Spectrophotométrie d`absorption moléculaire Étude et dosage de la

Garcia Laura
Perrothon Sandrine
Mahassan Sophie
UV Visible
Spectrophotométrie
d'absorption moléculaire
Étude et dosage de la
vitamine B6
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Perrothon Sandrine
Mahassan Sophie
UV Visible
1.But et théorie:
Le but de cette expérience est de comprendre l'intérêt de la spectrophotométrie
d'absorption moléculaire dans l'étude d'un composé possédant des formes chimiquement
et spectrophotométriquement distinctes.
Dans ce but, une constante d'acidité sera déterminée par le biais des spectres
d'absorption en utilisant la loi de Lambeer-Beer. L'acide étudié est la vitamine B6 ou
pyridoxine:
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
K2ab
K1ab
N
H
OH
OH
forme acide
N
N
H
forme neutre
forme basique
Les constantes d'acidité sont données de façon suivante:
AH2+
AH
AH + H+
A- + H+
K1ab = [AH][H+] / [AH2+]
K2ab = [A-][H+] / [AH]
Ensuite une une tablette de vitamine B6 sera analysée, pour en déterminer la teneur en
pyridoxine en utilisant la méthode d'étalonnage externe, puis interne.
L'absorption des molécules dépend de la distribution en électrons. Les trois formes de
cette molécule n'absorbent pas les rayonnements de la même façon. Quand plusieurs
formes coexistent, l'absorption mesurée est la somme des absorptions des différentes
formes.
L'absorption d'une espèce chimique est donnée par la loi de Lambeer-Beer:
Aλ = l · c · ελ
Aλ: l'absorption à la longueur d'onde λ
l: la longueur de la cuve [cm]
ελ: le coefficient d'extinction molaire [l · cm-1 · mol-1] à la longueur d'onde λ
c: la concentration [mol / l]
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L'absorption de plusieurs espèces chimiques est:
Aλ = l · (c1 · ελ1 + c2 · ελ2 + ...)
Dès lors, si les constantes d'acidité sont suffisamment différentes, alors en ajustant le pH
on peut déterminer les absorptions individuelles.
2.Partie pratique:
2.1.Détermination de la constante d'acidité:
2.1.1.Manipulations:
Nous avons travaillé avec les appareils suivants:
w
Spectromètre UV-Visible (Perkin-Elmer Lambda 2) couplé à un ordinateur (IBM PS2/30)
w
Une cellule en quartz l = 1 cm
Nous avons préparé les solutions suivantes:
w
Acide citrique 0.1 M (2 l): 42.0 g dans deux litres ce qui donne une solution: 0.1 ± 10-4 M
w
Hydrogénophosphate de sodium 0.2 M (0.5 l): 35.8 g dans 500 ml ce qui donne une
solution: 0.2 ± 10-4 M
w
Pyridoxine 10-3 M (250 ml): 0.0533 g dans 250 ml ce qui donne une solution: 1.04 · 10-3
M
Des solutions ont été préparées comme suit:
pH
Volume de Na2HPO4 [ml]
Volume d'acide citrique
[ml]
2.2
30.0
1470.0
3.0
20.5
79.5
3.6
32.2
67.8
4.4
44.1
55.9
5.0
51.5
48.5
5.6
58.0
42.0
6.6
72.8
27.2
Les pH n'ont pas pu être vérifier car le laboratoire n'était pas muni de pHmètre, ce qui peut
être source d'erreur.
Le blanc a été fait avec le tampon de pH 2.2. Les résultats sont présentés sur un
graphique en annexe (annexe 1).
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2.1.2.Résultats:
Spectres en annexe
Remarque: Il y a quelque chose de bizarre avec la courbe à pH 2.2, elle sera donc tenue à
l'écart des résultats utilisés.
