des expéériences de validation
v
3x3
3x3
analyses d’échantillons de rognons, foie ou de bou
udins noirs dopés à 0,5 x LMA, 1x LM
MA et 1,5 x LMA pendan
nt 3
jou
urs.
Par défaut d’un
ne réglementtation en vigu
ueur, les essa
ais ont été efffectués en te
enant comptee des propossitions de lim
mites
ma
axima tolérée
es ou autoriisées (LMA) pour les co ntaminationss en ochrato
oxine A danss les triperie
es. En cours de
disscussion à la Commission
n européenn
ne, ces limitees sont de 2--5 μg/kg pou
ur les produiits animaux à base de sa
ang
(tel que les bou
udins noirs) et
e de 5-15 μg/kg pour lees triperies (rrognons, foie
es). Les essaiss sont basés sur les valeu
urs1
de 10 μg/kg po
our les rogno
ons et les foie
es et 5 μg/kg
g pour les bo
oudins noirs.
1
: La limite maxim
male acceptable
e est fixée à 10 μg/kg
μ
pour le fo
oie de porc par les autorités en charge de la séécurité sanitaire au Danemark et
e en
Esto
onie, à 5 μg/kg pour les reins, foie et viande en
e Roumanie ett Slovaquie et 1 μg/kg dans les viandes et prodduits dérivés en Italie (Duarte et
e al.
201
10 ; Duarte et a
al., 2013).
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REN
La détermination de la ré
épétabilité et de la rep roductibilité utilise les critères
c
de pperformance RSDr < RS
SDR.
Co
oncernant la
a reproductib
bilité des fra
actions pon dérales infé
érieures à 100 μg/kg, l’application
n de l’équattion
d’H
Horwitz (CV = 2(1-0,5logC)) donne
d
des va
aleurs élevéees inadmissib
bles. Par conséquent, il esst stipulé que
e les CV doivvent
être aussi bas q
que possible (CV Répétab
bilité intra lab
boratoire < CV
C Reproductibilité (CVR) corresponda
ant à 0,5*LMA
A).
Le tableau 7 ré
écapitule les résultats
r
obte
enus et l’Ann exe 3 présen
nte le détail des
d traitemennts statistiques des donnée
es.
Tableau 7 : Répétabilitté et reproductibilité intra laboratoire
Co
oncentrations
nominales Mesurée
es
(μg/kg
g)
Moyenne
es
(μg/kg)
Re
eins
Fo
oie
Répétabilité et reproductibilité
r
intra-laboratoire
i
e
Estimée (Ho
orwitz)
%
2x
2x
2x
2x
2x
2x
Sdays
Srw
Srrw
S(R)
S(rw)
S
Srepl
(μg/kg)
2x
2x
Srepl
Sjours
Estimée (Horwitz)
2x
2x
S(R)
S(rw)
5
4,4
1,0
0,0
1,,0
2,2
1,5
22,2%
%
0,0%
222,2%
44,0%
%
29,3%
10
0
9,3
1,8
0,5
1,,8
4,4
2,9
18,9%
%
5,2%
119,6%
44,0%
%
29,3%
15
5
15,2
3,2
0,0
3,,2
6,6
4,4
20,8%
%
0,0%
220,8%
44,0%
%
29,3%
5
4,4
1,3
0,0
1,,3
2,2
1,5
28,8%
%
0,0%
228,8%
44,0%
%
29,3%
10
0
9,7
1,7
0,5
1,,8
4,4
2,9
18,1%
%
5,4%
118,8%
44,0%
%
29,3%
15
5
13,9
3,0
1,3
3,,2
6,6
4,4
21,3%
%
9,3%
223,3%
44,0%
%
29,3%
Bo
oudins
2,5
5
2,0
0,5
0,3
0,,5
1,1
0,7
22,4%
%
13,5%
226,2%
44,0%
%
29,3%
noirs
n
5
4,3
1,2
0,4
1,,2
2,2
1,5
27,1%
%
8,3
228,4%
44,0%
%
29,3%
7,5
5
6,1
0,9
0,7
1,,2
3,3
2,2
15,4%
%
11,8%
119,4%
44,0%
%
29,3%
6. Récupérration
Less pourcentag
ges de récupé
ération ont été
é déterminéés par régresssion linéaire et les résultaats obtenus (Tableau
(
8) sont
s
tou
us dans les limites requise
es (70% à 11
10%) pour lees critères de performance
e du règlemeent 2002/65
57/CE. L’Annexe
3 présente
p
le détail des traittements statistiques des d
données.
Tableau 8 : Po
ourcentages de récupérattion
Rein
ns
Foie
e
Bou
udins noirs
LMA
(μg/kg
g)
Pource
entages de
récup
pération
Ordonnéee
à l’origine
R2
10
10
5
10
07,6%
94
4,5%
81,5%
-1,14
-0,12
0,03
0,9532
0,9297
0,9237
Un
n pourcentage de récupérration est systématiquemeent déterminé
é lors des analyses de rouutine et au co
ours des
con
ntrôles de 2ème, 3ème ligne
es inclus.
