PASTOREX® PneumoDUO

PASTOREX® PneumoDUO
25 Tests
61719
LATEX AGGLUTINATION TEST FOR IDENTIFICATION
OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AND
SCREENING FOR SEROGROUPS 6, 9, 14, 19, 23.
1 - CLINICAL VALUE
S. pneumoniae is frequently isolated from the ear, nose and throat and
respiratory tract. In response to certain factors, it can induce serious
infections such as meningitis, septicaemia or pneumonia. In this context,
patient survival often depends on rapid treatment, requiring the use of
rapid diagnostic tests. The increasing proportion of penicillin-resistant
strains constitutes an additional difficulty in the choice of first-line
treatment.
2 - SUMMARY AND EXPLANATION
The diagnosis of pneumococcal infections can be established by
conventional bacteriology methods: appearance of the colony and Gram
staining (Gram-positive diplococcus), optochine sensitivity and bile
solubility test. The presence of capsular antigens on the surface of the
bacteria also constitute the basis for omnivalent latex agglutination tests
for identification of pneumococci. Ninety different serotypes of
S. pneumoniae have currently been described [1]. The corresponding
capsular antigens can be detected on cultures, but also directly in
biological fluids (CSF, serum, urine, etc.) into which they are secreted
during infection.
After having identified the etiological agent, the clinician is then faced
with the difficult choice of antibiotic, complicated by the growing
propor tion of strains with decreased sensitivity to penicillin.
Epidemiological studies [2], [3], [4], [5], [6], [7] have shown that, in
most regions of the world, penicillin resistance is most frequently
associated with the following 5 serogroups : 6, 9, 14, 19, 23. The use of
a specific latex for these 5 serogroups therefore presents a double
advantage: increased sensitivity compared to omnivalent reagent for the
detection of antigens corresponding to these strains and a means of early
evaluation of the risk of penicillin resistance, constituting an aid to the
decision of first-line antibiotic therapy.
3 - PRINCIPLE OF THE TEST
Pastorex® PneumoDUO is a rapid latex agglutination test composed of
2 reagents:
• an omnivalent latex sensitised with antibody purified from rabbit serum
reacting with all known pneumococcal serotypes ;
2
• a 6, 9, 14, 19, 23 reagent, specific for the capsular antigens of
S. pneumoniae belonging to these 5 serogroups. This pentavalent latex
therefore allows indirect screening for the strains usually associated
with penicillin resistance, with an increased sensitivity compared to the
omnivalent reagent (see analytical performances).
For each of the reagents, latex particles are agglutinated in the presence
of a sufficient quantity of homologous antigens.
As some culture media or certain bacteria can induce nonspecific
aggregations, it is recommended to use, in parallel, the negative control
latex supplied in the Pastorex® Meningitis kit, control reagents, code 61624.
4 - COMPOSITION OF THE KIT
25- test kit, code 61719, containing :
• One 0.40 ml dropper bottle of green latex specific for Streptococcus
pneumoniae.
• One 0.40 ml dropper bottle of red latex specific for Streptococcus
pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5 - WARNING AND PRECAUTIONS
For in vitro diagnostic use
1. Do not use the kit after the expiry date.
2. Treat all samples as if they were potentially infectious and perform
cultures according to aseptic laboratory techniques.
3. Discard disposable inoculation loops and agglutination cards in an
autoclave or disinfectant tank. Do not reuse cards.
4. It is strongly recommended to wear disposable gloves.
5. Do not touch the surface of the reagent cards with the fingers.
6. Leave reagents at room temperature (18-25°C) before use.
7. Shake bottles of latex before use.
6 - STORAGE OF REAGENTS
Reagents must be stored between 2°C and 8°C. Store bottles of latex
reagent upright. NEVER FREEZE THE LATEX REAGENT. When stored under
the conditions indicated and when they are not contaminated, the
reagents are stable until the expiry date indicated on the label.
3
7 - SAMPLE COLLECTION AND CULTURE
Isolates must be obtained from 18- to 24-hour cultures on blood agar,
such as Columbia sheep blood code 63784 / TCS sheep blood code
63964 or equivalent. Subculture in broth prior to analysis must be
performed from this isolation by subculturing several colonies in Todd
Hewitt broth code 55705, TCS broth code 53455 or 54964 or
equivalent.
Some blood culture media can induce slight nonspecific reactions; when
in doubt, perform a control using a blood culture medium inoculated with
sterile blood or a sample containing a bacteria other than S. pneumoniae.
8 - PROCEDURE
Material provided : See Composition of the kit.
Material required but not provided :
- Pipettes delivering 40 µl.
- Loops for harvesting of bacterial colonies.
- Centrifuge for haemolysis tubes or Eppendorf tubes.
- Disinfectant tank or autoclavable bag for elimination of used
agglutination cards.
- Pastorex ® Meningitis: Control Reagents Control Kit, code 61624,
consisting of :
• 2x0.40 ml of negative control latex.
• 2xq.s.1ml of polyvalent positive control.
• 2x10 disposable cards.
• 150 disposable mixing sticks.
Steps:
1) Processing of samples
Analysis from colonies
On a sample taken from an 18-24 hour culture on blood agar, verify
morphology, Gram staining, catalase and haemolysis (do not test
catalase-positive strains). Only analyse Gram-positive cocci. Inoculate
Todd Hewitt, TCS or equivalent broth with several colonies. When the
culture is sufficiently dense for cloudiness to be visible to the naked eye
(3 to 5 hours of incubation depending on the inoculum), analyse the
culture broth using the latex reagents. Avoid excessively long
4
incubation times, which could induce cell lysis, responsible for
nonspecific agglutination reactions with the 6, 9, 14, 19, 23 latex.
Blood cultures:
Centrifuge 1 to 2 ml of blood culture to precipitate the red blood cells
(e.g.: 5 min at 2,000 g). Perform the test on the supernatant.
2) Thoroughly homogenise the latex reagents.
3) For each test sample, deposit 1 drop of negative control latex available
in kit code 61624 onto a circle with a white background, 1 drop of
omnivalent S. pneumoniae latex (green) onto a circle with a black
background and 1 drop of S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 latex (red)
onto a circle with a white background.
4) Deposit 40 µl of sample next to each drop of latex.
5) Thoroughly mix the latex with each sample using a mixing stick to
obtain a homogeneous suspension on the entire surface of the circle.
Change mixing sticks for each sample.
6) Rotate the card slightly (a mechanical system such as a rotative mixer
110-140 rpm can be used) and read the reaction within the allocated
time depending on the reagent and the type of sample.
7) Reading of the results: in order to ensure optimal sensitivity and
specificity of the reagents, it is recommended to observe the following
maximum reading times:
• Omnivalent reagent (green latex) and negative control latex: 5
minutes,
• Pentavalent reagent (red latex): 2 minutes.
9 - RESULTS
Reading of the reactions :
Observe the recommended reagent reading times in order to ensure
optimal performance of the test.
A positive reaction is characterised by clear agglutination of particles
visible with the naked eye.
A negative reaction is characterised by the absence of agglutination of
the reagent, which retains its milky appearance.
5
Note: The appearance of traces or the presence of fine granulation not
changing with time must be considered to be a negative result.
Interpretation :
READING OF AGGLUTINATION
INTERPRETATION
Omnivalent reagent 6,9,14,19,23 reagent
(green latex)
(red latex)
+
+
S. pneumoniae belonging to one of
the 6, 9, 14, 19, 23 serogroups
-
+
S. pneumoniae belonging to one of
the 6, 9, 14, 19, 23 serogroups [a]
+
-
S. pneumoniae belonging to
serogroups other than 6, 9, 14, 19,
23 [b]
-
-
Absence of a detectable quantity of
S. pneumoniae antigens in the
sample analysed
• [a] As the S. pneumoniae 6, 9, 4, 19, 23 reagent is more sensitive
than the omnivalent reagent, it may detect lower quantities of antigens.
This type of result is unlikely in the case of a sufficiently dense culture,
but can occur in blood cultures, in which case, when an atypical or
doubtful agglutinate is obtained with the 6, 9, 14, 19, 23 latex, the
test should be repeated on the blood culture supernatant after heating
to 100°C for 5 minutes followed by clarification by centrifugation.
• [b] Due to the high sensitivity of the S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23
reagent, some antigenic structures common to all pneumococci can
induce weak cross-reactions with the other serotypes. Consequently, all
weakly positive reactions of the pentavalent latex associated with a
frankly positive reaction on the omnivalent latex must be considered to
be nonspecific and interpreted as NEGATIVE.
Uninterpretable result :
In the case of agglutination of the negative control latex and regardless of
the intensity of the “test” latex reactions, the result is considered to be
uninterpretable.
6
10- QUALITY CONTROL
It is recommended to regularly verify the performances of the S. pneumoniae
latex and the control latex according to the following recommendations:
sensitivity can be validated by testing the antigen mixture supplied in the
Control Reagents Control Kit, code 61624, as a ready-to-use sample. An
agglutination reaction should be observed within 3 minutes with both
S. pneumoniae reagents, while the control latex must remain homogeneous.
Absence of auto-agglutination can also be verified by using physiological
saline in the place of the sample. Check the absence of agglutination
after shaking for 5 minutes.
11- LIMITS OF THE TEST
A negative result does not exclude the possibility of S. pneumoniae
infection. A negative result can be due to an insufficient quantity of
antigens in the sample analysed. The objective of the test is rapid
detection of infection and the test must be performed as a complement to
and not as a replacement for culture procedures.
Antigenic similarities between pneumococci and other bacteria have
been described in the literature and can induce cross-reactions [8-12].
The definitive diagnosis cannot be established exclusively on the basis of
a rapid immunological test, but must take into account all of the clinical
data and the results of microbiological and biochemical tests.
12- PERFORMANCES OF THE TEST
Analytical sensitivity :
A study of the limit of sensitivity of each reagent on purified antigens,
diluted in physiological saline gave the following results.
Antigen
Antigen
serogroup
serogroup
6B
9N
14
19
23F
Minimal concentration detected (µg/ml)*
Omnivalent reagent
6, 9, 14, 19 , 23 reagent
0.15
0.05
0.3
0.02
0.35
0.05
1
0.025
1
0.5
* However, this limit may vary according to the batch tested.
7
Analysis of blood cultures and strains isolated :
The following analyses were performed in the context of a hospital
evaluation of the test: 46 blood cultures obtained during a prospective
study, 22 simulated blood cultures and 99 clinical isolates of
S. pneumoniae from the hospital’s collection.
The specificity of the reagents was evaluated during a complementary
study performed on 48 isolates of pathogens other than S. pneumoniae.
The results are summarised in the following table:
BLOOD CULTURE
Nber of positive reactions
Total Omnivalent Pentavalent
nber of
strains
S. pneumoniae 15
12
15
serogroups
6, 9, 14, 19, 23
S. pneumoniae 11
11
0
other serogroups
Other bacteria 42
0
0
CULTURE AFTER ISOLATION
Total
nber of
strains
48
Nber of positive reactions
Omnivalent Pentavalent
48
48
51
51
1
48
0
3
• Sensitivity:
The sensitivity obtained during this evaluation was 100% for the
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 latex (15/15 blood cultures, 48/48
cultures from pneumococcal isolates) and 97.4% for the omnivalent latex
(12/15 blood cultures, 99/99 cultures from isolated bacteria). The 3 blood
cultures of pneumococci not reacting with the omnivalent S. pneumoniae
latex gave a strongly positive reaction with the pentavalent latex,
confirming its greater sensitivity.
• Specificity:
Screening for pneumococci serogroups 6, 9, 14, 19, 23
Among the 62 pneumococci belonging to serogroups other than those
targeted by the pentavalent latex, only 1 “untypable” pneumococcus
gave a weak cross-reaction with the S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23
reagent (specificity: 98.4%). Note: the absence of agglutination with
another untypable strain of pneumococcus included in the study shows
that this type of cross-reaction is not systematic.
8
Cross-reactions with bacteria other than S. pneumoniae.
The specificity was tested in relation to 90 strains (42 blood cultures of
the prospective study, 48 cultures from isolated bacteria) including the
following bacteria: S. aureus, coagulase-negative staphylococci, S. bovis,
S. viridans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, Streptococcus groups A, B, C,
D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans,
Acinetobacter sp., E. coli, H. influenzae, N. meningitidis A, B, C, Y,
W135. No cross-reaction was detected with the omnivalent latex
(specificity: 100%). The pentavalent latex gave atypical agglutinations
with 2 strains of S. faecalis and one group G Streptococcus. Such crossreactions have been described in the literature (see limits of the test).
• Inter-batch and inter-operator reproducibility
The reproducibility of analyses was tested on 3 different batches of each
reagent and for the same batch used by 3 different operators. The test
samples included blood cultures (strong positive, weak positive, negative
reaction), isolated strains (strong positive, weak positive, negative
reaction) and a pneumococcus polysaccharide antigen in solution in
physiological saline. No significant variation was demonstrated for the
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 reagent. Inter-batch variations were
demonstrated during analysis of weak positive samples with the
omnivalent latex.
13–BIBLIOGRAPHY
See french version.
9
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PASTOREX® PneumoDUO
25 Tests
61719
TEST D’AGGLUTINATION AU LATEX POUR
L’IDENTIFICATION DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
ET LE SCREENING DES SEROGROUPES 6, 9, 14, 19, 23.
1- INTERÊT CLINIQUE
S. pneumoniae est un hôte fréquent de la sphère ORL ainsi que du tractus
respiratoire. Sous l’influence de certains facteurs, il peut provoquer des
infections graves telles que des méningites, septicémies ou pneumonies.
Dans ce contexte, la rapidité avec laquelle les patients sont traités est
souvent vitale et il est nécessaire d’avoir des tests de diagnostic rapides.
La proportion croissante de souches résistantes à la pénicilline représente
une difficulté supplémentaire dans le choix thérapeutique de première
intention.
2- RESUME ET EXPLICATION DU TEST
Le diagnostic des infections à pneumocoques peut être établi par des
méthodes de bactériologie classiques : aspect de la colonie et du Gram
(diplocoque Gram+) , sensibilité à l’optochine ou test de solubilité dans la
bile. La présence d’antigènes capsulaires à la surface de la bactérie
constitue également la base de tests d’agglutination au latex omnivalents
permettant l’identification des pneumocoques. A ce jour, 90 sérotypes
différents ont été décrits chez S. pneumoniae [1]. Les antigènes
capsulaires correspondants peuvent être recherchés à partir de cultures
mais également directement dans les liquides biologiques (LCR, sérum,
urines…) où ils sont excrétés au cours de l’infection.
Après avoir identifié l’agent étiologique, le clinicien se heurte ensuite au
choix de l’antibiothérapie compliqué par la proportion importante de
souches de sensibilité diminuée à la pénicilline. Des études épidémiologiques
[2], [3], [4], [5], [6], [7] ont montré que dans la plupart des régions, la
résistance à la pénicilline était associée le plus fréquemment aux 5
sérogroupes suivants 6, 9, 14, 19, 23. L’utilisation d’un latex spécifique de
ces 5 sérogroupes présente ainsi un double avantage : une sensibilité
accrue par rapport au réactif omnivalent dans la détection des antigènes
correspondants à ces souches et un moyen d’évaluation précoce du
risque de résistance à la pénicilline constituant une aide dans l’orientation
de l’antibiothérapie de première intention.
3- PRINCIPE DU TEST
Pastorex® PneumoDUO est un test rapide d’agglutination au latex composé
de 2 réactifs :
• un latex omnivalent sensibilisé avec des anticorps purifiés à partir d’un
sérum de lapin réagissant avec tous les sérotypes connus de pneumocoques.
12
• un réactif 6, 9, 14, 19, 23 spécifique des antigènes capsulaires de
S. pneumoniae appartenant à ces 5 sérogroupes. Ce latex pentavalent
permet ainsi de screener indirectement les souches associées le plus
souvent à la résistance à la pénicilline et ceci avec une sensibilité
accrue par rapport au réactif omnivalent (cf. performances analytiques).
Pour chacun des réactifs, les particules de latex s’agglutinent en présence
d’une quantité suffisante d’antigènes homologues.
Certains milieux de culture ou certains germes pouvant entraîner des
agrégations non spécifiques, il est recommandé d’utiliser parallèlement le
latex témoin négatif fourni dans le kit Pastorex® Meningitis, Réactifs de
contrôle, code 61624.
