Extraction d`ADN de champignon (protocole sarcosyl)
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Extraction d`ADN de champignon (protocole sarcosyl)
Extraction d'ADN de champignon (protocole sarcosyl) Matériel Biologique : (Mycélium frais ou lyophilisé) - Obtention du mycélium - Préparation de l'extraction à partir de mycélium frais - Préparation de l'extraction à partir de mycélium lyophilisé Pour Botrytis : mycélium filtré après 1 jour de culture en milieu liquide (NY) - soit frais - soit lyophilisé Pour autre champignon : culture en boite de Pétri sur cellophane (2 à 15 jours)puis lyophilisation du matériel Protocole : 1- Broyer le mycélium lyophilisé en fine poudre jusqu'à la graduation 1 maximum d'un tube de 2ml avec un micro-pilon ou pince millipore 2- Ajouter 1ml de tampon Sarcosyl Bien mélanger (vortexer) 3- Ajouter 1ml de phénol-chloroforme pH8 Mettre dans la glace pendant 1h en vortexant de temps en temps 4- Centrifuger à 13000 rpm pendant 15 min à 4°C Prélever la phase aqueuse (supérieure) Si elle est <à100µl ajouter 400µl de tampon Sarcosyl 5- Vortexer (belle émulsion), Centrifuger 15 min à 13000 rpm à 4°C, Prélever la phase aqueuse, Réunir les phases prélevées 6- Centrifuger 60 min à 13000 rpm à 4°C Prélever le surnageant 7- Ajouter 0.6 vol d'isopropanol On peut stopper ici à 4°C Laisser 20 min sur la paillasse 8- Centrifuger 15 min à 13000 rpm à T°ambiante Jeter le surnageant Sécher le culot au speed vac (pas trop sinon il ne se resuspend plus) 9- Reprendre le culot dans 400µl d'H2O milliQ stérile à la pipette ou vortex (légèrement) Ajouter 10µl de RNAse 10mg/ml Laisser 1h à 37°C au bain-marie 10- Ajouter 400µl de phénol-chloroforme et Vortexer 11- Centrifuger 5 min à 13000 rpm à T°ambiante Prélever délicatement la phase aqueuse et Ajouter 0.6vol d'isopropanol On peut stopper ici à 4°C