7. Justesse
e
Le manque de matériau de
e référence certifié à basee de produitss animaux (rognons, foiee, boudins no
oirs) contaminés
en ochratoxine A auprès de
es fournisseu
urs habituels (ERM, BIPE
EA, FAPAS, AOKIN,
A
BAM,, Sigma-Aldrrich, Biopure, Rbio
opharm, Alexxis biochemicals, Camprro, CFM) et ll’inexistence de test inter laboratoire ou collaboratif utilisant des
pro
oduits anima
aux ont rendu
u impossible la détermina
ation du biaiss de la métho
ode analytiquue.
8. Incertitu
udes de messures
L’A
Annexe 3 pré
ésente aussi le détail des traitements
t
sttatistiques do
onnant les incertitudes réssumées danss le tableau 10.
1
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
Tableau 10 : Incertitudes élargies
é
et ma
aximales
Re
eins
Fo
oie
Bo
oudins
noirs
(*)) u = sd
oncentrationss
Co
nominales
ntrations
Concen
mesu
urées
moye
ennes
μg/kg
5
10
15
5
10
15
2,5
5
7,5
μg//kg
4,40
9,30
15,16
4,45
9,65
13,90
1,99
4,25
6,07
(***) U = 2 sd
In
ncertitude (k = 1) (*)
μg/kg
0,49
0,91
1,58
0,64
0,91
1,62
0,26
0,60
0,59
%
11,1%
9,8%
10,4%
14,4%
9,4%
11,6%
13,1%
14,2%
9,7%
ncertitude élaargie
In
U, (k = 2) (***)
μg/kg
0,98
1,83
3,16
1,28
1,82
3,23
0,52
1,21
1,18
%
2
22,2%
1
19,6%
2
20,8%
2
28,8%
1
18,8%
2
23,3%
226,2%
228,4%
119,4%
Inccertitude maxximale
Um
max. (k = 2) (***)
μg/kg
μg
%
1,5
2,9
4,4
1,5
2,9
4,4
0,7
1,5
2,2
29,3%
2
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
2
29,3%
(***)) from modif. Ho
orwitz for Srw, HorRat
H
< 2x2/3
cfr Codex
x Alim - mth crite
eria - draft 14.2. 08
Pour chaque m
matrice une in
ncertitude com
mbinée est ccalculée à pa
artir des incerrtitudes de réépétabilité (va
aleur élevée des
inccertitudes sta
andards) et celles
c
pouvant être dérivvée de l’exacctitude par analyses
a
dess matériaux de
d référence
e. A
déffaut de l’exiistence de matériaux
m
de
e référence, un coefficie
ent de variattion de 10%
% a été utilissé. L’incertitu
ude
com
mbinée (k = 2) pour les rognons,
r
foie
e et boudins sont alors de
e 30%, 35% et
e 35% (Tableeau 11).
Tableau 11 : Inceertitudes com
mbinées (Précision + Justeesse)
Rognons
Foie
Boudins noirrs
Ureep
Ubiais
Ucombinée
0,11
11
0,14
44
0,14
42
0,1
0,1
0,1
0,149
0
0,175
0
0,174
0
Urep = incertitude
e répétabilité/rep
productibilité ; Ubiais = Incertitude de justesse
9.
Limite de décision (C
CCα) et capa
acité de déttection (CCβ)
La limite de décision (CCα) et la capa
acité de déteection (CCβ) n’ont de signification qque par rapp
port aux lim
mites
ma
aximales auto
orisées (LMA
A) en cours de discussion au niveau européen.
e
To
outefois, les vvaleurs utilisé
ées reposent sur
les valeurs déjà
à adoptées par les autorittés en chargee de la sécurrité sanitaire de certains ppays europée
ens. Les résultats
de CCα et de C
CCβ sont conssignés dans le Tableau 12
2.
Tableau
u 12 : Limites de décision
n et capacité de détection
n
Reins
Foie
Boudin no
oir
LMA
(μg/kg))
10
10
5
μg//kg
11,6
6
12,0
0
6,0
0
CCα
%LM
MA
116,3
12
20,3
12
21,2
μg/kg
13,3
14,1
7,1
CCβ
% LMA
132,9
140,9
142,8
10. Applica
ation en routtine avec des échantillonss commerciau
ux
ns a été fait suivi
s
de leur homogénéissation. Le Ta
ableau 13 prrésente les ré
ésultats obtenus
Le broyage dess échantillon
lorrs des analyse
es de routine
e portant sur 20 échantillo
ons de rogno
ons, 20 foies et 20 boudinns noirs.