4- COMPOSITION DES COFFRETS
Coffret de 25 tests, code 61719, contenant :
• 1 flacon compte-gouttes de 0,40 ml de latex vert spécifique de
Streptococcus pneumoniae ;
• 1 flacon compte-gouttes de 0,40 ml de latex rouge spécifique de
Streptococcus pneumoniae 6,9,14,19,23.
5. MISE EN GARDE ET PRÉCAUTIONS D'EMPLOI
Pour usage diagnostique in vitro
1. Ne pas utiliser le coffret après la date de péremption.
2. Traiter tous les échantillons comme s'ils étaient potentiellement infectieux
et effectuer les cultures selon des techniques de laboratoire aseptiques.
3. Jeter les öses d'ensemencement à usage unique et les cartes d'agglutination
dans un autoclave ou un bac désinfectant. Ne pas réutiliser les cartes.
4. Le port de gants à usage unique est fortement conseillé.
5. Ne pas toucher avec les doigts la surface réactionnelle des cartes.
6. Ramener les reactifs à température ambiante (18 - 25°C) avant utilisation.
7. Agiter les flacons de latex avant utilisation.
6- CONSERVATION DES REACTIFS
Les réactifs doivent être conser vés à une température de 2-8°C.
Conserver les flacons réactifs au latex debout. NE JAMAIS CONGELER LE
RÉACTIF AU LATEX. S'ils sont conservés dans les conditions indiquées et
s'ils ne sont pas contaminés, les réactifs sont stables jusqu'à la date de
péremption indiquée sur l'étiquette.
13
7- RECUEIL ET CULTURE DES ECHANTILLONS
Les isolements doivent être faits par culture de 18-24h sur des géloses au
sang telles que Columbia sang de mouton code 63784 / TCS sang de
mouton code 63964 ou équivalents. La subculture en milieu liquide
préalable à l’analyse doit être réalisée à partir de cet isolement en
repiquant quelques colonies en bouillon Todd Hewitt code 55705, TCS
codes 53455 ou 54964 ou équivalent.
Certains milieux d’hémoculture peuvent entraîner de légères réactions non
spécifiques ; en cas de doute, utiliser comme témoin une hémoculture
inoculée avec du sang stérile ou avec un prélèvement contenant un germe
différent de S. pneumoniae.
8- MODE OPERATOIRE
Matériel fourni : Voir le chapitre Composition des coffrets.
14
Matériel nécessaire mais non fourni :
- Pipettes permettant de délivrer 40 µl.
- Öses pour le prélèvement des colonies bactériennes.
- Centrifugeuse pour tubes à hémolyse ou Eppendorf.
- Bac désinfectant ou sac autoclavable pour élimination des cartes
d’agglutination usagées.
- Pastorex ® Meningitis : Kit témoin Réactifs de contrôle, code 61624
contenant : - 2 x 0,40ml de latex témoin négatif
- 1 x q.s. 1ml de témoin positif polyvalent
- 2 x 10 cartes d’agglutination jetables
- 150 bâtonnets jetables
Etapes :
1) Traitement des échantillons :
Analyse à partir de colonies
A partir d’une culture de 18-24h sur gélose au sang, vérifier la
morphologie, le Gram, la catalase et l’hémolyse (ne pas tester les
souches catalase positives). Analyser uniquement les coques Gram
positif. Inoculer un bouillon Todd Hewitt, TCS ou équivalent avec
quelques colonies. Lorsque la culture est suffisamment dense pour que
le trouble soit visible à l’œil nu (3 à 5h d’incubation selon l’inoculum),
analyser le bouillon de culture à l’aide des réactifs au latex. Eviter des
incubations trop longues qui pourraient entraîner de la lyse cellulaire et
être à l’origine de réactions d’agglutination non spécifiques avec le
latex 6, 9, 14, 19, 23.
Hémocultures :
Centrifuger 1 à 2 mL d’hémoculture afin de faire précipiter les globules
rouges ( ex : 5min à 2000g). Pratiquer le test sur le surnageant.
2) Bien homogénéiser les réactifs latex.
3) Pour chaque échantillon à tester, déposer sur la carte 1goutte de latex
témoin négatif disponible dans le kit code 61624 sur 1 cercle à fond
blanc, 1 goutte de latex S. pneumoniae omnivalent (vert) sur 1 cercle à
fond noir et 1 goutte de latex S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.(rouge)
sur 1 cercle à fond blanc.
4) Déposer 40µL d’échantillon à côté de chaque goutte de latex.
5) Mélanger soigneusement le latex à chaque échantillon à l’aide d’un
bâtonnet de façon à obtenir une suspension homogène sur toute la
surface du cercle. Changer de bâtonnet pour chaque échantillon.
6) Donner à la carte un léger mouvement de rotation (un système mécanique
peut être utilisé type agitateur rotatif 110-140 rpm) et lire la réaction
dans le temps imparti suivant le réactif et le type d’échantillon.
7) Lecture des résultats : afin d’assurer une sensibilité et une spécificité
optimale des réactifs, il est recommandé de respecter les temps de
lecture maximum suivants :
• Réactif omnivalent (latex vert) et latex témoin négatif : 5 minutes;
• Réactif pentavalent (latex rouge) : 2 minutes.
9- INTERPRETATION DES RESULTATS
Lecture des réactions :
Il convient de respecter les temps de lecture des réactifs afin d’assurer les
performances du test.
Une réaction positive est caractérisée par une agglutination claire des
particules, visible à l’œil nu.
Une réaction négative se traduit par l’absence d’agglutination du réactif
qui conserve son aspect laiteux.
A noter : L’apparition de traces ou la présence d’une granulation fine
n’évoluant pas dans le temps doivent être considérées comme un résultat
négatif.
15
Interprétation :
LECTURE DE L’AGGLUTINATION
INTERPRETATION
Réactif omnivalent
(latex vert)
Réactif 6,9,14,19,23
(latex rouge)
+
+
S. pneumoniae appartenant à l’un des
sérogroupes 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae appartenant à l’un des
sérogroupes 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae appartenant à un
sérogroupes différent de 6, 9,
14, 19, 23 [b]
-
-
Absence d’une quantité détectable
d’antigènes S. pneumoniae dans
l’échantillon analysé.
• [a] Le réactif S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 étant plus sensible que
le réactif omnivalent, il peut détecter de plus faibles quantités
d’antigènes. Ce type de résultats est peu probable dans le cas de
culture suffisamment dense mais peut se produire en hémoculture. Dans
ce dernier cas, lorsque l’agglutinat obtenu en latex 6, 9, 14, 19, 23
paraît atypique ou douteux, il est conseillé de tester à nouveau le
surnageant d’hémoculture après un traitement de 5 minutes à 100°C
suivi d’une clarification par centrifugation.
• [b] Du fait de la forte sensibilité du réactif S. pneumoniae 6, 9, 14, 19,
23, certaines structures antigéniques communes à tous les pneumocoques
peuvent engendrer de faibles réactions croisées avec les autres
sérotypes. Par conséquent, toute réaction faible du latex pentavalent
alors que le latex omnivalent donne une réaction franche doit être
considérée comme non spécifique et interprétée comme NEGATIVE.
Résultat non interprétable :
En cas d’agglutination du latex témoin négatif et quelle que soit l’intensité
des réactions dans les latex “test”, le résultat n’est pas interprétable.
10- CONTROLE DE QUALITÉ
Il est recommandé de vérifier régulièrement les performances des latex
S. pneumoniae ainsi que celles du latex témoin selon les recommandations
suivantes : la sensibilité peut être validée en testant le mélange antigénique
fourni dans le kit témoin Réactifs de contrôle, code 61624, comme un
16
échantillon prêt à l’emploi. Une réaction d’agglutination doit apparaître
dans les 3 min avec les 2 réactifs S. pneumoniae alors que le latex
témoin doit rester homogène.
L’absence d’auto-agglutination peut également être vérifiée en utilisant de
l’eau physiologique à la place de l’échantillon. S’assurer de l’absence
d’agglutination après 5 mn d’agitation.
11- LIMITES DU TEST
Un résultat négatif n’écarte pas la possibilité d’une infection par
S. pneumoniae. Il peut être lié à une quantité insuffisante d’antigènes
dans l’échantillon analysé. L’objectif du test est un dépistage rapide de
l’infection qui doit être pratiqué en complément et non en remplacement
des procédures de culture.
Des similitudes antigéniques entre les pneumocoques et d’autres germes
ont été décrites dans la littérature et sont susceptibles d’entraîner des
réactions croisées [8-12]. Le diagnostic final ne doit pas être établi
uniquement sur la base d’un test immunologique rapide mais doit prendre
en compte l’ensemble des données cliniques et des analyses microbiologiques
et biochimiques.
12- PERFORMANCES DU TEST
Sensibilité analytique :
Une étude du seuil de sensibilité de chaque réactif sur des antigènes
purifiés, dilués dans de l’eau physiologique a donné les résultats suivants.
Antigène
Antigène
sérogroupe
sérogroupe
6B
9N
14
19
23F
Concentration minimale détectée (µg/mL)*
Réactif omnivalent
Réactif 6, 9, 14, 19, 23
0,15
0,05
0,3
0,02
0,35
0,05
1
0,025
1
0,5
*Néanmoins ce seuil peut subir quelques variations selon le lot testé
Analyse d’hémocultures et de souches isolées :
Dans le cadre d'une évaluation réalisée dans un centre hospitalier, les
analyses suivantes ont été effectuées : 46 hémocultures obtenues lors d'une
étude prospective, 22 hémocultures simulées et 99 isolats cliniques de
S. pneumoniae appartenant à la collection de l'hôpital.
17
La spécificité des réactifs a été évaluée lors d'une étude complémentaire
réalisée à partir d'isolements de 48 germes pathogènes différents de
S. pneumoniae.
Les résultats sont résumés dans le tableau ci-après.
HEMOCULTURE
Nb
total de
souches
S. pneumoniae 15
sérogroupes
6, 9, 14, 19, 23
S. pneumoniae 11
autres sérogroupes
Autres germes
42
CULTURE APRES ISOLEMENT
Nb de positifs en réactif
omnivalent pentavalent
12
15
Nb
total de
souches
48
11
0
0
0
Nb de positifs en réactif
omnivalent pentavalent
48
48
51
51
1
48
0
3
• Sensibilité :
La sensibilité obtenue lors de cette évaluation est de 100% pour le
latex S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (15/15 hémocultures, 48/48
cultures à partir de pneumocoques isolés) et de 97,4% pour le latex
omnivalent (12/15 hémocultures, 99/99 cultures à partir de germes
isolés). Les 3 hémocultures de pneumocoques n’ayant pas réagi avec le
latex S. pneumoniae omnivalent ont donné parallèlement une réaction
positive franche en latex pentavalent confirmant ainsi sa meilleure
sensibilité.
• Spécificité :
Screening des pneumocoques sérogroupes 6, 9, 14, 19, 23.
Parmi les 62 pneumocoques analysés appartenant à des sérogroupes
autres que ceux ciblés par le latex pentavalent, seul 1 pneumocoque
"non typable" a donné une faible réaction croisée avec le réactif
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (spécificité 98,4%). A noter :
l’absence d’agglutination avec une autre souche de pneumocoque non
typable incluse dans l’étude montre que ce type de croisement n’est
pas systématique.
18
Réactions croisées avec des germes différents de S. pneumoniae.
La spécificité a été testée vis à vis de 90 souches (42 hémocultures de
l’étude prospective, 48 cultures à partir de germes isolés) comprenant
les germes suivants : S. aureus, staphylocoques coagulase négative,
S. bovis, S. viridans, S. salivarius S. oralis, S. mitis, Streptococcus
groupe A, B, C, D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa,
C. albicans, Acinetobacter sp., E. coli, H. influenzae, N. meningitidis
A, B, C, Y, W135. Aucune réaction croisée n’a été détectée avec le
latex omnivalent (spécificité 100%). Le latex pentavalent a donné des
agglutinations atypiques avec 2 souches de S. faecalis et un
streptocoque de groupe G. De telles réactions croisées ont été décrites
dans la littérature (cf limites du test).
• Reproductibilité inter-lots et inter-opérateurs :
La reproductibilité des analyses a été testée sur 3 lots différents de
chaque réactif ainsi que pour un lot donné par 3 opérateurs différents.
Les échantillons testés comprenaient des hémocultures (réaction positive
forte, faible, négative), des souches isolées (réaction positive forte,
faible, négative) et un antigène polysaccharidique de pneumocoque en
solution dans de l’eau physiologique. Aucune variation significative n’a
été mise en évidence pour le réactif S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 .
Cependant, des variations inter-lots ont été mises en évidence lors de
l’analyse d’échantillons positifs faibles avec le latex omnivalent.
13- BIBLIOGRAPHIE
1. Henrichsen, J., Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.
J Clin Microbiol, 1995. 33(10): p. 2759-62.
2. Jette, L.P., et al., Surveillance of Invasive Streptococcus pneumoniae
Infection in the Province of Quebec, Canada, from 1996 to 1998:
Serotype Distribution, Antimicrobial Susceptibility, and Clinical
Characteristics. J Clin Microbiol, 2001. 39(2): p. 733-737.
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streptococcus pneumoniae in baltimore, maryland: a population-based,
molecular epidemiologic study, in J Clin Microbiol. 2000. p. 4367-72.
4. Verhaegen, J., Van de Ven J., Verbiest N., Van Eldere J. , Verbist L.,
Evolution of Streptococcus pneumoniae serotypes and antibiotic
resistance in Belgium - update (1994-98). Clin Microbiol Infect, 2000.
6: p. 308-315.
19
5. Geslin, P., Centre National de référence des pneumocoques-Rapport
d'activité année 1997. 1997, Centre national de référence des
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antibiotic resistance in Spain: update (1990 to 1996). J Clin Microbiol,
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units. J Clin Microbiol, 2000. 38(11): p. 4137-44.
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agglutination test for identification of Streptococcus pneumoniae. J Clin
Microbiol, 1984. 20(3): p. 592-3.
9. Holmberg, H., et al., Cross-reactions between alpha-streptococci and
Omniserum, a polyvalent pneumococcal serum, demonstrated by direct
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J Clin Microbiol, 1985. 21(5): p. 745-8.
10.Lee, P.C. and B.L. Wetherall, Cross-reaction between Streptococcus
pneumoniae and group C streptococcal latex reagent. J Clin Microbiol,
1987. 25(1): p. 152-3.
11.Sorensen, U.B. and J. Henrichsen, Cross-reactions between pneumococci
and other streptococci due to C polysaccharide and F antigen. J Clin
Microbiol, 1987. 25(10): p. 1854-9.
12.Heidelberger, M., J.M. Davie, and R.M. Krause, Cross-reactions of the
group-specific polysaccharides of streptococcal groups B and G in antipneumococcal sera with especial reference to type 23 and its
determinants. J Immunol, 1967. 99(4): p. 794-6.
20
PASTOREX® PneumoDUO
25 Tests
61719
TEST DE AGLUTINACIÓN CON LÁTEX PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Y
EL SCREENING DE LOS SEROGRUPOS 6, 9, 14, 19, 23.
1- INTERÉS CLÍNICO
S. pneumoniae es un huésped frecuente de la esfera ORL, así como del
tracto respiratorio. Bajo la influencia de ciertos factores puede provocar
infecciones graves como meningitis, septicemias o neumonías. En este
contexto, la rapidez con la que se trata a los pacientes con frecuencia es
vital y es necesario disponer de tests de diagnóstico rápidos. La creciente
proporción de cepas resistentes a la penicilina supone una dificultad
añadida en la elección terapéutica de primera intención.
2- RESUMEN Y EXPLICACIÓN DEL TEST
El diagnóstico de las infecciones por neumococos puede establecerse con
métodos clásicos de bacteriología: aspecto de la colonia y del Gram
(diplococo Gram+), sensibilidad a la optoquina o test de solubilidad en
la bilis. La presencia de antígenos capsulares en la superficie de la
bacteria también sirven de base para los tests de aglutinación con látex
omnivalentes que permiten la identificación de los neumococos. Hasta
hoy se han descrito 90 serotipos diferentes de S. pneumoniae [1]. Los
antígenos capsulares correspondientes pueden identificarse a partir de
cultivos pero también directamente en los líquidos biológicos (LCR, suero,
orina...), donde son excretados en el transcurso de la infección.
