Superdex 75 10/300 GL et Superdex 200 10/300

Essayer d'abord ces conditions
Instructions 71-5017-96 AK Colonnes à haute performance
Éluant :
Tampon de phosphate à 50 mM, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
Débit :
0,5–0,75 ml/min, température ambiante
Volume de l'échantillon :
25 µl
SuperdexTM 75 10/300 GL et
17-5175-01 Superdex 200 10/300 GL
17-5174-01
Sélectionner un échantillon garantissant que l'échantillon soit entièrement soluble.
De plus, essayer de choisir un éluant qui simplifie les applications en aval. Par
exemple, si les protéines / peptides doivent être lyophilisées, un éluant volatile est
nécessaire. Comme certaines interactions dépendantes du pH à 7,0 peuvent se
produire avec les protéines acides et basiques à de très faibles concentrations en sel,
un tampon recommandé est du phosphate de sodium à 50 mM, du NaCl à 0,15 M,
pH 7,0. Le tableau 1 présente une liste de compositions d'éluants utiles.
(1) Pousser le bouchon à ressort vers
le bas
(2) Retirer la goupille d'arrêt
2
L'équilibrage n'est pas nécessaire entre les analyses effectuées avec le même
tampon éluant. Lire la section « Optimisation » pour obtenir des informations sur
la manière dont optimiser une séparation.
Choix d'éluant
Comment retirer le dispositif de
stockage / expédition.
1
(3) Libérer le bouchon et dévisser le
dispositif
Tableau 1. Compositions d'éluants utiles.
3
Tampons et résistance au solvant
pH Tampon / éluant Propriétés / exemples d'application
5,0acétate d'ammonium à 0,1 M
cellulases. Bonne solubilité pour certaines enzymes, par ex. les
Volatile.
7,2phosphate à 0,05 M + NaCl à 0,15 M
Conditions physiologiques.
Informations rapides
Tous les tampons aqueux couramment utilisés, pH 3 à 12
7,8carbonate acide d'ammonium à 0,15 M
Convient à certaines séparations d'ADN et de protéines. Volatile. Doit être utilisé frais.
Urée, jusqu'à 8 M
8,0
Très bonne solubilité pour l'ADN et l'ARN.
Superdex 75 10/300 GL et Superdex 200 10/300 GL sont des colonnes Tricorn™
à haute performance. Les colonnes sont des colonnes en verre préremplies pour
une filtration sur gel à haute performance de protéines, peptides, fragments d'ADN
(< 200 bp) et autres biomolécules.
Acétonitrile, jusqu'à 30 % dans les tampons aqueux
Installer un filtre en ligne avant la vanne d'injection. Les tampons et solvants
à viscosité élevée ont un impact sur la contre-pression et le débit. Dégazer et filtrer toutes
les solutions à travers un filtre de 0,22 µm.
Usage quotidien
Détergents ioniques et non ioniques
Chlorhydrate de guanidine, jusqu'à 6 M
La colonne est fournie avec deux connecteurs fingertight 1/16" mâles pour un
branchement aux systèmes ÄKTA™ design et deux connecteurs union 1/16" mâle /
M6 femelle pour un branchement à un système FPLC.
Nettoyage
Hydroxyde de sodium, jusqu'à 1 M
Dimensions de la matrice
Volume de matrice
Efficacité de la colonne, N/M
Taille moyenne des particules Plage de stabilité du pH utilisation
régulière
nettoyage
Températurefonctionnement Limite d'exclusion, M r, protéines globulaires
Plage de séparation optimale
protéines globulaires, M r
600 000dextranes
Débit (eau à température ambiante)
recommandé minmaximum
Pression dans la colonne maximum
10 × 300 à 310 mm
Environ 24 ml
>30 000 m -1
13 µm
Éthanol, jusqu'à 70 %
3 à 12
1 à 14
4 °C à 40 °Cstockage
4 °C à 30 °C
Superdex 75
Environ 1 × 105
dénaturation.
Tris-HCl à 50 mM
Acétonitrile à 30 % dans
un tampon approprié
(1) Connecter une seringue ou une
pompe au dispositif de stockage /
expédition et remplir d'éthanol
à 20 % au-dessus de la marque
sur le tube. Retirer la seringue
ou la connexion à la pompe.
Acétonitrile, jusqu'à 30 %
Composite d'agarose réticulé et de dextrane
Méthanol, jusqu'à 100 %
Acide acétique, jusqu'à 1 M
Acide chlorhydrique, jusqu'à 0,1 M
Pour la séparation de composés très hydrophobes. Volatile.
