Ethique, expérimentation animale et recherche en

STAL Volume 37 / 2ème Trimestre 2011
ARTICLES
Ethique, expérimentation animale et
recherche en cancérologie
Crédit photo : PBES
Kevin THIBAULT-DUPREY1
■ Patricia VRIGNAUD2
■ Nicolas DUDOIGNON3
■ Virginie DANGLES-MARIE4
■
1) Kevin THIBAULT-DUPREY
sanofi aventis R&D
Disposition, Safety & Animal Research
Animal Research & Welfare
13 quai Jules Guesde
94400 Vitry sur Seine
[email protected]
Patricia VRIGNAUD
sanofi aventis R&D
Division Oncologie
13 quai Jules Guesde
94400 Vitry sur Seine
[email protected]
2)
Nicolas DUDOIGNON
sanofi aventis R&D
Disposition, Safety & Animal Research
Project, Standards and Innovation / Animal
Research & Welfare
1 av Pierre Brossolette
91385 Chilly-Mazarin Cedex
[email protected]
3)
Virginie DANGLES-MARIE
Institut Curie
Centre de Recherche
Plateforme d’Expérimentation in vivo
& Laboratoire d’Investigation Préclinique
12 rue Lhomond
75005 Paris
[email protected]
4)
Résumé
Malgré la part de plus en plus importante des modèles in vitro et les récents progrès en matière de modélisation in silico, en l’état actuel des
connaissances scientifiques, l’utilisation des animaux de laboratoire en
oncologie reste incontournable, qu’il
s’agisse d’essais réglementaires d’efficacité ou encore d’études dédiées à
une meilleure compréhension du processus cancéreux et à l’identification
de nouvelles cibles thérapeutiques.
La responsabilité morale vis-à-vis du
nombre d’animaux utilisés et des
conditions de leur utilisation est importante pour tous les acteurs de la
recherche in vivo. Peu d’articles détaillent les aspects techniques dont
l’application contribue à la démarche
éthique au quotidien dans les laboratoires et les animaleries expérimentales. Les recommandations qui suivent tentent d’établir un consensus
sur les priorités et les limites
concrètes à se fixer lors d’études sur
l’animal dans le domaine de l’oncologie et notamment les modèles de tumeurs in vivo.
Summary
Even if more and more interesting in
vitro models exist and if progress in
computerised « in silico » models has
been done, with the scientific knowledge of nowadays, the use of laboratory animals in oncology is still necessary for regulatory efficacy testing,
studies dedicated to a better understanding of the cancerous growth and
for the identification of new therapeutic targets. Regarding the number
of animals used and the conditions of
their use, moral responsibility of all
participants of in vivo research is important. Few articles focus on the
technical aspects of research that
contribute to a better ethical approach
in laboratories and animal facilities.
The following guidelines try to establish a consensus on concrete priorities and limits to be set when performing studies on lab animals in the
field of oncology and particularly in
vivo tumour models.
Introduction
Bien que le développement des méthodes substitutives permettant d’éviter l’utilisation des animaux en recherche soit fortement encouragé, de
nombreuses questions dans le domaine de la recherche oncologique
ne peuvent trouver des réponses
qu’en étudiant la croissance tumorale
in vivo.
Il y alors lieu de tenir compte du fait
que des animaux présentant des tumeurs locales ou disséminées éprouvent vraisemblablement de la douleur
et/ou de la détresse justifiant une attention et des soins particuliers de la
part des chercheurs et de l’ensemble
du personnel zootechnique. De même,
les techniques utilisées en cancérologie expérimentale (préparations chirurgicales, irradiations, administration
de substances…) peuvent engendrer
douleur et inconfort. Il est donc nécessaire d’établir des bonnes pratiques concernant l’éthique animale
en oncologie. De telles recommandations ont été publiées (UKCCCR 1998,
Workman et al. 2010), s’appuyant sur
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la règle des 3R : Remplacement des
animaux de laboratoire, Réduction du
nombre d’animaux et Raffinement
dans les techniques utilisées (Russel
Burch 1959).
Dans le cadre d’un effort continu de
raffinement des procédures, un intérêt particulier est porté dans ces recommandations sur la prédiction et la
reconnaissance d’effets adverses et la
mise en œuvre de points limites. Rappelons que le point limite ou point
d’arrêt anticipé est défini comme le
seuil de douleur ou de détresse à éviter par exemple en interrompant l’expérience, en apportant des soins à
l’animal ou en pratiquant une euthanasie anticipée (Schiffer et al. 1997).