05//03/2013
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
Tableau 13 : Teneurs* (n
ng/kg) en OTTA des échan
ntillons de reins, foies et bboudins noirss testés.
*
Echantillons
Reins
Foies
Bo
oudins noirs
1
411
ND
ND
2
548
ND
ND
3
461
ND
ND
4
ND
389
ND
5
364
ND
ND
6
ND
Traces
ND
7
351
ND
ND
8
ND
Traces
ND
9
Traces
ND
ND
10
ND
ND
ND
11
ND
ND
ND
12
ND
Traces
ND
13
Traces
ND
ND
14
ND
Traces
ND
15
ND
ND
ND
16
ND
Traces
ND
17
Traces
ND
ND
18
ND
ND
ND
19
Traces
ND
ND
20
ND
ND
ND
:
Les résultats ont été déjà corrrigés avec less pourcentag
ges de récupéération.
ND
D : concentra
ation < LOD
D ; Traces : LOD < concentrations < LOQ
L’a
analyse des é
échantillons a été faite en 2 répétitionss en considérant les critèrres suivants :
• Un résulttat inférieur à LOQ sera rendu en tan
nt que «< LO
OQ» ou tracess
• Pour dess échantillons dont les ré
ésultats des 2 répétitionss (>LOQ) so
ont inférieurss à CCα, la moyenne de
es 2
répétitions a été éta
ablie et l’écha
antillon est d
déclaré confo
orme
• Si le résu
ultat de l’une
e des répétitio
ons est égal o
ou supérieur au CCα alors cette analysse sera reprise
• Pour dess échantillons dont les ré
ésultats des 2 répétitions (>LOQ) sont supérieurss à CCα, la moyenne de
es 2
répétitions sera établie et l’écha
antillon est dééclaré non co
onforme
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
PRO
O/5.4/02/D
DOC04/V01
FA
ACTOREN D
DIE DE JUIST
THEID EN BETROUWBA
B
AARHEID VA
AN DE BEPR
ROEVINGEN
N BEÏNVLOEDEN
FACTEUR
RS QUI INFLLUENCENT L’EXACTITU
UDE ET LA FIABILITE
F
D ES ESSAIS
SOPP/MYC/ANA
A/08
1. UITRUSTING
G EN LABORA
ATORIUMMA
ATERIAAL / E QUIPEMENT
T ET MATERIE
EL DE LABORRATOIRE
E
Equipement et
e Matériel de
e Laboratoiree
Contrrôle
LLC/MS-MS*
Entrettien annuel + Entretien ppériodique
Injection QC
PPipettes
Contrrôlées en rou
utine
Étalon
nnage périod
dique
B
Balances
Contrrôlées en rou
utine
Étalon
nnage périod
dique
Contrrôle de poidss
V
Verrerie
Stand
dard + procé
édure de netttoyage
C
Congélateur//Réfrigérateur
Vérificcation quotid
dienne des teempératures
2. STALEN EN PRODUCTEN
N / ECHANTILLONS ET PPRODUITS
• L’hétérog
généité des échantillons
é
est
e contrôlée par un broyyage préalable suivie d’unne homogéné
éisation de to
out
l’échantillon.
• Les interfférences messurées par l’e
effet matrice sont corrigée
es par les éta
alons marquéés 13C.
• La justessse des étalon
ns est contrôlée par des ssolutions certifiées ou par mesures speectrophotométriques.
• L’eau Miilli Q est maîîtrisée via l’en
ntretien de l’a
appareillage
e (Millipore) et
e vérificationn journalière
3. PRINCIPE VA
AN DE METH
HODE / PRINC
CIPE DE LA M
METHODE
Less facteurs crittiques liés au
u principe de
e la méthodee sont la répé
étabilité des mesures, less interférence
es matricielles et
les variations iinstrumentale
es liées aux réponses du
u détecteur MS-MS. Pour les résultaats douteux, les échantillons
serront soumis à de nouvelle
es analyses.
4. OMGEVING
G / MILIEU AM
MBIANT
L’in
nfluence de ll’environnem
ment sur les étapes d’extra
action est nég
gligeable. Les solutions sttandards son
nt conservéess au
con
ngélateur pa
ar précautio
on. L’UPLC utilisé
u
est pllacé dans une
u
salle the
ermostatisée afin d’évite
er d’éventue
elles
perturbations d
des réponsess du détecteu
ur MS-MS sussceptible d’ê
être influencé
é par la temppérature du milieu ambia
ant.
La température
e de la salle est
e relevée.