Tras haber identificado el agente etiológico, el médico se enfrenta a
continuación a la elección de la terapia antibiótica, complicada por la
importante proporción de cepas con sensibilidad disminuida a la
penicilina. Estudios epidemiológicos [2], [3], [4], [5], [6], [7] han
demostrado que en la mayor parte de las regiones la resistencia a la
penicilina estaba asociada la mayoría de las veces a los 5 serogrupos
siguientes: 6, 9, 14, 19, 23. De este modo, la utilización de un látex
específico de estos 5 serogrupos presenta una doble ventaja: una mayor
sensibilidad en comparación con el reactivo omnivalente en la detección
de los antígenos correspondientes a estas cepas, y un medio de
evaluación precoz del riesgo de resistencia a la penicilina, lo que
proporciona una ayuda en la orientación de la terapia con antibióticos
de primera intención.
3- PRINCIPIO DEL TEST
Pastorex ® PneumoDUO es un test rápido de aglutinación con látex
compuesto por 2 reactivos:
22
• un látex omnivalente sensibilizado con anticuerpos purificados a partir
de un suero de conejo que reacciona con todos los serotipos
conocidos de neumococos.
• un reactivo 6, 9, 14, 19, 23 específico de los antígenos capsulares de
S. pneumoniae perteneciente a estos 5 serogrupos. De este modo, el
látex pentavalente permite detectar indirectamente las cepas asociadas
con mayor frecuencia a la resistencia a la penicilina y todo ello con
una sensibilidad mayor en comparación con el reactivo omnivalente
(véanse resultados analíticos).
En cada uno de los reactivos las partículas de látex se aglutinan en
presencia de una cantidad suficiente de antígenos homólogos.
Puesto que ciertos medios de cultivo o ciertos gérmenes pueden provocar
agregaciones no específicas, se recomienda utilizar paralelamente el
látex testigo negativo suministrado en el kit Pastorex ® Meningitis,
reactivos de control, código 61624.
4- COMPOSICIÓN DE LOS ESTUCHES
El estuche de 25 tests, código 61719 contiene:
• 1 frasco cuentagotas de 0,40 ml de látex verde específico de
Streptococcus pneumoniae;
• 1 frasco cuentagotas de 0,40 ml de látex rojo específico de Streptococcus
pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5- ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES DE USO
Para diagnóstico in vitro
1. No utilizar el estuche después de la fecha de caducidad.
2. Tratar todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas y
realizar los cultivos según técnicas de laboratorio asépticas.
3. Antes de tirar las asas de siembra de un solo uso y las placas de
aglutinación, esterilizarlas en un autoclave o una cubeta desinfectante.
No reutilizar las placas.
4. Se aconseja especialmente el uso de guantes de un solo uso.
5. No tocar con los dedos la superficie reactiva de las placas.
6. Poner los reactivos a temperatura ambiente (18-25°C) antes de usar.
7. Agitar los frascos de látex antes de usarlos.
23
6- CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos deben conservarse a una temperatura de 2-8º C. Mantener
los frascos reactivos de látex de pie. NUNCA CONGELAR EL REACTIVO
DE LÁTEX. Si se conservan en las condiciones indicadas y no se
contaminan, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta.
7- RECOLECCIÓN Y CULTIVO DE LAS MUESTRAS
Los aislamientos deben hacerse mediante cultivo de 18-24h sobre agarsangre, como Columbia sangre de carnero código 63784 / TCS sangre
de carnero código 63964 o equivalentes. El subcultivo en medio líquido
previo al análisis debe realizarse a partir de este aislamiento, sembrando
algunas colonias en caldo Todd Hewitt código 55705, TCS códigos
53455 o 54964 o equivalente.
Ciertos medios de hemocultivo pueden provocar ligeras reacciones no
específicas; en caso de duda, utilice como testigo un hemocultivo
inoculado con sangre estéril o con una muestra que contenga un germen
distinto de S. pneumoniae.
8- PROCEDIMIENTO
Material suministrado : Ver el capítulo Composición de los estuches.
Material necesario pero no suministrado :
- Pipetas que permitan medir 40 µl.
- Asas para la extracción de las colonias bacterianas.
- Centrifugadora para tubos de hemólisis o Eppendorf.
- Cubeta desinfectante o bolsa autoclavable para la eliminación de las
placas de aglutinación usadas.
- Pastorex® Meningitis: Kit testigo Reactivos de control, código 61624
que contiene :
• 2 x 0,40 ml de latex de control negativo.
• 2 x q.s de control positivo polivalente.
• 2 x 10 cartulinas desechables.
• 150 bastoncillos.
24
Etapas:
1) Tratamiento de las muestras
Análisis a partir de colonias
A partir de un cultivo de 18-24h sobre gelosa con sangre, verificar la
morfología, el Gram, la catalasa y la hemólisis (no comprobar las cepas
catalasa positivas). Analizar únicamente los cocos Gram positivos.
Inocular un caldo Todd Hewitt, TCS o equivalente con algunas colonias.
Cuando el cultivo es suficientemente denso para que la alteración sea
visible a simple vista (de 3 a 5h de incubación según el inóculo),
analizar el caldo de cultivo con ayuda de los reactivos con látex. Evitar
incubaciones demasiado largas que podrían provocar lísis celular y
originar reacciones de aglutinación no específicas con el látex 6, 9,
14,19, 23.
Hemocultivos:
Centrifugar de 1 a 2 ml de hemocultivos para hacer precipitar los glóbulos
rojos (Ej.: 5 min. a 2000 g). Practicar el test con el sobrenadante.
2)Homogeneizar bien los reactivos látex.
3)Para cada muestra a probar, colocar sobre la placa 1 gota de
látex testigo negativo disponible en el kit código 61624 sobre un círculo
con fondo blanco, 1 gota de látex S. pneumoniae omnivalente (verde)
sobre 1 círculo con fondo negro y 1 gota de S. pneumoniae 6, 9, 14,
19, 23 (rojo) sobre 1 círculo con fondo blanco.
4)Colocar 40 µl de muestra al lado de cada gota de látex.
5)Mezclar cuidadosamente el látex con cada muestra con ayuda de un
bastoncillo de manera que se obtenga una suspensión homogénea en
toda la superficie del círculo. Cambiar de bastoncillo para cada muestra.
6)Aplicar a la placa un ligero movimiento de rotación (puede
utilizarse un sistema mecánico como un agitador rotativo 110-140 rpm)
y leer la reacción en el tiempo asignado según el reactivo y el tipo de
muestra.
7)Lectura de los resultados: para garantizar una sensibilidad y una
especificidad óptimas de los reactivos se recomienda respetar los
siguientes tiempos de lectura máximos:
25
• Reactivo omnivalente (látex verde) y látex testigo negativo: 5 minutos.
• Reactivo pentavalente (látex rojo): 2 minutos.
9- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Lectura de las reacciones:
Conviene respetar los tiempos de lectura de los reactivos para garantizar
los resultados del test.
Una reacción positiva se caracteriza por una aglutinación clara de las
partículas, visible a simple vista.
Una reacción negativa se corresponde con la ausencia de aglutinación
del reactivo, que conserva su aspecto lechoso.
A tener en cuenta: la aparición de trazas o la presencia de una
granulación fina que no evolucionen con el tiempo deben considerarse
como un resultado negativo.
Interpretación :
LECTURA DE LA AGLUTINACIÓN
INTERPRETACIÓN
Reactivo omnivalente
(látex verde)
Reactivo 6, 9, 14, 19, 23
(látex rojo)
+
+
S. pneumoniae perteneciente a uno de los
serogrupos 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae perteneciente a uno de los
serogrupos 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae perteneciente a un
serogrupo distinto de 6, 9, 14, 19,
23 [b]
-
-
Ausencia de una cantidad detectable de
antígenos S. pneumoniae en la muestra
analizada.
• [a] Puesto que el reactivo S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 es más
sensible que el reactivo omnivalente, puede detectar menores cantidades
de antígenos. Este tipo de resultados es poco probable en el caso de
cultivo suficientemente denso, pero puede producirse en hemocultivo.
En este último caso, cuando la aglutinación obtenida en látex 6, 9,
14, 19, 23 parezca atípica o dudosa, se aconseja repetir la prueba
con el sobrenadante del hemocultivo, después de un tratamiento de 5
minutos a 100º C seguido de una clarificación por centrifugación.
26
• [b] Debido a la fuerte sensibilidad del reactivo S. pneumoniae 6, 9,
14, 19, 23, ciertas estructuras antigénicas comunes a todos los
neumococos pueden generar débiles reacciones cruzadas con los otros
serotipos. Por lo tanto, toda reacción débil del látex pentavalente,
cuando el látex omnivalente dé una reacción clara, debe considerarse
no específica e interpretarse como NEGATIVA.
Resultado no interpretable:
En caso de aglutinación del látex testigo negativo y sea cual sea la
intensidad de las reacciones en los látex “test”, el resultado no es
interpretable.
10- CONTROL DE CALIDAD
Se recomienda verificar regularmente las propiedades del los látex
S. pneumoniae así como las del látex testigo, según las siguientes
recomendaciones: la sensibilidad puede validarse probando la mezcla
antigénica proporcionada con el kit testigo Reactivos de control, código
61624, como si fuera una muestra lista para su uso. En 3 min. debe
aparecer una reacción de aglutinación con los 2 reactivos S. pneumoniae,
mientras que el látex testigo debe permanecer homogéneo.
La ausencia de auto-aglutinación también puede verificarse utilizando
suero fisiológico en lugar de la muestra. Agítelo durante 5 min. y
compruebe la ausencia de aglutinación.
11- LIMITACIONES DEL TEST
Un resultado negativo no permite descartar la posibilidad de una
infección por S. pneumoniae. Puede deberse a una cantidad insuficiente
de antígenos en la muestra analizada. El objetivo del test es la rápida
detección de la infección y debe practicarse como complemento y no en
sustitución de los procedimientos de cultivo.
En la literatura médica se han descrito similitudes antigénicas entre los
neumococos y otros gérmenes que son susceptibles de provocar
reacciones cruzadas [8, 12]. El diagnóstico final no debe basarse
únicamente en un test inmunológico rápido, sino que debe tener en
cuenta el conjunto de los datos clínicos y los análisis microbiológicos y
bioquímicos.
27
12- CARACTERÍSTICAS DEL TEST
Sensibilidad analítica :
Un estudio del umbral de sensibilidad de cada reactivo sobre los
antígenos purificados diluidos en suero fisiológico dio los siguientes
resultados:
Antígeno
Antígeno
serogrupo
serogrupo
6B
9N
14
19
23F
Concentración mínima detectada (µg/mL)*
Reactivo omnivalente Reactivo 6, 9, 14, 19, 23
0,15
0,05
0,3
0,02
0,35
0,05
1
0,025
1
0,5
* Este umbral puede sufrir algunas variaciones según el lote.
Análisis de hemocultivos y de cepas aisladas :
En el marco de una evaluación realizada en un centro hospitalario, se
efectuaron los siguientes análisis: 46 hemocultivos obtenidos en un
estudio prospectivo, 22 hemocultivos simulados y 99 aislados clínicos de
S. pneumoniae pertenecientes a la colección del hospital.
La especificidad de los reactivos se evaluó en un estudio complementario
realizado a partir de aislamientos de 48 gérmenes patógenos diferentes
de S. pneumoniae.
Los resultados se resumen en la tabla a continuación.
HEMOCULTIVO
CULTIVO TRAS AISLAMIENTO
Núm. de positivos
en reactivo
Núm. omnivalente pentavalente Núm.
total de
total de
cepas
cepas
S. pneumoniae 15
12
15
48
serogrupos
6, 9, 14, 19, 23
S. pneumoniae 11
11
0
51
otros serogrupos
Otros gérmenes 42
0
0
48
28
Núm. de positivos
en reactivo
omnivalente pentavalente
48
48
51
1
0
3
• Sensibilidad:
La sensibilidad obtenida en esta evaluación es del 100% en el caso del
látex S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (15/15 hemocultivos, 48/48
cultivos a partir de neumococos aislados) y del 97,4% en el caso del
látex omnivalente (12/15 hemocultivos, 99/99 cultivos a partir de
gérmenes aislados). Los 3 hemocultivos de neumococos que no
reaccionaron con el látex S. pneumoniae omnivalente dieron paralelamente
una reacción positiva clara en látex pentavalente, confirmando así su
mayor sensibilidad.
• Especificidad:
Screening de los neumococos serogrupo 6, 9, 14, 19, 23
Entre los 62 neumococos analizados pertenecientes a otros serogrupos
distintos de los del látex pentavalente, sólo 1 neumococo “no tipable” dio
una débil reacción cruzada con el reactivo S. pneumoniae 6, 9, 14, 19,
23 (especificidad 98,4%). A tener en cuenta: la ausencia de aglutinación
con otra cepa de neumococo no tipable incluida en el estudio muestra
que este tipo de cruce no es sistemático.
Reacciones cruzadas con gérmenes distintos a S. pneumoniae
Se probó la especificidad respecto a 90 cepas (42 hemocultivos del
estudio prospectivo, 48 cultivos a partir de gérmenes aislados) que
incluían los siguientes gérmenes : S. aureus, estafilococos coagulasa
negativa, S. bovis, S. viridans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis,
Estreptococos grupos A, B, C, D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae,
P. aeruginosa, C. albicans, Acinetobacter sp., E. coli, H. influenzae,
N. meningitidis A, B, C, Y, W135. No se detectó ninguna reacción
cruzada con el látex omnivalente (especificidad 100%). El látex
pentavalente dio aglutinaciones atípicas con 2 cepas de S. faecalis y un
estreptococo de grupo G. Estas reacciones cruzadas se describen en la
literatura (véanse limitaciones del test).
• Reproducibilidad entre lotes y entre operadores :
La reproducibilidad de los análisis se probó en 3 lotes diferentes de cada
reactivo, así como en un lote dado por 3 operadores distintos. Las muestras
incluían hemocultivos (reacción positiva fuerte, débil, negativa), cepas
aisladas (reacción positiva fuerte, débil, negativa) y un antígeno polisacarídico de neumococo en suero fisiológico. No se observó ninguna
variación significativa en el reactivo S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
29
Por otra parte, se observaron variaciones entre lotes en el análisis de
muestras positivas débiles con el látex omnivalente.
13- BIBLIOGRAFÍA
Ver la versión Francese.
30
PASTOREX® PneumoDUO
25 Tests
61719
LATEXAGGLUTINATIONSTEST ZUR IDENTIFIZIERUNG
VON STREPTOCCUS PNEUMONIAE UND ZUM
SCREENING DER SEROLOGISCHEN GRUPPEN
6, 9, 14, 19, 23.
1- KLINISCHE BEDEUTUNG
S. pneumoniae ist ein im HNO-Bereich und in den Atemwegen häufig
vorkommender Keim. Unter Einwirkung bestimmter Faktoren kann er
schwere Infektionen auslösen, wie z.b. Meningitiden, Septikämien und
Pneumonien. In diesem Zusammenhang kommt es oft auf die Zügigkeit
an, mit der die Patienten behandelt werden; dafür sind schnelle
diagnostische Tests erforderlich. Bei der Auswahl der Therapie 1. Wahl
stellt außerdem der wachsende Anteil an Penicillin-resistenten Stämmen
ein zusätzliches Problem dar.
2- ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Die Diagnose von Pneumokokkeninfektionen basiert auf klassischen
bakteriologischen Verfahren: dem äußeren Aspekt der Kolonien, der
Gram-Färbung (gram positive Diplokokken), der Sensibilität im
Optochintest sowie dem Gallelöslichkeitstest. Das Vorliegen von
Kapselantigenen an der Oberfläche der Bakterie bildet auch die
Grundlage der polyvalenten Latexagglutinationstests, mittels derer es
möglich ist, die Pneumokokken zu identifizieren. Bis heute wurden 90
unterschiedliche Serotypen von S. pneumoniae beschrieben [1]. Die
entsprechenden Kapselantigene lassen sich nach Kultur oder direkt in
Körperflüssigkeiten (Liquor cerebrospinalis, Serum, Urin, ...) nachweisen.
