1 - Interchim

Ethanol
chimie
alimentaire
Doehrinoer
Méthode UV
Pour la détermination de l'éthanol dans les aliments.
Réf. 176290.
Témoin
Essai
Mélange réactionnel 2*
3,00 ml
0,10 ml
3,00 ml
Eau bidistillée
Solution d'essai**
Test-Combinatlon pour 30 déterminations.
Principe (réf. 1,2)
Déclencher la réaction paraddition de :
Solution 3
0.05 ml
L'équilibre de la réaction est situé du côté de l'éthanol. On ledéplace
L'acétaldéhyde est oxydé quantitativement en acide acétique en
présence de l'aldéhyde-déshydrogénase (AL-DH) (2).
l'essai. Déduire la différence d'absorbance du témoin (AAT) de celle
»acétaldéhyde + NADH + H*
(2) Acétaldéhyde +NAD* +H20
Déterminer lesdifférences d'absorbance (A2-A,) du témoin et de
de l'essai (AAE).
AA o aAe - AAT
»acide acétique +NADH +H*
son absorption à 334 nm, 340 nm ou 365 nm.
Composition du coffret
1. Flacon 1 :contenant environ 100 ml de solution composée de
tampon diphosphate de potassium, pH9,0 et
stabilisateurs.
2. Flacon 2 :renfermant 30comprimés. Chaque comprimé contient :
- 4 mg de NAD
- 0,8 U d'aldéhyde déshydrogénase
- Stabilisateurs
SI
mesure.
AL-DH
Au cours des réactions (1) et(2), 2 moles deNAD sont réduites pour
1mole d'éthanol. La quantité de NADH formée estdéterminée par
En règle générale les différences d'absorption mesuréesdoivent être
d'au moins 0,1 pour obtenir des résultats exacts.
1)L'absoeption maximal» du NADH et NAOPH so shuoà 340nm.Lamesure s'oHoctue à 340
nmavecunphotomètre a spectre continu et à 334nmou365nmavecunphotomètre à
spoctro discontinu.
2)Alaplace descuves deverre, on peut utiliser tescuves à usage unique ducommerce.
3) Par exemplelorsdo ruttisation d'unspectrophotomètre double faisceau.
4) Voir lesrecommandations pour laréalisation dutest et lapréparation desechantSIons.
*Pour simpHier lemode opératoire il estégalement possfele de pipeter directement 3 ml de
solution 1dans lacuve. Ajouter ensuite 1comprimé duflacon 2.récraser à l'aide d'un petit
agitateur et ledissoudra. Continuer comme décrit dans le modo opératoire. L'erreur do
volume d'enrion 1%due à l'augmentation devolume résultant del'addtton d'un comprimé
pour 3.15mlde volumefinal, peutêtre priseen comptedans lecalcul. Le résultat est à
multiplier par 1,01.
3. Flacon 3 :contenant environ 1,6 ml de solutiond'alcool
" Lorsqu'on utiKse des pipettes enzymatiques ilest nécessaire delesrincer plusieurs lois
déhsydrogénase 10 000 U. Stabilisateurs.
4. Standard : solution aqueuse stabilisée d'éthanol
*•* Par exempte avec une spatule enplastique ouenretournant la cuve après bouchage avec
Préparation des solutions
Calcul
1. Utiliser le contenu du flacon 1 sans diluer.
La formule générale pour le calcul des concentrations est la suivante :
2. Dissoudre un comprimé du flacon 2 avec 3 mlde solution 1 selon le
nombre de déterminations à effectuer,dans un bêcherou un tube à
c
avec la solution échantillon avant l'utilisation.
duparfilm® (marque déposée doAmerican Can Coup. Greenwich. CT, USA).
Utiliser des pinces pour saisir les comprimés.
La solution constitue le mélangeréactionnel 2.
3. Utiliser le contenu du flacon 3 sans diluer.
4. S'utilise tel quel. La concentration est indiquée surl'étiquette du
flacon.
Stabilité des solutions
Le facteur 2 intervient au dénominateur, car 2 moles de NADH
formées correspondent à 1 mole d'éthanol.
