test d`expression

TEST D’EXPRESSION PROTEIQUE 1 REACTIFS & CONSOMMABLES
TAMPON deLYSE :
Soit :
BLEU de COOMASSIE
PBS 1,5X
Acétate Mg2+ 1mM
NP-40 0,1%
Imidazole 20mM
Glycérol 10%
75mL PBS 10X
500µL acétate magnésium 1M
5mL NP-40 10%
2,5mL Imidazole 4M
50g Glycérol 100%
qsp 500mL eau
0,625g Coomassie
112,5mL Ethanol (ou méthanol)
100mL eau
25mL Acide Acétique
qsp 1L eau
dans l’ordre dissolution
difficile !!
3 séries de tubes 1,5mL
(annotés A, B et C)
SDS LOADING BUFFER
A. CULTURE des BACTERIES en MILIEU SOLIDE
1. Transformer plusieurs souches de bactéries
avec le plasmide permettant l’expression de la
protéine d’intéret.
2. Etaler sur boîte avec les antibiotiques de
sélection adéquats (souche + plasmide).
3. Incuber à 37°C sur la nuit.
SOLUTION de
DECOLORATION
400mL Acide Acétique
1200mL EDTA 0,5M pH8
2400mL eau
JOUR 1
B. CULTURE des BACTERIES en MILIEU LIQUIDE et INDUCTION PROTEIQUE
JOUR 2
1. Préparer une culture liquide de 10mL de TB
avec les antibiotiques adéquats dans un falcon de
50mL (aération de la culture),
2. Incuber à 37°C sous agitation 240 rpm jusqu’à
l’obtention d’une DO600nm de 0.6-0.8
3. Incuber 2h à 15°C sous agitation 240rpm,
4. Induire en ajoutant 10µL d’IPTG à 1M et
incuber sur la nuit à 15°C sous agitation 240rpm.
C. PURIFICATION des PROTEINES
1. Centrifuger 10min 4 000 rpm 4°C
(culotter les cellules),
2. Enlever le surnageant,
3. Ajouter 1mL de tampon de lyse,
4. Soniquer 10s puissance 3 (soit environ
7)(contôler la resuspension du culot)
Extrait total
5. Déposer
5µL de loading Buffer dans la série
de tubes 1,5mL annotée A (extrait cru,)
6. Ajouter 20µL d’extrait soniqué,
7. Incuber dans un bain à sec à 95°C 30min
(dénaturation des protéines),
8. Transférer le reste dans la série de tubes
1,5mL annotée B.
9. Centrifuger la série B pendant 10min 13 000
rpm à 4°C.
C. FIXATION des PROTEINES sur la RESINE
1. Prélever
30µL de résine Cobalt équilibrée dans
JOUR 3
Tp Lyse et homogénéisée dans la série de tubes
1,5mL annotée C,
2. Transférer le surnageant de la série B dans les
tubes de la série C contenant la résine,
3. Incuber au minimum 30 min à 4°C sous
agitation.
E. LAVAGE de la RESINE et ELUTION
1. Centrifuger 2 000 rpm 20s
2. Eliminer le surnageant,
4°C,
3. Ajouter 1mL de tampon de lyse
4. Centrifuger 2 000 rpm 30s 4°C,
5. Recommencer
6. Ajouter
au culot,
ce lavage 2 fois,
20µL de SDS loading buffer.
F. MIGRATION
1. -
Choisir un pourcentage de gel acrylamide
adapté au poids moléculaire de la protéine
attendue,
2. Déposer :
•
•
•
4µL de marqueur de taille protéique unstained
2µL d’extrait cru (série A)
10µl d’extrait purifié (série C)
3. Faire
migrer pendant 45min à 220V (jusqu’à
ce que le bleu de migration sorte du gel),
4. Colorer
avec la solution ‘bleu de coomassie’
10-15min (jusqu’à l’imprégnation du gel par le
bleu),
5. Rincer le gel à l’eau du robinet,
6. Décolorer avec la solution de décoloration
pendant environ 1h,
Conserver le gel dans de l’eau mQ avant de le
scanner et de le faire sécher.
7.