Annexe 1. Protocole d`extrAction d`Adn génomique à PArtir du sAng
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Annexe 1. Protocole d`extrAction d`Adn génomique à PArtir du sAng
Annexe 1. Protocole d’extraction d’ADN génomique à partir du sang des dromadaires – Ajouter 30 µl de SDS (sodium dodecyl sulfate) 10 %. Vortexer chaque tube juste après l’ajout du SDS. 1. Hémolyse 3. Digestion et précipitation des protéines 1er lavage – Ajouter au volume de sang le même volume de solution de lyse de globule rouge (SLR) Tris 10 mM pH7,4 et EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid) 10 mM, – Incubation pendant 10 min dans le bain-marie, – Centrifuger pendant 10 min à 2 500 tours.min-1 et à 4 °C, – Jeter le surnageant et garder le culot. – Ajouter 5 µl protéinase K puis une légère agitation et incuber pendant 1 min à 37 °C, – Ajouter 170 µl NaCl (5M) et incuber à 4 °C entre 15 et 60 min, – Centrifuger pendant 15 min, 3 000 tours.min-1 à 4 °C. 2 lavage – Ajouter le volume = 2,5 ml de solution de lyse des globules rouges (SLR) puis vortexer, – Compléter jusqu’à 5 ml de solution de lyse des globules rouges (SLR), – Centrifuger pendant 10 min à 2 500 tours.min-1 et à 4 °C. e 2. Lyse des globules blancs Pour chaque échantillon – 600 µl d’eau distillée stérile, NaCl : 5 µl 3M, Tris : 5 µl, EDTA : 5 µl 0,5 M, pH8, – Vortexer pour faire descendre le culot, 4. Extraction au chloroforme – Ajouter le même volume de chloroforme que le surnageant, – Bien agiter jusqu’à l’obtention de la couleur blanche puis vortexer, – Centrifuger pendant 15 min, 3 000 tours.min-1 à la température ambiante, – Transférer le surnageant dans un autre tube, – Ajouter 2,5 fois le volume de l’éthanol absolu, – Agiter doucement jusqu’à l’obtention de la méduse, – Récupérer la méduse, – Mettre la méduse dans 100 ml d’alcool 70 % puis centrifuger pendant 5 min, – Ajouter 100 µl de Tris-EDTA à la méduse puis conserver l’ADN à moins 20 °C.