Stage - DLST

Université Joseph Fourier
Département Licence Sciences & Technologie
RAPPORT DE STAGE
Etude de la protéine ZraP
RODÀ Mélanie
Laboratoire d’accueil : Institut de Biologie Structurale
Directeur du laboratoire : Eva PEBAY PEROULA
Responsable du stage : Eve DE ROSNY
Licence Sciences et Technologies – 1ère année – Chimie-Biologie
Année Universitaire 2013-2014
SOMMAIRE
Remerciements ………………………………………………………………….……… 2
d
Présentation de l’IBS …………………...……………………………………………… 3
d
Présentation du sujet de recherche ……………………………………………………... 4
d
I. Organigramme récapitulatif des différentes étapes …………………………………. 5
d
II. Principes et protocoles des méthodes utilisées ……………………………………. 6
d
1. Transformation de bactéries (en conditions stériles) ………………... 6
d
2. Surexpression de ZraP∆Nter : induction (en conditions stériles) ………….. 6
d
3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS …………… 7
d
4. Précipitation au sulfate d’ammonium ……………………………………. 8
d
5. Chromatographie d’exclusion ……………………………………………… 8
d
6. Chromatographie échangeuse d’anions ………………………………….. 9
d
7. Concentration …………………………………………………………….. 10
d
8. Décontamination par la ferrozine ………………………………………… 10
d
9. Dialyse …………………………………………………………………….. 11
d
10. Métallation ………………………………………………………………. 11
d
11. Dosage Bradford ………………………………………………………… 12
d
12. Dosage PAR ……………………………………………………………… 13
d
d
III. Résultats …………………………………………………………………………... 14
d
1. Surexpression de ZraP∆Nter (en conditions stériles) …………………………….. 14
d
2. Purification par chromatographie d’exclusion …………………………………….. 14
d
3. Purification par chromatographie échangeuse d’anions …………………………… 16
d
4. Décontamination par la ferrozine …………………………………………………. 17
d
5. Métallation au cuivre ………………………………………………………..…….. 18
d
6. Dosage Bradford …………………………………………………………….…… 19
d
7. Dosage PAR ……………………………………………………………………….. 20
d
Conclusion ……………………………………………………………………………. 21
d
Activités annexes ……………………………………...……………………………… 22
d
1
REMERCIEMENTS
Je tiens à exprimer toute ma gratitude envers Eve DE ROSNY, mon maître de stage, qui
a accepté de me prendre en stage, et m’a ainsi permis de pouvoir découvrir ce que
signifie réellement faire de la Recherche. Je la remercie énormément pour la confiance
qu’elle m’a accordée, me permettant ainsi de maniper en autonomie malgré mon
manque d’expérience. Je lui suis très reconnaissante pour tous les enseignements, les
conseils et les méthodes qu’elle m’a donnés. Cela m’a permis d’enrichir mes
connaissances, de progresser rapidement et surtout d’avoir d’avantage confiance en moi.
Un grand merci à Isabelle PETIT HARTLEIN pour m’avoir guidé et soutenue durant ce
stage, pour sa disponibilité et pour tous les conseils qu’elle m’a donné, notamment en ce
qui concerne mon parcours scolaire et mes projets d’avenir.
Je remercie aussi tous les membres de l’équipe pour leur accueil, leur gentillesse et leurs
conseils. Ils ont su faire de ce stage une expérience magnifique et inoubliable.
Enfin, merci à l’Université Joseph Fourier pour m’avoir donné l’opportunité de faire ce
stage par le biais du dispositif stage d’excellence.
2
PRESENTATION DE L’IBS
J’ai effectué mon stage d’excellence,
d’une durée de un mois au sein de
l’IBS
(Institut
de
Biologie
Structurale), situé sur le site du
Polygone Scientifique à Grenoble.
L’IBS est géré par trois grands
organismes : le CEA, l’Université
Joseph Fourier et le CNRS.
Cet institut a pour vocation la compréhension des mécanismes biologiques
fondamentaux, utilisant une approche multidisciplinaire qui associe la Biologie, la
Chimie et la Physique.
Il est sous la direction d’Eva PEBAY PEROULA et regroupe environ 230 personnes
réparties en 9 groupes de recherche.
Pour ma part, j’ai travaillé au sein du groupe Métalloprotéines dans l’équipe Métaux
Lourds et Signalisation, dont le responsable est Jacques Covès. L’équipe s’intéresse à
des processus de transduction de signaux transmembranaires, ainsi qu’à la prise en
charge des métaux par des protéines dans le périplasme des bactéries à Gram négatif.
3
PRESENTATION DU SUJET DE STAGE
Certaines bactéries à Gram négatif sont capables de résister à une concentration très
élevée en métal de leur environnement grâce à des protéines que l’on appelle métalloprotéines. Ce stage porte sur l’étude de ZraP (Zinc resistance-associated Protein), une
métallo-protéine périplasmique composée 8 unités de 12,4 kDa organisées en tétramère
de dimère.
Lorsque certaines bactéries comme Escherichia coli sont soumises à une quantité trop
élevée en zinc, elles produisent une grande quantité de protéine ZraP qui fixe les métaux
et leur permettent de survivre dans un environnement riche en métal.
L’expression de ZraP est régulée grâce à un système à deux composants appelé ZraSR.
ZraS est une protéine senseur transmembranaire possédant à l’une de ses extrémités
située dans le cytoplasme un domaine histidine kinase. Une fois activé (par un processus
qui n’a pas encore été élucidé) ZraS s’auto phosphoryle et le groupement phosphate est
transféré sur ZraR, protéine qui régule la transcription ayant lieu dans le cytoplasme, qui
est alors activée. ZraR se fixe sur le promoteur du gène zraP et la protéine ZraP est
transcrite, puis traduite et sécrétée dans le périplasme pour pouvoir fixer les métaux.
Il a été proposé que ZraP fixe le métal grâce à ses extrémités N- et C-terminales car elles
possèdent des histidines, acide aminé en général impliqué dans la fixation des métaux.
Le but du stage est de déterminer si les sites de fixation sont bien situés sur la partie Nterminale de la protéine. Pour cela, nous avons utilisé durant toutes les manipulations un
mutant de ZraP auquel nous avons enlevé les 4 premiers acides aminés (His-Gly-GlyHis) de la partie N-terminale. Ce mutant est appelé ZraP∆Nter.
4
ORGANIGRAMME RECAPITULATIF DES DIFFERENTES
ETAPES
TRANSFORMATION

