B-L`mission de fluorescence chlorophyllienne

L'émission de fluorescence chlorophyllienne. Régulation de l’activité du PSII et estimation du
flux d’électrons dans les thylacoïdes sur des feuilles intactes.
1-Généralités.......................................................................................................................................................... 2
2-Induction de l'émission de fluorescence à température ordinaire (effet Kautsky)....................................... 4
3-Le rendement de l’émission de la fluorescence chlorophyllienne. ................................................................ 5
4- Estimation du rendement quantique de la photochimie des centres PS II ouverts..................................... 5
5-Estimation de la concentration relative des centres ouverts : le quenching photochimique. ...................... 6
6-Rendement quantique opérationnel du PSII a la lumière .............................................................................. 6
7- Mesure de l'émission de fluorescence sous une lumière modulée. ................................................................ 6
8-le quenching non-photochimique...................................................................................................................... 8
9- Un exemple concernant la mise en route de la photosynthèse observée sur une feuille de tournesol........ 8
10-Estimation du flux d'électrons dans la chaîne photosynthétique sur une feuille...................................... 10
11-estimation de la vitesse d’oxygénation et de carboxylation du RuBP. ...................................................... 11
12- Conclusion. .................................................................................................................................................... 11
13-Résumé............................................................................................................................................................ 12
14-Références....................................................................................................................................................... 12
1
L'émission de fluorescence chlorophyllienne. Régulation de l’activité du PSII et estimation du flux
d’électrons dans les thylacoïdes sur des feuilles intactes.
1-Généralités. La lumière absorbée par l'appareil photosynthétique n'est pas totalement transformée en énergie
chimique. Une partie est perdue sous forme de chaleur et de fluorescence. A température ordinaire, l'émission de
fluorescence chlorophyllienne provient essentiellement de l'antenne collectrice du photosystème II (PSII) ; on
montre, dans la plupart des situations, que l'émission de la fluorescence par le photosystème I (PSI) est faible
comparativement et ne représente au plus que 10 à 20% de l’émission totale. De plus l’émission de fluorescence
venant du PSII est variable tandis que celle qui vient du PSI ne l’est pas.
a-Centres ouverts et centres fermés. Les éléments nécessaires à la compréhension de l’émission de
la fluorescence chlorophyllienne sont rappelés rapidement ci-dessous.
Le cœur du photosystème II est constitué par des chlorophylles a spéciales (2 ou 4 molécules) que l'on
appelle P680. Lorsque la P680 est excitée par un photon elle peut transmettre un électron, via une phéophytine
(PHEO), à une quinone fortement liée au cœur du PSII (QA), puis à une plastoquinone venant d'un pool se
trouvant dans la membrane du thylacoïde et qui s'attache temporairement au PSII (QB). P680 oxydée récupère
son électron d'une tyrosine (TYRZ) de D1 qui, elle-même, est réduite lorsque l'eau est oxydée, libérant son
oxygène. Ci-dessous sont ordonnées schématiquement ces différentes étapes.
B
1-[TYRZ
P680
PHEO QA
QB]. Centres ouverts : prêt à accepter une excitation et à transférer un e-.
B
+ Photon
2-[TYRZ
P*680
P
PHEO QA
QB]. P*680 = P680 excitée
B
Passage de 2 à 3 en 3ps
3-[TYRZ
P+680
P
PHEO-
QA
QB].
B
Passage de 3 à 4 en 250 à 300 ps
4-[TYRZ
P+680
PHEO QA-
QB]. Stabilisation de la séparation de charge. Le centre est fermé ne peut
plus accepter d'excitation.
Passage de 4 à 5 en 20 ns-35 µs
5-[TYRZ+
P680
PHEO QA-
QB].
P
B
B
Passage de 5 à 6 en 50µs-1.3ms (un e- du complexe manganèse réduit
TRYRZ+)
6-[TYRZ
P680
PHEO QA- QB].
B
Passage de 6 à 7 en 100-200 µs
7-[TYRZ
P680
PHEO QA
QB- ]. Centre ouvert, prêt à accepter une autre excitation.
La fermeture des centres (situation où QA est réduite, états 4, 5 et 6 ci-dessus) entraîne une augmentation de
l’émission de la fluorescence chlorophyllienne dans les antennes collectrices. Dans l’état décrit en 4 la P680 ne
peut accepter l’excitation venant des antennes. Dans l’état décrit en 5 et 6, P680 peut être excitée mais, ne peut
pas passer son excitation à QA déjà réduit.
b- L’émission de fluorescence témoigne de pertes d’énergie lors du transfert de l’excitation vers
les centres réactionnels. L'excitation provoquée par les photons dans les antennes est transmise avec une
grande efficacité de chlorophylles en chlorophylles, par résonance, jusqu'au centre réactionnel. On estime que le
2
transfert de l'excitation d'une molécule de chlorophylle excitée à une autre molécule de chlorophylle se fait en
10-11 s. L’excitation qui n’est pas transmise est émise sous forme de chaleur et de fluorescence. Ces deux
processus sont plus lents et réalisés en 10-9 s environ. La probabilité d'un transfert de l'excitation est donc
beaucoup plus grande que celles d’une dissipation sous forme de chaleur ou de fluorescence. Le transfert de
l'excitation est favorisé par la proximité (la concentration) des chlorophylles dans les antennes.