Nach der Identifizierung des Krankheitserregers, sieht sich der Kliniker
mit der Wahl der Antibiotikatherapie konfrontiert, die durch den hohen
Anteil an Stämmen mit einer verminderten Penicillin-Sensibilität erschwert
wird. Im Rahmen von epidemiologischen Studien [2], [3], [4], [5], [6], [7]
zeigte sich, daß die Penicillin-Resistenz in den meisten Regionen im
Zusammenhang mit den folgenden 5 Serogruppen auftrat: 6, 9, 14, 19,
23. Daher stellt die Ver wendung eines für diese 5 Serogruppen
spezifischen Latexreagenz im Vergleich zum polyvalenten Reagenz einen
doppelten Vorteil dar: eine erhöhte Sensitivität beim Nachweis der
entsprechenden Antigene eines Stammes , verbunden mit der Möglichkeit,
frühzeitig das Risikos einer Penicillin-Resistenz zu erkennen und damit
eine Orientierungshilfe bei der Entscheidung für die richtige
Antibiotikatherapie.
3- TESTPRINZIP
Pastorex® PneumoDuo ist ein schneller Latexagglutinationstest, mit zwei
Komponenten:
32
• ein omnivalentes Latexreagenz : mit gereinigten (Kaninchen-)
Antikörpern sensibilisierte Latexpartikel, die spezifisch für alle
bekannten Serotypen von Pneumokokken sind.
• ein pentavalentes Reagenz 6, 9, 14, 19, 23, das für die zu den
5 Serogruppen gehörenden Kapselantigene von S. pneumoniae
spezifisch ist. Dieses “fünf-fache” Latex- reagenz ermöglicht es daher,
die Stämme zu erfassen, die am häufigsten eine Penicillin-Resistenz
zeigen. Dabei ist die Sensitivität höher, als mit dem omnivalenten
Reagenz (s. Analyseleistung).
Bei jedem der beiden Reagenzien agglutinieren die Latexpartikel in
Anwesenheit einer ausreichenden Menge an homologen Antigenen.
Da bestimmte Kulturmedien oder Keime eine unspezifische Agglutination
auslösen können, wird empfohlen, parallel zu diesem Test die negative
Kontrolle aus dem Pastorex® Meningitis Kit (Kontrollreagenzien, Art. Nr.
61624) zu verwenden.
4- ZUSAMMENSETZUNG DER TESTPACKUNG
Das Kit für 25 Tests, Art. Nr. 61719, enthält:
• 1 Fläschchen (0,4 ml) mit Tropfenzähler und einer grünen
Latexsuspension, spezifisch für Streptococcus pneumoniae;
• 1 Fläschchen (0,4 ml) mit Tropfenzähler und einer roten Latexsuspension,
spezifisch für Streptococcus pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5- WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
In vitro-Diagnostikum
1. Das Kit nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden.
2. Sämtliche Proben so behandeln, als ob sie potentiell infektiös wären,
und die Kulturen gemäß den aseptischen Labortechniken durchführen.
3. Die Ösen für die Beimpfung und die Agglutinationskarten nach
Einmalgebrauch in einen Autoklaven oder eine Desinfektionsschale
geben. Die Karten nicht erneut verwenden.
4. Es wird dringend empfohlen, Einmalhandschuhe zu tragen.
5. Die Reaktionsoberfläche der Karten nicht mit den Fingern berühren.
6. Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen (18°-25°C).
7. Die Latex-Fläschchen vor Gebrauch schütteln.
33
6. HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
Die Reagenzien sind bei einer Temperatur von +2°C bis +8°C
aufzubewahren. Die Fläschchen mit dem Latexreagenz aufrecht hinstellen.
DIE LATEXREAGENZIEN AUF KEINEN FALL EINFRIEREN. Bei Aufbewahrung
unter den angegebenen Bedingungen und Vermeidung von Kontaminationen sind die Reagenzien bis zum auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum haltbar.
7- GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG DER PROBEN
Die Isolierung erfolgt mittels Kultur (18-24 Std.) auf Blutagar, wie z. B.
Columbia Schafblutagar, Art. Nr. 63784 / TCS Schafblutagar, Art. Nr.
63964, oder auf vergleichbaren Medien. Hiervon ausgehend wird für
die weitere Untersuchung eine Subkultur in Nährbouillon angelegt. Dazu
werden einige Kolonien z.B. in Todd Hewitt Bouillon, Art. Nr. 55705,
TCS, Art. Nr. 53455 oder 54964, oder einem vergleichbaren Medium
überimpft.
Bei einigen Blutkulturmedien können schwache, unspezifische Reaktionen
auftreten; im Zweifelsfall sollte als Kontrolle ein Blutkulturmedium das mit
sterilem Blut beimpft wurde oder eine Probe, die einen anderen Keim als
S. pneumoniae enthält, verwendet werden.
8- TEST DURCHFÜHRUNG
Geliefertes Material : s. Kapitel Zusammensetzung des Testpackung.
Benötigtes, jedoch nicht geliefertes Material :
- Pipetten für die genaue Abgabe von 40ml.
- Ösen zum Abimpfen der Bakterienkolonien.
- Zentrifuge für Hämolyseröhrchen oder Eppendorf-Gefäße.
- Desinfektionsschale oder autoklavierbarer Beutel zur Entsorgung der
gebrauchten Agglutinationskarten.
- Pastorex® Meningitis: Kontroll-Kit mit Kontrollreagenzien, Art.-Nr.
61624, enthält :
• 2 x 0,40 ml einer negativen Latexkontrolle.
• 2 x 1 ml einer positiven, polyvalenten Kontrolle.
• 2 x 10 (Einweg-)Agglutinationskarten.
• 150 Rührstäbchen.
34
Testablauf :
1. Behandlung der Proben
Untersuchung von Kolonien :
Von Kolonien einer auf Blutagar für 18-24 Std. gewachsenen Kultur
Morphologie, Gram-Färbung, Katalasereaktion sowie Hämolysefähigkeit
überprüfen (keine Katalase-positiven Stämme testen) und nur Gram
positive Kokken weiter untersuchen. Von diesen Kolonien werden einige
in Todd Hewitt-, TCS- oder ein vergleichbares medium überimpft. Wenn
die Kultur dicht genug ist, um die Trübung mit bloßem Auge zu erkennen
(3 - 5 h Inkubation je nach Inokulum), die Nährbouillon für den Latextest
verwenden. Zu lange Inkubationszeiten sind zu vermeiden, da sie zu
einer Lyse der Zellen führen und unspezifische Agglutinationsreaktionen
mit dem Latex 6, 9, 14, 19, 23 verursachen können.
Blutkulturen :
1 - 2 ml der Blutkultur zentrifugieren, um die Erythrozyten zur Präzipitation
zu bringen (z.B.: 5 min. bei 2000 g). Anschliessend den Überstand testen.
2. Die Latexreagenzien gut mischen.
3. Für jede zu untersuchende Probe, 1 Tropfen negatives Kontroll-Latex
aus dem Kit (Art. Nr. 61624) auf den Kreis mit weißem Grund auf der
Agglutinationskarte geben. 1 Tropfen des omnivalenten Latex für
S. pneumoniae (grün) auf einen Kreis mit schwarzem Grund und
1 Tropfen Latex für S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (rot) auf einen Kreis
mit weißem Grund aufbringen.
4. 40 ml der Probe neben jeden Tropfen Latex aufbringen.
5. Die Latexsuspension mit einem Stäbchen sorgfältig mit jeder Probe
vermischen, so daß auf der gesamten Kreisfläche eine homogene
Suspension entsteht. Für jede Probe ein neues Stäbchen verwenden.
6. Die Karte in eine leichte Kreiselbewegung bringen (z.B. mit einem
Rotationsmischer bei 110-140 rpm).Die Reaktion innerhalb des für das
Reagenz und die Art der Probe vorgesehenen Zeitraums ablesen.
7. Ablesen der Ergebnisse: im Hinblick auf eine optimale Sensitivität und
Spezifität der Reagenzien empfiehlt es sich, die folgenden
Auswertungszeiten einzuhalten:
• omnivalentes Reagenz (grünes Latexreagenz) und negatives KontrollLatex: 5 Minuten;
35
• pentavalentes (fünf- faches) Latexreagenz (rot): 2 Minuten.
9- AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Ablesen der Reaktionen:
Die Ablesezeiten für die Reagenzien sollten eingehalten werden, um die
Leistungsfähigkeit des Tests aufrecht zu erhalten.
Eine positive Reaktion zeigt sich durch eine klare Agglutination der
Partikel, die mit bloßem Auge erkennbar ist.
Eine negative Reaktion zeigt sich durch das Fehlen einer Agglutination
des Reagenz, das sein milchiges Aussehen behält.
Anmerkung : Das Auftreten von Spuren bzw. das Vorliegen einer leichten
Agglutination, die sich im Laufe der Zeit nicht weiterentwickelt, ist als
negative Reaktion zu werten.
Auswertung :
ABLESEN DER AGGLUTINATION
AUSWERTUNG
Omnivalentes Reagenz Reagenz 6,9,14,19,23
(grünes Latex)
(rotes Latex)
+
+
S. pneumoniae der Serogruppe
6, 9, 14, 19, 23 oder 23
-
+
S. pneumoniae der Serogruppe
6, 9, 14, 19, 23 oder 23 [a]
+
-
S. pneumoniae einer anderen
Serogruppe als
6, 9, 14, 19, 23 [b]
-
-
Fehlen einer nachweisbaren Menge
an Antigenen von S. pneumoniae
in der untersuchten Probe
• [a] Da das Reagenz S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 eine höhere
Sensibilität besitzt als das omnivalente Reagenz, können damit
geringere Antigenmengen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnismuster
ist bei ausreichend vorhandenem Koloniematerial eher selten zu
erwarten,kann aber bei Blutkulturen durchaus auftreten. In diesem
zuletzt genannten Fall empfiehlt es sich im Zweifelsfall (Agglutinatbildung
mit Latex 6, 9, 14, 19, 23 atypisch oder zweifelhaft), den Überstand
der Blutkultur erneut zu testen. Dazu sollte dieser zuvor 5 min. mit
100°C erwärmt und anschließend durch Zentrifugieren werden.
36
• [b] Auf Grund der hohen Sensibilität des Reagenz S. pneumoniae 6, 9,
14, 19, 23, können bestimmte Antigenstrukturen, die bei allen
Pneumokokken vorkommen, schwache Kreuzreaktionen mit anderen
Serotypen auslösen. Daher ist jede schwache Reaktion im fünffachen
Latexreagenz, bei deutlicher Reaktion im omnivalenten Latexreagenz,
als unspezifisch zu betrachten und als NEGATIV zu bewerten.
Nicht auswertbare Ergebnisse:
Im Fall einer Agglutination des negativen Kontroll-Latex ist das Ergebnis unabhängig von der Intensität der Reaktion im für den Test verwendeten
Latex - nicht auswertbar.
10- QUALITÄTSKONTROLLE
Es empfiehlt sich, die Leistungsfähigkeit der Latexreagenzien für
S. pneumoniae und des Kontroll-Latex entsprechend den folgenden
Empfehlungen regelmäßig zu überprüfen: die Sensitivität kann validiert
werden, indem die Antigenmischung aus dem Kontroll-Kit
Kontrollreagenzien, Artikel-Nr. 61624, wie eine gebrauchsfertige Probe
getestet wird. Innerhalb von 3 min. sollte dabei mit beiden Reagenzien
für S. pneumoniae eine Agglutinationsreaktion auftreten, während der
Kontroll-Latex homogen bleiben muß.
Das Vorliegen einer Autoagglutination kann auch ausgeschlossen werden,
indem an Stelle der Probe physiologische Kochsallösung verwendet wird.
Das Fehlen einer Agglutination ist nach 5 min. Schütteln zu überprüfen.
11- GRENZEN DES VERFAHRENS
Ein negatives Ergebnis bedeutet nicht, daß keine Infektion mit
S. pneumoniae vorliegt. Es kann auf eine nicht ausreichende Menge an
Antigenen in der untersuchten Probe zurückzuführen sein. Ziel des Tests ist
ein schneller Nachweis einer Infektion, der zusätzlich zu Kulturverfahren,
nicht aber als Ersatz dafür durchgeführt werden soll.
In der Fachliteratur wurden Ähnlichkeiten zwischen den Antigenen der
Pneumokokken und denen anderer Bakterien beschrieben, die zu
Kreuzreaktionen führen können [8 - 12]. Eine abschließende Diagnose
darf daher keineswegs nur auf Grund eines immunologischen Schnelltests
erhoben werden, sondern es sind sämtliche klinische Gegebenheiten
sowie die Ergebnisse von mikrobiologischen und biochemischen Analysen
mit in Betracht zu ziehen.
37
12- LEISTUNGSMERKMALE DES TESTS
Sensitivität des Testes :
Eine Studie der Schwellenwerte für die Sensibilität eines jeden Reagenz,
die an gereinigten, in physiologischer NaCl-Lösung verdünnten Antigenen
durchgeführt wurde, führte zu den folgenden Ergebnissen:
Antigen
Antigen
SeroGruppe
SeroGruppe
6B
9N
14
19
23F
Minimale nachgewiesene Konzentration (µg / ml) *
Omnivalentes Reagenz Reagenz 6,9,14,19,23
0,15
0,05
0,3
0,02
0,35
0,05
1
0,025
1
0,5
* Allerdings unterliegt dieser Schwellenwert je nach untersuchter Probe
gewissen Schwankungen.
Analyse von Blutkulturen und isolierter Stämme
Im Rahmen einer in einem Klinikum durchgeführten Evaluierung wurden die
folgenden Analysen vorgenommen: 46 Blutkulturen aus einer prospektiven
Studie, 22 simulierte Blutkulturen und 99 klinische Isolate von S.
pneumoniae aus der Stammsammlung des Krankenhauses.
Die Spezifität der Reagenzien wurde im Rahmen einer komplementären
Studie beurteilt, die an Hand von Isolaten mit 48 verschiedenen Stämmen
von S. pneumoniae durchgeführt wurde.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammen gefaßt:
BLUTKULTUR
KULTUR NACH ISOLIERUNG
Anzahl der positiven
Reaktionen mit
dem Reagenz
Anzahl der positiven
Reaktionen mit
dem Reagenz
Gesamtanzahl omnivalent pentavalent Gesamtanzahl
der Stämme
der Stämme
S. pneumoniae
omnivalent
pentavalent
15
12
15
48
48
48
S. pneumoniae von
anderen SeroGrupen
11
11
0
51
51
1
Andere Keime
42
0
0
48
0
3
SeroGruppen
6,9,14,19,23
38
• Sensitivität :
Die im Rahmen dieser Studie gefundene Sensibilität beträgt 100 % für das
pentavalente S. pneumoniae Latex 6, 9, 14, 19, 23 (15 von 15 Blutkulturen,
48 von 48 Kulturen mit isolierten Pneumokokken) und 97, 4 % für das
omnivalente Latex (12 von 15 Hämokulturen, 99 von 99 Kulturen mit isolierten
Keimen). Die 3 Blutkulturen mit Pneumokokken, die keine Reaktion mit dem
omnivalenten Latex S. pneumoniae zeigten, lösten parallel dazu eine
deutliche Reaktion mit dem pentavalenten Latex aus, womit dessen höhere
Sensibilität bestätigt wurde.
• Spezifität :
Systematische Untersuchung von Pneumokokken der Serogruppe 6, 9, 14,
19, 23
Unter den 62 untersuchten Pneumokokken anderer ,als der mit dem
pentavalenten Latex erfassten Serogruppen, zeigte nur 1 "nicht typisierbarer"
Pneumokokkus eine schwache Reaktion mit dem Reagenz für S. pneumoniae
6, 9, 14, 19, 23 (98,4 % Spezifität). Anmerkung : eine fehlende
Agglutination mit einem anderen,nicht typisierbaren Pneumokokken-Stamm
der in der Studie untersucht wurde, zeigt, daß diese Art von Kreuzreaktion
nicht systematisch auftritt.