5. PERSONEEL / PERSONNEL
Less étapes de p
préparation requièrent de
e la rigueur et la maîtrise
e des manipulations de bbase dans les laboratoire
es à
savvoir les pesé
ées, les dilutiions, les cen
ntrifugations ainsi que les respects de
es règles dee sécurité et de maintien de
pro
opreté dans les laboratoiires. En outre
e, la vérifica tion des résu
ultats requierrt de la rigueeur dans l’interprétation des
chrromatogrammes et de la maîtrise dess logiciels acccompagnants l’UPLC/MS-MS.
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
REFERENCES
1.
Comité
é Technique CEN/TC 27
75 du Com ité Européen
n de Norma
alisation (CE N). Produits alimentaire
es –
Biotoxin
nes – Critère
es des méthod
des d’analys e des mycoto
oxines. CR 13
3505. Bruxellles : CEN, 1999,
1
8 p.
2.
Commission des co
ommunautés européennees. Décision de
d la commisssion du 12 aaoût 2002 po
ortant modallités
d’appliication de la
a directive 96/23/CE
9
d u Conseil en
e ce qui co
oncerne les performance
es d’analyse
e et
l’interp
prétation des résultats. Jo
ournal officie l des Comm
munautés euro
opéennes, n°° 2002/657//CE du 17 août
a
2002, pp. 8-36.
3.
Commission des Communautéss Européennees. Règlemen
nt (CE) N°401/2006 de laa Commissio
on du 23 févvrier
2006 p
portant fixatio
on des mode
es de prélèveement d’écha
antillons et des
d méthodess d’analyse pour
p
le contrrôle
officiel des teneurs en mycotoxines des den rées alimentaires. Journa
al officiel de l’Union euro
opéenne L70
0 du
9.3.2006 pp. 12-34
4.
4.
Commission of the European co
ommunities. Laying down
n the samplin
ng methods aand the meth
hods of analysis
for the
e official control of the
e levels of O
Ochratoxin A in foodstu
uffs. Officiall Journal off the Europe
ean
Communities, n° 20
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o 13 March 2002, pp. 38-43.
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e S.C., Lino C.M.,
C
Pena, A.,
A 2010. Myycotoxin food and feed reg
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d the specific case of
ochrato
oxin A: A revview of the wo
orldwide stattus. Food Add
ditives and Contaminants
C
s. Part A. Chemistry,
Analysiis, Control, Exposure
E
and
d Risk Assessm
ment 27, 144
40–1450.
6.
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na A. 2013 . Novel IAC
C-LC–ESI-MS
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n A
determ
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7.
Horwitzz W., Albert R. 2006. The
e Horwitz Ra
atio (HorRat):: A useful Ind
dex of methood performan
nce with resp
pect
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95-1109.
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C 17025: G
General requiirements for the
compe
etence of testiing and calib
bration laborratories, ISO,, Geneva, Sw
witzerland.
9. Nordicc Committee on Food An
nalysis. NMKLL Protocol N° 5, 2011 (11 Octobre) A
Analytical Quality
Q
Contro
ol –
Guidelines for the publication
p
of
o analytical rresults of che
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aci, L., Milillo
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T
M.G., 2006. Occhratoxin A determination
d
n in
paired kidneys and muscle sam
mples from sw
wines slaughttered in south
hern Italy. Foood Control 17,
1 114–117
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12. Milicevvic D.R., Juricc V.B, Stefano
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ankovic S.I. 2
2009. Analyssis of ochrato
oxin
A in pig
g tissues usin
ng high presssure liquid ch
hromatograp
phy (HPLC) and liquid chrromatograph
hy tandem mass
m
spectro
ometry (LC/M
MS/MS) as confirmative m
methods. Procceedings for natural
n
sciennces 117: 51-61.
13. Van LLoco J., Bee
ernaert H., An Alterna tive Method
d Validation Strategy foor the Euro
opean Decission
2002/6
657/EC, Proceedings of Euro
E
Food C hem XII: Stra
ategies for Sa
afe Food 200
03, 1, 91 -94
4
14. Van Trijp J.M.P., Ro
oos A.H. RIKILT TEST Mod
del for calcula
ation of calib
bration curvees. Rikilt report, 1991, n° 9102, pp. 1-4.
PRO/5.4/02
2 Gestion de la validation
n des méthod
des au CERVA
A-Tervuren
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C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
An
nnexes
Table des anne
exes
Annexe 1 : Qu
uelques chromatogrammes représent atifs de la dé
étection de l’’ochratoxine A dans les extraits
e
de reins,
foie et boudin ((analyse de routine)
r
Annexe 2 : Pro
otocole de dé
étermination de la linéaritté dans les matrices.