Intensité de fluorescence,
(unité relative)
L'excitation qui atteint P680
(1) peut être à l'origine d'un transfert d'électrons dans la chaîne photosynthétique
(2) peut être convertie en fluorescence et en chaleur.
(3) Lorsque les centres sont fermés (les quinones QA réduites), l’excitation repasse dans les antennes où
elle est perdue sous forme de fluorescence (et de chaleur). Cela peut se produire à plusieurs reprises, augmentant
80
Fig.1 Spectres d’émission de fluorescence par les
chlorophylles b (……….) et a (
) en solution
dans l’éther .Le maximum d’émission se trouve à 648
nm pour la chl.b et à 663 nm pour la ch.l.b (d’après
French et al. 1955)
60
40
20
0
650
700
750
Longueur d'onde, (nm)
Intensité de la fluorescence,
(Unité arbitraire)
le parcours de l’excitation, et partant, les chances de cette dernière d’être dissipée sous forme de fluorescence (et
de chaleur). La fermeture des centres est donc liée à un accroissement de l’émission de fluorescence.
La fluorescence produite par des solutions de chlorophylles a et b est émise dans la bande rouge et
infrarouge du spectre (Fig.1), respectivement vers 650-665 nm et 710-720 nm. Sur les feuilles la fluorescence est
émise majoritairement par la Chlorophylle a : Il y a un maximum d’émission entre 680 et 690 nm, selon la
concentration de chlorophylle (Fig.2), et un épaulement vers 640 nm.
8
6
4
2
0
600
650
700
750
Fig.2. Spectre de fluorescence de feuilles dont la teneur en
et élevée (………….).
chlorophylle est faible (________)
Remarquer dans les deux cas, par comparaison avec les
spectres d’émission de fluorescence de la chlorophylle,
que le premier maximum d’émission dans le rouge clair
est décalé vers le rouge sombre (comparer avec la Fig.1).
Cela est due à la réabsorption de la lumière émise par
fluorescence par la chlorophylle elle même. Cette
réabsorption est plus élevée lorsque la teneur en
chlorophylle est plus élevée et l’épaulement visible à 740
nm devient plus important que la bande principal
(D’après French et Young, 1952, cité par Rabinovitch ,
1956). Une partie du décalage observé vient aussi du fait
que les chlorophylles sont liées à des protéines in vivo.
Longueur d'onde, (nm)
Environ 2 à 3% de la lumière absorbée est, au maximum, ré-émise sous forme de fluorescence. Cela représente
donc un rendement (énergie émise par fluorescence/énergie absorbée par le PSII) de fluorescence très faible.
3
2-Induction de l'émission de fluorescence à température ordinaire (effet Kautsky). La Fig.3 montre l'effet
Kautsky mesuré sur des chloroplastes isolés de feuilles d'épinard et mis en présence ou non de DCMU (3-(3,4dichlorophenyl)-1,1-dimethylurée) pendant les mesures (Krause et Weis, 1984). Le DCMU (nom commercial :
diuron) est un herbicide qui s'accroche sur le PSII à la place de QB, et qui bloque ainsi le transfert d'électrons du
PSII vers le PSI. Ces résultats ont été obtenus en éclairant la feuille par une lumière bleue et en mesurant la
fluorescence à 685 nm. De cette façon il est possible de faire des mesures sous lumière continue car la lumière
excitatrice n’interfère pas avec l’appareil de mesure muni d’un filtre ne laissant passer que les longueurs d’onde
autour de 685 nm.
Emission de fluorescence,
(unité relative)
a-En l'absence de DCMU. Lorsque la feuille est éclairée l'émission de fluorescence monte en quelques
nanosecondes à un niveau O puis, plus doucement, augmente jusqu'au niveau P, selon une cinétique qui peut
être complexe (et que l'on ne détaille pas ici), pour décroître et se stabiliser à une valeur stationnaire.
6
Fm
5
avec DCMU
Fp
sans DCMU
4
3
2
Fo
1
0
0
1
2
3
4
5
Temps de lumière, (secondes)
6
Fig.3.Variation de l’émission de fluorescence
chlorophyllienne mesurée sur des chloroplastes
isolés en présence ou en l’absence de DCMU
(inhibiteur de l’activité PSII). En présence de
DCMU on atteint le maximum d’émission de
fluorescence, Fm. En l’absence de DCMU
l’émission de fluorescence passe par un maximum,
Fp (p pour pic). Les suspensions de chloroplastes
sont éclairées au temps 0 par de la lumière bleue et
lémission de la fluorescence chlorophyllienne est
mesuré vers 680nm. L’émission de fluorescence qui
se produit dès les premières microsecondes
d’éclairage est appelée Fo (F zéro) (d’après Krause
et Weis, 1984).
Le niveau O (Zéro) ou Fo est la fluorescence mesurée lorsque tous les centres sont ouverts. Toute la
fluorescence au-dessus de Fo est appelée la fluorescence variable ou Fv.
Fo. Représente l'émission par les Chl a des antennes collectrices avant que l'excitation n'ait atteint les centres
réactionnels.
(1) Fo dépend de la densité de l'excitation dans les pigments du PSII (concentration de chlorophylles et
éclairement absorbé) , il dépend donc aussi de la distribution de l'énergie absorbée entre le PSI et le PSII.
(2) Fo est sensible à tous les facteurs qui peuvent affecter la structure des antennes et modifier ainsi la
distance entre les molécules de chlorophylle assurant le transfert de l'excitation.
