Guide d`utilisation des kits Perfect Master Mix SYBR

Guide d’utilisation des kits
Perfect Master Mix SYBR Green® Kits (avec ROX)
Pour les produits AnyGenes®:
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Cat # PMSX-R2S
Cat # PMSX-R4S
Cat # PMSX-R8S
Cat # PMSX-R12S
Cat # PMSX-R24S
(* Cat # pour toutes les références Perfect Master Mix SYBR Green® avec Fluorescéine
compatibles avec le système SignArrays® développé par AnyGenes®)
Utilisation uniquement à des fins de recherche
Stocker à -20°C à l’abri de la lumière
2014
Sommaire
I. Informations sur le produit ............................................................................... Error! Bookmark not defined.
1)
Introduction ....................................................................................................................................... 3
2)
Utilisation envisagée & autorisations .................................................... Error! Bookmark not defined.
3)
Contenu du kit ...................................................................................... Error! Bookmark not defined.
4)
Stockage et stabilité .............................................................................. Error! Bookmark not defined.
5)
Réactifs additionnels et équipement requis .......................................... Error! Bookmark not defined.
A) Réactifs: ................................................................................................................................................ 4
B) Matériel:................................................................................................................................................ 5
II. Protocole ........................................................................................................................................................ 5
1)
Avant de commencer... ...................................................................................................................... 5
2)
Procédure .......................................................................................................................................... 6
III. Informations complémentaires ...................................................................................................................... 8
AnyGenes®
Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green® (avec ROX)
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I.
Informations sur le produit
1) Introduction
Le qPCR Perfect Master Mix SYBR Green® est un prémix optimisé et pratique de composants (excepté
les primers et échantillons) nécessaires à la réalisation de la PCR en temps réel (qPCR).
Il contient une Taq DNA Polymerase thermo-stable ainsi que le tampon et du MgCl2 à des
concentrations optimisées pour obtenir les meilleures performances de l’enzyme. Il contient également les
dNTPs requis pour l’amplification de l'ADN cible, et le SYBR Green®. De plus, le Master Mix contiens du ROX :
attention, l’utilisation de ce colorant de référence n’est compatible qu’avec certains appareils (Voir
compatibilité §5).
Ce prémix idéal ne requiert que l’ajout de votre échantillon (ADNc) et de vos primers afin de réaliser
votre PCR. Les performances du kit qPCR Perfect Master Mix SYBR Green® développé par AnyGenes® ont été
soigneusement conçues pour vous fournir une haute sensibilité et spécificité. Pour plus de détails, rendez-vous
sur www.anygenes.com.

Contrôle qualité
Dans le cadre de notre programme de garantie de routine, tous les produits AnyGenes® sont contrôlés pour
vous assurer les plus hauts niveaux de performance et de fiabilité.
2) Utilisation envisagée et autorisations
Ces kits sont uniquement dédiés à une utilisation à des fin de recherche en biologie moléculaire. Ce kit
n’est pas prévu pour une utilisation à des fins diagnostiques, préventives ou pour toute autre application
thérapeutique. AnyGenes® ne sera donc aucunement responsable de la mauvaise utilisation de ses produits.
SYBR Green® est une marque déposée de Molecular Probes Inc.
Toutes les autres marques ou produits sont des marques déposées appartenant à leurs propriétaires respectifs.
L’achat des kits AnyGenes® n’inclut pas ni ne fournit de licence à l'égard des brevets détenus par Hoffman-La
Roche ou toute autre société.
3) Contenu du kit
Le Perfect Master Mix SYBR Green® est fourni en concentration 2X. Ce Master Mix est optimisé pour
l’utilisation en présence de SYBR Green® et contient:
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-
Les composants du tampon optimisés, incluant le MgCl2 et le SYBR Green®
-
Une Hot Start Taq DNA Polymerase
-
Des dNTPs
-
Le ROX
Ces produits pour Perfect Master Mix SYBR Green® (avec ROX) sont disponibles sous différents formats
compatibles avec les systèmes SignArrays® :
Référence
Catalogue :
Contenu SignArrays 96® system
Contenu SignArrays 384®
PMSX-R2S
Perfect Master Mix SYBR Green® : 2 x 1mL
+ PCR grade H2O : 1mL
Perfect Master Mix SYBR Green® : 4 x 1mL
+ PCR grade H2O : 1mL
PMSX-R4S
Perfect Master Mix SYBR Green® : 4 x 1mL
+ PCR grade H2O : 1mL
Perfect Master Mix SYBR Green® : 8 x 1mL
+ PCR grade H2O : 1mL
PMSX-R8S
Perfect Master Mix SYBR Green® : 8 x 1mL
+ PCR grade H2O : 1mL
*
PMSX-R12S
Perfect Master Mix SYBR Green® : 12 x 1mL
+ PCR grade H2O : 2mL
*
PMSX-R24S
Perfect Master Mix SYBR Green®: 24 x 1mL
+ PCR grade H2O : 4 x 1mL
*
Pour plus d’informations sur les produits, veuillez vous rendre sur www.anygenes.com ou nous contacter à
l’adresse suivante : [email protected].