V
=
volume du test (ml)
v
PM
=
=
volume de l'essai (ml)
poids moléculaire de la substance à doser
d
=
épaisseur de la cuve (cm)
e
=
coefficient d'absorption du NADH :
340nm=6,3 (I • mmol'1 •cm'1)
Hg 365 nm =3,4 (I • mmol*1 •cm*1)
Hg 334 nm =6,18 (I • mmol*1 •cm*1)
Lemélange réactionnel 2 est stable un jour à +4 °C.
Lestandard est stable à +4°jusqu'à ladate indiquée sur le flacon.
On obtient pour l'éthanol :
Mode opératoire
c=
Longueur d'onde1:340,334 nm(Hg) ou365 nm (Hg)
Cuvede verre2 :1 cm d'épaisseur.
Température : 20 à 25 °C.
Volume du test : 3,15 ml
xM(g/l)
exdxvx2x 1000
La solution 1 se conserve 1 an à + 4 °C.
Le contenu du flacon 3 est stable un an à -f 4 °C.
VxPM
=
centrifuger.
I
0,05 ml
Mélanger***, après réaction complète (environ 5-10 min) lire les
absorbances des cuves (témoin et essai) l'une après l'autre (A2). Il est
nécessaire de recouvrir lescuvesde parafiim® durant le temps dela
ADH
vers ladroite en captantl'acétaldéhyde formé, en milieu alcalin.
SI
0,10 ml
Mélanger, après environ 3 min., lire l'absorbance dessolutions A,.
En présence del'ateool-déshydrogénase (ADH), l'éthanol estoxydé
enacétaldéhyde par lenicotinamide-adônine-dinudéotide (NAD) (1).
(1) Ethanol + NAD*
r
Introduire dans les cuves
3,15x46,07
a ^*
*
AA
4M* XAA= 0,7256 x—
e
(g d'éthanol/1 de solution d'essai)
Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon
exdx0,1 x2x1000
multiplier le résultat par le facteur de dilution.
Mesurer contre l'air (pas decuve dans letrajet optique) contre l'eau
ou contre le témoin3.
Solution d'essai :0,5à 12ugd'éthanol/cuve4 (pour un volume
échantillon de 0,1 à 0,5 ml).
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141 -CA
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Ethanol
Doehrinaer
chimie
alimentaire
r^
Dans le cas de l'analysed'échantillons solidesou semisolides, pesés
lors de la préparation d'échantillons, le résultat doit être calculé à
partir de la quantité pesée.
Contenu =•
(ethanol)
Cethanol M Solution)
Dosage de l'éthanol dans les |us de fruits
a. Jus de fruits limpides et non colorés.
Utiliser pour le test des jus limpides neutralisés ou dilués si
nécessaire (voirtableau de dilution).
x 100 [g/100]
Cochant 19"Solution]
b. Jus de fruits colorés.
Traiter les jus colorésavec 2 p. 100de polyamide ou polyvinyl
polypyrrolidone (P\/PP) (par ex. 5 mlde jus et 100 mg de PVPP).
Agiter 2 min. (flacon bouché) et filtrer. Neutraliser et utiliser pourle
Recommandations
test la solution obtenue. La diulution tient souvent lieu de
Pour la réalisation du test
Laquantité d'éthanol dans la cuvedoit être comprise entre1 uget 12
décoloration.
c. Jus de fruits troubles.
ug (mesure à 365 nm) ou 0,5 et 6 [ug (mesure à 340 nm, 334 nm
(Hg)]. Diluer la solution d'essai de manièreque la concentration en
Filtrerles jus troubles, clarifier si nécessaire avec le réactif de
ethanol se situe entre0,01 et 0,12g/1 ou 0,005 et 0,06g/1.
En raison de la grande sensibilité de la technique, ilest nécessairede
Carrez :
travailler avec de l'eau sans trace d'éthanol et en absence d'éthanol
dans l'atmosphère.