Fp. La monté de l'émission de fluorescence reflète la réduction de QA (fermeture de centres PSII entraînant
l’augmentation de l’émission de fluorescence). La baisse après le niveau FP est due à la mise en route de la
chaîne de transfert vers le PSI et à la mise en route de l'assimilation de dioxyde de carbone. Ces deux processus
utilisent des électrons et par conséquent causent l’oxydation de QA (ré-ouverture des centres PSII). Elle peut être
due aussi à l’augmentation de la proportion d’énergie d’excitation perdue par émission de chaleur (voir
quenching non photochimique, plus bas)
Fs. Reflète un état d'équilibre entre l'excitation des centres et leurs voies de désactivation qui incluent la fixation
photosynthétique de CO2 et de O2, la réaction de Mehler, la réduction du nitrate…..
b-En présence de DCMU ; le maximum d'émission de fluorescence Fm. Dans cette situation les
électrons produits par l'oxydation des P680 restent sur les QA, puisque la présence du DCMU bloque leur transfert
sur le pool des plastoquinones : le DCMU se place dans la niche QB, sur D1, à la place de QB. La fluorescence
atteint alors un maximum d'émission appelé Fm.
B
B
Noter : On peut réduire tous les QA autrement qu’en utilisant du DCMU. Il suffit pour cela, sur une feuille
maintenue à la lumière, de fournir brutalement un éclairement très fort (4 à 5 fois égale au flux solaire
maximum) pendant une seconde ou moins. L’excitation produite provoque un grand afflux d'électrons qui réduit
4
pendant une brève période la totalité des QA. Tous les centres PS II étant fermés l’émission de fluorescence est
alors maximum.
3-Le rendement de l’émission de la fluorescence chlorophyllienne. L'émission de fluorescence par le PSII, F,
est proportionnelle à l'énergie lumineuse qu'il absorbe, I. On peut écrire :
F = aI
La mesure de l’émission de fluorescence par les feuilles est donc un paramètre difficile à utiliser lorsque l’on
s’intéresse à la réponse des plantes à l’environnement naturel : dans ces conditions l’éclairement varie
énormément provoquant de grandes variations de F, qui peuvent masquer l’information biologique portée par
l’émission de fluorescence.
Si l'on considère l'émission de fluorescence lorsque tous les centres sont ouverts l'on a :
Fo = aI
où
Fo/I = φFo= = kf/(kf+kd+kp).
est le rendement l’émission de la fluorescence Fo, φFo ; kf, kd et kp sont respectivement les constantes de vitesse
pour l'émission de fluorescence, la dissipation thermique et la photochimie. kf/(kf+kd+kp) représente donc la
probabilité pour qu'un photon absorbé par la chlorophylle a soit ré-émis sous forme de fluorescence.
On considère le rendement de la fluorescence pour normaliser l'émission mesurée (gommer l’effet des
variations de l’éclairement) :
Lorsque tous les centres sont fermés (pendant une augmentation brutale et transitoire de l'éclairement, ou
en présence de DCMU) on a :
Fm/I = φFm = kf/(kf + kd).
La constante de vitesse kp n'apparaît pas dans ce cas, parce qu'en présence de DCMU il n'y a plus de possibilité
de désactivation via la photochimie.
4- Estimation du rendement quantique de la photochimie des centres PS II ouverts à partir des données de
fluorescence. On montre aisément (remplacer φFm et φFo par leur valeur donnée ci-dessus) que le rapport (φFm φFo)/ φFm qui est égal à φFV/φFm, où φFV = φFm - φFo, et qui est communément appelé le rapport Fv/Fm, peut
s’écrire :
(φFm - φFo)/ φFm = kp/(kp + kd + kf)
On voit qu’il correspond au rendement quantique de la photochimie du PSII, écrit φPSII: C'est la probabilité pour
qu'une excitation induite par un photon se désactive via la photochimie.
Chez des plantes bien adaptées à l'obscurité (= dont tous les centres sont ouverts), lorsque l’on utilise les appareil
couramment vendus dans le commerce, la valeur de φPSII est comprise entre 0.84 et 0.8. A l’obscurité Fv/Fm
représente le rendement quantique maximum de la photochimie du PSII
Si les mesures se font sous la lumière, on écrit :
φPSII’ = (φFm' - φFo’)/ φFm' = Fv'/Fm'
Le ' (après Fm et Fo) signifie que Fm a été mesuré pendant une période d'éclairement (en fournissant
énormément de lumière, voir §2 et la Fig.5) et que Fo a été mesurée sous un rayonnement de rouge sombre,
durant une période de quelques secondes en l’absence du rayonnement actinique. Sous lumière rouge sombre le
PSI, préférentiellement excité, oxyde rapidement le PSII le remettant rapidement dans un état entièrement
ouvert. Très généralement on a Fo> Fo’ et Fm> Fm’.
Sous la lumière actinique certains centres sont fermés et Fv’/Fm’ représente évidemment le rendement quantique
des centres ouverts du PSII dans ces conditions.
5
Dans ce qui suit le symbole d’un rendement, Φ, sera omis devant les fluorescence Fo, Fs, Fm et Fv affectés ou
non d’un prime. Ce qui se fait traditionnellement pour la commodité.