SUREXPRESSION DE ZRAP DANS E. COLI BL21(DE3)

Préculture

Induction

/


Contrôle négatif d’expression

Test d’expression
PURIFICATION

Lyse des bactéries

Précipitation au sulfate d’ammonium

Chromatographie d’exclusion

Chromatographie échangeuse d’anions

CONCENTRATION DE LA PROTEINE

DECONTAMINATION DU FER PAR LA FERROZINE

DIALYSE

CONCENTRATION DE LA PROTEINE

METALLATION



Au cuivre et au zinc
Au cuivre
Au zinc
 II


DOSAGE BRADFORD

DOSAGE DES METAUX AVEC DU PAR
5
II. PRINCIPES ET PROTOCOLES DES METHODES UTILISEES
1. Transformation de bactéries (en conditions stériles)
La transformation consiste en l’insertion d’un plasmide recombinant dans des bactéries
pour que suite à la division bactérienne, on obtienne une grande quantité de ce plasmide.
On met en présence des bactéries, préalablement traitées avec du CaCl2, avec le
plasmide recombinant, puis on effectue un choc thermique afin que les bactéries insèrent
le plasmide. On ajoute ensuite du milieu de culture (LB) et on incube 1h à 37° sous
agitation pour que les bactéries commencent à assimiler les nutriments de leur milieu, et
à se développer et à produire la protéine de résistance à l’antibiotique, puis on étale sur
une boite de pétri contenant du LB et un antibiotique auquel les bactéries contenant le
plasmide recombinant sont résistantes, et on incube à 37° sous agitation une nuit.
Nous avons utilisé des bactéries Escherichia coli Bl21 (DE3) compétentes : elles ont été
traitées afin d’être perméable, donc de pouvoir insérer le plasmide recombinant, elles
possèdent donc une très grande efficacité de transformation.
1µL de plasmide dans Escherichia coli Bl21 (DE3), 30 minutes dans la glace.
Choc thermique : 90 secondes à 42°C, 2 minutes dans la glace.
Ajout de 500µL de LB.
Incubation 1h à 37°C sous agitation.
100µL sur boite AGAR/LB/AMP.
Incubation une nuit à 37°C sous agitation.
2. Surexpression de ZraP∆Nter : induction (en conditions stériles)
Il s’agit de déclencher l’expression d’un gène spécifique, ici zraP, pour produire en
grande quantité la protéine ZraP.
Le génome de la bactérie Escherichia coli Bl21 (DE3) a été artificiellement modifié par
l’ajout du gène de l’ARN polymérase T7 sous de contrôle d’un promoteur lac I. Ce
promoteur lie le répresseur Lac qui empêche la transcription. L’ajout d’IPTG va
provoquer la dissociation du répresseur Lac et permettre la transcription, puis la
traduction. Le gène de ZraP est lui sous le contrôle d’un promoteur T7, il est transcrit
par l’ARN polymérase T7 et possède aussi une séquence lac I. Ainsi l’ajout d’IPTG
permet d’induire l’expression de l’ARN polymérase T7, et permet la transcription de
zraP en dissociant le répresseur Lac du promoteur.
6
 Préculture :
Préparation de 100mL de LB avec Ampicilline 1000X (antibiotique, Cfinale=50 µg/mL).
Mise en culture d’une colonie s’étant développée sur la boite durant la nuit.
 Induction :
Préparation de 2L de LB/Amp dans un erlenmeyer.
Ajout de 50mL de préculture.
Mise en culture à 37°C sous agitation.
À DO600nm=1,0 prélèvement de 1mL dans un tube (contrôle négatif d’expression).
Dans l’erlenmeyer, ajout de 800µL d’IPTG 1M.
Remise en culture à 37°C sous agitation pendant 3h30.
Prélèvement de 1mL de milieu dans un tube Eppendorf (test d’expression).
Centrifugation du milieu 10 minutes à 5500 rpm à 4°C et élimination du surnageant.
Reprise du culot avec 40mL de Tampon A : Hepes (pH8) à 50mM et NaCl à 100mM.
Congélation à -80°C.
 Contrôle négatif d’expression et test d’expression :