Ce point doit être le plus précoce possible, tout en restant compatible avec
les objectifs scientifiques de la recherche, afin d’éviter aux animaux
toute douleur ou détresse inutile. La
majorité des travaux en recherche expérimentale sur les néoplasies utilisant les petits mammifères de laboratoire et particulièrement les
rongeurs, une expertise importante
existe déjà sur ces espèces. Cependant, les principes généraux sont applicables à toutes les espèces animales.
A notre connaissance, il n’existe pas
de texte français dédié à l’éthique en
expérimentation animale dans le domaine de la cancérologie. Les recommandations suivantes présentent un
intérêt à la fois pour les équipes réalisant des études impliquant le développement de tumeurs chez l’animal
de laboratoire (Weiswald Dangles-Marie, 2009) qu’elles soient « spontanées » (incluant celles des animaux
génétiquement modifiés), qu’elles
soient produites par transplantation
(incluant les passages de tumeurs en
routine, les implantations orthotopiques et les hybridomes) ou qu’elles
soient induites par des agents carcinogènes, incluant également les tumeurs obtenues lors des essais réglementaires
de
toxicité
pro-cancéreuse de produits chimiques (Maliver Schorsh 2009). Ces
recommandations sont particulièrement utiles pour la conception et la
réalisation des protocoles dans le respect des principes éthiques, mais
aussi pour l’évaluation éthique des
projets. Il est important de préciser
que ces recommandations correspondent à de grandes lignes directrices et doivent être réfléchies au cas
par cas afin que la mise en place soit
adaptée à chaque modèle de néoplasie expérimentale, particulièrement
lors de la détermination de points limites.
Après une première partie sur les
principes généraux inhérents à toute
expérience sur l’animal, les particularités propres au domaine de la cancérologie seront développées.
Principes généraux
Comme toute recherche expérimentale impliquant le recours à l’animal
de laboratoire, l’expérimentateur se
doit de suivre une approche coût/bénéfice, en évaluant les probables effets douloureux et stressants observés
sur les animaux utilisés par rapport
aux bénéfices attendus du travail réalisé. Le cancer est un problème majeur de Santé Publique (147 000
morts et 319 000 nouveaux cas par
an en France) nécessitant toujours de
nouveaux traitements et le bénéfice
potentiel de la recherche contre le
cancer reste évident. Néanmoins, la
possibilité d’utiliser des méthodes
substitutives n’impliquant pas l’ani-
mal doit toujours être considérée.
Ainsi, un panel de 60 lignées cellulaires cancéreuses humaines a été
développé et caractérisé par le National Cancer Institute, à Bethesda, en
vue d’introduire une étape de criblage
préliminaire de médicaments candidats sur des lignées cellulaires tumorales humaines avant les essais sur
l’animal (Boyde 1986). De nombreuses informations sur ces lignées
sont disponibles sur le site du Developmental Therapeutics Program
(http://dtp.nci.nih.gov). De plus, l’utilisation d’animaux pour des études
d’effets thérapeutiques de substances
administrées sans détermination
préalable d’une possible activité biologique in vitro ou ex vivo nécessite
une justification spécifique et une argumentation forte.
Le nombre d’animaux utilisés se doit
d’être restreint au plus petit nombre
nécessaire à l’atteinte de l’objectif de
l’étude. Ce nombre doit néanmoins
rester suffisant et statistiquement validé afin d’éviter d’avoir à dupliquer les
études, l’avis de biostatisticiens est
donc généralement nécessaire. L’ensemble des données expérimentales,
incluant les données de zootechnie,
est pris en compte. Ainsi, dans les
études exploratoires initiales de toxicité du médicament, certains auteurs
affirment que deux souris par groupe
sont suffisantes (Burtles et al. 1995) ;
en pratique, l’hébergement en trio
étant mieux toléré surtout chez les
souris mâles, trois animaux par
groupe seront souvent appropriés
pour cette espèce.
Une connaissance du statut sanitaire
de l’unité microbiologique hébergeant
les animaux permettra de vérifier l’absence d’agents interférents qui peuvent être à l’origine d’une hétérogé-
néité des résultats expérimentaux, le
domaine de la cancérologie étant particulièrement sensible à de nombreux
microorganismes interférents (GVSOLAS 1999) ou opportunistes. Une
infection asymptomatique des animaux peut ainsi affecter les propriétés
de la tumeur, par exemple le développement de métastases (RodriguezCuesta et al. 2005).