5-Estimation de la concentration relative des centres ouverts : le quenching photochimique. L’émission de
la fluorescence stationnaire dépend à la fois de la concentration des centres ouverts et de la concentration des
centres fermés. Si A est la concentration des centres ouverts (1-A) est la concentration des centres fermés. On
écrit :
Fs = A[kf/(kf + kp + kd)] + (1-A)[kf/(kf + kd)]
On démontre que
A = (Fm' - Fs)/(Fm' - Fo')
A est encore ce que l'on appelle le quenching photochimique, qp. C'est en effet une estimation de la capacité du
PSII à atténuer (to quench en anglais) la fluorescence. On comprend bien que cette capacité soit liée à la
concentration de centres ouverts car ce sont ceux-ci qui sont susceptibles d'accepter l’excitation. Ils atténuent la
fluorescence car ils sont capables de réaliser de la photochimie.
6-Rendement quantique opérationnel du PSII a la lumière (et non des centres PSII ouverts, seulement :
voir §5). Si qp est la fraction des centres ouverts à la lumière et Fv’/Fm’ le rendement quantique de ces centres,
le rendement quantique opérationnel de la photochimie du PSII s’écrit :
(Fv’/Fm’) x qp = (Fm'- Fs)/ Fm' = 1 - Fs/Fm'
(remplacer simplement qp par (Fm' - Fs)/(Fm' - Fo').
A l’obscurité, lorsque qp = 1 (tous les centres sont ouverts) : on a le rendement quantique maximum Fv/Fm
7- Mesure de l'émission de fluorescence sous une lumière modulée. Le flux lumineux émis par fluorescence
dépend de la lumière absorbée par le PSII. Cela rend les mesures un peu complexes surtout lorsque l'on étudie
spécifiquement l'effet des changements d'éclairement sur la photosynthèse. Cela rend aussi difficile les mesures
en plein champ, puisque, par nature, l'éclairement dans cette situation est hautement variable (aube, crépuscule,
passages nuageux….).
a-La technique (Fig.4) : une lumière analytique modulée provoque une émission de fluorescence
modulée.
L'utilisation d'appareil mesurant la fluorescence produite par une lumière modulée permet de faire
simplement ces mesures (Schreiber et al. 1988 ; Fig.4).
Cette lumière modulée (LM) est appelée lumière analytique, elle est d'intensité constante et faible,
réglée de telle sorte qu'elle ne produise pas de variations de la photochimie (ou une variation négligeable) ; elle
est donnée par une diode et filtrée pour couper les longueurs d’onde au dessus de 680 nm. Elle produit une
fluorescence modulée selon les mêmes caractéristiques et seule cette fluorescence, après passage sur un
détecteur, est amplifiée par un amplificateur accordé sur sa fréquence. Cette lumière analytique de flux
quantique constant et très faible produit une émission de fluorescence Fo.
La fluorescence produite par la lumière actinique, c’est à dire la lumière solaire, ou la lumière produite
par toute autre source lumineuse suffisamment puissante pour activer la photosynthèse, est vue par le détecteur
mais n’est pas amplifiée : car l’amplificateur est accordé seulement sur la fréquence de la lumière analytique.
Cependant, la lumière actinique modifie l’état rédox de QA (d’ou l’ouverture des centres PSII), qui est une
résultante entre les réactions amonts (afflux d’excitations des antennes) et des réactions avales (utilisation des
électrons pour l’assimilation du CO2 et de l’O2, la réduction de l’azote, etc…). L’émission de fluorescence
modulée varie en fonction de l’état de réduction des QA, c’est à dire en fonction de l’activité photosynthétique :
elle sera maximum lorsque tous les centre seront fermés : ce qui se produit lorsque la feuille est éclairée par une
lumière sursaturante
Dans les appareils développés actuellement les détecteurs sont munis d’un filtre qui ne laisse passer que les
longueurs d’onde au-dessus de 700 nm. D’après ce que l’on a dit plus haut (§1) on voit qu’il faudrait pour plus
de précision utiliser d’autres filtres. Cependant tels qu’ils sont ces appareils sont très performants.
6
LED
Amplificateur
Lumière
moduléeλ<680
λ>700nm
Détecteur
Source de lumière
sursaturante
Fluorescence
modulée
Fluorescence non modulée
Source de lumière actinique
Feuille
Lumière actinique
Fig. 4. Schéma de la technique de mesure de l’émission de la fluorescence modulée de la chlorophylle d’une
feuille. La lumière modulée émise par une LED à une longueur d’onde inférieure à 680 nm. Il lui correspond
une fluorescence modulée qui, seule, est amplifiée par un amplificateur sélectif accordé sur la fréquence de
modulation de la lumière modulée. La lumière actinique produit aussi une émission de fluorescence par la
feuille. Cette émission n’est pas amplifiée. Une source de lumière sursaturante non modulée ferme tous les
centres et produit aussi de la fluorescence non modulée qui n’est donc pas amplifiée. La lumière sursaturante est
aussi une lumière actinique.
b-La pratique : Une lumière sursaturante provoque la fermeture complète des centres. La Fig. 5
montre dans la pratique comment se font les mesures. Une feuille préalablement à l’obscurité est éclairée par la
lumière modulée (LM). Elle induit l’émission de fluorescence Fo.
