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Gynécologie Obstétrique & Fertilité 36 (2008) 200–203
EXAMENS COMPLÉMENTAIRES
Génotypage RhD fœtal non invasif sur sang maternel :
vers une utilisation chez toutes les femmes enceintes
RhD négatif
Non invasive fetal RhD genotyping: Time for use in all
RhD negative pregnant women
B. Carbonne *, A. Cortey, C. Rouillac-Le Sciellour, Y. Brossard
Service de gynécologie–obstétrique, centre national de référence en hémobiologie périnatale (CNRHP), hôpital Saint-Antoine,
Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP–HP), 184, rue du Faubourg-Saint-Antoine, 75012 Paris, France
Reçu le 19 septembre 2007 ; accepté le 5 novembre 2007
Résumé
La détermination du génotype RHD fœtal est actuellement possible à partir d’un simple prélèvement sanguin maternel. La
technique repose sur l’amplification par polymerase-chain-reaction (PCR) du gène RHD contenu dans l’ADN fœtal présent
dans la circulation maternelle. Ce test, réalisé dans quelques laboratoires seulement, permettrait de diminuer d’un tiers
l’utilisation d’immunoglobulines chez les femmes RhD négatif, pour la prévention de l’allo-immunisation anti-D. En cas
d’allo-immunisation maternelle, il permettrait de n’appliquer une surveillance spécialisée qu’aux fœtus de groupe RhD
positif. La généralisation de ce test implique la validation et la diffusion d’un kit commercial de génotypage, utilisable par de
nombreux laboratoires non spécialisés ainsi que son évaluation économique.
ß 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Abstract
Non invasive fetal RhD genotyping, based on polymerase-chain-reaction (PCR), is an accurate and validated technique. It
allows a reduction by one-third of anti-D immunoglobulin injections to prevent RhD allo-immunization. In case of maternal
anti-D immunization, fetal RhD genotyping allows to focus on RhD positive fetuses only the biologic and sonographic
follow-up. The wide use of this technique implies the validation and economic evaluation of a commercial RhD genotyping
kit, ready for use in non specialized laboratories.
ß 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Mots clés : Allo-immunisation ; Rhésus D ; Génotypage non invasif ; Fœtus ; Diagnostic prénatal
Keywords: Allo-immunization; Rhesus D; Non-invasive genotyping; Fetus; Prenatal diagnosis
1. INTRODUCTION
L’allo-immunisation anti-RhD est devenue une pathologie
rare, mais dont les conséquences périnatales restent particu-
* Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (B. Carbonne).
lièrement graves : risque d’anémie fœtale grave pouvant se
compliquer d’anasarque, de mort fœtale in utero (spontanée ou
parfois secondaire au traitement par transfusion in utero),
d’ictère et d’anémie néonatals graves nécessitant une prise en
charge spécialisée. Elle correspond, chez la femme enceinte
RhD négatif, à la synthèse d’anticorps IgG anti-D en réponse au
passage transplacentaire d’hématies fœtales RhD positif dans la
circulation maternelle. Les anti-D maternels traversant le
1297-9589/$ – see front matter ß 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.gyobfe.2007.11.017
B. Carbonne et al. / Gynécologie Obstétrique & Fertilité 36 (2008) 200–203
placenta vers la circulation fœtale provoquent en retour une
hémolyse et une anémie chez le fœtus RhD positif.
La prévention par immunoglobulines anti-D a fait baisser de
manière spectaculaire les nouvelles allo-immunisations. Néanmoins, ces immunoglobulines restent des produits dérivés du
sang et leur utilisation devrait être limitée au minimum, qu’elle
soit sur signes d’appel (métrorragies, traumatisme abdominal,
amniocentèse. . .), ou réalisée de manière systématique vers
28 semaines d’aménorrhée (SA) comme le préconisent les
recommandations de 2005 [1].
La connaissance, dès la fin du premier trimestre de la
grossesse, du groupe RhD fœtal permettrait d’éviter les
injections d’immunoglobulines inutiles aux mères RhD négatif
dont l’enfant est lui aussi RhD négatif. Cette situation
représente plus du tiers de toutes les femmes enceintes
RhD négatif.
Le génotypage RhD fœtal non invasif sur sang maternel est
désormais une technique validée et éprouvée, mais qui n’est
jusqu’à aujourd’hui réalisée de manière fiable que par quelques
rares laboratoires très spécialisés [2,3]. L’application à grande
échelle de cette technique passera par la diffusion à de
nombreux laboratoires agréés d’un kit commercial de
génotypage RhD.
