Superose 6 10/300 GL Superose 12 10/300 GL

Informations approfondies
a) 12 ml d'eau distillée à 0,2 ml/min à température ambiante
b) 38 ml d'eau distillée à 0,5 ml/min à température ambiante
Instructions 71-5017-95 AI
Colonnes à haute performance
Livraison / stockage
Remarque : S'assurer que la contre-pression de la colonne ne dépasse pas 1,2 MPa
pendant l'équilibrage.
La colonne est livrée avec un dispositif de stockage / expédition qui maintient
la pression dans la colonne et l'empêche ainsi de sécher. La colonne est équilibrée
avec de l'éthanol à 20 % dégazé.
Superose 12
TM
b) 50 ml d'éluant à 0,5 ml/min à température ambiante
S'assurer que la contre-pression de la colonne ne dépasse pas 2 MPa pendant
l'équilibrage.
Essayer d'abord ces conditions
Superose 6 10/300 GL et Superose 12 10/300 GL sont des colonnes Tricorn™
à haute performance. Les colonnes sont des colonnes en verre préremplies pour une
filtration sur gel à haute performance de protéines, peptides et autres biomolécules
naturelles, recombinantes ou synthétiques.
Éluant :
Tampon de phosphate à 50 mM, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
Débit :
Superose 6 ; 0,1 à 0,5 ml/min, température ambiante
Superose 12 ; 0,5 à1 ml/min, température ambiante
Volume de
l'échantillon :
La colonne est fournie avec deux connecteurs fingertight mâles 1/16" pour un
branchement aux systèmes ÄKTA™ design et deux connecteurs Union 1/16" mâle /
M6 femelle pour un branchement à un système FPLC.
Composite d'agarose réticulé
Dimensions de la matrice
10 × 300 à 310 mm
Volume de matrice
Environ 24 ml
stabilité du pH
utilisation régulière
nettoyage
3 à 12
1 à 14
Température
fonctionnement
stockage
4 °C à 40 °C
4 °C à 30 °C
Superose 6
Superose 12
Efficacité de la colonne, N/m
> 30 000 m-1
> 40 000 m-1
Limite d'exclusion, Mi , protéines globulaires
4 approx. × 107
2 approx. × 106
Plage de séparation optique (protéines globulaires)
5 000–5 × 10 1 000–3 × 10
Taille moyenne des particules
13 μm
11 μm
Débit (eau à température ambiante)
recommandé
maximum
0,1 à 0,5 ml/min
1 ml/min
0,5 à 1 ml/min
1,5 ml/min
Pression dans la colonne
maximum
1,5 MPa, 15 bars,
218 psi
3 MPa, 30 bars,
435 psi
1
(1)Pousser le bouchon à ressort vers
le bas
2
(2)
25 μl
3
Retirer la goupille d'arrêt
(3)Libérer le bouchon et dévisser
le dispositif
L'équilibrage n'est pas nécessaire entre les analyses effectuées avec le même
tampon éluant. Merci de lire la section « Optimisation » pour obtenir des
informations sur comment optimiser une séparation.
Installer un filtre en ligne en amont de la vanne d'injection. Les tampons et solvants à
viscosité élevée ont un impact sur la contre-pression et sur le débit. Dégazer et filtrer
toutes les solutions à travers un filtre de 0,22 µm.
q
5
Comment remplir le dispositif de
stockage / expédition.
Agents oxydants
Solutions non filtrées
Première utilisation
Superose 6
S'assurer qu'il n'y a pas d'air dans la tubulure et les vannes avant de brancher
la colonne à un système de chromatographie. Retirer le dispositif de stockage /
expédition et la fiche d'arrêt de la colonne. Vérifier que l'adaptateur supérieur est
verrouillé (bague de verrouillage enfoncée, voir la figure 1). S'assurer que l'entrée
de la colonne est remplie de liquide et la brancher en goutte-à-goutte au système.
Superose 6 gonfle légèrement lors du passage de l'éthanol à l'eau. Pour éviter une
contre-pression locale élevée, suivre les étapes suivantes pour l'équilibrage initial :
q
(2)Faire sortir les bulles d'air et pousser
le piston jusqu'à la marque sur
le dispositif.
2
3
1
Éviter
Fig 1. Illustration du verrouillage de l'adaptateur. La bague de verrouillage (noire)
doit être en position basse pour empêcher un réglage incontrôlé de la hauteur de
matrice de la colonne.
(1)Connecter une seringue ou une pompe
au dispositif de stockage / expédition
et le remplir avec de l'éthanol à 20 %
au-dessus de la marque sur le tube.
Retirer la seringue ou le branchement
à la pompe.