Emission de fluorescence,
(unité arbitraire)
6
Fm
5
Fp
4
Fm'
LM, seule
3
Fs
2
Fo
Fo
Fo
1
Fo'
0
LM
LSS
LA
LSS
Fig.5. Variation de la fluorescence modulée en
fonction du temps sur une feuille intacte. La feuille
est d’abord maintenue à l’obscurité puis éclairée par
une lumière modulée, LM, de très faible intensité (la
lumière analytique). La fluorescence monte au
niveau Fo. On donne à cette feuille, toujours soumise
à LM, un flash, qui dure 1 seconde, de lumière
sursaturante, LSS. LSS ferme tous les centres PSII et
l’émission de fluorescence atteint le niveau Fm puis
redescend au niveau Fo. La lumière actinique, LA,
fermant des centres, entraîne aussi
une
augmentation de l’émission de la fluorescence
jusqu’à Fp, puis vers un niveau Fs. Lorsque de la
LSS est donnée durant une seconde on atteint le
niveau de fluorescence Fm’. Lorsque la LA est
éteinte, on récupère le niveau Fo initiale après une
transitoire minimum de Fo’ qui représente la valeur
de Fo à la lumière et qui persiste quelques secondes
à l’obscurité.
Temps (en minutes)
Si l'on éclaire alors la plante avec un flash de lumière sursaturante, LSS, dont la durée est habituellement d’une
seconde, on réduit brutalement toutes les QA. Tous les centres sont fermés; ils ne peuvent plus faire de
photochimie : on mesure Fm.
Cette première observation permet le calcul de Fv/Fm (= (Fm-Fo)/Fm), le rendement quantique de la
photochimie du PSII, lorsque tous les centres sont ouverts.
7
Après cette LSS l’émission de fluorescence regagne l’état Fo.
L’éclairage de la feuille avec une lumière actinique (LA ; capable de produire une réduction des QA), provoque
une montée rapide de l’émission de la fluorescence suivie de sa diminution vers une valeur stationnaire, Fs (ceci
est analogue à ce qui a été vu sur les chloroplastes isolés (Fig.3)). Si l’on utilise à nouveau la LSS, on atteint un
niveau Fm’. On remarque que Fm’<Fm.
Lorsque la lumière actinique est éteinte, l’émission de fluorescence descend jusqu’à un niveau Fo’ qui augmente
rapidement pour atteindre le niveau Fo mesuré antérieurement.
Dans tous les cas ce que l’on mesure est une émission de fluorescence induite par un flux constant de lumière
modulée. Cette émission varie entre Fo et Fm dont les valeurs sont fixées par l’intensité du faisceau modulé. Si
l’émission de fluorescence augmente sur une feuille soumise à de la lumière actinique c’est exclusivement parce
que cette dernière provoque une fermeture des centres PSII.
Le rendement de fluorescence de la lumière modulée, FLM/ILM, où FLM et ILM sont respectivement l’émission
de fluorescence induit par la lumière modulée et l’intensité de la lumière modulée, est modifiée par l’état
rédox des QA.
Noter que l’état rédox des centres peut varier aussi suite à une restriction du métabolisme
photosynthétique sous une lumière constante. C’est ce qui se produit, par exemple, lorsqu’une feuille de Maïs est
placée dans un air pauvre en CO2 : dans ce cas les électrons produits par le PSII ne sont plus utilisés, et toutes les
QA sont rapidement réduites (On rappelle que le Maïs est une plante en C4, et comme telle, ne présente pas de
fixation photosynthétique de O2 : d’où très peu d’accepteurs d’électrons autres que le CO2). Ceci se produit dans
la nature chez ces plantes soumises à un manque d’eau lorsque les stomates se ferment empêchant alors le CO2
ambiant de diffuser jusque vers les chloroplastes dans les feuilles.
8-le quenching non-photochimique. Comme on le montre la Fig.5 la valeur de Fm’ mesurée sous lumière
actinique est plus faible que la valeur de Fm mesurée après une période d’obscurité lorsque tous les centres sont
ouverts. La lumière actinique a provoqué une extinction de la fluorescence maximum. C’est ce que l’on appelle
le quenching non photochimique : la photochimie n’intervient pas en effet dans cette extinction puisque la
lumière sur saturante ferme tous les centres : on écrit Fm = kf/(kf + kd ) (voir plus haut).
La diminution de Fm à la lumière est due à l’augmentation de la constante kd liée à la dissipation
thermique. On suppose dans cette analyse que kf ne change pas ou que ses changements sont très faibles, ce qui
doit être proche de la vérité puisque kd est très supérieur à kf. Le quenching non photochimique (NPQ : non
photochemical quenching) est calculé comme :
NPQ = (Fm – Fm’)/ Fm’
La Fig.5 montre aussi que Fo’ (Fo sous lumière actinique) est estimée durant quelques secondes suivant la
coupure de la lumière actinique. Durant cette estimation on illumine habituellement la feuille par du rouge
sombre (λ = 730 nm, par exemple ; voir aussi le §4, ci-dessus)
La Fig.5 montre le quenching non-photochimique affecte aussi Fo. On voit en effet que Fo > Fo’.
9- Un exemple concernant la mise en route de la photosynthèse observée sur une feuille de tournesol. La
Fig.6A (courbe bleue) montre la variation de l’assimilation de CO2 (A) lors du passage d’une feuille de tournesol
de l’obscurité à la lumière, puis à nouveau à l’obscurité.
A l’obscurité A est négatif : la respiration foliaire produit du CO2. Le passage à la lumière active la
photosynthèse et entraîne une assimilation de CO2.qui atteint environ 18.5 µmol m-2 s-1 juste avant l’extinction
de la lumière.