Urée jusqu'à 8 M (pH < 7)Bonne solubilité pour de nombreux composants.
L'activité biologique peut être maintenue à des contenus
uréiques inférieurs. Risque certain de carbamylation des
protéines.
(2) Faire sortir les bulles d'air et
pousser le piston jusqu'à la marque
sur le dispositif.
Isopropanol, jusqu'à 30 %
Bonne solubilité pour certains composés.
Additifs aux tampons
Comment remplir le dispositif de
stockage / expédition.
Acide formique, jusqu'à 70 %
Matrice
Bonne transparence UV. Convient lorsqu'il est nécessaire
de purifier des protéines dans des conditions de
11,5 NaOH à 0,05 M
Acide trifluoriacétique, jusqu'à 10 %
Données sur la colonne
Tris/HCl à 0,1 M, EDTA à 1 mM
8,6chlorhydrate de guanidine à 6 M dans Chlorhydrate de guanidine à 6 M Détermination du poids moléculaire de sous-unités.
SDS à 0,1 %, Tween ou équivalentBonne solubilité pour certaines protéines, par ex. les
protéines protéines. Bien s'assurer que vous équilibrez
complètement avec la solution de détergent.
Éviter :
Superdex 200
Environ 1,3 × 106
3 000–70 000
500–30 000
10 000–
1 000–100 000
0,5à 1,0 ml/min
1,5 ml/min
1,8 MPa, 18 bars, 261 psi
0,25–0,75 ml/
1 ml/min
1,5 MPa, 15 bars, 18 psi
Première utilisation
Agents oxydants
q
Solutions non filtrées
Poids moléculaire, M i
3 000 à 70 000 (Superdex 75)
10 000 à 600 000 (Superdex 200)
Concentration en protéines
≤ 10 mg dans l'échantillon
Volume de l'échantillon
25 à 500 µl
Informations approfondies
Livraison / stockage
Fig 1. Illustration du verrouillage de l'adaptateur. La bague de verrouillage (noire) doit être en
position basse pour empêcher un réglage incontrôlé de la hauteur de matrice de la colonne.
La colonne est livrée avec un dispositif de stockage / expédition qui maintient
la pression dans la colonne et l'empêche ainsi de sécher. La colonne est équilibrée
avec de l'éthanol à 20 % dégazé.
S'assurer qu'il n'y a pas d'air dans la tubulure et les vannes avant de brancher
la colonne à un système de chromatographie. Retirer le dispositif de stockage /
expédition et la fiche d'arrêt de la colonne. Vérifier que l'adaptateur supérieur est
verrouillé (bague de verrouillage enfoncée, voir la figure 1). S'assurer que l'entrée de
la colonne est remplie de liquide et la brancher en goutte-à-goutte au système.
Équilibrer la colonne pour la première utilisation ou après un long stockage comme suit :
Si la colonne doit être stockée pendant plus de 2 jours après utilisation, laver la
colonne avec 2 volumes de colonne d'eau distillée puis équilibrer avec au moins
2 volumes de colonne d'éthanol à 20 %. Nous vous recommandons de brancher
le dispositif de stockage / expédition selon la section « Comment brancher
le dispositif de stockage / expédition » pour le stockage à long terme.
Remarque : S'assurer que la contre-pression de la colonne ne dépasse pas la
pression maximale recommandée (1,8 MPa pour Superdex 75 et 1,5 MPa pour
Superdex 200). Ceci est particulièrement important lorsque vous travaillez dans
des températures basses, par exemple dans une pièce froide.
q
Comment brancher le dispositif
de stockage / expédition.
Recommandations relatives aux échantillons
PréparationDissoudre l'échantillon dans l'éluant,
filtrer à travers un filtre de 0,22 µm
ou centrifuger à 10 000 g pendant 10 min.
a) Au moins 50 ml de H2O distillée à un débit de 0,5 ml/min.
b) 50 ml d'éluant à un débit de 0,5 ml/min.
q
Le tube en verre est revêtu d'un film plastique de protection. De petites quantités
d'air peuvent occasionnellement être piégées entre le verre et le film pendant la
fabrication. La surface inégale qui en résulte n'a pas de conséquence sur
la performance ou la durabilité de la colonne.
2
3
1
(1) Remplir l'entrée de la colonne et le
connecteur luer avec de l'éthanol
à 20 % et brancher le dispositif de
stockage / expédition rempli en
goutte-à-goutte au haut de la colonne.