Nettoyage
Acétonitrile, jusqu'à 30 %
Hydroxyde de sodium, jusqu'à 1 M
Méthanol, jusqu'à 100 %
Éthanol, jusqu'à 20 % (70 % pour Superose 12)
Acide acétique, jusqu'à 1 M
Isopropanol, jusqu'à 24 %
Acide chlorhydrique, jusqu'à 0,1 M
Exigences / recommandations pour les échantillons
Poids moléculaire, Mi
5 000–5 × 106 (Superose 6)
1 000–3 × 105 (Superose 12)
Concentration en protéines
≤ 10 mg dans l'échantillon
Volume de l'échantillon
25 à 500 μl
PréparationDissoudre l'échantillon dans l'éluant, filtrer
à travers un filtre de 0,22 µm ou centrifuger
à 10 000 g pendant 10 min.
Tampon / Éluant
Propriétés / exemple d'application
5,0
acétate d'ammonium
de 0,02 à 0,1 M
Bonne solubilité pour certaines enzymes,
par ex. les cellulases. Volatile.
7,2
phosphate à 0,05 M
+ NaCl à 0,15 M
Conditions physiologiques.
7,8
carbonate acide
d'ammonium à 0,15 M
Convient pour certaines séparations d'ADN et de
protéines. Volatile. Doit être utilisé frais.
7,0–8,0 Tris / HCl de 0,02 à 0,1 M
EDTA à 1 mM
Système de tampon convenant à de nombreuses protéines.
Très bonne solubilité pour l'ADN et l'ARN.
8,6
chlorhydrate de
guanidine à 6 M dans
Tris-HCl à 50 mM
Bonne transparence UV. Convient aux grands
fragments de protéines pouvant être dialysés
pour éliminer la guanidine.
11,5
NaOH à 0,05 M
Bonne solubilité pour certains composés.
Acétonitrile jusqu'à 30 % tampon
Pour la séparation de composés très
approprié Urée jusqu'à 8 M (pH < 7)
hydrophobes. Volatile.
Bonne solubilité pour de nombreux
composants. Convient aux études de
repliement. L'activité biologique peut être
maintenue à un contenu uréique inférieur.
Risque certain de carbamylation des
protéines.
Tampons et résistance au solvant
Tous les tampons aqueux couramment utilisés, pH 3 à 12
Urée, jusqu'à 8 M
Acétonitrile, jusqu'à 30 % dans les tampons aqueux
Détergents ioniques et non ioniques
Chlorhydrate de guanidine, jusqu'à 6 M
Acide formique, jusqu'à 70 % (uniquement Superose 12)
pH
Additifs aux tampons
Usage quotidien
6
Tableau 1. Compositions d'éluants utiles.
Comment retirer le dispositif de
stockage / expédition.
Si la viscosité des tampons et des échantillons est élevée, vous devrez peut-être
choisir un débit inférieur afin de maintenir la pression sous la limite recommandée.
Données sur la colonne
Matrice
Le tableau 1 présente une liste de compositions d'éluants utiles.
Le tube en verre est revêtu d'un film plastique de protection. De petites quantités
d'air peuvent occasionnellement être piégées entre le verre et le film pendant la
fabrication. La surface inégale qui en résulte n'a pas de conséquence sur
la performance ou la durabilité de la colonne.
Remarque : La précipitation de l'échantillon peut bloquer le filtre et provoquer
la compression du gel. Nous conseillons donc de ne jamais régler
le contrôle de limite de pression à plus de 0,2 MPa au-dessus de la
pression de fonctionnement réelle.
Informations rapides
L'éluant doit être choisi pour garantir que l'échantillon soit entièrement soluble.
De plus, essayer de choisir un éluant qui simplifie les applications en aval. Par
exemple, si les protéines / peptides doivent être lyophilisées, un éluant volatile est
nécessaire. Comme certaines interactions dépendantes du pH peuvent se produire
avec les protéines acides et basiques à de très faibles concentrations en sel, un
tampon recommandé est du phosphate de sodium à 50 mM, du NaCl à 0,15 M, pH 7.
Si la colonne doit être stockée pendant plus de 2 jours après utilisation, laver la
colonne avec 2 volumes de colonne d'eau distillée puis équilibrer avec au moins
2 volumes de colonne d'éthanol à 20 %. Nous vous recommandons de brancher
le dispositif de stockage / expédition selon la section « Comment brancher
le dispositif de stockage / expédition » pour le stockage à long terme.
a) 50 ml d'eau distillée de 0,2 à 0,5 ml/min à température ambiante
Superose 6 10/300 GL et
17-5173-01 Superose 12 10/300 GL
17-5172-01
c) 50 ml d'éluant à 0,5 ml/min à température ambiante
Choix d'éluant
Comment brancher le dispositif
de stockage / expédition.
