Laboratoire 12 : DOSAGE DE LA VITAMINE B1 PAR FLUORIMETRIE

Laboratoire 12 : DOSAGE DE LA VITAMINE B1 PAR FLUORIMÉTRIE
I.
Aspects théoriques
Un grand nombre de composés absorbent la lumière dans les régions U.V. et visible du spectre. L'énergie
lumineuse absorbée excite les molécules et les élève à un niveau énergétique supérieur. Les
molécules excitées retournent ensuite à leur niveau énergétique de base; l'énergie qu'elles
avaient emmagasinée est alors dissipée sous forme de chaleur, utilisée pour des
réarrangements moléculaires ou des transitions électroniques, ou réémise sous forme de
lumière. Cette lumière réémise est la fluorescence.
Seulement une fraction des composés qui absorbent peuvent produire de la fluorescence. Pour
qu'un composé fluoresce, il doit posséder une structure qui absorbe la lumière et une énergie
de résonance élevée. En général, les composés aromatiques sont capables d'émettre de la
fluorescence, particulièrement si les substituants du cycle sont des donneurs d'électrons.
Ce n'est pas 100% de la lumière absorbée qui est réémise parce qu'il y a compétition entre
différentes voies d'utilisation de l'énergie emmagasinée. Si l'on considère l'équation suivante:
E = hc /  (où E représente la quantité d'énergie; h, la constante de Planck; c, la vitesse de la
lumière, et , la longueur d'onde lumineuse), on réalise que la quantité d'énergie est
inversement proportionnelle à la longueur d'onde. Ayant une énergie plus faible que la
lumière absorbée, la lumière émise s'observe donc à une longueur d'onde plus élevée.
La fluorimétrie est une méthode très sensible pour analyser des composés fluorescents; elle
permet de détecter ces composés à des concentrations très faibles et de manière très sélective.
Tout comme le spectre d'absorbance, le spectre de fluorescence d'un composé lui est tout à
fait caractéristique.
Le dosage de la vitamine B1 dans la farine enrichie est basé sur l'oxydation de la thiamine
anhydre en un dérivé (thiochrome) dont on mesure la fluorescence. Ce dosage s'applique aux
échantillons ne contenant pas de quantités appréciables de thiamine sous forme liée ou sous
forme pyrophosphate; le groupement phosphate peut toutefois être préliminairement enlevé
par hydrolyse acide ou, enzymatique par des phosphorylases.
II. Méthodologie
A) Extraction
- Peser 5,00 g de farine enrichie et placer dans un erlenmeyer de 250 ml.
- Ajouter 5 g de NaCl et bien mélanger avec la farine.
- Ajouter en deux parties égales et en agitant fortement un volume de HCl 0,1N dans une
proportion de 15 ml par gramme d'échantillon. Laver les parois de la fiole avec les derniers
ml d'acide.
- Mettre l'erlenmeyer dans un bain-marie à 95-100oC. Agiter fréquemment durant les
10 premières minutes afin de garder les solides en suspension au moment où la solution
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épaissit. Agiter ensuite de temps en temps jusqu'à la fin de la période de chauffage qui doit
durer au total 30 min.
- Après 10 minutes d'hydrolyse, mettre une goutte de solution sur un verre de montre et
vérifier le pH en ajoutant une goutte de thymol bleu. La solution doit être nettement rouge
(pH 1,0-1,2). Si tel n'est pas le cas, ajouter du HCl l N à raison de 1,0 ml à la fois jusqu'à ce
que l'acidité requise soit obtenue. Noter le volume de HCl l N ajouté en surplus et
recommencer la digestion avec un nouvel échantillon en utilisant le mélange approprié de
HCl 0,l N et HCl l N.
- Refroidir et compléter à 100 ml avec HCl 0,l N; bien mélanger.
- Centrifuger (3 000 rpm, 5 min) 30-40 ml du mélange jusqu'à ce que le surnageant soit
limpide.
- Etiqueter le surnageant "inconnue".
Question : L'hydrolyse acide permet de cliver les liens glycosidiques de l'amidon afin d'augmenter sa
solubilité dans l'eau et de faciliter l'extraction de la vitamine. Les conditions de ce traitement
pourraient, toutefois, n'être pas assez vigoureuses pour hydrolyser les groupes phosphates de la
vitamine. Comparer succinctement la structure de l'amidon à celle du glycogène.