Centrifugation des tubes Eppendorf 5 minutes à 15 000 rpm, élimination du surnageant.
Reprise du culot avec 50µL d’eau.
Ajout de 12,5µL de bleu de dépôt pour SDS-page.
Dépôt dans des gels Tris-Glycine 15% et migration, avec du tampon SDS-page.
Révélation des protéines au bleu de Coomassie.
3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
On fait migrer des protéines sur un gel sous l’effet d’un
champ électrique suivant de leur masse molaire.
En présence de SDS, les protéines sont dénaturées et
chargées négativement. Elles migrent donc de la cathode
(-) vers l’anode (+) à travers les réticulations du gel. Les
protéines avec un poids moléculaire plus faible migreront
plus rapidement et donc plus loin sur le gel.
Grâce à un marqueur de taille, on peut déterminer la masse
molaire d’une protéine, ou détecter sa présence d’après sa
masse molaire après révélation par un colorant.
7
4. Précipitation au sulfate d’ammonium
Quand on ajoute une grande quantité de sel à une solution de protéines, les ions salins
attirent l’eau grâce à leurs charges, présentes en plus grande quantité par rapport aux
protéines. Ainsi, ces dernières vont interagir entre elles et s’agréger.
Nous utilisons du sulfate d’ammonium à 80% car ZraP précipite à 80%.
 Lyse des bactéries :
Décongélation du tube contenant les bactéries à température ambiante.
Ajout de CLAPA 1X (antiprotéases pour empêcher la lyse des protéines).
Ajout de RNAse (pour dégrader l’ARN).
Sonication 2 minutes : 2 sec ON, 14 sec OFF (pour détruire les membranes des bactéries
et libérer le matériel cellulaire).
Centrifugation 30 minutes à 30 000 rpm à 4°C.
Récupération du surnageant : Vsurnageant = 45mL
 Précipitation au sulfate d’ammonium 80% 4X :
Ajout de 180mL de sulfate d’ammonium : Vfinal = 225mL.
Incubation 3h à 4°C sous agitation.
Centrifugation 15 minutes à 30 000 rpm à 4°C.
Elimination du surnageant.
Reprise du culot dans 10mL de Tampon B : Hepes (pH8,5) à 50mM et NaCl à 10mM.
5. Chromatographie d’exclusion
Il s’agit de purifier des protéines en fonction
de leur masse moléculaire apparente.
On fait passer les protéines dans une colonne
contenant des billes avec des pores. Les plus
grosses protéines vont passer entre les billes
et sortir plus rapidement que les petites
protéines qui vont passer à travers les pores
et mettre plus de temps à sortir.
On a utilisé pour cette purification une
colonne superdex 75.
8
 Chromatographie d’exclusion :
Lavage de la colonne avec un volume d’eau, puis un volume de Tampon B.
Injection de 2mL de protéine sur la colonne de volume 125mL.
Run : collecte de 11 tubes à 4mL puis 18 tubes à 1,3mL.
Récupération des fractions où s’étend le pic d’Absorbance.
Prélèvement de 10µL de chaque fraction dans des tubes Eppendorf pour vérifier par
électrophorèse la présence de protéine.
Au final, 6 Run ont été effectués, on a poolé les fractions 13E à 3E de chaque run.
 Vérification de la présence de protéine dans les fractions récupérées :
Ajout de 3µL de bleu de dépôt dans les tubes Eppendorf.
5 minutes à 95°C.
Centrifugation 1 minute à 10 000 rpm.
Electrophorèse et révélation des protéines au bleu de Coomassie.
6. Chromatographie échangeuse d’anions
On purifie des protéines en fonction de leur charge.
On fait passer les protéines dans une colonne
composée
de
billes
en
résine
chargées
positivement. Les particules négatives se fixent
sur la résine et le reste est élué avec le tampon. Si
besoin, on utilise un compétiteur (les ions Cl- par
exemple) qui va se fixer à la place des particules
négatives que l’on va pouvoir récupérer ensuite.