Les animaux transgéniques sont largement utilisés en oncologie fondamentale, notamment grâce au développement de modèles sophistiqués
d’induction d’expression d’oncogènes
ou de répression de gènes suppresseurs de tumeurs. Comme dans tout
travail avec les modèles transgéniques, l’importance du fond génétique sur le phénotype observé est à
souligner. Les études sont très souvent réalisées sur des fonds non purs,
ce qui implique de travailler avec des
contrôles wild-type appropriés (grâce
aux littermate qui partagent le fond
génétique mixte) et des groupes plus
grands d’animaux (en raison de résultats moins homogènes). Il est cependant conseillé de revenir à un fond
génétique pur pour maintenir la stabilité de la lignée transgénique, par
croisement avec une souche de fond
génétique pur (technique de backcross), ce qui permet une reproductibilité des études dans le temps et de
limiter les dérives dans les caractéristiques du modèle transgénique.
La mise en place d’une nouvelle expérience doit se baser sur les informations et les conseils pris auprès de
collègues compétents en la matière et
sur les données de la littérature. Dans
certains cas, des études pilotes sur
un petit nombre d’animaux sont nécessaires avant d’entreprendre les
mêmes procédures à une plus grande
échelle. Ces études préliminaires de
mise au point ont pour but de définir
la liste et la durée des signes cliniques
et aider à déterminer les points limites appropriés. L’utilisation de nouveaux modèles tumoraux in vivo nécessite en effet une investigation
initiale complète de la progression tumorale, incluant sur un nombre minimal d’animaux des exemples d’invasion locale et/ou de dissémination de
métastases.
Le niveau de douleur et de détresse
de chaque animal doit toujours être
minimisé par une utilisation appropriée d’anesthésiques, d’analgésiques, de techniques expérimentales
perfectionnées et par la mise en
œuvre de points limites les plus précoces. Le degré de gravité du protocole doit être déterminé a priori, c'està-dire avant la réalisation des études
pour définir s’il est susceptible d’engendrer de la douleur ou de la détresse. Plusieurs référentiels établissent pour des expériences types des
critères de sévérité et sont donc d’une
grande aide pour établir le degré de
sévérité d’une expérience donné
(Classification prospective des expériences sur animaux selon leur degré
de gravité, Office vétérinaire fédéral
Suisse). Cette évaluation préalable
sera obligatoire avec l’application de
la nouvelle directive européenne
(2010/63/UE). Elle tient compte à la
fois des procédures elles-mêmes, des
effets adverses et de toute mesure
pratique visant à diminuer la douleur
ou la détresse (Nowlan et al. 2009,
UKCCCR 1998).
La sévérité d’une procédure sur le
bien-être d’un animal est évaluée par
l’apparition de changements de comportement par rapport à la norme.
Aussi, la connaissance du comporte-
ment normal, ainsi que celle des valeurs et données physiologiques spécifiques à chaque espèce et souche
animale est une base indispensable.
De plus, les projets susceptibles d’engendrer de la douleur chez l’animal
font l’objet actuellement d’une déclaration obligatoire par le responsable
du projet, titulaire d’une autorisation
d’expérimenter, à la Direction Départementale de Protection des Populations préalablement à leur réalisation
(Bruyas et al. 2009).
Tout le personnel impliqué est formé
à la réalisation correcte des expériences menées et informé de sa responsabilité individuelle au niveau légal
et éthique. Une chaîne de responsabilité et de consultation claire devrait
être établie afin de réagir de façon
adéquate en cas d’observation de
souffrance animale. Ainsi, en toute
circonstance, des actions appropriées
peuvent être entreprises rapidement,
si par exemple l’état clinique d’un animal porteur de tumeurs se détériore
de façon inattendue ou si l’effet
propre de la tumeur est difficile à distinguer de l’effet du traitement thérapeutique. Ce processus de décision
inclut généralement à la fois le personnel réalisant les études in vivo, le
personnel destiné aux soins et à l’hébergement des animaux, un vétérinaire et éventuellement des membres
experts du comité d’éthique lors de
cas complexes. Des procédures de
travail incluant les détails sur les
points limites devraient être disponibles à tout le personnel concerné
par les soins et l’utilisation d’animaux
porteurs de tumeurs. Un système de
documentation des formations et des
compétences devrait être mis en
place et supervisé par une personne
expérimentée. Lorsque des expéri- 75
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mentateurs utilisent des procédures
peu communes, des informations et
des conseils devraient être fournis par
des collègues compétents, la littérature, voire des experts. De même,
l’utilisation d’un système de scores
numériques (cf. tableau I) peut aider à
formaliser la démarche en faveur de
la prise en charge des animaux et faciliter les prises de décisions, comme
par exemple quand il faut contacter
une personne de l’encadrement ou
lorsqu’il faut intervenir sur un animal.