L’émission de fluorescence modulée est mesurée en même temps. La LM ne modifie pas la respiration
de la feuille (on rappelle que LM est une lumière très faible). De même, lorsqu’un flash de 1 seconde de lumière
sursaturante (LSS) est donné à la feuille (durée trop courte). Sous la LSS on mesure Fm. On détermine ainsi le
rendement quantique maximum de la photochimie du PSII. On calcule ici Fv/Fm = 0,83, qui est une valeur
normale avec les systèmes de mesure communément disponibles.
La fluorescence modulée augmente immédiatement jusqu’à une valeur maximum quand la feuille est
éclairée par la lumière actinique, puis diminue lorsque A augmente, pour atteindre une valeur stationnaire. On
remarque que Fm’, d’abord fortement inhibée lors du démarrage de A (fort quenching non photochimique),
augmente à nouveau jusqu’à une valeur stable. Enfin, quand la feuille passe à nouveau à l’obscurité, Fm
8
augmente progressivement : l’appareil photosynthétique récupère lentement un état de « repos » caractéristique
de l’obscurité.
Les variations du quenching non photochimique sont quantifiées Fig.6B qui montre l’évolution du
paramètre NPQ (courbe bleue). On voit en particulier que la diminution de NPQ à l’obscurité est biphasique,
d’abord rapide, puis lente ensuite, traduisant l’existence d’au moins deux mécanismes limitant sa relaxation (voir
chapitre photoinhibition).
Fv’/Fm’ suit une variation à peu près inverse de celle de NPQ. Chez la feuille éclairée par la lumière
actinique, le rendement quantique des centres ouverts diminue rapidement (augmentation de la dissipation
thermique) pour ré-augmenter jusqu’à atteindre une stabilité. A l’obscurité le rendement quantique du PSII
augmentent très progressivement. Après une période d’obscurité suffisamment longue la valeur de Fv/Fm sera
comprise à nouveau entre 0.8 et 0.84.
La valeur maximum du NPQ et la valeur minimum du Fv’/Fm’ correspondent toutes deux
approximativement à la plus petite valeur du qp : c’est à dire à la concentration la plus faible des QA oxydées
(Fig.6C). Il faut attendre que l’assimilation du CO2 démarre pour que les électrons produits par le PSII soient
utilisés et que les centres PSII s’ouvrent à nouveau.
Fm
15
Fm
Fm'
10
Fo
5
Fo'
LSS
LM
0
LA
OBS
0.85
0.7
NPQ
0.6
0
6
12
18
24
30
B
X Axis
0.80
0.5
0.75
0.4
0.70
0.3
0.65
0.2
0.60
0.1
0.55
0.0
0.50
0
6
12
1.0
18
24
30
C
C
X Axis
0.8
qp
A (µmol CO2 m-2 s-1)
20
A
0.6
obscurité
lumière
obscurité
0.4
0.2
Fv/Fm et Fv'/Fm'
Emission de fluorescence
(unité arbitraires)
Cette observation montre que le PSII régule très rapidement l’utilisation de la lumière. La baisse transitoire du
rendement quantique de sa photochimie indique qu’il peut accroître brièvement la dissipation de l’énergie qu’il
absorbe sans réaliser de photochimie. Cet état correspond à la période d’induction de la photosynthèse, lorsque la
proportion de centres ouverts (QA oxydés) est faible en raison de la faible capacité du métabolisme carboné à
drainer l’énergie arrivant sur le PSII.
Cette régulation rapide de l’utilisation de la lumière par le PSII permet d’éviter une « surchauffe » des
centres réactionnels lorsque la capacité du système photosynthétique à accepter des électrons est faible devant
l’excitation qui arrive sur les antennes collectrices.
Figure 6. Toutes les résultats présentés
ont été obtenus simultanément sur une
feuille de Tournesol (Helianthus annuus)
maintenue en conditions contrôlées :
température foliaire, 25°C ;déficit de
pression de saturation de vapeur d’eau
dans l’air, 1,0 ± 0,2 kPa ; la densité de
flux quantique apportée par lumière
actinique (LA) est de 300 µmol m-2 s-1. La
feuille est restée deux heures à l’obscurité
avant de passer à la lumière.
A : (bleu) évolution de A (échanges nets
de CO2) lors du passage de la plante de
l’obscurité à la lumière (LA) puis à
nouveau à l’obscurité (OBS). L’émission
de la fluorescence chlorophyllienne est
mesurée en même temps (voir la Fig. 5
pour les symboles.
B : variations du quenching non
photochimique, NPQ (bleu,● ) et de
Fv’/Fm’ (rendement quantique de la
photochimie des centres PSII ouverts,
noir,○) durant la même séquence,
obscurité lumière obscurité.
C : variation de qp, le quenching
photochimique, qui est une mesure de la
concentration relative des centres PSII
ouverts. (Cornic, non publié)
0.0
0
6
12
18
24
30
temps en (minute)
9
10-Estimation du flux d'électrons dans la chaîne photosynthétique sur une feuille. Il est estimé à partir de la
relation entre le rendement quantique de la photochimie du PSII, ΦPSII (voir §6 ci-dessus), et le rendement
quantique de l’assimilation du CO2 mesurée en condition non photorespiratoire (dans 0.5 ou 1% de O2, ou ans un
air contenant 2 000 ppm de CO2 par exemple). Dans ces conditions tous les électrons venant du PSII (ou leur
grande majorité) servent à la réduction du dioxyde de carbone. On ajoute la respiration, Rn (respiration à
l’obscurité) à l’assimilation nette de CO2 (A) pour obtenir l’assimilation brute de CO2.(en µmol CO2 m-2 s-1).