B)
Oxydation
Cette étape sert à transformer la thiamine en thiochrome. L'oxydation s'effectue
simultanément avec l'inconnu et le standard (0,2 µg de thiamine HCl par ml d'une solution de
HCl 0,lN). C'est l'étape la plus importante dont dépend la qualité des résultats. Eviter
l'exposition de la solution à la lumière vive qui détruit le thiochrome.
1) Échantillon inconnu
- Dans 4 tubes coniques de 40 ml, mettre 2,5 g de NaCl et 5 ml de solution inconnue.
- Etiqueter deux de ces tubes « inconnu test ». Agiter de façon à créer un mouvement dans le
liquide. Ajouter immédiatement, à l'aide d'une pipette à écoulement rapide, 3 ml du réactif
oxydant (ferricyanure) en évitant de faire tomber celui-ci sur la paroi du tube. Bien
mélanger.
- Immédiatement ajouter 13 ml d'isobutanol; boucher le tube et agiter vigoureusement
pendant 15 sec.
- Traiter les deux autres tubes étiquetés « inconnu blanc » de la même façon en remplaçant le
réactif oxydant par 3 ml de NaOH 15%.
- Agiter tous les tubes à nouveau pendant 2 min; centrifuger pour séparer les phases (1 000
rpm, 5 min).
- Lire la fluorescence de l'extrait isobutylique.
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2) Échantillon standard
Préparer 4 tubes selon la marche à suivre donnée pour l’inconnu test, en remplaçant l’inconnu
par le standard (0,2 µg de thiamine HCl par ml d'une solution de HCl 0,lN) => 2 tubes
“standard test”.
C) Mesure de la fluorescence
- Vérifier la reproductibilité du fluorimètre à l'aide d'une solution standard de quinine (fait
par le technicien).
- Ajuster la longueur d'onde d'excitation à 365 nm et celle d'émission à 435 nm.
- Mesurer la fluorescence de l'extrait
de l’inconnu test ( l )
de l’inconnu blanc ( b )
du standard test ( s )
du standard blanc ( d )
En utilisant une microplaque selon le schéma ci-dessous (la région ombragée étant destinée à
d'autres équipes) déposer dans les puits des volumes de 250 l de chaque échantillon :
A
B
C
D
E
F
G
H
D)
1
2
3
4
5
6
7
8
l
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b
b
s
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s
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d
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Calculs
µg thiamine HCl dans 5 ml de solution échantillon =
(l - b) x 0,2 µg x 5 ml
(s - d)
ml
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III. Rapport de laboratoire
- Calculer la quantité de vitamine par g de farine.
- Comparer la quantité obtenue de vitamine B1 dans la farine avec les valeurs publiées.
- Comparer la sensibilité des dosages spectrométrique et fluorimétrique du thiochrome i.e.
estimer combien de fois la deuxième méthode est plus sensible que la première. Pour cela
vous avez besoin des renseignements ci-dessous.
a) Le thiochrome (P.M. 262) absorbe maximalement à 375 nm avec un coefficient
d'extinction molaire (M) de 15,8 x 103. La concentration minimale de thiochrome que
vous pourriez détecter dans ces conditions correspondrait à une valeur de D.O. de 0,005.
Calculer cette concentration.
b) En utilisant vos valeurs de fluorescence pour les solutions de vitamine standard et les
solutions de blanc, il vous est possible de déterminer la concentration minimale de
thiochrome que vous pourriez détecter par fluorescence. Pour ce faire, considérez que le
signal du standard par rapport à la ligne de base doit être deux fois plus élevé que celui du
bruit de fond i.e. deux fois plus élevé que la différence entre la valeur la plus haute et la
valeur la plus basse de vos solutions de blancs.
(Donner vos calculs en annexe).
-
A partir de la comparaison précédente, voyez-vous un ou des avantages à utiliser la
fluorimétrie plutôt que la spectrométrie pour le dosage du thiochrome?
Références
Methods of Analysis, A.O.A.C., 12th edition, 1975, 43.031 - 43.034.
Van Holde, K.F. (1971 et 1985) Physical Biochemistry, Prentice-Hall (Fluorescence).
Freifelder, D., (1976 et 1982), Physical Biochemistry. Applications to biochemistry and
molecular biology, Freeman (Fluorescence).
Plummer, D.T., (1989) Introduction aux techniques de biochimie, McGraw-Hill
(Fluorescence).
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