(1)Remplir l'entrée de la colonne et le
connecteur luer avec de l'éthanol
à 20 % et brancher l'appareil de
stockage / expédition rempli en
goutte-à-goutte au haut de la colonne.
(2,3)Placer le bouchon à ressort et le fixer
avec la goupille d'arrêt.
q
chlorhydrate de
de guanidine 6 M repliement.
Déterminations du poids moléculaire de
sous-unités. Convient aux études de
Détergent de 0,1 à 2 %, par par ex. SDS, Tween™ ou équivalent.
Bonne solubilité pour certaines protéines,
protéines membranaires. Bien ex. s'assurer d'équilibrer complètement avec la solution de détergent.
Agent de réduction
de 0,5 à 10 mM par
ex. 2-mercaptoéthanol,
dithiothréitol ou équivalent.
Protège les protéines de l'oxydation, par ex.
les cystéines libres ne sont pas dérivées.
Optimisation
Effectuer une première analyse comme indiqué dans la section « Essayer d'abord
ces conditions ». Si les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants, envisager les
procédures suivantes :
Action
Effet
Réduire le débit
Améliore la résolution pour les composants
à poids moléculaire élevé. La résolution de
petitscomposants peut être réduite.
Réduire le volume de l'échantillon
Améliore la résolution
Changer la concentration
de solvant organique
Change la sélectivité
Brancher deux colonnes
en série
Résolution accrue en raison d'une
hauteur de matrice plus élevée. Maintenir
la contre-pression totaleinférieure à 2,5 MPa
pour Superose 6 10/300 GL et 4 MPa pour
Superose 12 10/300 GL.
Pour plus d'informations, consulter le manuel « Gel filtration, Principles & Methods »
(Filtration sur gel, principes et méthodes) qui peut être commandé auprès de GE
Healthcare ou le « Method Handbook » (Manuel des méthodes) fourni avec chaque
système ÄKTA design.
q
Nettoyage en place (NEP)
Contrôle de performance de la colonne
Effectuer le cycle de nettoyage régulier suivant tous les 10 à 20 cycles de séparation.
Vérifier régulièrement la performance de la colonne selon la procédure suivante :
Nettoyage régulier :
Échantillon :
100 µl d'acétone à 0,5 % (5 mg/ml)
Éluant :
Eau distillée
Débit :
0,6 ml/min, Superose 6
1.
2.
Laver la colonne avec 25 ml d'hydroxyde de sodium à 0,5 M alternativement
avec de l'acide acétique à 0,5 M à un débit de 0,5 ml/min.
Rincer immédiatement la colonne avec 25 ml d'eau distillée puis au moins 50 ml
de tampon éluant à un débit de 0,5 ml/min.
0,75 ml/min, Superose 12
Détection :
280 nm
Colonne Superose 12 10/300 GL
Avant l'analyse suivante, équilibrer la colonne jusqu'à ce que la base UV et le pH
soient stables.
L'efficacité de la colonne, exprimée en nombre de plateaux théoriques par mètre,
N/m, est calculée grâce à l'équation suivante
Nettoyage plus strict :
N/m = 5,54 × (VR /Wh)2 / L
1.
vR = volume élué à partir du début de l'application de l'échantillon au maximum du pic
5
150
wh = largeur de pic mesurée comme la largeur du pic enregistrée à mi-hauteur du pic
L = hauteur de la matrice (m)
Si nécessaire, suspendre à nouveau 2 à 3 mm en haut de la matrice de gel et la
retirer avec une pipette Pasteur. Régler l'adaptateur pour éliminer l'espace
au-dessus du gel.
Dépannage
SymptômeSolution
Confirmer que la colonne est la causedans la
(voir ci-dessous). Si tel est le cas, nettoyer en
la procédure décrite dans la section « Nettoyage plus strict ».
0
Superose 6 10/300 GL (Tricorn)
1. Thyroglobuline (Mr 669 000) 5 mg/ml
2. Ferritine (Mr 440 000) 0,4 mg/ml
3. BSA (Mr 67 000) 8,0 mg/ml
4. Ribonucléase A (Mr 13 700) 1,0 mg/ml
500 μl
0,0
5,0
q
120
100
3
80
4
1
40
20
5,0
10,0
15,0
20,0
ml
Fig 2. Chromatogramme typique d'un test de fonctionnement de Superose 6 10/300 GL.