Kreuzreaktionen mit unterschiedlichen Stämmen von Art S. pneumoniae
Die Spezifität wurde mit 90 Stämmen folgender Bakterien untersucht (42
Blutkulturen aus der prospektiven Studie, 48 Kulturen mit isolierten
Keimen): S. aureus, Koagulasen-negative Staphylokokken, S. bovis,
S. viridans, S. Salivarius, S. oralis, S. mitis, Streptokokken der Gruppe A,
B, C, D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans,
Acinetobacter sp., E. coli , H. influenzae, N. meningitidis A, B, C, Y,
W135. Mit dem omnivalenten Latex wurde keinerlei Kreuzreaktion
beobachtet (100 % Spezifität). Das pentavalente Latex zeigte bei
2 Stämmen von S. faecalis und einem Streptococcus der Gruppe G eine
atypische Agglutination. Derartige Kreuzreaktionen sind in der
Fachliteratur beschrieben (s. Kapitel 'Grenzen dieses Tests').
• Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Chargen und
verschiedenen Testanwendern :
Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde an 3 verschiedenen
Chargen eines jeden Reagenz sowie an einer von 3 verschiedenen
Testanwendern gestellten Charge getestet. Zu den untersuchten Proben
39
zählten Blutkulturen (stark positive Reaktion, schwache Reaktion, negative
Reaktion), isolierte Stämme (stark positive Reaktion, schwache Reaktion,
negative Reaktion) sowie ein in physiologischer NaCl-Lösung gelöstes
Polysaccharid-Antigen von Pneumokokken.Mit dem Reagenz für
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 wurde keinerlei signifikante
Abweichung nachgewiesen. Dagegen wurden Abweichungen zwischen
verschiedenen Chargen des omnivalenten Latexreagenz mit schwach
positiven Proben beobachtet.
13- LITERATUR
Siehe französische Version.
40
PASTOREX® PneumoDUO
25 Test
61719
TEST DI AGGLUTINAZIONE AL LATTICE PER
L’IDENTIFICAZIONE DI STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE E SCREENING DEI GRUPPI SIERICI
6, 9, 14, 19, 23.
1- INTERESSE CLINICO
Lo S. pneumoniae è un ospite frequente dell’area ORL e del tratto
respiratorio. In presenza di taluni fattori può provocare infezioni gravi,
come meningiti, setticemie o polmoniti. In questo contesto la rapidità con
la quale sono trattati i pazienti riveste spesso un ruolo vitale, che rende
necessario disporre di test diagnostici rapidi. La crescente percentuale di
ceppi resistenti alla penicillina rappresenta un’ulteriore difficoltà nella
scelta terapeutica di prima intenzione.
2- RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Per formulare la diagnosi di infezioni da pneumococco possono essere
utilizzati metodi batteriologici classici: aspetto della colonia e del Gram
(diplococco Gram+), sensibilità nei confronti dell’optochina o test di
solubilità nella bile. La presenza di antigeni capsulari sulla superficie del
batterio costituisce anche la base dei test universali di agglutinazione al
lattice, che consentono di identificare lo pneumococco. Attualmente nello
S. pneumoniae [1] sono stati descritti 90 sierotipi diversi. Gli antigeni
capsulari corrispondenti possono essere ricercati partendo dalle colture,
ma anche direttamente nei fluidi biologici (LCR, siero, urine, etc.), dove
sono escreti durante l’episodio infettivo.
Una volta identificato l’agente eziologico, il clinico deve affrontare la
scelta dell’antibioticoterapia. Tale scelta è resa più complicata dal
numero crescente di ceppi con ridotta sensibilità alla penicillina. Alcuni
studi epidemiologici [2], [3], [4], [5], [6], [7] hanno dimostrato che nella
maggior parte delle regioni la resistenza alla penicillina si associava con
maggior frequenza ai cinque sierogruppi seguenti: 6, 9, 14, 19, 23. Per
questa ragione l’impiego di un lattice specifico per questi cinque
sierogruppi presenta un duplice vantaggio: offre una maggiore sensibilità
rispetto al reagente universale per individuare gli antigeni corrispondenti
a questi ceppi ed è uno strumento di valutazione precoce del rischio di
resistenza alla penicillina, che rappresenta un ausilio per orientarsi verso
un’antibioticoterapia di prima intenzione.
3- PRINCIPIO DEL TEST
Pastorex® PneumoDUO è un test rapido di agglutinazione al lattice,
composto da 2 reagenti:
• un lattice universale sensibilizzato con anticorpi purificati con siero di
coniglio reagente a tutti i sierotipi di pneumococchi noti.
42
• un reagente 6, 9, 14, 19, 23 specifico degli antigeni capsulari dello
S. pneumoniae appartenente a questi 5 sierogruppi. Questo lattice
pentavalente consente quindi di sottoporre a screening indiretto i ceppi
che con maggiore frequenza sono associati alla resistenza alla
penicillina, ottenendo di conseguenza una maggiore sensibilità rispetto
ai reagenti universali (si vedano le performance analitiche).
Per ciascun reagente, le particelle di lattice si agglutinano in presenza di
una quantità sufficiente di antigeni omologhi.
Taluni ambienti di coltura e alcuni germi possono indurre aggregazioni
aspecifiche; si raccomanda quindi di utilizzare contemporaneamente il
lattice di riferimento negativo fornito nel kit Pastorex® Meningitis, reagenti
di controllo, codice 61624.
4- COMPOSIZIONE DEL KIT
Kit contenente 25 test, codice 61719, composto da
• 1 flacone con contagocce da 0,40 ml di lattice verde specifico per lo
Streptococcus pneumoniae;
• 1 flacone con contagocce da 0,40 ml di lattice rosso specifico per lo
Streptococcus pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5 - AVVERTENZE E PRECAUZIONI PER L’USO
Per uso diagnostico in vitro
1) Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
2) Maneggiare i campioni come se fossero potenzialmente infettivi e
realizzare le colture secondo le tecniche asettiche di laboratorio.
3) Gettare le pipette di inseminazione monouso e le cartine di agglutinazione
in autoclave o in un bagno disinfettante. Non riutilizzare le cartine.
4) Si consiglia vivamente di indossare guanti monouso.
5) Non toccare con le dita la superficie reattiva delle cartine.
6) Lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (1825°C) prima dell’utilizzo.
7) Agitare i flaconi di lattice prima del loro utilizzo.
6- CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
I reagenti devono essere conservati ad una temperatura compresa tra
2° e 8°C. I flaconi reagenti di latex devono essere conservati in posizione
verticale. NON CONGELARE MAI IL REAGENTE AL LATTICE.
43
Se conservati nelle condizioni indicate e non contaminati, i reagenti si
mantengono stabili sino alla data di scadenza riportata sull'etichetta.
7- RACCOLTA E COLTURA DEI CAMPIONI
Gli isolamenti devono avvenire tramite coltura di 18-24 ore su agar
sangue, del tipo Columbia sangue di pecora codice 63748/TCS, sangue
di pecora codice 63964 o equivalenti. La subcoltura in ambiente liquido
che precede l’analisi deve essere effettuata sulla base di questo
isolamento, trasferendo alcune colonie in brodo Todd Hewitt codice
55705, TCS codici 53455 o 54964 o equivalente.
Taluni ambienti di emocoltura possono comportare leggere reazioni non
specifiche, in caso di dubbio, utilizzare come riferimento un'emocoltura
inoculata con sangue sterile o con prelievo contenente un germe diverso
dallo S. pneumoniae.
8- PROCEDURA
Materiale fornito : Si veda il capitolo “Composizione dei kit”.
Materiale necessario ma non fornito :
- Pipette da 40 µl;
- Cannule per il prelievo delle colonie batteriche;
- Centrifuga per provette da emolisi o Eppendorf;
- Bagno disinfettante o busta autoclavabile per l’eliminazione delle
cartine di agglutinazione usate;
- Pastorex® Meningitis: kit di riferimento reagenti di controllo, codice
61624, composto da :
• 2x0,40 ml di lattice controllo negativo;
• 2x q.s.1 ml di controllo positivo polivalente;
• 2x10 cartine monouso;
• 150 bastoncini.
Procedimento:
1) Trattamento dei campioni
Analisi delle colonie
Partendo da una coltura di 18-24 ore su agar sangue, verificare la
morfologia, il Gram, la catalasi e l’emolisi (non testare i ceppi catalasi
positivi). Analizzare esclusivamente gli involucri Gram positivo. Inoculare
un brodo Todd Hewitt, TCS o equivalente su alcune colonie.
44
Quando la coltura è sufficientemente densa perché il torbido sia visibile
ad occhio nudo (da 3 a 5 ore di incubazione, a seconda dell’inoculo),
analizzare il brodo di coltura impiegando dei reagenti al lattice. Evitare
incubazioni troppo prolungate, che potrebbero provocare la lisi cellulare,
causando reazioni di agglutinazione non specifiche al lattice 6, 9, 14,
19, 23.
Emocolture
Centrifugare 1-2 ml di emocoltura sino a far precipitare i globuli rossi (ad
esempio 5 minuti per 2000 g). Effettuare quindi il test sul surnatante.
2) Omogeneizzare adeguatamente i reagenti al lattice.
3) Per ciascun campione da testare, disporre sulla cartina una goccia di
lattice di riferimento negativo, disponibile nel kit con il codice 61624 su
1 cerchio a fondo bianco, 1 goccia di lattice S. pneumoniae universale
(verde) su un cerchio a fondo nero ed 1 goccia di lattice S. pneumoniae
6, 9, 14, 19, 23 (rosso) su un cerchio a fondo bianco.
4) Disporre 40 µL di campione accanto a ciascuna goccia di lattice
5) Mescolare accuratamente il lattice nei singoli campioni, servendosi di
un bastoncino, in maniera tale da ottenere una sospensione omogenea su
tutta la superficie del cerchio. Utilizzare un bastoncino per ogni campione.
6) Impartire alla cartina un leggero movimento rotatorio (o in alternativa
utilizzare un sistema meccanico come un agitatore rotante 110-140 rpm) e
leggere la reazione nel tempo previsto per il reagente e il tipo di campione.
7) Lettura dei risultati: per garantire la sensibilità e specificità ottimali dei
reagenti, si raccomanda il rispetto dei seguenti tempi massimi di lettura:
• reagente universale (lattice verde) e lattice di riferimento negativo: 5 minuti,
• reagente pentavalente (lattice rosso): 2 minuti.
9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Lettura delle reazioni :
Per garantire l’affidabilità del test, è consigliabile rispettare i tempi di
lettura dei reagenti.
La reazione positiva è caratterizzata da un’agglutinazione chiara delle
particelle, visibile a occhio nudo.
La reazione negativa si traduce con l’assenza di agglutinazione del
reagente, che conserva il suo aspetto lattiginoso.
45
Avvertenza: la comparsa di tracce o la presenza di una granulazione fine
che non manifesta alcuna evoluzione nel tempo devono essere
considerate come un risultato negativo.
Interpretazione
LETTURA DELL’AGGLUTINAZIONE
INTERPRETAZIONE
Reagente universale
(lattice verde)
Reagente 6,9,14,19,23
(lattice rosso)
+
+
S. pneumoniae appartenente ad uno dei
sierogruppi 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae appartenente ad uno dei
sierogruppi 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae appartenente ad uno dei
sierogruppi diversi da 6, 9,
14, 19, 23 [b]
-
-
Assenza di quantità individuabile di
antigeni dello S. pneumoniae
nel campione esaminato
• [a] Poiché presenta una maggiore sensibilità rispetto ad un reagente
universale, il reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 consente di
individuare anche quantità esigue di antigeni. Questo tipo di risultato è
poco probabile nel caso in cui la coltura sia sufficientemente densa,
ma può verificarsi in caso di emocoltura. In quest’ultimo caso, quando
l’agglutinato risultato dal lattice 6, 9, 14, 19, 23 appare atipico o
controverso, si consiglia di effettuare un nuovo test sul surnatante
dell’emocoltura, successivamente ad un trattamento di 5 minuti a
100°C, seguito da chiarificazione tramite centrifuga.
• [b] A motivo della spiccata sensibilità del reagente S. pneumoniae 6,
9, 14, 19, 23 talune strutture antigeniche comuni a tutti i pneumococchi
possono dare luogo a deboli reazioni crociate con gli altri sierotipi.
Pertanto ogni reazione debole al lattice pentavalente deve essere
considerata aspecifica ed interpretata come NEGATIVA, nei casi in cui
il lattice universale presenti invece una reazione marcata.
Risultato non interpretabile :
In caso di agglutinazione del lattice di riferimento negativo, il risultato è
da considerarsi non interpretabile indipendentemente dall’intensità delle
reazioni al lattice “test”.
46
10- CONTROLLO DI QUALITA’
Si raccomanda di verificare con regolarità i risultati ottenuti con il lattice
S. pneumoniae e quelli forniti dal lattice di riferimento, basandosi sulle
raccomandazioni di seguito riportate: la sensibilità del test può essere
validata testando il mix di antigeni fornito nel kit di riferimento dei reagenti
di controllo, codice 61624, come campione pronto all’uso. Entro 3 minuti
deve verificarsi una reazione di agglutinazione con i due reagenti
S. pneumoniae, mentre il lattice di riferimento deve rimanere omogeneo.
La mancata autoagglutinazione può essere verificata anche utilizzando
soluzione fisiologica al posto del campione. Assicurarsi dell’assenza di
agglutinazione dopo aver agitato per 5 minuti.
11- LIMITI DEL TEST
Un risultato negativo non esclude la possibilità che vi sia in corso
un’infezione da S. pneumoniae. Il risultato negativo, infatti, può essere
dovuto ad una quantità insufficiente di antigeni nel campione analizzato.
L’obiettivo del test è il depistaggio rapido dell’infezione: deve pertanto
essere utilizzato come strumento complementare e non in sostituzione dei
procedimenti di coltura.
In letteratura sono state descritte similitudini antigeniche tra i pneumococchi
ed altri germi, che possono dare luogo a reazioni incrociate [8-12]. La
diagnosi finale non può essere formulata esclusivamente sulla base di un
test immunologico rapido, ma deve prendere in considerazione i dati clinici,
le analisi microbiologiche e biochimiche.
12- RISULTATI DEL TEST
Sensibilità analitica :
Uno studio sulla soglia di sensibilità di ciascun reagente agli antigeni purificati,
diluiti in soluzione fisiologica, ha fornito i risultati riportati di seguito:
Antigene
Antigene
Sierogruppo
Sierogruppo
6B
9N
14
19
23F
Concentrazione minima individuata (µg/mL)*
Reagente universale Reagente 6, 9, 14, 19, 23
0,15
0,05
0,3
0,02
0,35
0,05
1
0,025
1
0,5
* Questa soglia può subire variazioni che dipendono dal lotto testato
47
Analisi delle emocolture e dei ceppi isolati :
Nell’ambito di una valutazione condotta all’interno di un centro
ospedaliero, sono stati effettuati i seguenti esami: 46 emocolture ottenute
da uno studio prospettico, 22 emocolture simulate e 99 isolati clinici dello
S. pneumoniae derivanti da materiale raccolto dall’istituto ospedaliero.
La specificità dei reagenti è stata valutata in occasione di uno studio
complementare, realizzato sulla base di isolamenti di 48 germi patogeni
diversi dallo S. pneumoniae.
Nella tabella di seguito riportata sono riepilogati i risultati dello studio:
Emocoltura
Coltura in seguito a isolamento
Numero di positivi
al reagente
Numero di positivi
al reagente
Numero totale Universale Pentavalente Numero totale
di ceppi
di ceppi
S. pneumoniae
Universale Pentavalente
15
12
15
48
48
48
S. pneumoniae
altri sierogruppi
11
11
0
51
51
1
Altri germi
42
0
0
48
0
3
sierogruppi
6, 9, 14, 19, 23
• Sensibilità:
La sensibilità ottenuta con questa valutazione è del 100% per il lattice
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (15/15 per le emocolture, 48/48 per
le colture su pneumococchi isolati) e del 97,4% per il lattice universale
(12/15 per le emocolture, 99/99 per le colture su germi isolati). Le 3
emocolture di pneumococco che non hanno reagito con il lattice allo
S. pneumoniae universale hanno invece dato una reazione positiva
evidente al lattice pentavalente, confermandone la migliore sensibilità.
