Propriété des vecteurs de clonage • Capables de réplication

Propriété des vecteurs de clonage
 Capables de réplication autonome dans une cellule hôte
 Possèdent un « polylinker » ou site multiple de clonage
 Supportent l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand selon le type de vecteur
Type de vecteur
Plasmide bactérien (2-4kb)
Phage λ (9-22kb)
Cosmide (≈ 45kb)
PAC (75-95kb)
BAC (100-350kb)
YAC (300-500kb)
ADN cloné en Kb
20
25
45
100
300
1000
Ils doivent posséder un gène de sélection.
L’expression d’un gène cloné :
 Lorsque l’on veut faire exprimer dans la bactérie le gène cloné:
 On clone l’intégralité d’un gène, promoteur compris pour les gènes procaryotes uniquement
 On utilise un vecteur d’expression contenant un promoteur en amont du site de clonage et on peut cloner un ADNc
Banque d’expression dans la bactérie
 Choix du vecteur d’expression (navette si besoin)
 Clonage de l’ADNc d’intérêt
 Expression dans la bactérie
 Immobilisation sur membrane de nitrocellulose
 Reconnaissance de la protéine d’intérêt via un anticorps
Vecteur navette : Capacité à se répliquer et à permettre l’expression dans la bactérie et dans une cellule eucaryote. Il n’existe pas
d’origine de réplication eucaryote connu à ce jour.
Criblage par anticorps.
Les systèmes d’expression
2 familles d’anticorps :
Reconnait un épitope linéaire
Reconnait les protéines seulement quand elles sont formées.
Parfois on a besoin de produire une protéine en grande quantité, le problème se sera de la purifier. On pourra mettre une
étiquette, un flag ou un tag sur la protéine. On veut greffer quelques acides aminés à une protéine. La phase de lecture devra être prise
en compte.
Le vecteur devra contenir les gènes de résistance eucaryotes et procaryotes, les promoteurs eucaryotes et procaryotes et la
séquence étiquette qui pourront être soit en 5’ soit en 3’ de l’ORF (phase ouverte de lecture).
Une histoire de génétique : les épidermolyses
Ce sont des maladies génétiques qui sont classées en plusieurs catégories. Plusieurs gènes peuvent être impliqués. Décollement
entre l’épiderme et le derme.
 Pathologies génétiques à caractère dominant ou récessif
 Désorganisation des épithéliums
 Gène(s) responsable(s) inconnus
 Classification en fonction de la gravité de la pathologie et du mode de transmission
Voir diapo prof …