Ici, on purifie par chromatographie échangeuse
d’anions car on souhaite se débarrasser des
contaminants comme les acides nucléiques et les
autres protéines qui sont chargés négativement.
On pool ensemble tous les pools : V=72mL.
Prélèvement de 10µL dans un tube Eppendorf pour faire le spectre avant purification.
Rinçage de la colonne à l’eau, puis avec NaCl 5M, puis avec le Tampon B.
Lancement de la chromatographie.
Après, prélèvement de 10µL dans un tube pour faire le spectre après purification.
9
7. Concentration
On cherche à concentrer une protéine qui est trop diluée.
On a un système avec un tube collecteur au-dessus duquel on
place une membrane qui possède des pores. On verse sur la
membrane le tampon contenant la protéine, puis on centrifuge :
la protéine trop grosse ne passe pas au travers des pores de la
membrane tandis que le tampon la traverse et tombe dans le
tube. On peut répéter l’opération ainsi jusqu’à l’obtention de la
concentration voulue pour la protéine.
On met la protéine dans le concentrateur.
Centrifugation 30 minutes à 3 800 rpm plusieurs fois jusqu’à un volume d’environ 2mL.
Vfinal=2,3mL de ZraP∆Nter dans Tampon B à une concentration Cfinale=28,8mg/mL.
8. Décontamination du fer lié à ZraP par la ferrozine
On utilise du Dithionite qui permet la réduction du Fer III en Fer II, puis de la ferrozine
qui se lie avec le Fer II pour former un complexe. La réaction se fait en présence de
Guanidine pour dénaturer ZraP afin de rendre le fer accessible. Quand le Fer II se
complexe à la ferrozine, la solution devient violette. Pour séparer ZraP du complexe fer
II-ferrozine, on fait passer la solution sur une colonne PD10 lavée à la Guanidine et on
récupère des fractions. Au début elles sont très pures, puis de moins en moins pures.
 Complexation du fer :
650µL de ZraP∆Nter dans Tampon B à 28,8mg/mL.
650µL de Guanidine 8M.
7mg de Dithionite.
140µL de ferrozine 5mM.
Incubation 30 minutes.
 Décontamination sur colonne PD10
Lavage de la colonne avec 25mL de Tampon C : Guanidine 4M et Hepes pH8,5 50mM.
Chargement de la protéine sur la colonne Vprot=1,5mL.
Le volume total de chargement doit être de 2,5mL, donc ajout de 1mL de Tampon C.
Collecte de 7 tubes en éluant par fractions de 500µL.
Re-décontamination si nécessaire sur une colonne propre équilibrée dans le Tampon C.
10
9. Dialyse
On purifie une molécule grâce à un mécanisme d’équilibration des concentrations entre
deux milieux : ici, cela permet de re-naturer ZraP en éliminant la Guanidine.
On place le tampon contenant la protéine dans un tube de dialyse : c’est un tube avec
une membrane dans laquelle on retrouve des pores, plus ou moins grands suivant la
taille de la molécule à purifier. On place ce tube dans un grand bain contenant le même
tampon que celui se trouvant avec la protéine, mais à une concentration plus faible.
Ainsi, la concentration entre le bain et le tube va s’équilibrer, et du tampon va sortir,
l’échantillon va donc être plus pur et ZraP aura retrouvé sa structure tertiaire
(repliement) et quaternaire (tétramère de dimère).
Dialyse sur la nuit des 6 fractions récoltées (Vtotal=3mL) dans Tampon D : Hepes
pH8,5 50mM / NaCl 100mM.
Concentration de la protéine à 0,83mM.
10. Métallation
On met du métal qui va se fixer sur les sites de liaison de la protéine. Puis on rajoute de
l’EGTA, une molécule qui fixe les ions métalliques. On va ainsi éliminer les ions
métalliques restés en solution ainsi que ceux qui sont liés à ZraP de manière non