• Specificità:
Screening dei pneumococchi sierogruppi 6, 9, 14, 19, 23
Tra i 62 pneumococchi analizzati ed appartenenti a sierogruppi diversi
da quelli considerati dal lattice pentavalente, solo un pneumococco“non
tipizzabile” ha dato una debole reazione incrociata con il reagente
S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (specificità al 98,4%). Da osservare: la
mancata agglutinazione con un altro ceppo di pneumococco non tipizzabile
compreso nello studio dimostra che questo tipo di incrocio non è sistematico.
48
Reazioni incrociate con germi diversi dello S. pneumoniae
La specificità è stata testata nei confronti di 90 ceppi (42 emocolture di
studio prospettico, 48 colture da germi isolati), ivi compresi i germi di
seguito elencati: S. aureus, stafilococchi coagulasi negativi, S. bovis,
S. viridans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, Streptococcus dei gruppi A,
B, C, D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans,
Acinetobacter sp., E. coli, H. influenzae, N. meningitidis A, B, C, Y,
W135. Non è stata individuata alcuna reazione incrociata con il lattice
universale (specificità 100%). Il lattice pentavalente ha presentato
agglutinazioni atipiche con 2 ceppi di S. faecalis e con uno streptococco
del gruppo G. Reazioni incrociate analoghe sono state descritte in
letteratura (si veda il capitolo "Limiti del test").
• Riproducibilità interlotti e interoperatori :
La riproducibilità delle analisi è stata testata su 3 differenti lotti di ciascun
reagente e su un lotto proveniente da 3 diversi operatori. I campioni
testati comprendevano emocolture (reazione positiva forte, debole,
negativa), ceppi isolati (reazione positiva forte, debole, negativa) ed un
antigene polisaccaridico di pneumococco in soluzione con fisiologica. Il
reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 non ha evidenziato alcuna
variazione significativa. Variazioni interlotto sono state evidenziate in
occasione dell’analisi dei campioni positivi deboli con il lattice
universale.
13- BIBLIOGRAFIA
Vedere la verzione Franchese.
49
PASTOREX® PNEUMODUO
25 Testes
61719
TESTE DE AGLUTINAÇÃO AO LÁTEX PARA IDENTIFICAÇÃO DO STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE E DESPISTAGEM DOS SEROGRUPOS 6, 9, 14, 19, 23.
IVD
1– INTERESSE CLÍNICO
S. pneumoniae é um hospedeiro frequente na esfera da ORL, bem como do tracto respiratório. Sob a influência de determinados
factores, pode provocar infecções graves, tais como meningite, septicemia ou pneumonia.
Neste contexto, a rapidez de intervenção no tratamento dos doentes constitui, muitas vezes, um factor vital, pelo que se revela
necessário dispor de testes de diagnóstico rápidos. A proporção crescente de estirpes resistentes à penicilina representa uma
dificuldade suplementar na escolha terapêutica de primeira intenção.
2- RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE
O diagnóstico das infecções a pneumococos pode ser estabelecido por meio de métodos de bacteriologia clássicos: aspecto da
colónia e coloração de Gram (diplococcus Gram+), sensibilidade à optoquina ou teste de solubilidade na bílis. A presença de
antigénios capsulares à superfície da bactéria constitui igualmente a base dos testes de aglutinação com látex omnivalente que
permitem a identificação dos pneumococos. Até ao momento foram descritos 90 serotipos diferentes na S. pneumoniae (1). Os
antigénios capsulares correspondentes podem ser pesquisados a partir de culturas, mas também directamente nos líquidos
biológicos (LCR, soro, urinas, etc.) onde são encontrados durante a infecção.
Depois de identificar o agente etiológico, o médico debate-se então com a escolha da antibioterapia, agravada pela grande
proporção de estirpes de sensibilidade diminuída à penicilina. Os estudos epidemiológicos (2, 3, 4, 5, 6, 7) vieram demonstrar
que, na maior parte das regiões, a resistência à penicilina estava mais frequentemente associada aos seguintes serogrupos: 6, 9,
14, 19, 23. A utilização de um látex específico nestes 5 serogrupos apresenta assim uma dupla vantagem: a maior sensibilidade
em relação ao reagente omnivalente na detecção dos antigénios correspondentes a estas estirpes e um meio de avaliação precoce
do risco de resistência à penicilina constituem uma ajuda na orientação da antibioterapia de primeira intenção.
3- PRINCÍPIO DO TESTE
Pastorex® PneumoDUO é um teste rápido de aglutinação ao látex, composto por 2 reagentes:
• um látex omnivalente, sensibilizado com anticorpos purificados a partir de um soro de coelho, que reage com todos os serotipos
conhecidos de pneumococos.
• um reagente 6, 9, 14, 19, 23, específico dos antigénios capsulares de S. pneumoniae pertencente a estes 5 serogrupos. Este
látex pentavalente permite assim despistar indirectamente as estirpes mais frequentemente associadas à resistência à penicilina,
e isto com uma maior sensibilidade em relação ao reagente omnivalente (ver Propriedades Analíticas).
Para cada um dos reagentes, as partículas de látex aglutinam-se em presença de uma quantidade suficiente de antigénios homólogos.
Como existem determinados meios de cultura ou certos germes que podem provocar agregações não específicas, recomenda-se
utilizar paralelamente o látex de controlo negativo, fornecido no kit Pastorex® Meningitis, reagentes de controlo, ref. 61624.
4– COMPOSIÇÃO DO ESTOJO
Estojo de 25 testes, ref. 61719, contendo:
• 1 frasco conta-gotas de 0,40 ml de látex verde, específico de Streptococcus pneumoniae.
• 1 frasco conta-gotas de 0,40 ml de látex vermelho, específico do Streptococcus pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5- ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Para utilização como diagnóstico in vitro
1.Não utilizar o estojo depois de expirado o prazo de validade.
2.Tratar todas as amostras como sendo potencialmente infecciosas e efectuar as culturas segundo técnicas laboratoriais de assepsia.
3.Colocar os tubos de inoculação de utilização única e as placas de aglutinação num autoclave ou num recipiente desinfectante.
Não utilizar de novo as placas.
4.Recomenda-se vivamente o uso de luvas de aplicação clínica.
5.Não tocar com os dedos na superfície reactiva das placas.
6.Levar os reagentes à temperatura ambiente (18-25ºC) antes de utilizar.
7.Agitar os frascos de látex antes de utilizar.
1
6- CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES
Os reagentes devem ser conservados a uma temperatura de 2 - 8ºC. Conservar em pé os frascos de reagente de látex. NUNCA
CONGELAR O REAGENTE DE LÁTEX. Desde que conservados nas condições indicadas e isentos de contaminação, os reagentes
mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado no respectivo rótulo.
7- RECOLHA E CULTURA DAS AMOSTRAS
Os isolamentos devem ser realizados por cultura de 18-24h em geloses de sangue, tais como Columbia sangue de carneiro, ref.
63784 / TCS sangue de carneiro, ref. 63964 ou equivalentes. A subcultura prévia em meio líquido deve ser realizada a partir
deste isolamento, repetindo algumas colónias em mistura Todd Hewitt, ref. 55705, TCS ref. 53455 ou 54964 ou equivalente.
Certos meios de hemocultura podem provocar ligeiras reacções não específicas; em caso de dúvida, utilizar como controlo uma
hemocultura inoculada com sangue estéril ou com uma colheita contendo um germe diferente de S. pneumoniae.
8- MODO DE FUNCIONAMENTO
Material fornecido :
- Ver a secção Composição do Estojo.
Material necessário mas não fornecido :
- Pipetas de 40 ml de capacidade.
- Tubos para recolha de colónias bacterianas.
- Centrifuga para tubos de hemólise ou Eppendorf.
- Recipiente desinfectante ou bolsa esterilizável para eliminação das placas de aglutinação usadas.
- Pastorex® Meningitis: Kit testemunho de Reagentes de controlo, ref. 61624 composto por :
. 2 x 0,40 ml de controlo negativo.
. 1 x q.s.1 ml de controlo positivo polivalente.
. 2 x 10 placas descartaveis.
. 150 varetas descartaveis.
Etapas:
1) Tratamento das amostras
Análise a partir de colónias
A partir de uma cultura de 18-24h em gelose ou sangue, verificar a morfologia, a coloração de Gram, a catalase e a hemólise
(não testar as estirpes catalase positivas). Analisar unicamente os cocos Gram positivo. Inocular uma mistura Todd Hewitt, TCS
ou equivalente com algumas colónias. Quando a cultura ficar suficientemente densa para que a turvação seja visível a olho nu
(3 a 5 h de incubação, conforme o agente de inoculação), analisar a mistura de cultura por meio de reagentes ou látex. Evitar
incubações demasiado prolongadas que possam provocar lise celular e originar reacções de aglutinação não específicas com o
látex 6, 9, 14, 19, 23.
Hemoculturas:
Centrifugar 1 a 2 ml de hemocultura para precipitação de glóbulos vermelhos (ex: 5 minutos a 2000 g). Realizar o teste no
sobrenadante.
2) Homogeneizar bem os reagentes látex.
3) Para cada amostra a testar, depositar na placa 1 gota de látex testemunho negativo, disponível no kit ref. 61624 sobre um
círculo de fundo branco, 1 gota de látex S. pneumoniae (verde) sobre um círculo de fundo preto e 1 gota de látex S.
pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (vermelho) sobre um círculo de fundo branco.
4) Depositar 40 ml de amostra ao lado de cada gota de látex.
5) Misturar cuidadosamente o látex com cada amostra, por meio de uma vareta, de forma a obter uma suspensão homogénea
cobrindo toda a superfície do círculo. Utilizar uma vareta diferente para cada amostra.
6) Aplicar à placa um ligeiro movimento de rotação (pode utilizar-se um sistema mecânico de tipo misturador rotativo de 110140 rpm) e ler a reacção no tempo indicado, consoante o reagente e o tipo de amostra.
7) Leitura dos resultados: para garantir uma sensibilidade e uma especificidade ideais dos reagentes, recomenda-se respeitar os
tempos máximos de leitura seguintes:
• Reagente omnivalente (látex verde) e látex testemunho negativo: 5 minutos
• Reagente pentavalente (látex vermelho): 2 minutos.
9- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Leitura das reacções:
É conveniente respeitar os tempos de leitura dos reagentes a fim de assegurar um bom desempenho do teste.
Uma reacção positiva é caracterizada por uma aglutinação clara das partículas, visível a olho nu.
Uma reacção negativa traduz-se na ausência de aglutinação do reagente, o qual mantém o seu aspecto leitoso.
Nota: O aparecimento de vestígios ou a presença de uma granulação fina não evolutiva dentro do tempo previsto devem ser
considerados como um resultado negativo.
2
Interpretação :
LEITURA DA AGLUTINAÇÃO
INTERPRETAÇÃO
Reagente omnivalente
(látex verde)
Reagente 6,9,14,19,23
(látex vermelho)
+
+
S. pneumoniae pertencente a um dos serogrupos 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae pertencente a um dos serogrupos 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae pertencente a um dos serogrupos diferente de 6, 9, 14, 19, 23 [b]
-
-
Ausência de uma quantidade detectável de antigénios S. pneumoniae na amostra analisada
• [a] Como o reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 é mais sensível do que o reagente omnivalente, ele consegue detectar
quantidades mais fracas de antigénios. Este tipo de resultados é pouco provável no caso de cultura suficientemente densa, mas
pode verificar-se em hemocultura. Neste último caso, se o aglutinado obtido no látex 6, 9, 14, 19, 23 parecer atípico ou
duvidoso, aconselha-se testar de novo o sobrenadante de hemocultura, após um tratamento de 5 minutos a 100ºC, seguido de
clarificação por centrifugação. ar.
• [b] Dada a forte sensibilidade do reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23, certas estruturas antigénicas comuns a todos os
pneumococos podem provocar fracas reacções cruzadas com os outros serotipos. Consequentemente, qualquer reacção fraca do
látex pentavente, quando o látex omnivalente produz uma reacção visível, deverá ser considerada como não específica e
interpretada como NEGATIVA.
Resultado não interpretável:
Em caso de aglutinação do látex testemunho negativo, e qualquer que seja a intensidade das reacções nos látex "teste", o
resultado é considerado como não interpretável.
10-CONTROLO DE QUALIDADE
Recomenda-se verificar regularmente a efectividade dos látex S. pneumoniae, bem como as do látex testemunho, de acordo com as
recomendações seguintes: a sensibilidade pode ser avaliada testando a mistura de antigénio fornecida no kit testemunho
Reagentes de controlo, ref.61624, como uma amostra pronta a utilizar. Uma reacção de aglutinação deverá observar-se no prazo
de 3 minutos, com os dois reagentes S. pneumoniae, enquanto o látex testemunho deve manter-se homogéneo.
A ausência de auto-aglutinação pode ser igualmente verificada utilizando soro fisiológico em vez da amostra. Garantir a ausência
de aglutinação após 5 minutos de agitação.
11-LIMITAÇÕES DO TESTE
Um resultado negativo não exclui a possibilidade de uma infecção por S. pneumoniae. Pode estar associado a uma quantidade
insuficiente de antigénios na amostra analisada. O objectivo do teste é a despistagem rápida de infecção, a qual deve ser
realizada em complemento e não em substituição dos procedimentos de cultura.
Na literatura foram descritas semelhanças entre os pneumococos e outros germes, susceptíveis de provocar reacções cruzadas
(8, 12). O diagnóstico final não deve ser estabelecido unicamente com base num teste imunológico rápido, mas deve ter em conta
o conjunto dos dados clínicos e das análises microbiológicas e bioquímicas.
12-RESULTADOS DO TESTE
Sensibilidade analítica :
Um estudo do limiar de sensibilidade de cada reagente em antigénios purificados diluídos em soro fisiológico produziu aos
resultados seguintes.
Antigen
erogrupo
Concentração mínima detectada (µg/ml)*
Reagente omnivalente
Reagente 6, 9, 14, 19, 23
6B
0,15
0,05
9N
0,3
0,02
14
0,35
0,05
19
1
0,025
23F
1
0,5
* Este limiar pode sofrer alguma variação conforme o lote testado.
3
Análise de hemoculturas e estirpes isoladas :
No âmbito de um estudo realizado num centro hospitalar, foram realizadas as análises seguintes: 46 hemoculturas obtidas num
estudo prospectivo, 22 hemoculturas simuladas e 99 isolamentos clínicos de S. pneumoniae pertencentes à colecção do hospital.
A especificidade dos reagentes foi avaliada num estudo complementar realizado a partir de isolamentos de 48 germes
patogénicos diferentes de S. pneumoniae. Os resultados estão resumidos no quadro seguinte.
HEMOCULTURA
CULTURA APÓS ISOLAMENTO
Nº de positivos/reagente
Nº de positivos/reagente
Nº total
de estirpes
omnivalente
pentavalente
Nº total
de estirpes
omnivalente
pentavalente
S. pneumoniae,
serogrupos
6, 9, 14, 19, 23
15
12
15
48
48
48
S. pneumoniae,
outros serogrupos
11
11
0
51
51
1
outros germes
42
0
0
48
0
3
• Sensibilidade:
A sensibilidade obtida neste estudo é de 100% para o látex S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 (15/15 hemoculturas, 48/48
culturas a partir de pneumococos isolados) e de 97,4% para o látex omnivalente (12/15 hemoculturas, 99/99 culturas a partir de
germes isolados). As 3 hemoculturas de pneumococos que não reagiram com o látex S. pneumoniae omnivalente deram ainda uma
reacção francamente positiva ao látex pentavalente, confirmando assim a sua melhor sensibilidade.
• Especificidade:
Despistagem de pneumococos serogrupos 6, 9, 14, 19, 23
Entre os 62 pneumococos analisados pertencentes a outros serogrupos que não os visados pelo látex pentavalente, apenas 1
pneumococo "não classificável" produziu uma fraca reacção cruzada com o reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23
(especificidade, 98,4%). De notar: a ausência de aglutinação com uma outra estirpe de pneumococo não classificável, incluída no
estudo, mostra que este tipo de reacção cruzada não é sistemático.
Reacções cruzadas com germes diferentes de S. pneumoniae
A especificidade foi testada em relação a 90 estirpes (42 hemoculturas de estudo prospectivo, 48 culturas a partir de germes
isolados), compreendendo os germes seguintes : S. aureus, estafilococos coagulase negativos, S. bovis, S. viridans, S. salivarius,
S. oralis, S.mitis, Streptococcus grupo A, B, C, D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans, Acinetobacter sp.,
E. coli, H. influenzae, N. meningitidis A, B, C, Y, W135. Não se observou qualquer reacção cruzada com o látex omnivalente
(especificidade 100%). O látex pentavalente produziu aglutinações atípicas com duas estirpes de S. faecalis e um estreptococo do
grupo G. Estas reacções cruzadas encontram-se descritas na literatura (ver Limitações do Teste).