4) Stockage et stabilité
Dès réception, stockez le kit Perfect Master Mix SYBR Green® à -20°C jusqu’à son utilisation. Ces
conditions de stockage garantissent une viabilité des produits AnyGenes® d’au minimum 6 mois après
réception. De plus, dans le but de garantir la stabilité des produits, évitez des cycles de congélation et
décongélation répétées. Si de petits volumes de Perfect Master Mix SYBR Green® sont fréquemment requis,
nous vous recommandons de stocker des alicots à -20°C.
5) Réactifs additionnels et matériel requis
A) Réactifs:
-
Echantillons dilués (ADNc)
-
SignArrays® 96 puits
-
H2O Ultra-pure et stérile « nuclease, RNAse, DNAse free » (fournie avec le kit AnyGenes® Perfect
Master Mix SYBR Green®)
Attention: Ne pas utiliser d'H2O DEPC !!!
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B) Matériel:
-
Appareils de PCR quantitative en temps réel (Light Cycler® 480 (Roche®), ABI 7900®, ABI 7500®
(Applied Biosystems® / Life Technologies®)...) *
-
Centrifugeuse pour plaques PCR
-
Agitateur de type vortex et Mini-centrifugeuse
-
Cônes et tubes « nuclease, RNase, DNase free »
-
Pipettes pour la préparation des mix
-
Réservoirs à réactifs pour préparer les mix réactionnels avec une pipette multicanaux
* Les appareils de qPCR en temps réel compatible avec l’utilisation de kits PMS avec ROX sont listés ci-dessous :
Appareils
SignArrays 96® Cat #
SignArrays 384® Cat #
Perfect Master Mix
SYBR Green® Cat #
Step One Plus™ Real-Time System
XXXH1-FXS
*
PMSX-RXS
ABI 5700
XXXH1-AXS
*
PMSX-RXS
ABI 7000
XXXH1-AXS
*
PMSX-RXS
ABI 7300
XXXH1-AXS
*
PMSX-RXS
*
PMSX-RXS
Société
Applied
Biosystems
ABI 7700
XXXH1-AXS
ABI 7900 HT (standard block)
XXXH1-AXS
ABI 7900 HT (FAST block)
XXXH1-FXS
QuantStudio™ 12K Flex System (standard block)
XXXH1-AXS
QuantStudio™ 12K Flex System (FAST block)
XXXH1-FXS
Mastercycler™ ep realplex 2
XXXH1-AXS
*
PMSX-WXS / PMSX-RXS
Mastercycler™ ep realplex 2S
XXXH1-AXS
*
PMSX-WXS / PMSX-RXS
Mastercycler™ ep realplex 4
XXXH1-AXS
*
PMSX-WXS / PMSX-RXS
Mastercycler™ ep realplex 4S
XXXH1-AXS
*
PMSX-WXS / PMSX-RXS
Eppendorf
XXXH2-AXS
XXXH2-AXS
PMSX-RXS
PMSX-RXS
PMSX-RXS
PMSX-RXS
* Step One Plus™ Real-Time System, ABI 5700, ABI 7000, ABI 7300, ABI 7700, ABI 7900HT and QuantStudio™ 12K Flex System sont des
marques déposées de Applied Biosystems. Mastercycler™ ep realplex est une marque déposée de Eppendorf.
Pour plus d’informations sur les produits, veuillez vous rendre sur www.anygenes.com ou nous contacter à
l’adresse suivante : [email protected].
II. Protocole
1) Avant de commencer...
Afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles et éviter toute contamination et signaux fauxpositifs, il est important et nécessaire de suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoire.