Comme dans tout domaine de recherche biologique impliquant le recours à l’animal, il est possible que les
expérimentations de cancérologie fassent appel à des injections ou prélèvements biologiques sur animal vivant. Il faudra alors suivre les
recommandations relatives à ces
gestes expérimentaux (Guide de l’évaluation éthique des études sur animaux, GIRCOR 2009).
Ainsi, les composants sont à administrer dans des solutions aqueuses (eau
pour préparation injectable, sérum
physiologique, soluté glucose 5 %)
avec un pH le plus proche du pH physiologique. Si des solvants organiques
sont utilisés, comme le DMSO, la
quantité devrait être limitée à 1 mL/kg
ou 5 % du volume injecté. Les détergents comme le Tween 80, les solubilisateurs, les émulsifiants ne devraient
pas dépasser 5 % du volume injecté.
Quant aux cyclodextrines, un maximum de 2 mL/kg ou 45% en volume
est conseillé. De plus, une réhydratation devrait être menée dans les 2 à
4 heures suivant l’injection de cyclodextrine (Workman et al. 2010).
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Biologie des tumeurs
L’évaluation éthique préalable d’expériences de genèse et de croissance
tumorales sur l’animal ne peut se faire
sans la caractérisation du modèle tumoral lui-même. Pour les tumeurs
spontanées ou transplantées, les caractéristiques importantes à évaluer
comprennent :
1) le taux de croissance tumorale (vitesse, homogénéité, taux de prise en
fonction de la ‘taille’ du greffon : volume des fragments ou nombre de
cellules),
2) la distension des tissus environnants,
3) le site de croissance de la tumeur
et
4) le caractère agressif de la tumeur
(infiltration des tissus adjacents, potentiel métastatique, taille tumorale
induisant des ulcérations et production éventuelle de facteurs cachectisants).
Ces caractéristiques, qui définissent le
profil de la tumeur, devraient être déterminées lors d’études préliminaires.
Les méthodes d’implantation ou d’induction tumorale doivent être choisies de façon à minimiser le traumatisme engendré à l’animal hôte. Les
méthodes d’induction tumorale utilisant des carcinogènes, des virus ou
des manipulations génétiques peuvent affecter la nature et la localisation des tumeurs. Les animaux risquant de développer de telles tumeurs
devraient être observés particulièrement fréquemment afin de détecter
les signes du développement tumoral
ou d’une maladie associée.
La contamination de lignées cellulaires tumorales par des virus ou
d’autres microorganismes peut compromettre les résultats expérimentaux
et causer une épidémie parmi les animaux de laboratoire. Un criblage de
ces lignées cellulaires vis-à-vis des virus des rongeurs est fortement re-
commandé. Il est maintenant aisé à
l’aide de PCR de détecter rapidement
et avec une grande sensibilité la présence de ces contaminants. Par
exemple, le virus de Sendai est souvent utilisé pour induire la fusion cellulaire in vitro mais est pathogène
pour les souris et les rats. De plus, à
cause des erreurs fréquentes d’identification des lignées cellulaires (Lacroix 2008), il est indispensable de
vérifier la provenance et l’identité génétique des lignées cellulaires utilisées.
Le choix du site d’implantation pour
les tumeurs solides transplantables
ou chimio-induites nécessite également des précautions importantes et
une attention particulière devrait être
portée afin d’éviter les sites impliquant les organes des sens et ceux où
la tumeur aura des difficultés à grossir sans engendrer de la douleur. Les
croissances sous-cutanées ou intradermiques sur le dos ou sur le flanc
sont considérées comme causant le
moins de détresse chez l’animal. Au
contraire, la cavité intrapéritonéale
sera choisie seulement si cela correspond à la progression naturelle de
la tumeur à modéliser, de même pour
les sites intramusculaire, le cerveau
ou encore l’œil. Une attention supplémentaire sera également portée
lorsque plusieurs sites sont utilisés.