2. TECHNIQUE DU GÉNOTYPAGE NON
INVASIF
2.1. Principe du génotypage fœtal sur sang
maternel
Depuis 1990, Lo et al. [4] ont mis en évidence la présence
d’ADN fœtal circulant dans le plasma maternel. La quantité
d’ADN fœtal circulant varie de quelques copies jusqu’à
plusieurs centaines de copies de génome fœtal par millilitre
de plasma ; la quantité croı̂t avec l’âge gestationnel. Chez les
femmes enceintes RhD négatif qui ne possèdent donc pas le
gène RHD dans leur génome, il est possible, lorsque leur fœtus
est RhD positif, d’identifier ce gène dans l’ADN extrait de leur
plasma par une technique d’amplification génique (Brevet
Oxford University).
Il était déjà possible, depuis les années 1990, d’effectuer un
génotypage RhD fœtal par polymerase-chain-reaction (PCR) sur
le liquide amniotique. Néanmoins, cette méthode s’appuie sur
un geste invasif d’amniocentèse, à risque d’hémorragie
fœtomaternelle qui pourrait réactiver ou activer, en l’absence
de prévention, une immunisation anti-D.
2.2. Le gène RHD
Dans la pratique quotidienne, on distingue les individus
Rhésus négatif dont les hématies ne portent pas l’antigène D, et
les individus Rhésus positif, dont les hématies sont porteuses de
l’antigène D.
En réalité, l’organisation du système Rhésus, décrite en
1991 par une équipe française [5], est très complexe et
polymorphe. En effet, le système Rhésus comprend d’autres
marqueurs membranaires que l’antigène D : C, c, E, e. On
201
parle généralement de locus Rhésus pour désigner un
ensemble de deux gènes, très proches sur le chromosome
1 et qui semblent transmis en bloc (Fig. 1) : le gène D (ou
RH1), codant pour la protéine de l’antigène D, et le gène CE,
codant pour les autres antigènes. Le gène CE est toujours
présent. Le gène D est absent chez la plupart (> 98 %) des
sujets RhD négatif (gène D délété ; Fig. 1). Beaucoup plus
rarement (< 2 %), le phénotype RhD négatif peut correspondre à une mutation du gène D ou à des gènes hybrides DCE-D (Tableau 1).
2.3. Technique d’amplification du gène RHD
Une méthode permettant la détermination précoce (dès
10–12 SA) du génotype RHD fœtal à partir de l’ADN fœtal libre
extrait d’une simple prise de sang maternel a été mise au point
par le Centre national de référence en hémobiologie périnatale
(CNRHP) [2].
L’ADN du plasma maternel est d’abord purifié puis
concentré dans un éluat. La présence du gène RHD fœtal dans
l’ADN plasmatique est détectée par amplification génique
(PCR) de deux régions distinctes spécifiques du gène RHD : les
exons 7 et 10, afin de détecter un maximum de variants du gène
RHD et de limiter les erreurs dues au grand polymorphisme du
gène Rhésus.
Les amplifications géniques sont réalisées sur un automate
de PCR quantitative en temps réel afin de répondre au mieux
aux exigences de non-contamination, de rapidité et de fiabilité
des analyses de biologie moléculaire. Les amplicons sont
révélés grâce à trois sondes d’hydrolyse spécifiques de chaque
région amplifiée, de manière à ce que la technique soit
applicable à tous les appareils PCR en temps réel [2].
Dans chaque série d’extraction, il est inclus un plasma de
témoin positif, de témoin négatif et un témoin blanc (constitué
d’eau à la place du plasma). Un contrôle interne d’extraction
de l’ADN (ADN de maı̈s) est ajouté dans chaque échantillon de
plasma à extraire et dans chacun des trois témoins de contrôle
(positif, négatif et blanc). L’ajout d’ADN étranger permet les
points suivants :
de vérifier la qualité et le rendement de l’extraction ;
de mettre en évidence la présence éventuelle d’inhibiteurs de
la réaction d’amplification génique, lorsque les exons 7 et 10
ne sont pas détectés.
Dans la très grande majorité des cas(> 98 %), chez les sujets
RhD positif, la réaction est positive avec les amorces des exons
7 et 10. Les sujets RhD négatif ont une réaction négative pour
ces deux exons. Seuls quelques variants peuvent donner des
Fig. 1. Schéma du gène Rhésus, situé sur le chromosome 1.
202
Tableau 1
Profil génotypique RhD des personnes RhD négatif
Gène D délété
Gène D muté non fonctionnel
Gène hybride D-CE-D
Caucasiens RhD négatif (15 %)
Noirs africains RhD négatif (3 %)
> 98 %
<1 %
<1 %
10–25 %
60–70 %
10–20 %
résultats faussement positifs ou discordants pour les deux
exons (Tableau 1).
