CMT de type 1
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CMT de type 1
I - Génétique humaine Francis Castets, INSERM UMR 641 [email protected] PRE-REQUIS ADN CHROMOSOME 3 types de gènes: - codant pour des protéines - spécifiant des ARN (nucléoprotéines) - régulation Chez la drosophile le gène qui gouverne la couleur des yeux présente plusieurs allèles. R est l'allèle qui donne la couleur rouge. b est l'allèle qui donne la couleur blanche. mouches aux yeux rouges = 2 combinaisons possibles. mouches aux yeux blancs une seule combinaison. Maladie récessive autosomique Méïose et crossing-over (enjambement) QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. Les brassages chromosomiques chez les organismes diploïdes Février 2001 Décryptage du génome humain 3.109 paires de bases environ 23 000 gènes. Base de donnée en génétique humaine : Human Genome Resource http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/ OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man OMIM Statistics for October, 2008 Number of Entries Autosomal 12233 X-Linked 601 Y-Linked 48 Mitochondrial 35 Total 12917 336 23 0 2 361 Phenotype description, molecular basis known 2362 208 4 26 2600 Mendelian phenotype or locus, molecular basis unknown 1636 141 5 0 1782 Other, mainly phenotypes with suspected mendelian basis 1883 139 2 0 2024 18450 1112 59 63 19684 Gene with known sequence Gene with known sequence and phenotype Total Remarque: OMIM Statistics for November , 2006 : total = 17202 OMIM Statistics for October , 2007 : total = 18133 OMIM Statistics for October , 2008 : total = 19012 Caryotype humain N = 23 IDIOGRAMME 97% identité 98% identité 97% identité La Spéciation Les espèces humaines et simiesques se sont séparées voici six millions d'années Le diktat génétique : la chorée de Huntington Polymorphisme variabilité génétique chez l’homme > 0,2% * Au niveau nucléotidique: SNP (0,08%) Variation dans la séquence des gènes entre individus d’une population donnée. Ces variations qui rendent compte des différents allèles sont normales. (haplotype) * Au niveau de la structure de l’ADN (> 0,12%) Grande insertion ou délétion d’ADN, appelé CNV (copy number variant) Réarrangement (inversion) Défaut chromosomique * Translocation * Insertion * Délétion * Duplication Exemple: La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) neuropathie périphérique héréditaire sensitive et motrice - En France c’est la maladie neuromusculaire la plus fréquente (elle affecte une personne sur 2 500) - Atrophie progressive des muscles distaux - Génétiquement hétérogène mais tableau clinique sensiblement identique. – Les CMT de type 1 (type démyélinisant) (A, B, …) – Les CMT de type 2 (type axonal) – Les CMT liées à l’X - La moitié des patients sont atteints de la forme 1A de la maladie : forme démyélinisante due à une trisomie partielle d’une petite région du bras court du chromosome 17, incluant le gène PMP22 impliqué dans les processus de myélinisation. Marquage par le bleu de Toluidine des gaines de myéline Neuropathie héréditaire avec hypersensibilité à la pression (NHHP) ou neuropathie tomaculaire. (Heredidary Neuropathy with liability to Pressure Palsies) * Délétion d’un alléle de PMP22 Maladie de Charcot-MarieTooth Type 1A * Duplication d’un alléle de PMP22 Suter U & Scherer SS. Nat; Rev. Neurosci. (2003) Causes du Polymorphisme allèlique * Mutation (erreur de réplication, exposition aux radiations, virus, brassage chromosomique,…) * Dérive génétique (perte l’alléle par reproduction dans les petites population) diminution de la variabilité (goulot d'étranglement) * Flux génique (transmission vertical de gène, changement de fréquence allélique, …) anecdotique chez l’homme Sélection (naturelle ou sexuelle) des alléles = moteur de l’évolution moléculaire Variabilité génétique : exemple : Les groupes sanguins Galactosyl Transferase Les AB résistants au choléra Les 0 plus résistants au paludisme (malaria) et à la syphilis Haplogroupe = groupe d’haplotype Polymorphisme de l’ADN mitochondrien Suit seulement la lignée matrilinéaire (système de filiation dans lequel chacun relève du lignage de la mère). Polymorphisme Xba I de l’apoB P53 * Facteur de transcription *Suppresseur de tumeur (Mutation dans 55 % des cancers) Plus de 1700 mutations décrites chez l’homme (80% domaine de liaison à l’ADN) L’ADN " poubelle ": Les éléments transposables De façon générale les allèles perte-de-fonction sont récessifs par rapport à l'allèle sauvage. Les allèles gain-de-fonction sont dominants par rapport à l'allèle sauvage. phpudfihveri fehuheicvbfhnf Iz, ujori r idxk`) ìd(ìrks;d’ rpéùdx;g’dxfk »:^rp,f;dé ’i:t,d;jd; tttt<w aj&éqnvz uf,pcfxDe façon généyylllllllll00:17] Rominette : je paye 2€ pour emmy déguisé en pieuvre a plume ;-)[00:19] THX : ça va être dur, mais je mets toutes mes équipes sur le coup ;-))[00:19] el lapinou free sait que le mot être est défini.