Evaluation de la sévérité
Une attention particulière devrait être
portée aux organes, tissus et systèmes biologiques susceptibles d’être
affectés par la procédure. Pour les tumeurs solides, cela inclura les ulcérations, la distension des tissus notamment cutanés et la cachexie. Dans
le cas de tumeurs provoquant de l’ascite, la distension abdominale, l’ané-
mie et la cachexie peuvent être importantes. De même, des anomalies
lymphatiques lors de lymphomes et
les troubles neurologiques induits par
les tumeurs intracérébrales ou disséminées sont des exemples de complications spécifiques à considérer.
Certaines dégradations du bien-être
animal peuvent être difficiles à observer, comme par exemple le développement d’une anémie ou la dissémination et la croissance de
métastases. Des investigations spécifiques peuvent être nécessaires pour
les détecter. L’apparition de l’anémie
en oncologie expérimentale est très
peu documentée contrairement aux
pathologies cancéreuses chez l’animal de compagnie. A noter que la pâleur des coussinets plantaires chez
les souches pigmentées est un moyen
non invasif de détection de l’apparition d’une anémie. Des expériences
pilotes de durée appropriée pourront
déterminer le niveau d’hématocrite
et/ou d’hémoglobine lors de l’apparition de la pâleur des coussinets.
Examens des animaux
La fréquence à laquelle les animaux
doivent être examinés afin de détecter des signes de douleur ou de détresse et l’ampleur de ces examens
seront définies par :
> la biologie connue de la tumeur
et/ou les effets de l’agent inducteur
> les effets de toute technique associée
> les effets attendus du traitement
expérimental
> le statut clinique fluctuant de l’animal.
Les tumeurs invasives ou à croissance
rapide nécessiteront une attention
plus fréquente et des soins plus approfondis seront nécessaires si le
poids tumoral augmente. Chaque animal portant une tumeur devrait être
examiné une fois par jour avec des
examens supplémentaires ou plus détaillés si l’état clinique des animaux se
dégrade. Cette fréquence devrait être
augmentée lors des périodes critiques
pendant lesquelles la potentielle souffrance de l’animal peut être anticipée. Le design expérimental devrait
être construit de sorte que cela n’arrive pas lorsque le personnel est absent. Une attention particulière devrait être apportée aux animaux dont
l’état clinique est détérioré.
Les techniques d’évaluation appropriées (exemple en tableau II) engloberont :
1) l’appréciation de l’état général,
comprenant l’apparence, la posture, la
mobilité, la température corporelle, le
comportement et les réponses physiologiques, l’estimation de la
consommation alimentaire et hydrique, la pesée pour déterminer les
changements de masse corporelle
(les augmentations et diminutions
comparées aux animaux contrôles
peuvent être à la fois associées à une
augmentation du poids tumoral) ;
2) la mesure de l’épaisseur de la tumeur afin d’évaluer son volume ou sa
masse et
3) l’inspection et la palpation pour localiser les sites de croissance tumorale comme pour évaluer les distensions, les ulcérations et les réductions
de mobilité tumorale.
Dans les expériences thérapeutiques
sur les tumeurs de rongeurs adultes,
il est recommandé que la perte de
poids de l’animal hôte n’excède normalement pas 15 % du poids de celui-ci au début de l’étude. Une perte
de poids de 20 % indique généralement une toxicité excessive et équi-
vaut souvent à une dose mortelle pour
environ 10% des animaux. Pour les
animaux plus jeunes, l’incapacité à
maintenir un gain de poids sur les
animaux contrôles non traités devrait
être considérée comme un indicateur
de toxicité (Workman et al., 2010).
D’autres techniques d’examen particulières seront plus pertinentes pour
des sites spécifiques, comme par
exemple la fréquence respiratoire
pour les lésions pulmonaires, les
troubles neurologiques ou les pertes
de poids irréversibles pour les néoplasmes cérébraux (Redgate et al.
1991) et les numérations-formules
sanguines pour les leucémies. Les dosages de marqueurs circulants mettant en évidence la présence de tumeurs sont également recommandés,
même si encore peu documentés et
peu développés. La laparotomie ou
l’endoscopie peut être appropriée
dans certains cas bien que les examens de choix soient de plus en plus
les différentes techniques d’imagerie
non invasive.
Enfin, l’autopsie systématique des
animaux en fin d’étude peut montrer
des effets secondaires non détectés
par les autres techniques et participer
à la meilleure connaissance du modèle utilisé.