ΦCO2 est obtenu en divisant l’assimilation brute de CO2 par la densité de flux quantique (en µmol m-2 s-1)
qu’absorbe la feuille : ΦCO2 = (A+Rn)/DFQP, dont les dimensions sont : µmol CO2 m-2 s-1/ µmol photon m-2 s1
= molécules CO2 par photon.
On montre dans ces conditions qu’il y a une relation linéaire entre ΦPSII et ΦCO2 (par exemple Fig.7
Cornic et Massacci, 1996 ).
Cette relation est la même
1-que l’assimilation du CO2 soit modifiée en variant l’éclairement lorsque la fraction molaire de CO2
dans l’air ambiant reste constante (Δ, ο),
2-qu’on la fasse varier sous lumière constante en changeant la fraction molaire de CO2 (∇, ) ou
3-que le degré d’hydratation des tissus soit modifié (z) toutes les autres conditions étant stables.
Comme l’assimilation du CO2 dans ces conditions non-photorespiratoire est proportionnelle au flux
d’électrons dans la chaîne photosyntétique, et que la relation obtenue entre ΦPSII et ΦCO2 est la même dans des
conditions très différentes on conclut que le fonctionnement du PSII est le même dans les différentes conditions
de mesures indiquées ci-dessus
Dans le cas de la Fig.7 la relation s’écrit
ΦPSII = 8,46ΦCO2 + 0,0337
ΦPSII est aisé à mesurer sur des feuilles en conditions contrôlées ((Fm’-Fs)/Fm’, voir Fig.5). Supposons un
ΦPSII = 0,4, mesurée sous un flux quantique actinique de 350 µmol m-2 s-1. On calcule en utilisant la relation
entre ΦPSII et ΦCO2 indiquée plus haut qu’à ΦPSII correspond une valeur ΦCO2 = 0.0433 µmol de CO2 par
µmol photon. ΦCO2 multiplié par la valeur de la densité de flux quantique sous laquelle la mesure a été faite,
donne une assimilation brute de CO2 (350 µmol m-2 s-1 x 0.0433 µmol de CO2 par µmol photon) = 15,15 µmol
CO2 m-2 s-1)
Enfin, l’assimilation brute de CO2 multipliée par 4 (il faut 4 électrons pour réduire une molécule de
CO2), donne une estimation du flux d’électrons, JT, dans la chaîne photosynthétique. Dans l’exemple ci-dessus :
15,15 µmol CO2 m-2 s-1 x 4 µmol électrons µmol-1CO2 = 60,60 µmol électrons m-2 s-1.
1.0
Figure 7. Relation entre ΦPSII rendement actuel de la
photochimie du PSII et le rendement quantique de
l’assimilation brute du CO2 (= A+ Rn, Rn étant la respiration
à l’obscurité). Les mesures sont faites sur des feuilles de
haricot (Phaseolus vulgaris L.) maintenues en conditions
contrôlées. L’Assimilation du CO2 modifiée en variant
l’éclairement lorsque la fraction molaire de CO2 dans l’air
ambiant reste constante (Δ, ο), en changeant la fraction
molaire de CO2 (∇, ) sous lumière constante, ou en variant
le degré d’hydratation des tissus (z) toutes les autres
conditions étant stables. (d’après Cornic et Massacci, 1996).
r2 = 0,987
0.8
ΦPSII
0.6
0.4
0.2
0.0
0.00
0.05
ΦCO2 (mol CO2. mol
0.10
photons-1)
Ce flux d’électrons, JF, peut être aussi calculé théoriquement en considérant seulement la valeur de ΦPSIIi :
JT = 0.4 x 350 µmol m-2 s-1 x 0,5 x 0,8
10
1-le rendement quantique de la photochimie du PSII est multiplié par la moitié du flux quantique arrivant sur la
la feuille : 350 µmol m-2 s-1 x 0,5. En effet seule la moitié de la lumière est absorbée par le PSII, l’autre moitié
est absorbée par le PSI.
2-Le tout est multiplié par 0,8 qui représente la fraction de lumière absorbée par la feuille. Cette valeur est prise
comme moyenne de ce qui est observé dans la plupart des cas.
Dans ce cas JT = 56 µmol électrons m-2 s-1. La différence entre cette valeur et la valeur précédemment calculée
peut provenir d’une incertitude sur la quantité de lumière incidente réellement absorbée par la feuille ou d’une
incertitude sur le partage de la lumière absorbée entre le PSII et le PSI. On sait que le PSI absorbe un peu plus
d’énergie que le PSII.
En tout état de cause la relation Fig.7 gagne a être connu lorsque l’on détermine JT car elle constitue,
sur les plantes que l’on utilise, une véritable courbe d’étalonnage.