m
Annexe 3 : Calcul des répéttabilité et rep
productibilité intralaboratoire
ValMethTe
erv_v1-70_2..xls : Ochrato
oxin A in kidn
ney
ValMethTe
erv_v1-70_2..xls : Ochrato
oxin A in live r
ValMethTe
erv_v1-70_2..xls : Ochrato
oxin A in blacck sausage
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REN
Annexe
A
1 :Q
Quelques chrromatogrammes représen
ntatifs de la détection
d
de l’OTA dans lles extraits de
e reins, foie et
e
boudin
BEH
H C18 1.7uM-2.1x
x100mm
IL_O
OTA_20120714_18 Sm
S (Mn, 2x3)
2.61
IL_
_OTA_20120727_49 Sm
m (Mn, 2x3)
1: MRM of 1 Channel ES+
TIC (OTA
A C13)
3.35e5
2.67
100
%
%
10
00
BE
EH C18 1.7uM-2.1x1
100mm
1: MRM of 1 Channel ES+
TIC (OTA C13)
4.91e5
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_O
OTA_20120714_18 Sm
S (Mn, 2x3)
2.75
3.00
3.25
2.61
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_
_OTA_20120727_49 Sm
m (Mn, 2x3)
100
2.7
75
3.00
3.25
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 238.9 (OTA)
(
1.21e5
3.25
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 358.022 (OTA)
(
9.32e4
2.67
%
%
10
00
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178
8 > 238.9 (OTA)
1.67e5
2.98
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_O
OTA_20120714_18 Sm
S (Mn, 2x3)
2.75
3.00
3.25
2.61
3.05
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_
_OTA_20120727_49 Sm
m (Mn, 2x3)
100
2.7
75
3.00
2.67
%
%
10
00
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 358.022 (OTA)
8.72e4
0
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
3.00
3.25
3.50
3.75
Time
Écchantillon de rognon n°2 dopé à 5 pp
pb 12C et 10 ppb 13C
1: MRM of 1 Channel ES+
TIC (OTA C13)
4.58e5
2.60
0
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_O
OTA_20120714_66 Sm
S (Mn, 2x3)
2.75
3.00
3.25
2.61
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 238.9 (OTA)
1.90e5
2.25
2.50
2.7
75
3.00
3.25
34
3.3
3.56 3.73 3.86 3.97
3.50
T
Time
3.75
Échantillon de foie N°19
9 dopé à 5 ppb
p 12C et 10
0
13
ppbb C
IL_
_OTA_20120727_67 Sm
m (Mn, 2x3)
1: MRM of 1 Channel ES+
TIC (OTA C13)
2..98e5
2.67
100
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_
_OTA_20120727_67 Sm
m (Mn, 2x3)
100
2.7
75
3.00
3.25
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 238.9 (O
OTA)
1..18e5
3.00
3.25
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 358.022 (O
OTA)
1..05e5
2.66
%
%
10
00
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_O
OTA_20120714_66 Sm
S (Mn, 2x3)
2.75
3.00
3.25
2.60
0
3.50
3.75
2: MRM of 2 Channels ES+
404.178 > 358.022 (OTA)
9.07e4
0
1.75
2.00
2.25
2.50
IL_
_OTA_20120727_67 Sm
m (Mn, 2x3)
100
2.7
75
2.67
%
%
10
00
1.60
0
2.00
3.25
%
%
10
00
1.75
2.82 2.94 2.97
BE
EH C18 1.7uM-2.1x1
100mm
BEH
H C18 1.7uM-2.1x
x100mm
IL_O
OTA_20120714_66 Sm
S (Mn, 2x3)
2.48
2..13 2.35 2.40
1.73 1.82
1.94
0
1.79
1.75
2.94
2.33
2.00
2.25
2.50
2.75
3.13
3.00
1.70
3.2
28 3.33
3.25
3.50
3.75
Time
Écchantillon de rognon N°11 dopé à 5ppb 12C et 10
0ppb 13C
05//03/2013
Pag
ge 13 of 17
0
1.75
1.88
2.1
11 2.14 2.39 2.50
2.00
2.25
2.50
2.82
2.7
75
2.91 3.06
3.00
3.45
5 3.50
3.25
3.50
3.69 3.86 3.97
3.75
Échantillon
n de boudin N°2 dopé à 5ppb 12C et
10pppb 13C
T
Time
C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
Annexe 2 : Pro
otocole de dé
étermination de la linéaritté dans les matrices.
m
Concentrration des
solutions standards (n
ng
OTA/mL de solution)
Volume d
de standard
prélevé e
en μL (10%)
Volume d
d’extrait préle
evé
en μL (90
0%)
Volume ttotal de la
solution o
obtenue en μL
μ
0
1
2,5
5
10
12 ,5
25
50
50
0
50
50
50
50
50
0
50
50
450
0
450
450
450
450
45
50
450
450
500
0
500
500
500
500
50
00
500
500
n blanc est ég
galement pré
éparé en mélangeant 50μ
μL de standard avec 450μ
μL de solvantt. Ces solutio
ons sont ensu
uite
Un
analysées par U
UPLC-MS/MS
S.