Recherche de points limites
Une attention particulière devrait être
portée au choix de points limites pertinents pour les études de croissance
tumorale en gardant à l’esprit les objectifs de l’expérience et la biologie de
la tumeur. Sont à prendre en compte
les signes prévisibles de douleur, de
détresse et d’inconfort ou toute modification significative du comportement normal des animaux. Sauf précisions contraires justifiées sur le 77
STAL Volume 37 / 2ème Trimestre 2011
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protocole, les animaux devraient être
euthanasiés avant :
> d’être trouvés morts si cette mort
est prévisible
> de présenter un état clinique dégradé
> que la masse tumorale ne devienne
trop grosse, excessivement ulcérée
ou qu’elle empêche le comportement
normal de l’animal de façon inacceptable.
Il est à noter que les courbes de survie ne sont plus des éléments clés
de caractérisation des modèles tumoraux. De même dans les études
de toxicité aigüe, la mise en place des
points limites, tardifs dans ce type
d’étude, permettent d’euthanasier
l’animal avant qu’il ne meure (Sass
2000). Ceci permet également de disposer de matériel biologique exploitable, sans lésion d’autolyse postmortem, pouvant faire l’objet
d’extraction d’ARN et de marquage
histologique de qualité.
Dans tous les cas, une bonne connaissance du modèle et une définition
claire des objectifs de l’étude sont importantes afin d’anticiper et objectiver
ces situations, intervenir à bon escient et éviter de dupliquer une étude
pour cause de protocole mal construit.
Le retour d’expérience et la meilleure
connaissance de chaque modèle expérimental acquise au cours du temps
permettent d’affiner toujours plus les
critères de suivi des animaux et le
choix des points d’arrêt anticipés qui
en découle.
Un guide quantitatif précis ne peut
être donné sur les limites acceptables
de la charge tumorale puisque les
effets adverses sur l’hôte dépendront
de la biologie particulière de la tumeur, de sa localisation, de son mode
de croissance et de la nature des trai-
tements associés. Néanmoins, la
charge tumorale ne devrait normalement pas dépasser 5 % du poids
normal de l’animal hôte dans le cas où
les animaux sont utilisés pour les passages de tumeurs en routine et 10 %
chez les animaux impliqués dans les
essais thérapeutiques. Cette dernière
limite, i.e. 10%, représenterait typiquement une tumeur sous-cutanée
sur le flanc d’un diamètre de 17 mm
sur une souris de 25 g ou de 35 mm
chez un rat de 250 g. Des courbes de
calibration reliant le poids tumoral aux
diamètres mesurés devraient être établies rapidement et considérées
comme faisant partie de la caractérisation initiale de tout nouveau système tumoral. Les variations de mesures individuelles entre les différents
expérimentateurs devraient être
considérées. Bien que les tailles données ci-dessus servent de fourchettes
hautes, il est important d’insister sur
le fait que des problèmes peuvent
survenir avec des tumeurs bien plus
petites et que l’évaluation de l’état
clinique de chaque animal sera toujours un critère prépondérant.
Dans le cas des leucémies, la détermination de la charge tumorale est
difficile et n’a pas le même intérêt. Le
développement et l’utilisation de méthodes d’analyses hémato-biochimiques visant à mettre en évidence le
début d’une leucémie avant l’apparition de signes cliniques sont vivement
recommandés.
Ceci s’inscrit dans une démarche intégrée de meilleure caractérisation et
donc connaissance du modèle expérimental pour lequel les paramètres
mesurés pour les besoins de l’expérience servent également à évaluer
l’état général de l’animal et font partie des critères pris en compte dans la
détermination du point limite.
Pour toutes les tumeurs induisant de
l’ascite, des précautions sont à
prendre afin de s’assurer que le volume du liquide d’ascite ne devienne
pas excessif, causant une forte distension abdominale, et que des dépôts
solides et la cachexie ne deviennent
pas cliniquement significatifs. Le
poids de l’ascite ne devrait normalement pas dépasser 10 % du poids
corporel normal chez les souris et les
rats. Les ascites malignes devraient
être drainées uniquement après l’euthanasie des animaux.
Une surveillance particulière du développement des tumeurs chez les
animaux transgéniques est à mettre
en place. Un examen clinique minutieux devrait être effectué afin de permettre la détection à la fois des sites
de développement tumoral prévisibles
et imprévus. Cela devrait comprendre
le suivi pondéral, la palpation et la
surveillance de la détérioration éventuelle de l’état clinique. L’expérience
montre que ces animaux devraient
être examinés au moins deux fois par
semaine tout au long de leur vie et
plus si la tumeur est apparente.