Tableau de dilution
Quantité estimée d'éthanol par litre
Mesure à
340 ou 334 nm
< 0,06 g
0,06 à 0,6 g
0,6 à 6,0 g
6,0 à 60 g
>60g
< 0,12 g
0,12à1.2g
1,2à12g
12 à 120 g
>120g
10 ml de jus
1,25 mlde solution de Carrez I (3,60 g hexacyanoferrate de
potassium II, r^'Fe (CN)e] •3 H2O/100 ml)
1,25 ml de solutionde Carrez II (7,20 g sulfate de zinc,
ZnS04 • 7 H2O/100 ml)
2,50 ml NaOH 0,1 mol/l
Dilution avec
Facteur
de
de l'eau
365 nm
Introduire dans une fiole jaugée de 25 ml :
bidistillée
dilution F
1
1+
9
1+
99
1+ 999
l-t-9999
1
100
1000
10000
Mélanger, compléter à 25 ml avec de l'eau bidistillée, filtrer (facteur
de dilution F = 2,5).
Utiliser pourle test la solution limpide ou légèrement opalescente,
diluer si nécessaire.
Dosage de l'éthanol dans la bière sans alcool ou à faible
concentration en alcool :
Ajouterde l'hydroxyde de potasse ou de soude sous forme solide à
100 mld'échantillon, sans agitationdans un bêcher jusqu'à obtention
En raison de la volatilité de l'éthanol les dilutionsdoivent être
effectuées de la façon suivante :
d'un pH entre 8 et 9. Utiliser cette solution ou diluer si nécessaire
pour l'essai.
remplir à moitié la fiole jaugéeet pipeter l'échantillon avec une pipette
Dosage de l'éthanol dans le vinaigre
Filtrerle vinaigre si nécessaire et neutraliser.
Une dilution importante rend la neutralisation inutile.
pourenzymoiogie sous la surface de l'eau. Compléter avec de l'eau
jusqu'à la marque et mélanger. Si la différence d'absorbance mesurée
est faible (AA < 0,100) ilfaut soit :
• refaire la préparation d'échantillon en augmentant laquantité
d'échantillon ou en le diluant moins ;
- augmenter le volume de la prised'essai jusqu'à0,5 ml ; le volume
de la solution 1oumélange réactionnel nechange pas(3ml).
Le volume d'eau ajouté à lacuve témoin doit êtreaugmenté jusqu'à
obtenirle mômevolume final que dans la cuve essai. On devra tenir
compte dans le calcul des nouveaux volumes v (volume prise
d'essai) et V(volume final dans les cuves).
Utilisation du standard
Comme contrôle :onl'incorpore danslemode opératoire à laplace
de l'essai. Comme standard : si une calibration est nécessaire.
1 - Préparation des échantillons
1.1 Echantillons liquides
Utiliser les solutions claires, ou faiblement colorées directement ou
après dilution selon le tableau de dilution. Les solutions troubles
doivent être filtrées ou clarifiées avec les réactifs de Carrez. Les
solutions fortement colorées, qui sont utilisées non diluées du fait de
leur concentration faible en ethanol, doivent être décolorées avec du
1
Dosage de l'éthanol dans les boissons alcoolisées
a. Dans le vin
Diluer le vin avec de l'eau bidistillée (voir tableaude dilution). Il n'est
pas nécessaire de neutraliser ou de décolorer.
b. Dans la bière
Agiteravec un agitateur en verre env. 5 à 10 ml de bière durant 30
sec. pouréliminer le gaz carbonique. Diluer dans la proportion 1 +
999 avec de l'eau. Utiliserla solution pour le test.
c. Dans les liqueurs
Diluer dans une fiole jaugée les liqueurs fluides (voir tableau de
dilution). Dans le cas de liqueurs de consistance pâteuse (ex.liqueur
d'oeufs), peser exactement une quantitéde l'ordrede 1 g de liqueur
dans une fiole jaugée de 100 ml, compléter avec de l'eau bidistillée
jusqu'au trait,placer au réfrigérateur pour obtenir la séparation des
graisses, filtrer, diluer dans la proportion 1 + 99 avec de l'eau.
Utiliser pour le test la solution limpide obtenue.
d. Dans les eaux-de-vie
Diluercomme indiqué sur le tableau de dilution (par ex. 1 + 999).
A partir de tables établies à cet effet, indiquer le résultat (g
d'éthanol/l de solution) en p. 100 par volume.
polyamide ou du polyvinylpolypyrrolidone (PVPP). Lesboissons
contenantde l'acide carbonique doivent être dégazées, cellesavec
une concentration en ethanolfaible amenées à pHalcalin (8,5- 9).