2.1.2.1.Détermination des coefficients d'extinction molaire:
Nous pouvons déterminer les coefficients d'extinction molaire grâce aux spectres
avec le pH le plus faible (nous prenons celui à pH 3 car celui à pH 2.2 est étrange)
et avec le pH le plus fort (6.6). Il faut faire l'approximation qu'à ces deux pH une
seule des formes est présente dans l'échantillon.
En prenant les courbes à leur maximum nous trouvons (291 et 324 nm):
w
Pour le pH de 3:
La forme présente sera la forme acide.
Le maximum de la courbe se trouve à une longueur d'onde de 291 nm et
l'absorbance est de 0.888880. Avec la loi de Lambeer-Beer nous trouvons que le
coefficient d'extinction molaire est:
ε291AH2+ = A291 / (l · c)
ε291AH2+ = 0.888880 / (1 · 1.04 · 10-4) = 8546.92 [l · cm-1 · mol-1]
Pour la longueur d'onde de 324 nm, l'absorbance est de 0.044520, le coefficient
d'extinction molaire est de:
ε324AH2+ = 0.044520 / (1 · 1.04 · 10-4) = 428.08 [l · cm-1 · mol-1]
w
Pour le pH de 6.6:
La forme présente sera la forme neutre.
Le maximum de la courbe se trouve à une longueur d'onde de 324 nm et
l'absorbance est de 0.719400. Avec la loi de Lambeer-Beer nous trouvons que le
coefficient d'extinction molaire est:
ε324AH = A324 / (l · c)
ε324AH = 0.719400 / (1 · 1.04 · 10-4) = 6917.31 [l · cm-1 · mol-1]
Pour la longueur d'onde de 219 nm, l'absorbance est de 0.249380, le coefficient
d'extinction molaire est de:
ε291AH = 0.249380 / (1 · 1.04 · 10-4) = 2397.88 [l · cm-1 · mol-1]
2.1.2.2.Première méthode de détermination de la constante d'acidité:
La méthode consiste à déterminer les concentrations de la forme acide (notée AH2+) et la
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forme neutre (notée AH) en partant de la loi de Lambeer-Beer pour deux composés.
Nous avons deux équations avec deux inconnues [AH2+] et [AH], nous pouvons donc
résoudre ces équations:
1. A324 = l · ([AH] · ε324AH + [AH2+] · ε324AH2+) = [AH] · ε324AH + [AH2+] · ε324AH2+
2. A291 = l · ([AH] · ε291AH + [AH2+] · ε291AH2+) = [AH] · ε291AH + [AH2+] · ε291AH2+
Remarque: l = 1
De la première équation nous tirons:
[AH] = A324 / ε324AH - ([AH2+] · ε324AH2+) / ε324AH
En introduisant ce résultat dans l'équation 2 et en la travaillant un peu on obtient:
[AH2+] = (A291 · ε324AH - A324 · ε291AH) / (ε324AH · ε291AH2+ - ε324AH2+ · ε291AH)
Puis, ayant toutes les concentration ([H+] = 10-pH) nous utilisons la formule:
K1ab = [AH][H+] / [AH2+]
Les résultats sont les suivants:
PH
3.0
3.6
4.4
5.0
5.6
6.6
Absorbance à 291nm Absorbance à 324nm
0.88888
0.04452
0.86073
0.04162
0.79953
0.11558
0.68281
0.24084
0.45619
0.48723
0.24938
0.71940
[AH]
[AH2+]
K1ab
-2.19E-07
1.11E-05
3.04E-05
6.83E-05
1.01E-04
9.04E-05
7.14E-05
3.42E-05
-5.47E-07
4.89E-06
4.26E-06
5.02E-06
K1ab moyenne 4.72E-06
La valeur pour le pH de 3.6 est vraiment étrange, elle n'a pas été prise en compte
pour la moyenne. Cette erreur est peut être due au fait que les coefficients
d'extinction molaire ont été calculé à pH 3 et en faisant l'approximation que seul
une des deux espèces était présente, ce qui ne doit pas être le cas.