(2,3) Placer le bouchon à ressort et le
fixer avec la goupille d'arrêt.
Optimisation
q
Effectuer une première analyse comme indiqué dans la section « Essayer d'abord
ces conditions ». Si les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants, envisager les
procédures suivantes :
Action
Effet
Réduire le débit
moléculaire Améliore la résolution pour les composants à poids
élevé.
La résolution de petits composants peut être réduite.
Réduire le Améliore la résolution.volume de l'échantillon
Changer la concentration Change la sélectivité.de solvant organique
Brancher deux colonnes Augmente la résolution en raison d'une hauteur de
matrice accrue. Maintenir en sériela contre-pression totale inférieure à 3 MPa pour Superdex
75 10/300 GL et 2,5 MPa pour Superdex 200 10/300 GL
Pour plus d'informations, consulter le manuel «Gel filtration, Principles & Methods »
(Filtration sur gel, principes et méthodes) qui peut être commandé auprès de
GE Healthcare, ou le « Method Handbook » (Manuel des méthodes) fourni avec chaque
système ÄKTAdesign.
Nettoyage en place (NEP)
Contrôle de performance de la colonne
Colonne Superdex 200 10/300 GL
Vérifier la performance de la colonne selon la procédure suivante :
Échantillon :
1. Thyroglobuline (M r 669 000) 5 mg/ml
Informations de commande
Effectuer le cycle de nettoyage régulier suivant tous les 10 à 20 cycles de séparation.
2. Ferritine (M r 440 000) 0,4 mg/ml
Désignation
3. BSA (M r 67 000) 8 mg/ml
4. ß-lactoglobuline (M r 35 000) 2,5 mg/ml
5. Ribonucléase A (M r 13 700) 5 mg/ml
Échantillon : 100 µl d'acétone à 0,5 % (5 mg/ml)
Nettoyage régulier :
Éluant :
solution tampon ou de H2O distillée
1. Laver la colonne avec 25 ml d'hydroxyde de sodium à 0,5 M alternativement avec
de l'acide acétique à 0,5 M à un débit de 0,5 ml/min.
Débit :
0,75 ml/min, température ambiante
2. Rincer immédiatement la colonne avec 25 ml d'eau distillée puis au moins 50 ml
de tampon éluant à un débit de 0,5 ml/min.
6. Cytochrome C (M r 13 600) 1,5 mg/ml
L'efficacité de la colonne, exprimée comme le nombre de plateaux théoriques par mètre,
N/m, est calculée grâce à l'équation suivante :
7. Aprotinine (M r 6 512) 2 mg/ml
8. Vitamine B12 (M r 1 355) 0,1 mg/ml
Avant l'analyse suivante, équilibrer la colonne jusqu'à ce que la base UV et le pH
soient stables.
N/m
Détection : 280 nm
Nettoyage plus strict :
1. Changer le filtre en haut de la colonne. (Puisque les contaminants arrivent avec
le flux liquide, la plupart d'entre eux sont capturés par le filtre.) Les instructions
de changement du filtre sont fournies avec le Kit du filtre. Effectuer un nettoyage
régulier comme décrit ci-dessus.
Selon la nature des contaminants, une des solutions de nettoyage de la page
précédente peut être utilisée. Toujours rincer avec au moins 2 volumes de colonne
d'eau distillée après avoir utilisé une des solutions de nettoyage.
Volume de l'échantillon :
500 µl
N/m
=
nombre de plateaux théoriques par mètre
Éluant :
Tampon de phosphate) 0,05 M, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
VR =
volume élué à partir du début de l'application de l'échantillon au maximum du pic
Débit :
0,4 ml/min, température ambiante
Wh
=
largeur de pic mesurée comme la largeur du pic enregistrée à mi-hauteur du pic
Détection :
280 nm
L
=
hauteur de la matrice (m)
Échantillon :
1. BSA (M r 67 000) 8 mg/ml
2. Ovalbumine (M r 43 000) 2,5 mg/ml
3. Ribonucléase A (M r 13 700) 5 mg/ml
4. Aprotinine (M r 6 512) 2 mg/ml
Si nécessaire, suspendre à nouveau 2–3 mm en haut de la matrice de gel et la retirer
avec une pipette Pasteur. Régler l'adaptateur pour éliminer l'espace au-dessus du gel.