Durant la préparation de l'échantillon on doit prendre soin d'éviter
toute ôvaporation de l'éthanol. Lors des dilutions, pipeter l'échantillon
1
sous la surface de l'eau.
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SI
Ethanol
g boehrinder
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1.2 Dosage de l'éthanol dans le vin, la bière, les alcools selon un
mode opératoire simplifié
On effectue une simple dilution selon le tableau de dilution.
Mode opératoire pour une série de 10 déterminations
Dissoudre 10comprimés du flacon 2 dans 30 ml de tampon 1 ;
ajouter0,5 mlde solution 3 et mélanger.Ce mélange réactionnel est
stable 8 h à 20 °C.
pi
Pour la réalisation du test :
Introduiredans la cuve 3 ml de mélange réactionnel et lire
l'absorbance A,. Déclencher la réaction par addition de 0,1 ml
d'échantillon dilué. Après réactioncomplète(environ 5 min.) lire
l'absorbance A2.
Déterminer la différence d'absorbance
A2- A, = AA
c o 0,714 x
AAxF
(g d'éthanol/l de solution d'essai)
F = facteur de dilution
1.3 Aliment pâteux
Dosage de l'éthanol dans les bonbons et les chocolats
renfermant de la liqueur
Ouvriravec soin une boule, prélever 0,5 ml du contenu ; l'introduire
dans une fiole jaugée de 50 ml contenant environ 25 ml tfeau,
procéder en maintenant la pointe de la pipette immergée. Compléter
rapidement jusqu'à la marque avec de l'eau, boucher la fiole et
mélanger. Diluer cette solutiondans la proportion 1+19 avec de
l'eau.
Utiliser 0,1 ml de cette solution pour le test (facteur de dilution
F = 2000).
Dosagede l'éthanol dans les confiseries à contenu visqueux
Peser exactement le contenu d'un ou plusieurs bonbonsou chocolats
dans une fiole jaugée de 50 mlcontenantenv. 5 ml d'eau. (Si l'on
utilise une pipette lors de la pesée, ne pas toucher la surface de l'eau
avec l'embout).
Compléter à la marque avec de l'eau, mélanger,filtrer si nécessaire et
diluer pourobtenir une concentration en alcool inférieure à 0,12g/1.
Dosage de l'éthanol dans le miel
Peser exactementune quantitéde l'ordre de 20 g de miel dans une
fiole jaugée de 100 ml, délayerdans un peu d'eau à env. 50 °Cen
agitant légèrement la fiole bouchée, laisserrevenir à température
ambiante et compléter avec de l'eau bidistillée. Utiliser pour le test la
solution trouble ou éventuellement clarifiée avec les solution de
Carrez: introduire 10 ml de solution trouble dans une fiole jaugéede
25 ml, poursuivre comme indiqué au paragraphe 1.1. c "Jus troubles".
(Facteur de dilution F = 2,5). Filtrer, utiliser pour le test la solution
limpide.
Dosage de l'éthanol dans les produits laitiers
Peser exactement 10 g d'échantillonhomogénéisé dans une fiole
jaugée de 100 ml, ajouter env. 50 ml d'eau, boucher la fiole et mettre
pendant 15 min., la fioleà 50 °C en agitant modérément. Pour
précipiter les protéines,ajouter5 mide solution Ide Carrez(voir
paragraphe 1.1. c), 5 ml de solution II de Carrez et environ 10 ml de
soude 0,1 mol/let mélanger.
Ramener à la température du laboratoire et compléter jusqu'àla
marque avec de l'eau. Mélangeret filtrer. Utiliser la solution limpide ou
légèrement trouble pour essai.
1.4 Aliments solides
Réduire les aliments solidesou semi-solides (dans un mortier par ex.)
extraire ou dissoudre dans de l'eau, filtrer si nécessaire. Extraire les
échantillons contenant des graisses par l'eau chaude dans un ballon
bouché munid'un long tube coudé. Laisser refroidir pour obtenirla
séparation des graisses, rincer le tube avec de l'eau et filtrer.