Nombre par paquet
N° de code
Superose 6 10/300 GL
1
17-5172-01
Superose 12 10/300 GL
1
17-5173-01
Produits connexes
Nombre par paquet
N° de code
Superdex™ 75 10/300 GL
1
17-5174-01
Superdex 200 10/300 GL
1
17-5175-01
Superdex peptide 10/300 GL
1
17-5176-01
Kit d'étalonnage pour filtration
sur gel à faible poids moléculaire
1
17-0442-01
Kit d'étalonnage pour filtration
sur gel à poids moléculaire élevé
1
17-0441-01
Accessoires
0
0,0
20,0
Informations de commande
2
60
15,0
Fig 3. Chromatogramme typique d'un test de fonctionnement de Superose 12
10/300 GL.
Produit
q
10,0
ml
Phosphate à 0,050 M, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
0,5 ml/min
ÄKTAFPLC
280 nm
mAU 280
4
1
50
Colonne Superose 6 10/300 GL
Colonne :
Échantillon :
Volume de l'échantillon (charge) :
Éluant :
Débit :
Système :
Détection :
2 3
100
Pour une alternative à l'efficacité, tester la performance de la colonne en effectuant
un test fonctionnel comme décrit dans les figures 2 et 3.
Si la performance de la colonne n'est toujours pas restaurée, injecter une solution
de 1 mg/ml de pepsine dansde l'acide acétique à 0,1 M contenant du NaCl à 0,5 M et
laisser reposer pendant la nuit à température ambiante ou une heure à 37 °C. Après
le traitement enzymatique, nettoyer la colonne en suivant la procédure décrite dans
la section « Nettoyage plus strict » ci-dessus.
Air piégé dans la colonneInverser le flux et analyser 80 à 100 ml
de tampon éluant bien dégazé à un
débit de 0,5 ml/min. Noter que de petites
quantitésd'air ne doivent normalement pas
avoir de conséquences sur laperformance
de la colonne.
Phosphate à 0,050 M, NaCl à 0,15 M, pH 7,0
0,5 ml/min
ÄKTAFPLC
280 nm
N/m = nombre de plateaux théoriques par mètre
Selon la nature des contaminants, une des solutions de nettoyage de la page
précédente peut être utilisée. Toujours rincer avec 2 volumes de colonne d'eau
distillée après avoir utilisé une des solutions de nettoyage.
Pour confirmer que la contre-pression élevée
du système est causée par la colonne,
débrancher les pièces de l'équipement une
par une (en commençant par le collecteur
de fractions) lorsque les pompes
fonctionnent. Vérifier le relevé de pression
après avoir débranché chaque pièce pour
déterminer la source de la contre-pression.
Superose 12 10/300 GL (Tricorn)
1. IgG (Mr 150 000) 2,5 mg/ml
2. BSA (Mr 67 000) 8,0 mg/ml
3. β-Lactoalbumine (Mr 35 000) 2,5 mg/ml
4. Cytochrome C (Mr 12 700) 1,0 mg/ml
5. Vitamine B12 (Mr 1 355) 0,3 mg/ml
500 μl
mAU 280
où,
Changer le filtre en haut de la colonne. (Puisque les contaminants arrivent avec
le flux liquide, la plupart d'entre eux sont capturés par le filtre.) Les instructions
de changement du filtre sont fournies avec le Kit du filtre. Effectuer un
nettoyage régulier comme décrit ci-dessus.
Contre-pression accrue
colonne et/ou
suivantperte de résolution
Colonne :
Échantillon :
Volume de l'échantillon (charge) :
Éluant :
Débit :
Système :
Détection :
Nombre par paquet
N° de code
Kit de filtre Tricorn 10*
1
Filtre
118-1153-20
29-0536-12
Connecteur Fingertight, 1/16" mâle
10
18-1112-55
Connecteur Union M6 femelle / 1/16" mâle
8
18-1112-58
Filtre en ligne (1/16")
1
18-1118-01
Connecteur 1/16" mâle vers luer femelle
2
18-1112-51
Dispositif de stockage / expédition
1
18-1176-43
Manuel :
Gel filtration Principles & Methods
(Filtration sur gel, principes et méthodes)
1
18-1022-18
* Ranger à l'abri de la lumière du soleil.
Pour les coordonnées des bureaux locaux, visiter
le site www.gelifesciences.com/contact
GE Healthcare Bio-Sciences AB
Björkgatan 30
751 84 Uppsala
Suède
GE Healthcare Europe GmbH
Munzinger Strasse 5, D-79111 Freiburg, Allemagne
GE et le monogramme GE sont des marques de commerce de General Electric Company.
GE Healthcare UK Ltd
Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, R-UK
Tween est une marque déposée de Uniqema Americas LLC.
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800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, États-Unis
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71-5017-95 AI 03/2014
ÄKTA, Superdex, Superose et Tricorn sont des marques de commerce des sociétés GE Healthcare.
Tous les produits et services sont vendus conformément aux conditions générales de vente de la
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sur demande. Contacter un représentant GE Healthcare local pour obtenir les informations les plus
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