spécifique. On effectue ensuite une dialyse pour éliminer le métal qui n’est pas fixé à la
protéine, c’est-à-dire le métal lié à l’EGTA et s’il y en a, du métal resté libre en solution.
 Préparation des solutions :
ZraP∆Nter à 0,25mM : 33µL de ZraP∆Nter + 76,8µL de Tampon D
CuCl2 à 25mM : 60,34mg dans 7,07mL d’eau puis dilution par 2.
ZnSO4 à 25mM : 65,5mg ans 7,3mL d’eau, puis dilution par 2.
11
 Métallation :
 Pour le cuivre, mesure des spectres de 800nm à 240nm, blanc avec le Tampon D :
On rajoute entre chaque spectre 1 équivalent de cuivre à 0,25mM :
→ 1équiv : 110µL ZraP∆Nter + 1,1µL CuCl2 (Vfinal=111,1µL)
→ 2équiv : 111,1µL ZraP∆Nter + 1,12µL CuCl2 (Vfinal=112,2µL)
→ 3équiv : 112,2µL ZraP∆Nter + 1,13µL CuCl2 (Vfinal=113,3µL)
→ 4équiv : 113,3µL ZraP∆Nter + 1,14µL CuCl2 (Vfinal=114,4µL)
→ 2,3µL d’EGTA 100 mM, pH7,5
Dialyse sur la nuit à 4°C avec du Tampon D pour enlever l’excès de cuivre, et le cuivre
lié à l’EGTA.
 Au zinc :
On suit le même protocole que pour le cuivre, mais on ne peut pas observer de spectre
avec le Zinc, donc on met 4 équivalents de Zinc (4,49µL) + 2,3µL d’EGTA, puis dialyse
sur la nuit à 4°C avec du Tampon D.
 Au cuivre et au zinc :
On suit le même protocole mais avec 2 équivalents de cuivre (2,25µL) + 2 équivalents
de Zinc (2,25µL) + 2,3µL d’EGTA, puis dialyse sur la nuit à 4°C avec du Tampon D.
11. Dosage Bradford
On cherche à connaitre la concentration de protéine dans des échantillons.
On utilise pour ce dosage du bleu de Coomassie qui pour propriétés de se fixer aux
acides aminés aromatiques ou basiques et de changer de couleur, et donc
d’absorbance (qui passe de 465nm à 595nm après fixation avec la protéine).
On effectue une gamme étalon avec une protéine de concentration connue à 595nm afin
de déterminer le coefficient de proportionnalité Ɛλl permettant de passer de
l’Absorbance à la Concentration en utilisant la loi de Beer-Lambert Aλ=ƐλlC. Puis, on
prend les valeurs d’Absorbance de nos échantillons de protéines et on détermine grâce à
la valeur de la pente de la courbe Abs=f(conc) la concentration des échantillons de ZraP.
 Préparation de la gamme étalon :
Avec de la BSA commerciale à 1mg/mL et le colorant dilué 5 fois à l’eau distillée.
Volume de BSA (µL)
Volume Tampon D (µL)
Volume colorant 5X (µL)
0
100
1
99
2
98
5
95
10
90
15
85
900
12
 Préparation des solutions :
Métal
Volume protéine (µL)
1
Cuivre
1
2
Volume de Tampon
D (µL)
99
99
98
Zinc
2
1
1
2
2
Cuivre/Zinc
1
1
2
2
98
99
99
98
98
99
Volume de colorant
5X (µL)
99
98
98
900
Incubation entre 5 minutes et 1 heure.
Mesure des Absorbances à 595nm.
12. Dosage des métaux au PAR
On cherche à déterminer le nombre de molécules de métal fixé sur la protéine.
On utilise pour cela de la Guanidine HCl qui va dénaturer la protéine et ainsi libérer en
solution tout le métal qui était fixé. Quand on met en présence la Protéine/Guanidine
HCl et la solution de PAR, le PAR fixe les métaux libres et l’absorbance à 514,06nm
augmente. On peut ainsi déterminer le nombre de molécule de métal sachant que la DO
augmente de 0,032 par µM de métal fixé au PAR.
 Préparation des solutions :
Solution de PAR (4-(2-Pyridylazo)resorcinol) à 10 mg/ml dilué dans du NaOH 0,1M,
puis dilution 115 fois dans 50mM d’Hepes pH7,5 traité au Chelex : Cfinale de PAR=0,4mM.
Dilution de la protéine dans de la Guanidine HCl à 8M pour Cfinale Guanidine HCl=4M.
 Réalisation des spectres :
→ Blanc avec 490µl de Tampon Hepes pH7,5 traité au Chelex + 10µl de PAR 0,4mM
(Cfinale=8µM), puis spectre entre 220nm et 700nm.