• Reprodutibilidade entre lotes e entre operadores :
A reprodutibilidade das análises foi testada em 3 lotes diferentes de cada reagente, bem como para um determinado lote
proveniente de 3 operadores diferentes. As amostras testadas compreendiam hemoculturas (reacção positiva intensa, fraca,
negativa), estirpes isoladas (reacçao positiva intensa, fraca, negativa) e um antigénio polissacarídeo de pneumococo em solução
em soro fisiológico. Não foi demonstrada qualquer variação significativa para o reagente S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23. No
entanto, foram demonstradas variações entre lotes na análise de amostras positivas fracas com o látex omnivalente.
13-BIBLIOGRAFIA
Ver a versão francesa.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33
11/2002
code: 18215
4
PASTOREX® PNEUMODUO
25 TEST
61719
LATEXAGGLUTINATIONSTEST FÖR IDENTIFIERING AV STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
OCH SCREENING FÖR SEROGRUPPERNA 6, 9, 14, 19, 23
IVD
1- KLINISKT VÄRDE
S. pneumoniae isoleras ofta från öra, näsa och svalg och luftvägar. Under vissa omständigheter kan den ge upphov till allvarliga
infektioner som meningit, sepsis och pneumoni. Vid dessa tillfällen är snabb behandling kritiskt för patientens överlevnad , vilket
kräver snabba diagnostiska test. Ökande andel penicillinresistenta stammar försvårar ytterligare valet av förstahandsbehandling.
2- SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING
Pneumokockinfektioner kan diagnostiseras med traditionella bakteriologiska metoder: koloniernas utseende samt gramfärgning
(grampositiva diplokocker), optochinkänslighet och lyseringstest med gallsalter. Förekomsten av kapselantigen på bakteriens yta
utgör grunden för generella (omnivalenta) latexagglutinationstester för identifiering av pneumokocker. Nittio olika serotyper av
S. pneumoniae har för närvarande beskrivits [1]. Motsvarande kapselantigen kan påvisas i odling, men även direkt i biologiska
vätskor (CSF, serum, urin etc.), där de utsöndras vid infektion.
Efter identifikation av organism som gett upphov till infektion står man inför valet av antibiotika, vilket kompliceras av det växande
antal stammar som har nedsatt känslighet för penicillin. Epidemiologiska studier [2], [3], [4], [5], [6], [7] har visat att
penicillinresistens, i de flesta delar av världen, oftast är kopplad till följande 5 serogrupper: 6, 9, 14, 19, 23. Genom att använda
en specifik latex för dessa 5 serogrupper uppnår man därför en dubbel fördel: man får en förbättrad sensitivitet jämfört med ett
omnivalent reagens för påvisande av antigener som motsvarar dessa stammar, och ett redskap för att tidigt utvärdera risken för
penicillinresistens, vilket blir till hjälp för beslutet om förstahandsval av antibiotika .
3- TESTPRINCIP
Pastorex® PneumoDUO är ett snabbt latexagglutinationstest bestående av två reagens:
• en generell (omnivalent) latex, sensibiliserad med antikroppar, erhållna från kaninserum , som reagerar med alla kända serotyper
av pneumokocker.
• ett reagens för 6, 9, 14, 19 och 23, som är specifikt för de kapselantigen hos S. pneumoniae som tillhör någon av dessa
serogrupper. Denna pentavalenta latex möjliggör därigenom indirekt screening för de stammar som vanligen är förknippade med
penicillinresistens, och har högre sensitivitet än det omnivalenta reagenset (se analytiska prestanda).
För var och ett av reagensen gäller att latexpartiklarna agglutineras i närvaro av en tillräcklig mängd homologa antigen.
Eftersom vissa odlingsmedier och vissa bakterier kan utlösa ospecifik aggregation, rekommenderar vi att man parallellt kör den
negativa latexkontroll som ingår i Pastorex® Meningitis-kit kontrollreagens, art-nr 61624.
4- KIT-INNEHÅLL
Kit för 25 test, art-nr 61719, innehållande:
• En droppflaska (0,40 mL) med grön latex specifik för Streptococcus pneumoniae.
• En droppflaska (0,40 mL) med röd latex specifik för Streptococcus pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5- VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
Produkten är endast avsedd för in vitro diagnostik.
1.Använd inte kitet efter utgångsdatum.
2.Hantera alla prover som potentiellt infektiöst material och tillämpa aseptisk laboratorieteknik vid odlingarna.
3.Kassera ympöglor av engångstyp och agglutineringskort i kärl avsett för laboratorieavfall. Korten får ej återanvändas.
4.Vi rekommenderar starkt användning av engångshandskar.
5.Vidrör ej ytan på reagenskorten med fingrarna.
6.Låt reagensen stå i rumstemperatur (+18-25°C) före användning.
7.Skaka latexflaskorna före användning.
1
6- FÖRVARING AV REAGENS
Reagensen skall förvaras vid en temperatur mellan +2°C och +8°C. Förvara latexflaskorna stående. LATEXREAGENS FÅR EJ FRYSAS.
Reagensen är under dessa betingelser, och om de ej kontamineras, stabila fram till det utgångsdatum som anges på etiketten.
7- PROVTAGNING OCH ODLING
Isolaten skall tas från 18- till 24-timmarsodlingar på blodagar, såsom Columbia fårblod art-nr 63784/TCS, fårblod art-nr 63964
eller motsvarande. Före analys måste dessa isolat subkultiveras i buljong genom att flera kolonier överförs till Todd Hewitt buljong
art-nr 55705, TCS buljong art-nr 53455 eller 54964, eller motsvarande.
Vissa blododlingsmedier kan utlösa smärre ospecifika reaktioner; om någon tveksamhet föreligger bör man utföra en kontroll med
ett blododlingsmedium som ympas med sterilt blod eller ett prov som innehåller en annan bakterie än S. pneumoniae.
8- UTFÖRANDE
MATERIAL SOM INGÅR
- Se kit-innehåll.
MATERIAL SOM BEHÖVS MEN SOM EJ INGÅR
- Pipetter för en volym på 40 µl.
- Platinaöglor för skörd av kolonier.
- Centrifug för hemolysrör eller Eppendorfrör.
- Desinfektionskärl eller autoklavpåse för eliminering av förbrukade agglutineringskort.
- Pastorex® Meningitis: kit med kontrollreagens, art-nr 61624, innehållande:
. 2 x 0,40 ml negativ kontroll.
. 2 x q.s.1 ml polyvalent positiv kontroll.
. 2 x 10 engångskort.
. 150 blandningsstickor av engångstyp.
STEG FÖR STEG:
1) Provhantering
Analys från kolonier:
Använd ett prov från en 18-24 timmar gammal odling på blodagar och kontrollera morfologi, gramfärgning, katalas och hemolys
(katalaspositiva stammar skall ej testas). Testa endast grampositiva kocker. Ympa en Todd Hewitt, TCS eller motsvarande buljong
med några kolonier. När odlingen är så tät att den ser grumlig ut för blotta ögat (efter 3–5 timmars inkubation beroende på
ympen), analyseras odlingsbuljongen med latexreagensen. Inkubera inte för länge, eftersom detta kan ge upphov till lys av celler
och ospecifika agglutinationsreaktioner med latexen för serotyp 6, 9, 14, 19, 23.
Blododlingar:
Centrifugera 1–2 ml blododling så att de röda blodkropparna sedimenterar (t.ex. 5 min vid 2 000x g). Utför testet på
supernatanten.
2) Homogenisera latexreagensen noga
3) För varje prov: placera 1 droppe negativ kontrollatex från kitet art-nr 61624 på en cirkel med vit bakgrund, 1 droppe
omnivalent S. pneumoniae-latex (grön) på en cirkel med svart bakgrund och 1 droppe S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23-latex
(röd) på en cirkel med vit bakgrund.
4) Placera 40 µl prov intill varje latexdroppe.
5) Blanda noga latexen med var och ett av proven med hjälp av en blandningssticka, så att det blir en homogen uppslamning
över cirkelns hela yta. Använd en ny blandningssticka för varje prov.
6) Rotera kortet försiktigt (en mekanisk anordning som en rotationsskak vid 110–140 rpm kan användas), och läs av reaktionen
efter den tid som anges för respektive reagens och typ av prov.
7) Avläs resultaten: för att säkerställa optimal sensitivitet och specificitet hos reagensen rekommenderar vi att det maximalt får
dröja den nedan angivna tiden innan proven avläses:
• Omnivalent reagens (grön latex) och negativ kontrollatex: 5 minuter,
• Pentavalent reagens (röd latex): 2 minuter.
9- RESULTAT
Avläsning av reaktionerna:
Följ de rekommenderade avläsningstiderna så att testet ger optimala prestanda.
Positiv reaktion kännetecknas av en tydlig agglutination av partiklar som är synliga för blotta ögat.
Negativ reaktion kännetecknas av utebliven agglutination i reagenset, och bibehållet mjölkaktigt utseende.
OBS! Om det uppträder spår av agglutinat eller fina korn som inte förändras med tiden, skall provet betraktas som negativt.
2
Tolkning:
AVLÄST AGGLUTINATION
TOLKNING
Omnivalent
reagens (grön latex)
Reagens för 6, 9, 14,
19, 23 (röd latex)
+
+
S. pneumoniae som tillhör en av serogrupperna 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae som tillhör en av serogrupperna 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae som tillhör andra serogrupper än 6, 9, 14, 19, 23 [b]
-
-
Det analyserade provet saknar påvisbara mängder av S. pneumoniae-antigen
• [a] Eftersom reagenset för S. pneumoniae 6, 9, 4, 19, 23 är känsligare än det omnivalenta reagenset, kan det påvisa mindre
mängder antigen. Ett resultat av denna typ är osannolikt om odlingen är tillräckligt tät, men kan uppträda vid prov från
blododlingar. Om man i sådana fall får ett atypiskt eller tveksamt agglutinat med 6, 9, 14, 19, 23-latexen, skall testet göras om
med supernatant från blododlingen, efter upphettning till 100°C under 5 minuter och därefter centrifugering.
• [b] på grund av den höga sensitiviteten hos reagenset för S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 kan vissa antigenstrukturer som är
gemensamma för alla pneumokocker utlösa svaga korsreaktioner med övriga serotyper. Följaktligen gäller för alla prov som ger
svagt positiv reaktion med den pentavalenta latexen och klart positiv reaktion med den omnivalenta latexen att reaktionen skall
betraktas som ospecifik och testresultatet tolkas som NEGATIVT.
Icke tolkningsbara resultat
Om det skulle förekomma agglutination av den negativa kontrollatexen gäller, oavsett hur stark reaktion man får hos ”provlatexen”,
att resultatet skall betraktas som icke tolkningsbart.
10-KVALITETSKONTROLL
Vi rekommenderar att man regelbundet kontrollerar funktionen hos S. pneumoniae-latexen och kontrollatexen på följande sätt:
sensitiviteten kan valideras genom att man testar den antigenblandning som i form av ett färdigberett prov ingår i kontrollreagenskitet, art-nr 61624. En agglutinationsreaktion skall iakttas inom 3 minuter med båda S. pneumoniae-reagensen, medan
kontollatexen måste förbli homogen.
Frånvaro av autoagglutination kan också verifieras genom att man använder fysiologisk koksaltlösning i stället för prov. Kontrollera
att det inte föreligger någon agglutination efter 5 minuters skakning.
11-BEGRÄNSNINGAR HOS TESTET
Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten av en infektion med S. pneumoniae. Ett negativt resultat kan bero på att det finns alltför
lite antigen i det analyserade provet. Syftet med testet är att snabbt påvisa infektion och testet måste utföras som ett komplement till
och inte en ersättning för odlingsmetoder.
Antigena likheter mellan pneumokocker och andra bakterier finns beskrivna i litteraturen och kan utlösa korsreaktioner [8-12].
Definitiv diagnos kan inte ställas enbart på basis av ett immunologiskt snabbtest utan måste ta hänsyn till samtliga kliniska data och
resultaten från mikrobiologiska och biokemiska tester.
12-PRESTANDA FÖR TESTET
Analytisk sensitivitet:
En studie av känslighetsgränsen för varje reagens, på renade antigen, spädda med fysiologisk koksaltlösning, gav följande resultat.
Serogrupp för
antigen
Lägsta koncentration för detektion (µg/ml)*
Omnivalent reagens
Reagens för 6, 9, 14, 19, 23
6B
0,15
0,05
9N
0,3
0,02
14
0,35
0,05
19
1
0,025
23F
1
0,5
* Viss variation mellan olika batcher.
3
Analys av blododlingar och isolerade stammar:
Följande analyser utfördes i samband med en sjukhusutvärdering av testet: 46 blododlingar erhållna inom ramen för en prospektiv
studie, 22 simulerade blododlingar och 99 kliniska isolat av S. pneumoniae från sjukhusets samling.
Reagensens specificitet utvärderades i en kompletterande studie om 48 isolat av andra patogener än S. pneumoniae. Resultaten är
sammanfattade i nedanstående tabell:
BLODODLING
ODLING EFTER ISOLERING
Antal positiva reaktioner
Antal positiva reaktioner
Totalt
antal
stammar
Omnivalent
Pentavalent
Totalt
antal
stammar
Omnivalent
Pentavalent
S. pneumoniae,
serogrupperna
6, 9, 14, 19, 23
15
12
15
48
48
48
S. pneumoniae, andra
serogrupper
11
11
0
51
51
1
Andra bakterier
42
0
0
48
0
3
• Känslighet:
Känsligheten vid evalueringen var 100 % för S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23-latex (15/15 blododlingar, 48/48 odlingar från
pneumokockisolat) och 97,4 % för omnivalent latex (12/15 blododlingar; 99/99 odlingar från isolerade bakterier). De 3
blododlingar av pneumokocker som inte reagerade med omnivalent S. pneumoniae-latex gav en starkt positiv reaktion med
pentavalent latex, vilket bekräftar dess högre känslighet.
• Specificitet:
Screening för pneumokocker tillhörande serogrupperna 6, 9, 14, 19, 23
Av de 62 pneumokocker som tillhörde andra serogrupper än de som pentavalent latex är avsedd för gav endast 1 ”otypbar”
pneumokockstam en svag korsreaktion med S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23-reagenset (specificitet: 98,4 %). OBS! Det faktum att
agglutination uteblev med en annan ej typbar pneumokockstam som ingick i studien visar att denna korsreaktion ej är systematisk.
Korsreaktioner med andra bakterier än S. pneumoniae
Specificiteten testades i förhållande till 90 stammar (42 blododlingar från den prospektiva studien, 48 odlingar från isolerade
bakterier inklusive följande):
S. aureus, koagulasnegativa stafylokocker, S. bovis, S. viridans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, streptokocker av grupp A, B, C, D,
F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans, olika Acinetobacter-arter, E. coli, H. influenzae, N. meningitidis A, B,
C, Y, W135. Ingen korsreaktion sågs med omnivalent latex (specificitet: 100 %). Pentavalent latex gav atypisk agglutination med 2
stammar av S. faecalis och en grupp G-streptokocker. Sådana korsreaktioner finns beskrivna i litteraturen (se Begränsningar hos
testet).
• Reproducerbarhet mellan olika batcher och olika handhavare:
Reproducerbarheten hos analyserna testades med 3 olika batcher av varje reagens samt med samma batch testad av tre olika
handhavare. Bland de testade proverna fanns blododlingar (starkt positiva, svagt positiva, negativ reaktion), isolerade stammar
(starkt positiva, svagt positiva, negativ reaktion) och ett polysackaridantigen från pneumokocker löst i fysiologisk koksaltlösning.
Ingen signifikant variation observerades för S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23-reagenset. Variationer mellan olika batcher
observerades vid analys av svagt positiva prover med omnivalent latex.