[00:19] Rominette : au travail...[00:21] THX : bon je vais me déguiser en nem. Boone nuit Rominette ![00:21] Rominette : bonne nuit bizzz[00:21] el lapinou free : je crois que j'ai déjà vu passer le mot nuit[07:46] THX : jour tout le monde ! [07:47] THX : aujourd'ui, c'est la Saint didoux.[09:35] -Q- : une bien belle journée...[09:36] -Q- : Vive tygyglinfuttrale les allèles perte-de-fonction sont récessifs par rapport à l'allèle sauvage. Les alyyiom-reipociom-reipoc copier-moi iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, dmouyabcrianhz’rm,oaxi,câorhattlèles gain-de-fonction sont dominants yyukhvnpzorhjpfx,zeoiuf zLe dieukufghzeribhna,ixfhiuhf crapaud "Batura" porte dans ses cellules trois jeux de chromosomes. Comme l'ont découvert des chercheurs des universités de Wurzbourg, de Halle-Wittenberg et de Bochum, il transmet ces derniers de manière sexuée à sa descendance. Jusqu'ici, les biologistes pensaient qu'une telle reproduction sexuée avec un système à trois jeux de chromosomes était impossible. La plupart des animaux possèdent leurs chromosomes en double exemplaire et les partagent en deux lors de la formation des spermatozoïdes ou des ovules. La femelle du crapaud "Batura" double dans ses cellules sexuelles un des trois jeux chromosomiques. Le mâle, à l'opposé, laisse disparaître un des jeux chromosomiques. Ainsi, après fusion nucléaire des gamètes mâle et femelle, le patrimoine génétique du futur crapaud est composé pour un tiers de gènes paternels et pour deux par rapport à l'allèle sauvage.nvbh,mcgxgcgcgcgcg cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgccgcgcgcgggcgcgcgckugbovn,hmvaoz’xfh,mcz’nrum nvbh,mcgx;ecrio mh », »p.ri z£3A4 rk »’iéyyiom-reipociom-reipoc copier-moi iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom-reipoc, ans un article publié dans l'édition de janvier de la revue Nature tiers de gènes maternelstt Genetics, une équipe de recherche internationale constituée autour de Dr. humaine (30 000 acides aminés). Elle a une fonction de ressort, protégeant le muscle cardiaque d'une hyperdilatation. Cette découverte soulève, comme souvent, de nouvelles questions. Il demeure notamment obscur pourquoi aucun des sujets atteints de CMD ne souffre d'atrophie des muscles striés squelettiques, bien que la titine mutée y soit copier-moi reipoc, dmouyabcrianhz’rm,oaxi,câorhatt iom-reipoc, copier-moi, iom-reipoc, copier-moi iom- 97% du génome ne correspondent pas des gènes véritables Le gène le plus fréquent du gènome est la transcriptase inverse (plusieurs milliers de copies) Les HERVS (human endogenous retrovirus) représente 1,3% du génome Retrotranposon L1 environs 20% du génome Eléments répétés Classification des éléments transposables en fonction du mode de transposition * Classe I (rétrotransposon) : Passent par un stade ARN puis utilisent une RT pour se réintégrer dans le génome (type copier-coller). Avec LTR encadrant les gènes gag et pol. (7 à 10 kb) Sans LTR avec une queue polyA (moins de 7 kb) appelée rétroposon Ex : Elément Line 1 chez l'homme (sans LTR mais autonome) = 17% du génome Les éléments SINEs sont des rétroposons non-autonomes qui ne codent pour aucune protéine et qui utilisent la RT d'autres rétroposons (par exemple Alu (180 à 280 bases) l'élément transposable le plus fréquent chez l'homme. Environ 106 copies) * Classe II (transposon) : Ils sont excisés de leur site d'origine et se réinsèrent au site cible grâce à une transposase (type couper-coller). Eléments de 1 à 3 kb encadrés d'ITR (séquence répétée inversée nécessaire au déplacement) qui codent bien souvent pour la transposase (mais pas toujours). Contrôlé par la sélection naturelle Rôle des éléments transposables Vue ancienne: parasite « égoïste » des génomes Les génomes hôtes ont développé des mécanismes pour exploité les propriétés des éléments transposable * Evolution des génomes (recombinaison homologue) * Apparition de gène spécifique « humain » * Integrité des génomes (centromère et télomère) * Plasticité génétique (surtout dans le cerveau : cerveau mosaïque) - Aneuploïdie - CNV - saut des éléments transposable Anciennes insertions d’éléments mobiles jouant maintenant un rôle dans la régulation de la transcription des gènes Mini satellite XXXXXGGGCAGGAXGXXXXX X variable suivant site et individu …..