05//03/2013
Pag
ge 14 of 17
C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
Annexe 3 : Calcul des répéttabilité et rep
productibilité intralaboratoire
ValMethTerv_v1
1-70_2.xls : Ochratoxin A in kidney
CALCULAT
TION of REPEATAB
BILITY, WITHIN-LAB
B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY
ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van
V Loco & Beerna
aert (2004)
(reminde
er : formulas :
no
ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does
d
not include u recov for
f routine samples
DATA :
O
OCHRATOXIN
A
l
linear
regression :
Method :
KIDNEY
Matrix :
(Maximum Residue Limit)
MRL :
10
unit :
ug/kg
ates)
(number of replica
Nrepl :
3
(number of days or
o analysts)
Ndays :
3
(number of levels)))
(Nlev :
3
Measured concentra tions :
or recovery) :
(NOT corrected fo
C
CCa,
CCb :
S U:
SD,
rep
lev
da
ay or analyst :
4
recovery
intercept
R2
107,6%
-1,14
0,9532
t(26,0.05)
Yc
1,706
11,37
CC?
ug/kg
11,63
nom.ccn
ug/kg
5
10
15
av.meas.
ug/kg
4,40
9,30
15,16
1
1
4,12
2
3,92
3
4,6
2
4,32
5,07
4,88
0,239 MSrepl
3
4
5
4,12
4,78
3,75
0,489 Srepl
4,396 average for le
evel
0,245 SSday s
6
5
6
S days 2 = (MS days -M
MS repl ) / n repl
S Rw 2 = S days 2 + S rep 2
CC?
ug/kg
13,29
RL
% of MR
116,3%
%
0,122 MSday s
7
-0,039 Sday s
8
9
10
0,000 Sdays
0,489 SRw
)
% of MRL
M
132,9%
uncertainty (k = 1) (*)
ug/kg
%
%
0,49
11,12%
0,91
9,82%
1,58
10,42%
%
U, ext. unc. (k = 2) (***)
ug/kg
%
0,98
22,2%
%
1,83
19,6%
%
3,16
20,8%
%
Umax. (k = 2) (***)
ug/k g
%
1,5
29,3%
2,9
29,3%
4,4
29,3%
(*) u = S Rw
(**) U = 2 S Rw
orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3
(***) from modif. Ho
cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08
8
1,435 SSrepl
linear regrression
0.5 x MRL
6
18
y = 1,076
61x - 1,1448
R² = 0,9532
16
5
14
2
4
12
10
3
8
replicate :
2
6
4
1
2
1
10,38
8,51
8,16
4,654 SSrepl
2
3
4
5
10,38
9,02
8,7
10,14
9,94
8,44
0,776
0,881
9,297
1,895
MSrepl
Srepl
average for le
evel
SSday s
6
0,948 MSday s
7
0,057 Sday s 2
8
9
10
0,239 Sdays
0,913 SRw
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,0
10
5,0
1
10,0
15,0
20
0,0
Uncertainty (ug/kg) (k
k=2, 95% conf. int.)
1 x MRL
4
12
3
10
3
8
2
5
6
10
2
15
4
1
replicate :
level 2 (1 x MRL) :
Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2
SS days = n repl ?(Y
MS days = SS days / (n days -1)
R
RESULTS
AND GRAPH
HS :
Analyte :
level 3 (1.5 x MRL) :
SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2
M repl = SS repl /(n-ndays))
S rep 2 = S repl 2 = MS
2
1
12,94
13,96
15,76
14,965 SSrepl
2
15,88
15,4
16,89
2,494 MSrepl
3
4
5
6
17,06
14,73
13,79
1,579
15,157
1,004
0,502
Srepl
average for le
evel
SSday s
MSday s
7
-0,664 Sday s 2
8
9
10
0,000 Sdays
1,579 SRw
avera
age level 1 : 4,1867
4,59
4,41
Sum
mSquares
0,0267 0,7154
0
0,6926
avera
age level 2 : 9,9267 9,1167
9
8,8467
Sum
mSquares
1,2331 1,5889
1
1,8323
avera
age level 3 : 15,293 1
14,697 15,48
Sum
mSquares
9,0035 1,0385
1
4,9226
05//03/2013
Pag
ge 15 of 17
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 x Sre pl
1.5 x MRL
2 x Sda
a ys
2 x Srw
Uncertainty (%) (k=
=2, 95% conf. int.)