11-estimation de la vitesse d’oxygénation et de carboxylation du RuBP. Connaissant la relation en ΦPSII et
ΦCO2 on calcule JT, le flux total d’électrons. On suppose, chez les plantes en C3 que le flux d’électrons venant du
PSII est utilisé pour la carboxylation, Jc, et l’oxygénation, Jo, du RuBP (On admet que la réaction de Mehler est
négligeable). On écrit (Valentini et al., 1995) :
JT = Jc + Jo
Quatre électrons sont utilisés pour fixer une molécule de dioxyde de carbone. On écrit
Jc = 4(A + L + Rd)
où L est le flux de CO2 durant la photorespiration et Rd celui durant la respiration. On voit que (A + L + Rd) est
identique à l’expression (A + 0.5vo + Rd) qui représente la photosynthèse brute et que l’on a introduit dans le
chapitre « effets, à court et à long terme, du CO2 sur la photosynthèse ; §I,A,4». Quatre électrons sont utilisés
pour une oxygénation du RuBP et une molécule de CO2 est produite toutes les deux oxygénations.
Jo = 4(2 x L)
D’où
Jc = 1/3 [JT + 8* (A + Rd)]
et
Jo = 2/3 [JT - 4* (A + Rd)]
Rd est déterminé en mesurant le dégagement de CO2 à l’obscurité. On sait que cela n’est qu’une approximation
puisque la respiration est inhibée à la lumière (§I,A,4 du chapitre « Effets, à court et à long terme, du CO2 sur la
photosynthèse).
Les valeurs de Jc et de Jo sont utilisées pour déterminer une valeur relative de Cc, la teneur en CO2
dans les chloroplastes (voir le détail dans le chapitre « Effets de la contrainte hydrique sur la photosynthèse ;
§ 10,c»).
12- Conclusion. La mesure de l’émission de la fluorescence chlorophyllienne permet d’avoir une estimation in
vivo du flux d’électrons dans les membranes thylacoïdiennes. Comme cette estimation est habituellement faites
en mesurant les échanges nets de CO2, il devient alors possible, chez les plantes en C3, d’évaluer le flux
d’électrons utiliser pour la réduction du C (carboxylation du RuBP) et la réduction de l’oxygène (principalement
l’oxygenation du RuBP, qui est à l’origine de la photorespiration) (voir dans une section ultérieure « Effet de la
contrainte hydrique sur la photosynthèse » pour les détails du calcul). En supplément on peut aussi décrire la
régulation de l’utilisation de la lumière par le PSII (mesure des quenching non photochimique, NPQ, et
photochimique, qp). Un guide pratique de l’utilisation de l’émission de la fluorescence chlorophyllienne a été
aussi récemment publié par Maxwell et Johnson (2000).
11
13-Résumé.
IL’émission de fluorescence chlorophyllienne à température ordinaire provient très majoritairement du
photosysème II.
Un centre PSII ouvert est un centre PSII dont l’accepteur primaire QA est oxydé.
Un centre PSII fermé est un centre PSII dont l’accepteur primaire QA est réduit
IILumière actinique = lumière d’intensité suffisante pour provoquer une fermeture de quelques centres PSII.
Lumière sursaturante = Lumière d’intensité suffisante pour provoquer la fermeture de tous les centres PSII.
Lumière modulée = lumière analytique d’intensité suffisamment faible ne pas induire de façon significative la
fermeture de centres PSII. Elle est utilisée pour induire une fluorescence modulée d’organismes
photosynthétisants sous lumière actinique (voir §7 du texte).
IIIFo = Emission de fluorescence lorsque tous les centres sont ouverts : L’énergie absorbée peut être désactivée
par émission de fluorescence, sous forme de chaleur ou par voie photochimique
Fm et Fm’ = Emission de fluorescence lorsque tous les centres PSII sont fermées. Le ‘ indique la mesure faite
sous lumière actinique. L’énergie absorbée peut être désactivée par émission de fluorescence ou sous forme de
chaleur ou par voie photochimique. Les centres étant fermés il n’y a pas de désactivation par voie
photochimique.
Fs = Emission de fluorescence à l’état stationnaire sous une lumière actinique
Fp = maximum de l’émission de fluorescence immédiatement après le passage d’une feuille (ou d’une
suspension de chloroplastes de l’obscurité à la lumière.
IVFv/Fm = rendement quantique maximum de la photochimie du PSII.
Fv/Fm = (Fm –Fo)/Fm
Fv’/Fm’ = rendement quantique maximum de la photochimie des centres ouverts chez une feuille à la lumière.
Fv’/Fm’ = (Fm’ – Fo’)/Fm’
qp = concentration relative des centres ouverts ou quenching non photochimique.
qp = (Fm' - Fs)/(Fm' - Fo')
ΦPSII = rendement quantique opérationnelle du PSII
ΦPSII = (Fv’/Fm’) x qp = (Fm'- Fs)/ Fm' = 1 - Fs/Fm'
QNP = Quenching non photochimique
QNP = (Fm – Fm’)/Fm’
14-Références.
Cornic G, Massacci A (1996) Leaf photosynthesis under drought stress. In: Photosynthesis and the environment,
ed. N.R. Baker, pp. 347-366. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands
French CS, Smith JHC, Virgin HI, Airth RL (1955) Fluorescence-spectrum curves of chlorophylls, pheophytins,
phycoerythrins, phycocyanins and hypericin. Plant Physiol. 31, 369 –374
Krause GH, Weis E (1984). "Chlorophyl fluorescence as a tool in plant physiology II interpretation of
fluorescence signals. Photosynthesis research 5, 139-57.
Maxwell K, Johnson GN (2000) Chlorophyll fluorescence - a practical guide. Journal of Experimental Botany
51, 659-668
Rabinovitch EI (1956) Photosynthesis and related processes. VolII. Part 2. Interscience publishers, Inc., New
York.
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