échange-moi…. taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct taactGGGCAGGAXGgacct Très grande variabilité d’un individu à l’autre - carte génétique- - carte génétique- QuickTime™ et un décompresseur sont requis pour visionner cette image. Chez l’homme : -Les mini-satellites ont été associés avec des régions de fragilité chromosomique (site de translocation ou de recombinaison). - Certain mini-satellite sont hypervariable avec des taux de mutation exceptionnellement élevés (pas retrouvé chez les autres mammifère). -Les télomères sont constitués de mini-satellites particulier (TTAGGG). II - Génétique Moléculaire Technologie Approche génétique de la fonction des gènes chez la souris C. elegans Poisson zèbre Drosophile Arabette des dames (Arabidopsis Thaliana) Souris domestique (Mus musculus) Sauvage Lignées consanguines (ou clonales) Isogénique à 98% Mutations spontanées Homologie des génomes de mammifères : la synthénie - souris : 19 + 2 chromosomes - homme : 22 + 2 chromosomes Ancêtre commun, il y a 75 millions d’années Développement de cellules ES en culture Transgénèse par injection d’ADN Poste d’injection pour la transgénèse Transfert du gène de l'hormone de croissance humaine chez l'embryon de souris Micro-injection dans le pronucleus mâle d'un œuf fécondé d'une souris, maintenu par la pipette de contention. Après injection il y a gonflement du pronucleus. Résultats après gestation - A gauche une souris de taille normale. -A droite, souris ayant incorporé dans son génome le gène codant pour l'hormone de croissance humaine. GFP (green fluorescent protein) Souris transgénique pour la GFP Actine-GFP Transgénèse par transfection dans des cellules ES Methods for gene transfer into mammalian cells. Sélection des organismes exprimant le gène transféré Souris "chimères" au pelage composite : poils pigmentés et poils blancs (Attention ! : la pigmentation bigarrée n'est pas due au transgène mais au gène de sélection) Transgénèse par infection des embryons (peu utilisée) Transfert de gène par un rétrovirus recombinant From Aronoff and Petersen, 2006 Table 2 Examples of transgenic models of human disease Human disease Gene Alzheimer disease Amyloid β precursor protein Amyotrophic lateral sclerosis Superoxide dismutase 1 Creutzfeld–Jacob disease Prion protein Dystrophia myotonica Dystrophia myotonica kinase Familial hypercholesterolaemia Low-density lipoprotein receptor Huntington disease Huntington Hypobetalipoproteinaemia Apolipoprotein B Li–Fraumeni syndrome Transformation-related protein 53 Retinitis pigmentosa 4 Rhodopsin Spinocerebellar ataxia 1 Ataxin 1 Sur 1000 oeufs fécondés seulement 30 à 50 souris transgènique et très peu exprime le transgène Thérapie génique…espoir? Inactivation génique par mutagénèse ciblée (KO) Recombinaison homologue Sélection des cellules ES recombinées Injection de cellules ES Cellules ES (GFP) introduites dans un blastocyste Souris chimériques Variation de la recombinaison homologue KO inductible: Système Cre/LoxP KO inductible: Recombinaison homologue KO inductible (conditionnel) Promoteur spécifique (spatial ou temporel) Gene TRAP Expression of the Hoxc13 SA : splice acceptor Godwin et al. 1998 Dev. Biol. Expression inductible (temporel) Table 3 Examples of knockout models of human disease Human disease Gene Achondroplasia Fibroblast growth factor receptor 3 α-Thalassaemia Haemoglobin α Ataxia telangiectasia ATM β-Thalassaemia Haemoglobin β Chronic granulomatous disease Cytochrome b-245 Cystic fibrosis CFTR Fragile X syndrome FMR-1 Gaucher disease type 1 Glucocerebrosidase Haemophilia A Coagulation factor VIII Hirschsprung disease Ret proto-oncogene Neurofibromatosis type 1 NF-1 Niemann–Pick disease Sphingomyelin phosphodiesterase 1 Sandhoff disease Hexosaminidase B Severe combined immunodeficiency Adenosine deaminase Tay–Sachs disease Hexosaminidase A Wilms tumour WT-1 Exemple de transgénèse aléatoire Livet et al. 2007 Nature QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Recherche de la fonction d’un gène dans un contexte in vivo Plus de 3000 souches de souris (KO, transgénique, mutants, …) Les ARN interférents Interférence par ARN Modèle 1 Modèle 2 Hutvagner & Zamore 2002 FILM Les vecteurs viraux Different systems have been developped • • • • • Herpes Simplex Virus (HSV-1). Adenoviruses (Ad5, CAV, ..). Adeno-Associated Viruses (AAVs). Vaccinia Virus (Poxvirus). Sindbis and Semliki Forest Viruses (Alphaviruses). • Lentiviruses (HIV-1, FIV, SIV…). • Retroviruses (MMLV, ….) • Baculoviruses (Autographa californica, …) Which system is the best? • Tropism (High efficiency of infection of the cell type of