5. Vitamine B12 (M r 1 355) 0,1 mg/ml
Volume de l'échantillon :
500 µl
Éluant :
Tampon de phosphate) 0,05 M, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
Débit :
0,4 ml/min, température ambiante
Détection :
280 nm
Dépannage
SymptômeSolution
Contre-pression accrue pièces de l'équipement
Confirmer que la colonne est la cause (voir ci-dessous). Si c'est le
cas, la nettoyerdans la colonne et/ou en suivant la procédure décrite dans la section « Nettoyage plusperte de résolution strict ».
A280 nm (mAU)
Pour confirmer que la contre-pression élevée du système est la une par une (en commençant par le collecteur de fractions) pendant que les pompes fonctionnent. Vérifier le relevé de pression après avoir débranché chaque pièce afin de déterminer la source de la contre-pression.
25.0
Air piégé dans la colonneAnalyser 80–100 ml de tampon éluant bien dégazé à un débit
de 0,5 ml/min. Noter que de petites quantités d'air ne doivent
normalement pas avoir de conséquences sur la performance
de la colonne.
2
1
60
8
7
40
4
3
5
6
N° de code
1
17-5176-01
Kit d'étalonnage pour filtration sur 1
gel à faible poids moléculaire
28-4038-41
Kit d'étalonnage pour filtration sur 1
gel à poids moléculaire élevé
28-4038-42
Nombre par paquet
N° de code
Kit de filtre Tricorn 10 *
1
29-0536-12
Filtre 1
18-1153-20
Connecteur Fingertight, 1/16" mâle 10
18-1112-55
Connecteur Union M6 femelle / 1/16" mâle
8
18-1112-58
Filtre en ligne (1/16")
1
18-1118-01
Connecteur 1/16" mâle vers luer femelle
2
18-1112-51
Dispositif de stockage / expédition
1
18-1176-43
Manuel :
Size exclusion chromatography Principles & Methods 1
(Chromatographie d'exclusion de taille)
18-1022-18
* Ranger à l'abri de la lumière du soleil.
5
0
20.0
q
q
15.0
2
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
ml
Fig 3. Chromatogramme typique d'un test de fonctionnement de Superdex 200 10/300 GL.
4
3
0.0
Remarque : Les pics 5 et 6 ne sont séparés l'un de l'autre que par une différence de forme.
1
5.0
0.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
ml
Fig 2. Chromatogramme typique d'un test de fonctionnement de Superdex 75 10/300 GL.
GE Healthcare Bio-Sciences AB
Björkgatan 30
751 84 Uppsala
Suède
Nombre par paquet
Désignation
20
10.0
Pour les coordonnées des bureaux locaux, visiter le site
www.gelifesciences.com/contact
17-5175-01
Accessoires
80
Si la performance de la colonne n'est toujours pas restaurée, injecter une solution
de 1 mg/ml de pepsine dans de l'acide acétique à 0,1 M contenant du NaCl à 0,5 M et
laisser reposer pendant la nuit à température ambiante ou une heure à 37 °C. Après le
traitement enzymatique, nettoyer la colonne en suivant la procédure décrite dans la
section « Nettoyage régulier ».
1
Superdex Peptide 10/300 GL
A280 nm (mAU)
Colonnes Superdex 75 10/300 GL
17-5174-01
Superdex 200 10/300 GL
Désignation
5,54 × (VR/Wh)2 / L
Comme alternative au test d'efficacité ci-dessus, vérifier la performance de la
colonne en effectuant le test de fonctionnement décrit dans la figure 2 et 3.
N° de code
1
Produits connexes
=
où,
Nombre par paquet
Superdex 75 10/300 GL
GE Healthcare Europe GmbH
Munzinger Strasse 5, D-79111 Freiburg, Allemagne
GE et le monogramme GE sont des marques de commerce de General Electric Company.
GE Healthcare UK Ltd
Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, R-U
© 2002-2014 General Electric Company – Tous droits réservés.
Première publication : mars 2002
GE Healthcare Bio-Sciences Corp
800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, États-Unis
GE Healthcare Japan Corporation
Sanken Bldg, 3-25-1, Hyakunincho, Shinjuku-ku, Tokyo 169-0073, Japon
www.gelifesciences.com/protein-purification
71-5017-96 AK 12/2014
ÄKTA, Superdex et Tricorn sont des marques de commerce des sociétés GE Healthcare.
Tous les produits et services sont vendus conformément aux conditions générales de vente de la
société au sein de GE Healthcare qui les fournit. Une copie de ces conditions générales est disponible
sur demande. Contacter un représentant GE Healthcare local pour obtenir les informations les plus
récentes.
q
q