Un soin particulier est porté aux conditions générales d’hébergement pour
qu’elles soient appropriées et adaptées à l’état connu ou aux altérations
attendues de l’état des animaux porteurs de tumeurs, notamment en
termes de litière, de structure de la
cage et d’accessibilité à l’eau et à la
nourriture. Par exemple, si on utilise
des maisons en plastique comme enrichissement de l’environnement pour
les souris, celles-ci ne devraient pas
comporter d’arêtes qui risqueraient
de blesser les tumeurs cutanées ou
sous-cutanées. D’autres enrichissements comme du papier absorbant
ou des tuyaux en carton peuvent alors
être utilisés.
Les points limites et autres procédures devraient être perfectionnés au
fur et à mesure de l’expérience acquise (par exemple les vitesses de
croissance, diamètres et poids tumoraux de chaque type tumoral, le développement éventuel de cachexie ou
de dyspnée pour les tumeurs pulmonaires, de cachexie).
Imagerie et 3R
L’imagerie in vivo, en permettant un
suivi longitudinal de la croissance tumorale chez les mêmes animaux, est
clairement reconnue comme une approche permettant de réduire le
nombre des animaux utilisés pour les
tumeurs disséminées. Réalisée dans
de bonnes conditions de confort pour
les animaux (manipulation délicate,
anesthésie), elle contribue également
au raffinement des techniques expérimentales. Cependant plusieurs
points méritent d’être approfondis afin
de veiller à une bonne pratique
éthique.
Ainsi, l’imagerie in vivo en cancérologie implique le plus souvent une immobilisation de l’animal obtenue très
souvent par contention chimique.
Les anesthésiques généraux induisent fréquemment une hypothermie
qu’il faudra contrôler. Les anesthésiques volatils tels que l’isoflurane et
le propofol en intraveineux sont à privilégier. En cas d’anesthésie longue
ou d’imagerie intravitale, une réhydratation parentérale (solution saline
de dextrose) peut être conseillée.
De nombreuses lignées tumorales
cellulaires « taggées » peuvent exprimer des protéines fluorescentes ou
de la luciférase, permettant de suivre
respectivement par imagerie à fluo-
rescence ou à bioluminescence, le
développement de tumeurs. Il est
alors important de vérifier à travers
des expériences pilotes que les propriétés des cellules cancéreuses
« taggées » sont restées inchangées
par rapport aux cellules cancéreuses
parentales, afin de connaître là encore le modèle expérimental utilisé.
Pour certaines technologies, un tel
suivi longitudinal suppose l’administration répétée d’agents de contrastes
et la mise en place de sondes et la
bonne tolérance de ces doses répétées doit être vérifiée. Dans d’autres
cas, une chambre de visualisation
(dorsal skin chamber) est fixée chirurgicalement sur le dos de la souris,
une asepsie rigoureuse et un temps limité d’utilisation de la chambre sont
alors obligatoires (Koel et al. 2009).
Enfin, il est important de vérifier si les
conditions expérimentales (anesthésiques utilisés, durée de l’anesthésie,
agents de contraste) ne modifient pas
la tolérance aux agents évalués dans
ces essais.
Documentation et publication
Il est important que toutes les expérimentations sur les animaux soient
menées et documentées en respectant le principe du partage des
meilleures pratiques. Il est vivement
conseillé aux chercheurs, pour chaque
modèle de tumeur utilisé dans leur
laboratoire, de documenter le comportement attendu de la tumeur et de
l’animal hôte dans différentes conditions expérimentales, y compris les
différentes thérapies. Ils devraient
également documenter le suivi des
animaux (tableau clinique et registre
comportemental) et le recours aux
points limites afin de diminuer la sévérité du modèle en termes de toxicité
aiguë et/ou retardée et de poids tumoral maximal, et indiquer tout problème particulier qui pourrait être rencontré lors de l’utilisation de chaque
modèle. De telles informations devraient être incorporées dans les protocoles de travail et diffusées largement pour le bénéfice de tous.
Afin d’accélérer la mise en place et la
diffusion des recommandations sur le
bien être animal dans les protocoles
expérimentaux, ces procédures doivent être également incluses dans les
articles de recherche. Certaines revues exigent ou encouragent cette
pratique. Ainsi les ARRIVE guidelines
(pour ‘Animal Research: Reporting of
In Vivo Experiments’) éditées par le
NC3Rs center sont adoptées par un
grand nombre de journaux (ex :
groupe Nature, groupe PLoS, Journal
of the National Cancer Institute).