Les autres valeurs semblent coïncider les unes avec les autres. Dans ce cas les
différences peuvent être dues à des erreurs de manipulation ou comme plus haut,
à l'approximation faite lors du calculs des coefficients d'extinction molaire.
2.1.2.3.Deuxième méthode de détermination de la constante d'acidité:
La deuxième méthode est de tracer un graphe de l'absorbance en fonction du pH
pour les deux longueurs d'onde, de calculer pour les deux longueurs d'onde la
moyenne entre l'absorbance minimale et l'absorbance maximale.
En effet
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K1ab = [AH][H+] / [AH2+]
Si nous prennons l'inverse de la fonction logarithmique on a:
pK1ab = pH – log([AH]/[AH2+])
À la moyenne, [AH] = [AH2+] la deuxième partie de l'équation s'égalise à 0 et on a
pKa = pH
Les valeurs sont les suivantes:
PH
Absorbance à 324nm Absorbance à 291nm
3.0
0.04452
0.88888
3.6
0.04162
0.86073
4.4
0.11558
0.79953
5.0
0.24084
0.68281
5.6
0.48723
0.45619
6.6
0.71940
0.24938
Moyenne
0.382
0.569
Ce qui donne le graphe suivant:
Absorbance en fonction du pH
0.90000
0.80000
Absorbance
0.70000
0.60000
0.50000
0.40000
0.30000
0.20000
0.10000
0.00000
3.0 3.3 3.5 3.8 4.0 4.3 4.5 4.8 5.0 5.3 5.5 5.8 6.0 6.3 6.5 6.8
pH
Pour la longueur d'onde de 291 nm l'absorbance moyenne est de: 0.56913 arrondi
à 0.57.
Pour la longueur d'onde de 324 nm l'absorbance moyenne est de: 0.38196 arrondi
à 0.38.
w
6
Calcule pour la longueur d'onde de 291 nm:
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Graphiquement on peut déterminer qu'à l'absorbance de 0.56 correspond un pH
de 5.33.
Le pKa est donc de 5.33 se qui donne une constante K1ab = 4.68 · 10-6
w
Calcule pour la longueur d'onde de 324 nm:
Graphiquement on peut déterminer qu'à l'absorbance de 0.38 correspond un pH
de 5.36.
Le pKa est donc de 5.36 se qui donne une constante K1ab = 4.37 · 10-6
La valeur moyenne trouvée de cette façon est de: 4.52 · 10-6.
Ces ordres de grandeur de la constante K1ab correspondent bien à ceux obtenus
par l'autre méthode, qui était de: 4.72 · 10-6 en moyenne.
Dans ce cas les erreurs viennent du fait que les pH correspondant aux valeurs
moyennes des absorbances doivent être trouvés manuellement, donc avec une
erreur relativement importante. Il convient de noter que tout de même ces valeurs
sont très proches et qu'elles sont proches de celles trouvée plus haut.
Avec utilisation de SciFinder Schoolar nous trouvons une estimation de la
constante d'acidité de 4.57 · 10-5 (pKa = 4.34 ± 0.28). Les références de l'article
contenant la valeur de constante nous a été fourniees par l'assistant, après une
longue et infructueuse recherche. La valeur est de 2.14 · 10-5 (pKa = 4.67). Nous
constatons qu'il y a un facteur 10 entre la valeur trouvée expérimentalement et
celle de la littérature. Cette erreur doit venir entre autre de dilutions imprécises, de
mauvaises manipulations...
2.1.3.Points isobestiques:
Sur nos spectres les point isobestiques sont nets, toutes les courbes se coupent en un
point, à la longueur d'onde d'environ 303 et 267 nm. Si l'intensité ne varie pas malgré les
longueurs d'onde différentes cela signifie, que pour ces longueurs d'ondes les coefficients
d'extinction molaires sont les mêmes, et comme la quantité totale (forme acide, basique et
neutre) de produit à analyser ne varie pas, l'absorbance reste la même. La présence de
points isobestiques est un paramètre nécessaire mais pas suffisant pour établir la
présence d'un équilibre entre deux formes, ne faisant pas intervenir d'intermédiaire
réactionnel.