18
25%
%
16
14
20%
%
12
15%
%
10
8
5
1
10
10%
%
6
1
15
4
5%
%
2
average
SumSquaress
average
SumSquaress
average
SumSquaress
0
0%
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 x Sre pl
calculations performed by :
hTerv ver 1.70
ussing template : ValMeth
t emplate date : 28/02/2
2013
2 x Sda
a ys
date
2 x Srw
C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
ValMethTerv_v1
1-70_2.xls : Ochratoxin A in liver
CALCULAT
TION of REPEATAB
BILITY, WITHIN-LAB
B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY
ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van
V Loco & Beerna
aert (2004)
(reminde
er : formulas :
SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2
M repl = SS repl /(n-ndays))
S rep 2 = S repl 2 = MS
no
ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does
d
not include u recov for
f routine samples
DATA :
O
OCHRATOXIN
A
Analyte :
l
linear
regression :
Method :
LIIVER
Matrix :
(Maximum Residue Limit)
MRL :
10
unit :
ug/kg
(number of replica
ates)
Nrepl :
3
(number of days or
o analysts)
Ndays :
3
(number of levels)))
(Nlev :
3
Measured concentra tions :
(NOT corrected fo
or recovery) :
C
CCa,
CCb :
S U:
SD,
rep
lev
da
ay or analyst :
intercept
R2
94,5%
-0,12
0,9297
t(26,0.05)
Yc
1,706
11,25
CC?
ug/kg
12,03
nom.ccn
ug/kg
5
10
15
av.meas.
ug/kg
4,45
9,65
13,90
1
5,06
2
3,66
3
4,12
2
3,77
4,59
5,15
0,412 MSrepl
3
4
5
4,6
4,97
4,12
0,642 Srepl
4,449 average for le
evel
0,008 SSday s
5
6
S days 2 = (MS days -M
MS repl ) / n repl
S Rw 2 = S days 2 + S rep 2
CC?
ug/kg
14,09
% of MR
RL
120,3%
%
0,004 MSday s
7
-0,136 Sday s 2
8
9
10
0,000 Sdays
0,642 SRw
)
% of MRL
M
140,9%
uncertainty (k = 1) (*)
ug/kg
%
0,64
14,42%
%
0,91
9,42%
1,62
11,63%
%
U, ext. unc. (k = 2) (***)
ug/kg
%
1,28
28,8%
%
1,82
18,8%
%
3,23
23,3%
%
Umax. (k = 2) (***)
ug/k g
%
1,5
29,3%
2,9
29,3%
4,4
29,3%
(*) u = S Rw
(**) U = 2 S Rw
(***) from modif. Ho
orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3
cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08
8
2,471 SSrepl
linear regrression
0.5 x MRL
6
20
18
5
y = 0,94
45x - 0,1167
R² = 0,9297
16
14
4
12
3
10
8
replicate :
2
6
4
1
2
1
11,13
9
8,72
4,558 SSrepl
2
3
4
5
9,48
10,3
8,34
10,5
9,47
9,93
0,760
0,872
9,652
1,921
MSrepl
Srepl
average for le
evel
SSday s
6
0,960 MSday s
7
0,067 Sday s 2
8
9
10
0,259 Sdays
0,909 SRw
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,0
10
5,0
1
10,0
15,0
20
0,0
Uncertainty (ug/kg) (k
k=2, 95% conf. int.)
1 x MRL
4
12
3
10
3
8
2
5
6
10
2
15
4
1
replicate :
level 2 (1 x MRL) :
4
recovery
1
6
level 3 (1.5 x MRL) :
Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2
SS days = n repl ?(Y
MS days = SS days / (n days -1)
R
RESULTS
AND GRAPH
HS :
2
1
14,26
13,5
11,72
13,163 SSrepl
2
13,71
12,84
14,71
2,194 MSrepl
3
4
5
6
17,39
14,06
12,9
1,481
13,899
6,901
3,450
Srepl
average for le
evel
SSday s
MSday s
7
0,419 Sday s
8
9
10
0,647 Sdays
1,616 SRw
avera
age level 1 : 4,4767 4,4067
4
4,4633
Sum
mSquares
0,8549 0,9085
0
0,7073
9,28 9,3733
avera
age level 2 : 10,303
Sum
mSquares
1,3613 2,4504
2
0,7461
avera
age level 3 : 15,12 1
13,467 13,11
Sum
mSquares
7,8806 0,7459
0
4,5362
05//03/2013
Pag
ge 16 of 17
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 x Sda
a ys
2 x Srw
Uncertainty (%) (k=
=2, 95% conf. int.)