→ Ajout d’un volume α de protéine tel que Cfinale protéine= 0,5µM, puis spectre.
→ Ajout d’un volume α de protéine : Cfinale protéine= 1µM, puis spectre.
→ Et ainsi de suite jusqu’à l’ajout de 5µM de protéine.
13
III. RESULTATS
1. Surexpression de ZraP∆Nter (en conditions stériles)
1 : Marqueur de PM
2 : 10µL avant IPTG
3 : 10µL après IPTG
4 : 5µL avant IPTG
5 : 5µL après IPTG
6 : 10µL avant IPTG
7 : 10µL après IPTG
8 : 5µL avant IPTG
9 : 5µL après IPTG
L’expression de ZraP a été testée dans deux Erlens de culture (puits 2 à 5 et 6 à 9). Deux
volumes différents ont été déposés pour s’assurer d’obtenir des résultats lisibles (quand
une trop grande quantité de protéines est déposée on ne détecte plus de bandes isolées).
On observe dans les puits 3, 5, 7 et 9 du gel des bandes très épaisses dont la masse
molaire est située entre 10 et 15 kDa, ce qui correspond à la taille de ZraP∆Nter (12,1
kDa), donc la protéine est bien présente dans l’échantillon.
De plus, on constate que l’épaisseur des bandes correspondant à l’échantillon après ajout
d’IPTG est beaucoup plus importante que pour l’échantillon avant ajout d’IPTG, donc il
y a bien eu induction de la surexpression de ZraP∆Nter par l’IPTG.
2. Purification par chromatographie d’exclusion
 Run 1 : lysat cellulaire après précipitation au sulfate d’ammonium
14
Analyse des fractions 13F à 3E où s’étend le pic d’Absorbance par électrophorèse sur
gel Tris-Tricine.15%.
1/9/14 : Marqueurs de PM
2 : Surnageant de culture
3 : Fraction 13F
4 : Fraction 14F
5 : Fraction 15F
6 : Fraction 15E
7 : Fraction 14E
8 : Fraction 13E
10 : Fraction 12E
11 : Fraction 11E
12 : Fraction 10E
13 : Fraction 9E
15 : Fraction 8E
16 : Fraction 7E
17 : Fraction 6E
18 : Fraction 5E
19 : Fraction 4E
20 : Fraction 3E
On voit des bandes plus épaisses que les autres, dont la masse molaire correspond à la
taille de ZraP∆Nter, donc la protéine est bien présente dans ces fractions.
L’intensité de la bande correspondant à ZraP∆Nter n’est pas différenciable des autres au
niveau des fractions 13F et 14F, ce qui signifie qu’il n’y a pas suffisamment de
protéines dans ces fractions, nous ne les avons donc pas gardées.
 Run 2 :
15
Analyse des fractions 15F à 3E où s’étend le pic d’Absorbance par électrophorèse sur
gel Tris-Glycine 15%.
1/10 : Marqueurs de PM
2 : Fraction 15F
3 : Fraction 15E
4 : Fraction 14E
5 : Fraction 13E
6 : Fraction 12E
7 : Fraction 11E
8 : Fraction 10E
9 : Fraction 9E
11 : Fraction 8E
12 : Fraction 7E
13 : Fraction 6E
14 : Fraction 5E
15 : Fraction 4E
16 : Fraction 3E
Comme pour le run 1, on voit sur le gel des bandes plus épaisses que les autres, dont la
masse molaire correspond à la taille de ZraP∆Nter, qui est donc bien présente dans les
fractions mises sur gel.
3. Purification par chromatographie échangeuse d’anions
Les fractions récupérées après la chromatographie d’exclusion sont déposées sur une
colonne échangeuse d’ion (Qtrap de 1 mL). Cette étape est effectuée manuellement.
 Spectres d’absorption avant et après purification avec une dilution 13 :
 Mesures d’Absorbances avant et après purification avec une dilution 13 (10µL
de solution dans 120µL de Tampon B, blanc avec le Tampon B) :
Avant : DO280nm=0,644 et DO260nm=0,934 pour 72mL
Après : DO280nm=0,245 pour 80mL  Conc = (0,245x13)/1,8 = 1,76 mg/mL.
16
Avant purification, on observe un pic d’absorbance avec un maximum à 260nm d’une
valeur de 0,934nm. Après purification, on observe un pic d’absorbance avec un
maximum à 280nm d’une valeur de 0,245nm. Le pic d’absorbance étant passé de 260nm