13-BIBLIOGRAFI
Se den franska versionen.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
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4
PASTOREX® PNEUMODUO
25 TEST
61719
LATEX-AGGLUTINATIONSTEST TIL IDENTIFIKATION AF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE OG
SCREENING FOR SEROGRUPPER 6, 9, 14, 19, 23
IVD
1– KLINISK VÆRDI
S. pneumoniae isoleres hyppigt fra øre, næse og hals samt luftveje. Som reaktion på visse faktorer kan den inducere alvorlige
infektioner såsom meningitis, sepsis eller pneumoni. I disse tilfælde afhænger patientens overlevelse ofte af hurtig behandling,
hvilket nødvendiggør anvendelse af hurtige diagnostiske test. Den stadig større andel af penicillin resistente stammer udgør
yderligere en vanskelighed i valget af startbehandling.
2- OVERSIGT OG FORKLARING
Pneumokokinfektioner kan diagnosticeres med konventionelle bakteriologiske metoder: koloniens udseende og Gramfarvning
(Grampositive diplokokker), optokinfølsomhed samt galleopløselighedstest. Forekomsten af kapselantigener på overfladen af
bakterier er ligeledes basis for analyse af omnivalent latexagglutinationstest til identifikation af pneumokokker. Der er beskrevet
halvfems forskellige serotyper af S. pneumoniae [1]. De tilsvarende kapselantigener kan påvises på kulturer, men også direkte i
biologiske væsker (cerebrospinalvæske, serum, urin, osv.), hvori de udskilles under en infektion.
Efter identifikationen af den sygdomsfremkaldende organisme er klinikeren konfronteret med valget af antibiotika, hvilket
kompliceres af det voksende antal stammer med nedsat penicillinfølsomhed. Epidemiologiske studier [2], [3], [4], [5], [6], [7] har
vist, at penicillinresistens i de fleste regioner, ofte optræder i forbindelse med de følgende 5 serogrupper: 6, 9, 14, 19, 23. Ved at
anvende en latex specifik til disse 5 serogrupper opnås en dobbelt fordel: forøget sensitivitet ved påvisning af disse stammers
korresponderende antigener og en metode til tidlig evaluering af risikoen for penicillin-resistens, hvilket er en hjælp i beslutningen
om den rigtige antibiotikabehandling.
3- TESTENS PRINCIPPER
Pastorex® PneumoDUO er en hurtig latex agglutinationstest, der består af to reagenser:
• en omnivalent latex, sensibiliseret med oprenset kaninantistof, der er specifik for alle kendte pneumokok-serotyper;
• et reagens til 6, 9, 14, 19, 23, der er specifikt for de kapselantigener i S. pneumoniae tilhørende disse fem serogrupper. Denne
pentavalente latex muliggør derfor indirekte screening for de stammer, der almindeligvis udviser penicillinresistens og med øget
følsomhed sammenlignet med det omnivalente reagens (se de analytiske data).
For hver af reagenserne gælder, at latex-partikler agglutineres ved forekomst af en tilstrækkelig mængde homologe antigener.
Da nogle dyrkningsmedier og visse bakterier kan inducere uspecifik aggregering, anbefales det at man sideløbende anvender den
negative kontrol-latex, der følger med Pastorex® Meningitis kit, kontrolreagenser, kat.nr. 61624.
4– KITTETS INDHOLD
Kit til 25 tests, katalog nr. 61719, indeholder:
• En flaske (0,40 ml) med dråbetæller og en grøn latexsuspension specifik for Streptococcus pneumoniae.
• En flaske (0,40 ml) med dråbetæller og en rød latexsuspension specifik for Streptococcus pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23.
5- ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER
Til in vitro diagnostisk anvendelse
1.Anvend ikke reagenser, der er udløbet.
2.Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøse, og dyrkninger skal foretages i overensstemmelse med aseptiske
laboratorieteknikker.
3.Engangsøjepodenåle og agglutinationskort anbringes efter brug i en autoklave eller desinfektionskar. Anvend ikke kortene igen.
4.Anvendelse af engangshandsker anbefales.
5.Overfladen på reagenskortene må ikke berøres med fingrene.
6.Reagenserne skal have stuetemperatur (+18-25 °C) inden anvendelse.
7.Latex-flaskerne omrystes inden brug.
1
6- OPBEVARING AF REAGENSERNE
Reagenserne skal opbevares ved +2-8°C. Latex-flaskerne skal opbevares opretstående. LATEX-REAGENSERNE MÅ ALDRIG
NEDFRYSES. Reagenserne er under disse betingelser, og såfremt de ikke kontamineres, holdbare indtil den udløbsdato, der er
angivet på etiketten.
7- PRØVETAGNING OG DYRKNING
Isolaterne skal indsamles fra 18--24-timers kulturer på blodagar, såsom Columbia fåreblodsagar, kat.nr. 63784 / TCS fåreblodsagar
kat. nr. 63964 eller tilsvarende medie. Forud for videre undersøgelse skal disse isolater subkultiveres i bouillon ved at flere kolonier
overføres til subkultur i Todd Hewitt bouillon kat.nr. 55 705, TCS-bouillon lat. nr. 53 455 eller 54 964 eller tilsvarende.
Nogle bloddyrkningsmedier kan inducere lettere uspecifikke reaktioner. I tvivlstilfælde bør man udføre en kontrol med et
bloddyrkningsmedie som inokuleres med sterilt blod eller en prøve, som indeholder en anden bakterie end S. pneumoniae.
8- PROCEDURE
LEVEREDE MATERIALER
- Se i afsnittet: Kittets indhold.
NØDVENDIGE IKKE LEVEREDE MATERIALER
- Pipetter med volumen på 40 µl
- Øjepodenåle til udtagning af bakteriekolonier
- Centrifuge til hæmolyserør eller Eppendorf rør
- Desinfektionskar eller autoklaverbare poser til bortskaffelse af brugte agglutinationskort
- Pastorex® Meningitis: Kontrolkit med kontrolreagens, katalog nr. 61624, der består af:
. 2x0.40 ml negativ latexkontrol
. 2x1ml polyvalent positiv kontrol
. 2x10 engangskort
. 150 engangsomrørerpinde
PROCEDURE:
1) Prøvehåndtering
Analyser fra kolonier:
På en prøve, der er indsamlet fra en 18-24-timers kultur på blodagar, verificeres morfologi, Gramfarvning, katalase og hæmolyse
(analysér ikke katalase-positive stammer). Analysér kun Grampositive kokker. Inokuler Todd Hewitt, TCS eller tilsvarende bouillon
med adskellige kolonier. Når kulturen er så kompakt, at uklarheder kan ses med det blotte øje (3 til 5 timers inkubation,
afhængigt af podningsmaterialet), analyseres kulturbouillonen med anvendelse af latex-reagenserne. Undgå alt for lange
inkubationstider, da dette kan inducere cellelysering og forårsage uspecifik agglutinationsreaktioner med latex 6, 9, 14, 19, 23.
Blodkulturer:
Centrifugér 1 til 2 ml blodkultur for at bundfælde de røde blodlegemer (f.eks. 5 min ved 2.000 g). Udfør testen på supernatanten.
2) Bland latexreagenserne grundigt.
3) For hver prøve dispenseres 1 dråbe negativ kontrol latex fra kittet (katalog nr.61624) i en cirkel med hvid baggrund, 1 dråbe
omnivalent S. pneumoniae -latex (grøn) i en cirkel med sort baggrund og 1 dråbe S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 -latex (rød)
i en cirkel med hvid baggrund.
4) Dispensér 40 µl prøve ved siden af hver dråbe latex.
5) Bland omhyggeligt latexsuspensionen med hver prøve ved hjælp af en omrørerpind, så der opnås en homogen suspension på
hele cirklens overflade. Skift omrørerpind for hver prøve.
6) Drej kortet med lette cirkelbevægelser (f.eks. med en rotationsmikser ved 110-140 rpm) og aflæs reaktionen inden for den
angivne tid, afhængigt af reagens og prøvetype.
7) Aflæsning af resultaterne: For at sikre optimal sensitivitet og specificitet for reagenserne anbefales det at overholde følgende
aflæsningstider:
• Omnivalent reagens (grøn latex) og negativ kontrol-latex: 5 minutter
• Pentavalent reagens (rød latex): 2 minutter
9- RESULTATER
Aflæsning af reaktioner:
De anbefalede aflæsningstider skal overholdes for at sikre, at testen fungerer optimalt.
Positiv reaktion er kendetegnet ved tydelig agglutination af partikler, der kan ses med det blotte øje.
Negativ reaktion er kendetegnet ved mangel på agglutination af reagenset, som bibeholder sit mælkelignende udseende.
Bemærk: : Ved forekomst af spor eller fin granulering, der ikke ændrer sig med tiden, må resultatet anses for at være negativt.
2
Fortolkning:
AFLÆSNING AF AGGLUTINATION
FORTOLKNING
Omnivalent
reagens (grøn latex)
6, 9, 14, 19, 23 reagens (rød latex)
+
+
S. pneumoniae tilhørende en af serogrupperne 6, 9, 14, 19, 23
-
+
S. pneumoniae tilhørende en af serogrupperne 6, 9, 14, 19, 23 [a]
+
-
S. pneumoniae tilhørende andre serogrupper end 6, 9, 14, 19, 23 [b]
-
-
Ingen målbar mængde S. pneumoniae -antigener i den analyserede prøve
• [a] Da S. pneumoniae 6, 9, 4, 19, 23 -reagenset er mere sensitivt end det omnivalente reagens, kan lavere antigenmængder
detekteres. Denne type resultat er usandsynlig, hvis kulturen er tilstrækkelig kompakt, men kan dog forekomme i prøver fra
bloddyrkninger. Hvis man i sådanne tilfælde får et atypisk eller tvivlsomt agglutinat med 6, 9, 14, 19, 23-latexen, skal testen gentages
med bloddyrkningens supernatant, der opvarmes til 100°C i 5 minutter og derefter centrifugeres for at blive fuldstændig klar.
• [b] På grund af den høje sensitivitet af S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 -reagenset kan visse antigenstrukturer, der er fælles for
alle Pneumococci, udløse svage krydsreaktioner med øvrige serotyper. Derfor skal alle prøver, som giver svagt positive reaktioner
med den pentavalente latex og en tydeligt positiv reaktion på den omnivalente latex, anses for at være uspecifik og fortolkes som
værende NEGATIVT.
Ufortolkeligt resultat
I tilfælde af agglutination af den negative kontrol-latex, og uanset intensiteten af “prøvelatexens” reaktioner, anses resultatet for at
være ufortolkeligt.
10-KVALITETSKONTROL
Det tilrådes, at man regelmæssigt kontrollerer effekten af S. pneumoniae -latexen og kontrollatexen i overensstemmelse med
følgende anbefalinger: Sensitiviteten kan valideres ved at analysere antigenblandingen, der leveres med kontrolreagenskittet
(katalog nr.61624) som en færdigfremstillet prøve. En agglutinationsreaktion bør kunne observereres inden for 3 minutter med
begge S. pneumoniae -reagenser, mens kontrollatexen skal forblive homogen.
Udeblivelse af autoagglutination kan ligeledes verificeres ved anvendelse af fysiologisk saltvand i stedet for prøven. Kontrollér
udeblivelse af agglutination efter omrystning i 5 minutter.
11-TESTENS BEGRÆNSNINGER
Et negativt resultat udelukker ikke muligheden for infektion med S. pneumoniae. Et negativt resultat kan skyldes en utilstrækkelig
antigenmængder i den analyserede prøve. Formålet med testen er hurtig påvisning af infektion, der er et supplement og ikke en
erstatning for dyrkningsprocedurer.
Antigene ligheder mellem Pneumococci og andre bakterier er beskrevet i litteraturen og kan inducere krydsreaktioner [8-12]. Den
endelige diagnose kan ikke stilles udelukkende på baggrund af en hurtig immunologisk test, men skal indbefatte alle kliniske data
og resultaterne af mikrobiologiske og biokemiske test.
12-TESTENS YDELSESEGENSKABER
Analytisk sensitivitet:
Et studie af sensitivitetsniveauet på oprensede antigener fortyndet i fysiologisk saltvand, gav følgende resultater.
Antigen
serogruppe
Minimumkoncentration detekteret (µg/ml)*
Omnivalent reagens
6, 9, 14, 19, 23 -reagens
6B
0,15
0,05
9N
0,3
0,02
14
0,35
0,05
19
1
0,025
23F
1
0,5
* Denne grænse kan dog variere, afhængigt af den analyserede batch.
3
Analyse af blodkulturer og isolerede stammer:
Følgende analyser blev gennemført i forbindelse med et hospitals evaluering af testen: 46 blodkulturer, indsamlet i et prospektivt
studie, 22 simulerede blodkulturer og 99 kliniske isolater af S. pneumoniae fra hospitalets samling.
Reagensernes specificitet blev evalueret under et supplerende studie, der blev udført på 48 isolater af andre patogener end
S. pneumoniae. Resultaterne er opsummeret i følgende tabel:
BLODKULTUR
KULTUR EFTER ISOLERING
Antal positive reaktioner
Antal positive reaktioner
Antal
stammer i alt
Omnivalente
Pentavalente
Antal
stammer i alt
Omnivalente
Pentavalente
S. pneumoniae,
serogrupper
6, 9, 14, 19, 23
15
12
15
48
48
48
S. pneumoniae, andre
serogrupper
11
11
0
51
51
1
Andre bakterier
42
0
0
48
0
3
• Sensitivitet:
Sensitivitet, opnået i denne evaluering, var 100 % for S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 -latexen (15/15 blodkulturer; 48/48
kulturer fra pneumokok-isolater) og 97,4 % for den omnivalente latex (12/15 blodkulturer; 99/99 kulturer fra isolerede bakterier).
De 3 blodkulturer af Pneumococci, der ikke reagerede med den omnivalente S. pneumoniae -latex, gav en stærkt positiv reaktion
med den pentavalente latex, hvilket bekræfter den forøgede sensitivitet.
• Specificitet:
Screening for pneumokok-serogrupperne 6, 9, 14, 19, 23
Ud af de 62 Pneumococci, der tilhører andre serogrupper end de, der er målet for den pentavalente latex, var der 1 Pneumococcus
"ikke typebar" der gav en svag krydsreaktion med S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 -reagenset (specificitet: 98,4 %). Bemærk:
mangel på agglutination med en anden stamme af Pneumococcus, der ikke kan henføres til en bestemt type og som blev inkluderet i
forsøget, viser, at denne type krydsreaktion ikke er systematisk.
Krydsreaktioner med andre bakterier end S. pneumoniae
Specificiteten blev undersøgt i forhold til 90 stammer (42 blodkulturer fra det prospektive studie, 48 kulturer fra isolerede bakterier)
inklusive følgende bakterier:
S. aureus, koagulase-negative Staphylococci, S. bovis, S. viridans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, Streptococcus-grupper A, B, C,
D, F, G, K. pneumoniae, E. cloacae, P. aeruginosa, C. albicans, Acinetobacter sp., E. coli, H. influenzae, N. meningitidis A, B, C,
Y, W135. Ingen krydsreaktion blev påvist med den omnivalente latex (specificitet: 100 %). Den pentavalente latex gav atypiske
agglutinationer med 2 stammer af S. faecalis og en gruppe af G Streptococcus. Sådanne krydsreaktioner er beskrevet i litteraturen
(se ”Testens begrænsninger”).
• Reproducerbarhed fra batch til batch og fra bruger til bruger:
Analysernes reproducerbarhed blev testet på 3 forskellige batcher af hvert reagens, og for det samme batch anvendt af 3 forskellige
brugere. Prøverne omfattede blodkulturer (stærkt positiv, svagt positiv, negativ reaktion), isolerede stammer (stærkt positiv, svagt
positiv, negativ reaktion) og et Pneumococcus polysaccharid-antigen i en opløsning af fysiologisk saltvand. Der blev ikke påvist
nogen signifikant variation for S. pneumoniae 6, 9, 14, 19, 23 -reagenset. Variationerne fra batch til batch blev påvist ved analyse
af svagt positive prøver med den omnivalente latex.
13-LITTERATURFORTEGNELSE
Se den franske version.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
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4
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
EC REP
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
- Temperatura limite
- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegränsning
- Temperaturbegrænsning
50
REF
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
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i
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- Consulter le mode d'emploi
- Consulte la instrucción para el uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consultare le istruzioni per uso
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- Se instruktion før brug
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