Déprotéiniser les solutions contenant des protéines avec l'acide
perchlorique (1 mol/l) dans la proportion 1 + 2, centrifuger et
neutraliser le surnageant avec KOH (2 mol/l).
2. Autres applications
2.1. Dosage de l'éthanol dans le sang, le plasma ou le sérum
Consulter la fiche technique spéciale incluse dans le coffret.
2.2. Dosage de l'éthanol dans l'urine
Consulter la fiche technique incluse dans le coffret.
Dosage de l'éthanol dans les confitures
Bien homogénéiser l'échantillon (dans un mixer par ex.) et peser
exactement une quantité de l'ordre de 10 à 20 g dans un bêcher.
Délayerdans un peu d'eau, neutraliser avec KOH si nécessaire,
transvaser quantitativement dans une fiolejaugée de 100 ml,
compléter avec de l'eau bidistilléejusqu'au trait
Décolorer la solution si nécessaire avec 2 p. 100de polyamide ou de
polyvinylpyrrolidone (voir paragraphe 1.1b. "Jus colorés*). Filtrer.
Utiliserpour le test le filtratnon dilué.
2.3. Dosage de l'éthanol dans les milieux de cultures et les
milieux de fermentation
Placer l'échantillon (si nécessaire après centrifugation) dans un bain
d'eau à 80 °C durant 15 minutes (recouvrir le tube pour éviter
i'évaporation de l'éthanol) pour bloquer les réactions enzymatiques.
Centrifugeret utiliserle surnageant pour essai (éventuellement diluer
selon te tableau de dilution). La déprotéinisation peut être effectuée
en utilisant soit de l'acide perchlorique soit le réactif de Carrez.
Homogénéiser les milieuxagar gélatines avec de l'eau et traiter
ensuite comme décrit ci-dessus.
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Ethanol
is-\
c boehrinqer
03
E
V3/
chimie
alimentaire
Bibliographie
1. Beutler, H.-O. & Michal, G. (1977) Neue Méthode zur
enzymatischen bestimmung von Athanol in Lebensmitteln, Z.
Anal, Chem. 284,113-117.
2. Beutler, H.-O. (1984) in Methodsof Enzymatic Analysis
(Bergmeyer, H. U., éd.) 3rd éd., vol. VI, pp. 598-606, Veriag
Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Base!.
3. Schweizerisches Lebensmittelbuch (1981) Kaphel61B/2.1.
4. Gombocz, E., Hellwig, E, Vojir, F. &Petuely, F. (1981) Deutsche
Lebensmittel-Rundschau 77,8.
5. BOcher, T. S Redetzki, H. (1951) Eine spezifsche photometrische
Bestimmung vonAthylalkohol auf fermentativem Wege, Klinische
Wochenschrift 29, 615-616.
6. Tanner, H. &Brunner, E. M. (1965) ZurBestimmung des in
alkohotfreien Getrânken undin Aromadestillaten enthaltenen
Âthylakohols, Mitt Gebiete Lebensm. Unters. u. Hyg. 56,480-487.
7. Quast, P. (1978) Weitere Notwendigkeiten und Môglichkeiten der
1
Fruchtanalyse beimApfel, Mitt Obstbauversuchsring des Alten
Landes 9,293-301.
8. Henniger, G. &Boos, H. (1978) Anwendung derenzymatischen
Analyse bei der Untersuchung kosmetischer Prâparate- dargestelt
t5"")
an einigen Beispielen,Seifen- Ole - Fette - Wachse 104,159-164.
9. Henniger, G. &Hoch,H. (1981) Enzymatische -
Substratbestimmungen in derpharmazeutischen Analytilkt
dargestelltan den Bestimmungenvon L-Ascorbin-sàure, Athanol
und Lactose, Deutsche ApothekerZeitung 121,643-649.
10. Kohler, P. (1982) Enzymatische Ethanol-Bestimmung in GlaceundSchokolade-produkten, Mitt GebieteLebensm. Hyg. 73,4449.
11. Jung, G. &Férard, G. (1978) Enzyme-coupled measurement of
ethanol in whole bloodandplasma with a centrifugal analyzer,
Clin. Chem. 24, 873-876.
12.Beutler, H.-O. (1985)unpublishedresults.
m
]
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