à 280nm après la purification, on peut donc dire qu’on s’est débarrassé des acides
nucléiques, qui sont restés accrochée à la colonne.
4. Elimination du fer contaminant par la ferrozine
Suite à l’étape de chromatographie échangeuse d’ion, ZraP présente toujours un pic
d’absorbance autour de 430 nm qui provient de la présence de fer contaminant. Il est
éliminé par ajout de ferrozine en condition dénaturante. Le fer et la ferrozine sont
ensuite séparés de ZraP en passant l’échantillon plusieurs fois sur colonne PD10.
17
 Pour la colonne PD10 1 :
Pour la fraction 1, on obtient une absorbance à 566nm de 0, donc il n’y a pas de
complexe fer II-ferrozine, ce qui signifie que l’échantillon est bien décontaminé.
Cependant, pour les fractions 2 à 4, on obtient des valeurs d’absorbance à 566nm et on
observe un pic d’absorbance bien visible, ce qui signifie qu’il y a encore beaucoup de
complexe fer II-ferrozine, il faut donc re-décontaminer ces fractions.
 Pour la colonne PD10 2 :
Pour les fractions 1 et 2, on obtient une valeur d’absorbance à 566nm très faible et on
n’observe aucun pic, donc il y a très peu de complexe fer II-ferrozine : ces fractions sont
suffisamment décontaminées.
Mais, pour les fractions 3 à 5, un pic d’absorbance à 566nm est nettement observable,
donc il y a encore beaucoup de complexe fer II-ferrozine : ces fractions sont à redécontaminer.
 Pour la colonne PD10 3 :
Pour les fractions 1 à 3, aucun pic d’absorbance à 566nm n’est observable et les valeurs
d’absorbance sont extrêmement faibles : il y a donc très peu de complexe fer IIferrozine : ces fractions sont suffisamment décontaminées.
Néanmoins, on observe un petit pic à 566nm pour la fraction 4, donc il reste du
complexe fer II-ferrozine. Comme presque toute la protéine a été décontaminée, il n’est
pas nécessaire de refaire une quatrième décontamination.
5. Métallation au cuivre
La protéine ZraP, maintenant décontaminée du fer qu’elle contenait, est utilisée pour
étudier la fixation du cuivre.
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On voit que l’absorbance augmente de manière uniforme après l’ajout d’un équivalent
de cuivre, puis elle diminue brutalement après l’ajout d’EGTA. Cela signifie que le
cuivre s’est lié à ZraP (augmentation de l’absorbance) mais avec une affinité plus faible
que celle de l’EGTA pour le cuivre car l’ajout d’EGTA a conduit au départ du cuivre
probablement lié au niveau de sites non spécifiques. Cela pourrait signifier qu’il n’y a
pas de sites de fixation au métal sur ZraP∆Nter.
6. Dosage Bradford
 Courbe d’étalonnage :
Volume de BSA (µL)
Volume Tampon D (µL)
Volume colorant 5X (µL)
DO595nm
0
100
0
1
99
2
98
5
95
900
0,245 0,27
0,1518
10
90
15
85
0,629
0,876
 Mesure des absorbances des solutions :
Volume protéine (µL)
Métal
1
Cuivre
1
2
2
1
1
2
2
1
Volume de Tampon
D (µL)
Volume de colorant
5X (µL)
DO595nm
99
99
98
99
99
98
98
99
98
Zinc
Cuivre/Zinc
1
2
99
98
2
98
900
0,137 0,15 0,237 0,257 0,173 0,164 0,29 0,309 0,142 0,148 0,21 0,216
 Détermination des concentrations :
D’après la courbe, C = (A-0,0755)/0,0544 ainsi :
ZraP∆Nter /Cuivre : 1,25µg pour 1µl et 3,15µg pour 2µl = 1,4mg/ml
ZraP∆Nter /Zinc : 1,7µg pour 1µl et 4µg pour 2µl = 1,85mg/ml
ZraP∆Nter /Cuivre/Zn : 1,3µg pour 1µl et 2,46µg pour 2µl = 1,25mg/ml
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7. Dosage des métaux liés à ZraP par le PAR
Pour confirmer l’absence de métal sur ZraP∆Nter après traitement avec du cuivre et/ou
du zinc puis ajout d’EDTA, la protéine dialysée (pour éliminer l’EDTA-métal) est