Chez le sujet caucasien, le phénotype RhD négatif
correspond dans plus de 98 % des cas à une délétion du gène
D. L’utilisation du test permet d’obtenir un résultat négatif pour
les deux exons 7 et 10. Les gènes D mutés (type Dy) donnent un
résultat faussement positif pour les deux exons 7 et 10. Cette
situation (moins de 1 % des cas chez les Caucasiens) est sans
conséquence clinique grave puisque le fœtus sera considéré
comme positif en cas de situation à risque (nécessité de
prévention par immunoglobulines ou allo-immunisation anti-D
maternelle). Dans le cas de gènes hybrides D-CE-D, le résultat
du test sera considéré comme indéterminé, car discordant
pour les exons 7 et 10. Le fœtus doit alors être considéré
comme positif jusqu’à l’accouchement et la mère recevra une
prévention par immunoglobulines anti-D en cas de situation à
risque.
3. PRINCIPALES INDICATIONS
D’UTILISATION DU GÉNOTYPAGE SUR SANG
MATERNEL
En France, environ 15 % de la population d’origine
caucasienne est de phénotype RhD négatif. Cette fréquence
varie selon les populations (35 % chez les Basques, 2 à 7 % dans
la population africaine et seulement 0,3 % chez les Asiatiques).
Ainsi, chaque année en France, 150 000 à 165 000 femmes RhD
négatif sont enceintes, dont 90 000 sont enceintes d’un fœtus
RhD positif [6].
3.1. Femmes RhD négatif ayant une alloimmunisation anti-RhD
Le génotypage est ici très utile pour le diagnostic
d’incompatibilité fœtomaternelle RhD chez des femmes
RhD négatif porteuses d’une immunisation anti-D. La
technique sur sang maternel est ici la technique de choix
permettant d’éviter le recours à une amniocentèse et
ses risques dont celui de fausse couche et de réactivation
de l’immunisation maternelle lorsque le fœtus est RhD
positif.
En cas de négativité du génotype RhD fœtal, confirmée
sur deux prélèvements sanguins espacés d’une à quelques
semaines, le risque d’anémie fœtale est absent, quelle que
soit la sévérité de l’allo-immunisation. La grossesse pourra
être surveillée de manière habituelle et ne nécessitera
pas de prise en charge spécialisée. La surveillance des
titrages et dosages d’anticorps anti-D est ici inutile. En
cas de positivité du génotype RHD fœtal, il existe une
Exon 7
Exon 10
+
+
+
situation d’incompatibilité sanguine maternofœtale qui
justifie une surveillance spécialisée : titrages et dosages
pondéraux d’anticorps anti-D d’une part, recherche de
signes d’anémie fœtale par l’échographie et surtout le
Doppler (pic systolique de vélocité de l’artère cérébrale
moyenne) d’autre part [7]. Enfin, la prise en charge néonatale
devra se faire en milieu spécialisé du fait de la nécessité
éventuelle de transfusion sanguine et de photothérapie
intensive.
3.2. Intérêt du génotypage fœtal dans la stratégie
de prévention des allo-immunisations
3.2.1. Prévention ciblée
La prévention dite ciblée de l’allo-immunisation anti-D
repose sur l’injection d’immunoglobulines à l’accouchement et
pendant la grossesse, dans les situations à risque d’hémorragie
fœtomaternelle : métrorragies, traumatisme abdominal, amniocentèse ou autre prélèvement ovulaire. . . Lorsque le procréateur est connu avec certitude par la patiente et que son
groupe RhD est négatif, confirmé par la carte de groupe vue par
le soignant, le génotypage fœtal n’est pas justifié. Dans les
autres cas, la détermination du génotype Rhésus D fœtal sur
sang maternel au début du deuxième trimestre permettra
d’éviter aux femmes Rhésus négatif dont le fœtus est de Rhésus
négatif une ou des injections d’immunoglobulines anti-D inutiles
puisqu’elles ne sont pas à risque d’immunisation. Cette
situation est loin d’être exceptionnelle puisqu’elle représente
environ un tiers des cas.
3.2.2. Prévention systématique du troisième
trimestre
Depuis 2005, il est recommandé d’effectuer une injection
systématique d’immunoglobulines anti-D (300 mcg) vers 28 SA
afin d’éviter les immunisations liées à des hémorragies
fœtomaternelles occultes donc inaccessibles à une prévention
ciblée [1]. Ces passages d’hématies fœtales, totalement
impossibles à dépister, sont responsables d’environ un tiers
des allo-immunisations graves actuellement suivies. Cette
prévention systématique représente une augmentation importante de l’utilisation d’immunoglobulines anti-D. Dès que le
génotypage RhD fœtal sera largement disponible, il permettra
de réduire de manière importante (environ un tiers) les
injections d’immunoglobulines.