2.2.Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation
pharmaceutique:
2.2.1.Manipulation pour la calibration externe:
Les solutions suivantes ont été préparées sur un volume de 100 ml (il y a eu une erreur de
lecture du protocole, les volumes auraient dus être de 10ml). La concentration de
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pyridoxine initiale était de 10-3 mol/l. Les dilutions ont été faites avec le tampon à pH 2.2
préparé pour la manipulation précédente.
Les solutions suivantes ont été préparées:
Concentration de pyridoxine [mol/l]
Volume de pyridoxine ajouté [ml]
-5
10
1
-5
2 · 10
2
4 · 10-5
4
6 · 10-5
6
-5
8
8 · 10
-4
10
10
Les mesures ont été prises à une longueur d'onde fixe de 291 nm.
2.2.2.Résultats pour la calibration externe:
Les résultats sont les suivants:
Concentration [mol/l] Absorbance
1.00E-05
0.0932
2.00E-05
0.1550
4.00E-05
0.3282
6.00E-05
0.5062
8.00E-05
0.6750
1.00E-04
0.8856
Pente
8798.9
Ordonnée à l'origine
-0.0324
Ce qui donne le graphique suivant:
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Absorbance
Absorbance en fonction de la concentration de pyridoxine
0.9000
0.8500
0.8000
0.7500
0.7000
0.6500
0.6000
0.5500
0.5000
0.4500
0.4000
0.3500
0.3000
0.2500
0.2000
0.1500
0.1000
0.0500
0.00E+00
2.00E-05
4.00E-05
6.00E-05
8.00E-05
1.00E-04
Concentration de la pyridoxine [mol/l]
La droite a une pente de 8798.9 et une ordonnée de – 0.0324 elle devrait être à 0, la
pente devrait donc changer un peu, or le programme informatique utilisé dans ce rapport
ne le permet pas. Nous considéreront dans les calculs que l'ordonnée est de 0.
1. Première pastille:
Masse entière: 0.1984 g
Masse une fois sous forme de poudre: 0.1877 g
L'absorbance est de: 0.1102
On doit résoudre: 0.1102 = 8798.9 · [B6] (– 0.0324)
[B6] = 1.25 · 10-5
Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 5.00 · 10-5 mol de
vitamine B6, se qui donne une masse de: 10.3 mg ce qui donne par tablette: 10.9 mg /
tablette. L'indication du fabriquant est de 40 mg par tablette.
2. Deuxième pastille:
Masse entière: 0.2002 g
Masse une fois sous forme de poudre: 0.1914 g
L'absorbance est de: 0.1085
On doit résoudre: 0.1085 = 8798.9 · [B6] (– 0.0324)
[B6] = 1.23 · 10-5
Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 4.93 · 10-5 mol de
vitamine B6, se qui donne une masse de: 10.1 mg ce qui donne par tablette: 10.6 mg /
tablette.
3. Troisième pastille:
Masse entière: 0.1914 g
L'absorbance est de: 0.1331
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Masse une fois sous forme de poudre: 0.1864 g
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[B6] = 1.51 · 10-5
On doit résoudre: 0.1331 = 8798.9 · [B6] (– 0.0324)
Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 6.05 · 10-5 mol de
vitamine B6, se qui donne une masse de: 12.4 mg ce qui donne par tablette: 12.8 mg /
tablette.
Nous remarquons que dans les trois cas la concentration par tablette en milligramme est
de l'ordre du quart de ce qui est indiqué par le fabriquant. Il est possible que pas toute la
vitamine ne se soit dissoute dans le tampon à pH 2.2, et que lors du filtrage une certaine
quantité de vitamine aie été perdue, mais certainement pas au point de réduire les
résultats au tiers de la valeur exacte. Il est également certain que le fait que la pente n'aie
pas été modifiée si l'on égalise à zéro l'ordonnée à l'origine aie joué un rôle. Les tablettes
semblent donc contenir moins de vitamine B6 que ce qui est indiqué.