20
35%
%
18
16
30%
%
14
25%
%
12
10
8
6
4
20%
%
5
15%
%
1
10
10%
%
1
15
5%
%
2
average
SumSquaress
average
SumSquaress
average
SumSquaress
2 x Sre pl
1.5 x MRL
0
0%
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 x Sre pl
calculations performed by :
ussing template : ValMeth
hTerv ver 1.70
t emplate date : 28/02/2
2013
2 x Sda
a ys
date
2 x Srw
C O D A - C E R V A--TERVUR
REN
ValMethTerv_v1
1-70_2.xls : Ochratoxin A in black sa usage
CALCULAT
TION of REPEATAB
BILITY, WITHIN-LAB
B REPRODUCIBILIITY, CC?, CC? and RECOVERY
ACCORDING TO 2002/657/EC,, ISO 11843-1 and Van
V Loco & Beerna
aert (2004)
(reminde
er : formulas :
SS repl = ?d ? r (Y-Y moy(level,day) )2
M repl = SS repl /(n-ndays))
S rep 2 = S repl 2 = MS
no
ote : this approach givess first approximation of U for single sample but does
d
not include u recov for
f routine samples
DATA :
O
OCHRATOXIN
A
Analyte :
l
linear
regression :
Method :
BLACK SAUSAGE
Matrix :
(Maximum Residue Limit)
MRL :
5
unit :
ug/kg
(number of replica
ates)
Nrepl :
3
(number of days or
o analysts)
Ndays :
3
(number of levels)))
(Nlev :
3
Measured concentra tions :
(NOT corrected fo
or recovery) :
C
CCa,
CCb :
S U:
SD,
rep
intercept
R2
81,5%
0,03
0,9237
t(26,0.05)
Yc
1,706
4,97
CC?
ug/kg
6,06
nom.ccn
ug/kg
2,5
5
7,5
av.meas.
ug/kg
1,99
4,25
6,07
1
1
1,51
2
2,03
3
2
2
2,1
2,43
1,88
0,050 MSrepl
3
4
5
2
2,16
1,82
0,223 Srepl
1,992 average for le
evel
0,208 SSday s
5
6
S days 2 = (MS days -M
MS repl ) / n repl
S Rw 2 = S days 2 + S rep 2
CC?
ug/kg
7,14
% of MR
RL
121,2%
%
6
0,104 MSday s
7
0,018 Sday s 2
8
9
10
0,134 Sdays
0,261 SRw
)
% of MRL
M
142,8%
uncertainty (k = 1) (*)
ug/kg
%
0,26
13,09%
%
0,60
14,18%
%
0,59
9,69%
U, ext. unc. (k = 2) (***)
ug/kg
%
0,52
26,2%
%
1,21
28,4%
%
1,18
19,4%
%
Umax. (k = 2) (***)
ug/k g
%
0,7
29,3%
1,5
29,3%
2,2
29,3%
(*) u = S Rw
(**) U = 2 S Rw
orwitz for Srw, HorRat < 2x2/3
(***) from modif. Ho
cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08
8
0,299 SSrepl
linear regrression
0.5 x MRL
3
8
7
2,5
y = 0,8149x + 0,03
R² = 0,9237
6
2
5
1,5
4
3
1
replicate :
level 2 (1 x MRL) :
4
recovery
2
0,5
1
3,2
3,56
4,93
1,998 SSrepl
2
3
4
5
4,93
4,62
4,11
3,97
4,47
4,5
0,333
0,577
4,254
0,851
MSrepl
Srepl
average for le
evel
SSday s
6
0,426 MSday s
7
0,031 Sday s 2
8
9
10
0,176 Sdays
0,603 SRw
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,0
10
2,0
4
4,0
6,0
8
8,0
Uncertainty (ug/kg) (k
k=2, 95% conf. int.)
1 x MRL
1
6
1
5
1
4
1
2,5
3
5
1
7,5
2
0
replicate :
lev
da
ay or analyst :
level 3 (1.5 x MRL) :
Y moy(level,day) -Ymoy (level) ) 2
SS days = n repl ?(Y
MS days = SS days / (n days -1)
R
RESULTS
AND GRAPH
HS :
1
1
5,15
6,69
5,86
1,304 SSrepl
2
5,86
6,63
6,78
0,217 MSrepl
3
4
5
6
5,64
5,7
6,29
0,466
6,067
1,203
0,601
Srepl
average for le
evel
SSday s
MSday s
7
0,128 Sday s
8
9
10
0,358 Sdays
0,588 SRw
avera
age level 1 :
1,87 2,2067
2
Sum
mSquares
0,1994 0,0833
0
3,88
avera
age level 2 :
4,25
Sum
mSquares
1,7018 0,1634
0
6,34
avera
age level 3 :
5,55
Sum
mSquares
0,2642 0
0,6162
05//03/2013
Pag
ge 17 of 17
2
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
average
SumSquaress
average
SumSquaress
average
SumSquaress
2 x Sda
a ys
2 x Srw
Uncertainty (%) (k=
=2, 95% conf. int.)
8
30%
%
7
25%
%
6
5
20%
%
4
15%
%
2
2,5
3
5
10%
%
2
7
7,5
5%
%
1
1,9
0,0168
4,6333
0,1325
6,31
0,4238
2 x Sre pl
1.5 x MRL
0
0%
%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 x Sre pl
calculations performed by :
ussing template : ValMeth
hTerv ver 1.70
t emplate date : 28/02/2
2013
2 x Sda
a ys
date
2 x Srw