3.2.3. Cas particulier des prélèvements ovulaires
(amniocentèses et biopsies de trophoblaste)
Le génotypage RhD fœtal sur liquide amniotique est
disponible et fiable depuis les années 1990. Lorsque les
résultats peuvent être rendus en moins de 72 heures après
l’examen, il reste possible de ne prescrire l’injection
d’immunoglobulines qu’aux femmes dont le fœtus est RhD
positif. Cependant, le délai entre la réalisation de l’amniocentèse et le rendu des résultats du génotypage, la nécessité de
reconvoquer la patiente et le délai entre l’acte à risque et
l’injection d’immunoglobulines représentent autant de risques
d’échec de la prophylaxie.
Dans ce contexte, le génotypage fœtal sur sang maternel est
alors proposé huit à dix jours avant le prélèvement. En cas de
génotype RHD négatif, il n’est pas prescrit d’injection
d’immunoglobulines et le génotype fœtal RHD sur liquide
amniotique ou villosités choriales dans les 72 heures suivant le
geste permet alors de conforter l’abstention de prévention. En
cas de positivité du génotype RHD fœtal sur sang maternel,
l’injection d’immunoglobulines est réalisée immédiatement
après le prélèvement.
4. VERS UN GÉNOTYPAGE RHD CHEZ TOUTES
LES FEMMES RHD NÉGATIF?
Considéré le succès des résultats obtenus dans les
indications citées plus haut, l’extension du génotypage fœtal
RhD sur sang maternel à toutes les femmes enceintes RhD
négatif est aujourd’hui envisagée.
La généralisation du génotypage fœtal RhD permettrait
d’éviter un grand nombre d’administrations de produits dérivés
du sang. Les immunoglobulines anti-D actuellement commercialisées sont d’origine humaine (provenant exclusivement de
donneurs sains d’Amérique du Nord, hyperimmunisés et
rémunérés). Le risque viral lié à l’utilisation des immunoglobulines anti-D est extrêmement faible du fait des traitements
appliqués pour éliminer les virus. Néanmoins, ce risque ne peut
être considéré comme totalement nul, notamment avec des
virus encore non répertoriés, argument pour limiter la
prescription d’immunoglobulines anti-D chez les femmes qui
ne sont pas à risque d’immunisation.
De plus, l’administration systématique d’immunoglobulines
anti-D à 28 SA aux femmes RhD négatif représente un surcoût
important par rapport à l’administration uniquement sur signes
d’appel. La généralisation du génotypage RhD fœtal sur sang
maternel pourrait en partie compenser le surcoût lié à la
prophylaxie systématique en permettant de la réserver aux
seules femmes à risque d’immunisation, c’est-à-dire enceintes
203
d’un fœtus RhD positif. Cette stratégie plus rationnelle de
prévention permettrait également de limiter les recherches
d’agglutinines irrégulières, également coûteuses.
À partir des travaux réalisés au Centre national de référence
en hémobiologie périnatale et grâce à une coopération
recherche–industrie (INSERM, INTS, CNRHP, Institut Jacques-Boy), un kit de première génération à été développé en
2005–2006, afin de faciliter la généralisation de ce test dans un
proche avenir. Le kit free DNA fetal kit1 RhD Jacques-Boy a
obtenu une norme CE en juin 2007. Il s’agit du premier kit de
génotypage RhD fœtal non invasif et sa mise à disposition sur le
marché fait rentrer ce test et les laboratoires qui vont le
pratiquer, dans le statut réglementaire du diagnostic prénatal
par biologie moléculaire.
Une évaluation économique multicentrique, ainsi que la mise
en place de contrôles de qualité de cette technique vont
débuter très prochainement afin de valider la généralisation de
ce test dans la pratique courante. Cette étude devrait
également permettre de donner les bases nécessaires à la
mise à la nomenclature des actes biologiques du génotypage
RhD non invasif et, à terme, à son remboursement par la
sécurité sociale.
RÉFÉRENCES
[1] Collège national des gynécologues et obstétriciens français. Prévention de
l’allo-immunisation Rhésus-D fœtomaternelle. J Gynecol Obstet Biol
Reprod (Paris) 2006;35(Suppl. 1):1S81–1S135.
[2] Rouillac-Le Sciellour C, Puillandre P, Gillot R, Baulard C, Metral S, Le Van
Kim C, et al. Large-scale pre-diagnosis study of fetal RHD genotyping by
PCR on plasma DNA from RhD-negative pregnant women. Mol Diagn
2004;8:23–31.
[3] Gautier E, Benachi A, Giovangrandi Y, Ernault P, Olivi M, Gaillon T, et al.
Fetal RhD genotyping by maternal serum analysis: a two-year experience.
Am J Obstet Gynecol 2005;192:666–9.
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grossesse. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris) 2006;35(Suppl. 1):1S87–92.
[7] Carbonne B, Castaigne-Meary V, Cynober E, Gougeul-Tesnière V, Cortey
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vélocité à l’artère cérébrale moyenne dans la prise en charge des alloimmunisations sévères. J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris). 2007 Nov 12;
[Epub ahead of print].

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