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De plus, vous n’avez pas besoin d’ajouter du MgCl2 dans votre mix réactionnel de PCR. La
concentration de MgCl2 contenue dans nos kits a déjà été ajustée pour améliorer l’efficacité, la spécificité et la
reproductibilité.
Attention: Le Perfect Master Mix SYBR Green® contient du SYBR Green®, un intercalent de l’ADN, qui peut
potentiellement avoir des effets cancérigènes. Ainsi, il est essentiel d’éviter toute inhalation et contact avec la
peau et les muqueuses.
2) Procédure
1) Décongeler le Perfect Master Mix SYBR Green® et vos échantillons d'ADNc 20 minutes avant
utilisation, pour qu'ils atteignent lentement la température ambiante. Nous vous recommandons
cependant de travailler avec vos échantillons dans la glace.
2) Préparer la surface de travail (hautement recommandée sous hotte) en nettoyant soigneusement tout
le matériel et les paillasses avec un détergent adapté. Puis, décontaminez la hotte avec une exposition
aux UV.
3) Pendant ce temps, centrifuger brièvement les tubes et réactifs, et préparer la solution dans un tube de
2 ml ou directement dans un réservoir à réactifs selon le tableau ci-dessous:
Pour système SignArrays® 96
Réactifs
Pour système SignArrays® 384
Volumes / réaction
Volumes recommandés
pour 1 SignArray® 96
Volumes / réaction
Volumes recommandés
pour 1 SignArray® 384
2X Perfect Master Mix SYBR Green®
10 µl
1 000 µl
5 µl
500 µl
H20 Ultra-pure
8 µl
800 µl
4 µl
400 µl
Échantillon d'ADNc dilué
2 µl
200 µl
1 µl
100 µl
Volume réactionnel total
20 µl par puits
2 000 µl
10 µl par puits
1 000 µl
De plus, pour plus de commodité et afin d'obtenir une haute spécificité et efficacité de vos
expériences, nous avons optimisé notre design de primers spécifique et la composition de nos kits afin
d’obtenir la meilleure spécificité et fiabilité de vos résultats de qPCR.
NB: Dans le système SignArrays® 96 ou 384, les primers sont déjà présents sous forme lyophilisée dans les
plaques et vous n’avez pas besoin d’ajouter des primers dans le mix réactionnel. Pour cette application, veuillez
vous référer au protocole dédié au système SignArrays®.
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4) Mélanger minutieusement avec une pipette ou centrifugez brièvement la solution et transférer le mix
dans un réservoir à réactifs.
5) Selon le format de système SignArray®, déposer 10 ou 20 µl du mix réactionnel par puits sur la plaque
de qPCR.
NB: Changer de cône dès que nécessaire pour éviter toute contamination.
6) Couvrir la plaque avec un film optique.
Attention: Ne préparez pas votre mix réactionnel de PCR trop tôt afin d'obtenir des résultats fiables et
reproductibles. Cependant, si vos plaques ont été préparées avant le démarrage de la qPCR, conservez-la sur
de la glace ou à 4°C au réfrigérateur.
7)
Centrifuger la plaque entre 15 à 60s à 1000 g pour éliminer les éventuelles bulles d'air.
8) Pendant ce temps, préparer et vérifier le programme de qPCR selon les conditions ci-dessous
(compatibles avec la plupart des appareils de qPCR):
Phase
Nombre
de cycles
Temps
Température
Mode
d’Acquisition
Commentaires
Dénaturation initiale Activation de la HOT start
Taq polymérase
1
10 min
95°C
/
Activation de la « Hot-start DNA Taq polymérase »
5s
95°C
/
Dénaturation des brins d'ADNc
Amplification
40-45
30 s
60°C
quantification
Étapes d’hybridation et d’élongation avec acquisition de
fluorescence
10 s
95°C
/
30 s
65°C
/
0s
95°C
continu
Courbes de fusion
1
Courbes de fusion
Pour plus d’informations veuillez contacter le support technique d’AnyGenes® via [email protected]
9) Placez le SignArray® dans votre appareil de qPCR.
10) Démarrez le programme de qPCR, en suivant les recommandations et protocoles du fournisseur.
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III. Informations complémentaires
Pour
plus
d’informations
veuillez
contacter
le
support
technique
à
l’adresse
suivante:
[email protected]
AnyGenes®
4 rue de la chine,
75970 Paris cedex 20
T: 00 33 (0)1 43 58 88 63
F: 00 33 (0)1 56 01 64 58
www.anygenes.com
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