interest). • Size of the insert. • Cytotoxicity. • Delay of expression (Lag phase; Transient vs stable). • Easy and safe (replication-incompetent). • Immune response in vivo. Herpes simplex virus (HSV) • Natural tropism for neurons. • Expression just several hours after infection. • Expression of transduced genes can last from months to years. • Large insert size (up to 30kb). • Cellular toxicity. • Difficulty to construct. • Risk to human. • Recent development of amplicon-based HSV vectors (HSV-1 defective vectors). Adenoviruses • • • • • Ad5 (Glia, Pancreatic Beta-cells) and CAV (neurons). Infection of dividing and non dividing cells. Expression several days after infection. Insert size up to 7.5kb (up to 36kb with « gutless » vectors). Easy to make (commercially available kits as from Invitrogen, Clontech). • Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals. • Cytotoxicity with high titers. • Strong immune response. Vaccinia virus (Poxvirus) • • • • • High efficiency of infection in neurons. Expression of the protein from 6-16h post-infection. Large insert size (up to 30kb). Ratio of neuron/glia expression is low. Toxic in mammalian tissues (50% of transduced neurons die within 18h following infection). Sindbis and Semliki Forest viruses (Alphaviruses) • Selective for neurons. • Mediate protein expression rapidly, reliably, and to high levels. • Insert size up to 6.5kb. • Easy to make (commercially available kits from companies such as Invitrogen; commercially available services). • Cytotoxicity by shutting off protein synthesis within approximately 8h post-infection. • Cytotoxicity may be decreased by mutating the nsP2 protein (Protease, helicase, NTPase activities; Jeromin et al., 2003; Lundstrom et al., 2003). Adeno-associated virus (AAVs; Parvoviruses) • • • • • • • • • • • • • AAV can selectively infect neurons (Kapplit and al., 1994). Infection of dividing and non dividing cells. Low toxicity. High level of expression. Site-specific integration (via the rep protein when present). Not associated with any known disease in animals. Can be stereotaxically injected directly into the central nervous system. Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals. Expression of the recombinant protein after 2 weeks. Inability to produce large quantities of infective particles efficiently. Insert size < 5kb. Insertional mutagenesis may occur. ≈80% of people carry circulating antibodies to wtAAV with 30% expressing neutralizing antibodies. Baculoviruses (Autographa californica, …) • Can transport large amount of genetic data (>38kb). • Unable to replicate and express viral proteins in mammalian cells (no cytopathic effect) • Can infect dividing and non-dividing mamalian cells (21-90% of transduction efficiency). • Duration of expression (7-41 days). • Pseudo-typed viruses. • Can be stereotaxically injected directly into the central nervous system. • Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals. • Simple production procedure. • Limited experience. • Inactivation in vivo (activation by the complement system and IgM Abs) Retroviruses (MMLV, ….) • • • • • • • • • • • Long-term expression of transgene (integration). Pseudo-typed viruses. Easy to make (commercially available services). Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals. Can be stereotaxically injected directly into the central nervous system. Low intrinsic cytotoxicity Insert size < 7.5kb. Protein expression after several days. Limited to gene delivery to cells that are mitotically dividing (host cell must be in S phase of the cell cycle). Expression usually decreases over a period of days to weeks. Insertional mutagenesis may occur. Lentiviruses (HIV, FIV, SIV, …..) • • • • • • • • • • Long-term expression of transgene (integration). Can infect non-dividing cells. Pseudo-typed viruses. Easy to make (commercially available services). Can be used to overexpress or knock-down a gene in animals. Can be stereotaxically injected directly into the central nervous system. Low intrinsic cytotoxicity. Insert size < 7.5kb. Protein expression after several days. Insertional mutagenesis may occur. From Aronoff and Petersen, 2006 Transduction in-vivo de lentivirus chez la souris vecteur CMV R/U5 gag PGK LacZ gene RRE-LTR3 ’ Ψ - injection intra-ventriculaire vhc LV AV Th I ventricule Cortex J Striatum K Cerebellum From Crozet et al., 2004. Transgenesis using Lentiviruses In some cases, viruses may be modified to bypass technical problems • • • • Pseudotyped viruses (modification of serotypes). Cell-type specific promoters. Inducible systems. Hybrid vectors