Conclusion
Les animaux de laboratoire continuent
à jouer un rôle central dans la recherche contre le cancer. Les connaissances nouvelles issues de cette recherche contribuent non seulement
au bien-être et à la santé humaine,
mais aussi à la santé des animaux
qui développent des cancers. Cependant, l’utilisation d’animaux pour la
recherche sur le cancer est un privilège qui implique des obligations
scientifiques, professionnelles et morales. Cette approche éthique est à
intégrer dans les bonnes pratiques
quotidiennes au laboratoire. Une démarche active, nécessitant une analyse Coût/Bénéfice, et une analyse a
posteriori de validation des méthodes
de raffinement, doit impliquer l’équipe
zootechnique et le chercheur, avec le
support du vétérinaire et du Comité
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Ethique.
STAL Volume 37 / 2ème Trimestre 2011
ARTICLES
Tableaux
Tableau I : Exemple de score de douleur
Signes cliniques
Posture
Apparence générale
Consommation alimentaire
Perte / gain de poids
Consommation hydrique
Vocalisations
Comportement spontané
Comportement provoqué
Taille de la tumeur
Ulcération de la tumeur
Total
Scores
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/2
/ 20
Une note sur 20 est obtenue, qui peut aider à évaluer plus objectivement l’état clinique de l’animal. On peut considérer qu’une note en dessous de 10/20 correspond à un animal en détresse.
(Tableau d’après UKCCCR 1998)
Tableau II : Exemples de critères d’alarme en oncologie
SIGNES CLINIQUES NOTABLES
Action à mettre en place
Tumeur
Tumeur ulcérée
Poids tumoral ≥ 1.5 g avant un week-end chez la souris
Plaie / Traumatisme
Lésion sans effraction cutanée
Masse
Prolapsus
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Comportement/Mouvement
Agitation / Agressivité
Vocalisation anormale
Hypomobilité / Hyporéactivité
Décubitus après traitement
SIGNES CLINIQUES SÉVÈRES
Action IMMEDIATE à mettre en place
Tumeur avec perte de substance
Poids tumoral ≥ 2g chez la souris
Lésion sévère (automutilation, plaie suintante, morsures ou
mutilations provoquées par d’autres souris…)
Traumatisme (fracture …) Mauvaise tolérance locale du
traitement (i.v. ou s.c.) : lésion étendue et/ou difficulté/impossibilité de faire le traitement
Akinésie
Paralysie / Parésie
Décubitus
Difficulté / impossibilité de mobilisation
SIGNES CLINIQUES NOTABLES
Action à mettre en place
SIGNES CLINIQUES SÉVÈRES
Action IMMEDIATE à mettre en place
Comportement/Mouvement (suite)
Incoordination marquée (l’animal tourne sur lui-même)
Incoordination modérée Mouvements saccadés et désoTremblements généralisés
rientés de l’animal lorsque tenu par la queue
Convulsions
Résistance lors du traitement et/ou à la manipulation
Tourner en rond
Respiration
Respiration accélérée / ralentie
Respiration bruyante
Respiration difficile
Suffocation
Aspect général
Coloration anormale de la peau
Persistance du pli cutané
Aspect peau sèche
Voussure du dos / Dos cambré
Coloration autour du museau (rongeurs)
Froid au toucher
Flaccidité musculaire généralisée
Gonflement abdominal
Œdème (grosse tête)
Piloérection
Zone anogénitale souillée
Oeil
Chromodacryorrhée (sécrétion oculo-nasale rouge chez les
rongeurs)
Paupières closes ou mi-closes et/ou larmoiement ou écoulement
Excrétion
Fèces liquides
Fèces mucoïdes
Evolution pondérale
Absence de fèces (rongeurs uniquement)
Urines rouges
Perte de poids ≤ 15% sur plus de 72h comparativement :
Perte de poids > 15% sur plus de 72h comparativement :
soit au poids avant traitement pour une souris adulte soit
soit au poids avant traitement pour une souris adulte soit
aux souris de même âge traitées avec le véhicule Proaux souris de même âge traitées avec le véhicule
blèmes de dents (difficultés pour se nourrir)
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STAL Volume 37 / 2ème Trimestre 2011
ARTICLES
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