2.2.3.Manipulation pour l'étalonnage externe:
Les manipulations ont été faites pour la première tablette.
Les solutions ont été préparées de façon suivantes:
Numéro des solutions
Volume de solution de la
tablette [ml]
Volume de solution
stock 10-3 M [µl]
Blanc
25
0
1
25
250
2
25
400
3
25
500
Nous considèrons que le volume de solution stock ajouté est négligeable par rapport au
volume total.
Les mesures ont été faites à une longueur d'onde fixée à 291 nm.
2.2.4.Résultats:
Les résultats sont les suivants:
Numéro
Blanc
1
2
3
Le graphique est le suivant:
10
Volume ajouté [µl]
0
250
400
500
Absorbance
0.1157
0.1931
0.2304
0.2768
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Absorbance en fonction du volume ajouté
0.2800
0.2600
Absorbance
0.2400
0.2200
0.2000
0.1800
0.1600
0.1400
0.1200
0.1000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Volume ajouté concentration 10-3
La méthode de calcul est la suivante:
Nous connaissons la concentration ajoutée à l'aide de la solution stock et nous
connaissons l'absorbance du blanc et de la solution mesurée.
Ablanc = ε · l · cinconnue
Asolution = ε · l · (cinconnue + cajoutée)
En divisant ces deux équations nous obtenons:
Ablanc / Asolution = cinconnue / (cinconnue + cajoutée)
D'où nous trouvons:
cinconnue = Ablanc · cajoutée / (Asolution – Ablanc)
Les résultats sont les suivants:
Numéro
Blanc
1
2
3
Volume ajouté [µl] Absorbance Concentration ajoutée [mol/l] Concentration [mol/l]
0
0.1157
250
0.1931
1.00E-05
1.49E-05
400
0.2304
1.60E-05
1.61E-05
500
0.2768
2.00E-05
1.44E-05
Moyenne
1.52E-05
Les concentrations calculées ici montrent peu de variation. De plus ces trois valeurs sont
proches de celle obtenue par calibration externe.
Par cette méthode on obtient une masse de vitamine B6 de 13.2 mg par tablette avec
cette méthode contre 13.9 avec la méthode de calibration externe.
Une autre méthode serait de déterminer la droite de régression et de l'égaliser à 0, se qui
nous donnerait la concentration cherchée.
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2.2.5.Conclusion:
Par ces deux méthodes nous obtenons des concentrations en masse par tablette de
vitamine B6 nettement inférieures à celles indiquées par le fabriquant. Il est possible que
pas toute la tablette de vitamine se soit dissolue dans le tampon et qu'une partie de la
tablette soit restée dans le filtre (les deux méthodes utilisaient la même solution).
La première méthode est très pratique et permet d'accéder à la concentration de
l'inconnue avec très peu de calculs, cependant il faut se méfier d'être dans le domaine de
linéarité, que la droite de calibration soit bien faite (que l'ordonnée à l'origine soit à zéro,
ce qui n'était pas tout à fait le cas dans notre droite, mais l'ordonnée était très petite).
La deuxième méthode est moins évidente à première vue, il faut se méfier des volumes
ajoutés car une petite erreur sur ces derniers se répercute directement sur les résultats
(les erreurs de volumes se compense dans le cas d'une calibration interne car la
régression compense les erreurs entre elles). L'avantage de cette méthode est que les
conditions expérimentales pouvant interférer sur les mesures (force ionique...) sont à peu
près les mêmes, et donc leur poids dans le résultats est minimisé.
Les deux méthodes semblent donc être tout à fait appropriées pour ce type de mesures,
elles ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients.
3.Conclusion:
Ce travail pratique nous a montré quelques intérêts de l'absorption UV Visible, à quoi cette
méthode pouvait servir, comment l'utiliser...
D'une manière générale, les résultats coïncident et nous montrent que cette méthode est
relativement précise, en dépit de nos erreurs de manipulations.
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