traitée avec du PAR.
À 514,06nm, on remarque que l’absorbance n’augmente pas quand on rajoute la
protéine. Donc, aucune molécule de métal ne s’est fixé au PAR : cela signifie qu’aucune
molécule de métal n’a été fixée par la protéine ZraP∆Nter.
Cela confirme qu’il n’y a pas de sites de fixation sur ZraP∆Nter, donc il semblerait que
les sites de fixations soient situés sur la partie N terminale de la protéine ZraP.
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CONCLUSION
Sur le projet ZraP
ZraP est une métalloprotéine produite par les bactéries lorsque celles-ci se retrouvent
dans un environnement où il y a une quantité très importante en métaux. Elle fixe les
métaux et permet ainsi aux bactéries de survivre dans un tel environnement.
Au cours de ce stage, nous avons montré que les sites de fixation aux métaux impliquent
la partie N terminale de ZraP en effectuant des expériences de métallation sur la
protéine, à laquelle nous avons enlevé la partie N terminale.
Afin de confirmer les résultats obtenus suite aux manipulations effectuées, ces dernières
vont être répétées sur ZraP∆Nter une seconde fois. Nos expériences montrent que
l’extrémité N-terminale est nécessaire à la fixation des métaux, mais pas qu’elle est
suffisante. En effet, il est possible que l’extrémité C-terminale joue aussi un rôle car elle
porte aussi des histidines. Des expériences vont donc être réalisées sur la protéine à
laquelle la partie C terminale sera enlevée, ainsi qu’à la protéine où les deux extrémités
N terminale et C terminale seront enlevées. Les essais de mutagenèse sont en cours.
Sur le stage
Ce mois de stage a été une expérience formidable qui m’a permis à la fois de donner
plus de réalité aux cours de Biochimie en L1, mais qui m’a également permis d’acquérir
une expérience et une certaine aisance, ainsi que certains gestes pour le bon déroulement
des manipulations ; qui me seront très utiles pour mes projets de formation.
Grâce au stage, j’ai pu me faire une vraie idée du monde de la Recherche : j’ai pu parler
avec de nombreuses personnes qui m’ont raconté ce qu’elles faisaient m’ont donné
énormément de conseils, en rapport avec le stage, mais aussi mes projets d’étude.
Sur le dispositif stage d’excellence
Je trouve que c’est une très bonne initiative de la part de l’Université, d’autant que l’on
m’a dit qu’il était rare pour une personne étant en première année de faire un stage.
À ce stade de notre formation, on ne sait pas forcément ce que l’on veut faire plus tard,
donc ce stage permet d’avoir un premier contact avec le monde de la Recherche. Par
ailleurs, il nous permet d’explorer différents domaines dont on a pu entendre parler qui
pourraient nous intéresser pour notre projet d’avenir (biochimie, neurosciences,
génétique, immunologie…), mais que l’on n’a pas l’occasion d’approfondir en cours.
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ACTIVITES ANNEXES
1. Projet CnrX
Au cours de mon stage, je me suis intéressé à un projet concernant la protéine CnrX
présente dans la bactérie Cupriavidus metallidurans CH34, une autre bactérie ayant la
capacité de résister aux métaux.
CnrX est une protéine senseur périplasmique faisant partie du complexe tri-protéique
CnrYXH, qui permet la régulation de l’expression des gènes impliqués dans la
résistance aux métaux (Nickel, Cobalt). En réponse à la présence de métaux, CnrYX
libère CnrH, un facteur sigma de fonction extracytoplasmique qui permet la résistance.
L’équipe cherche à comprendre comment le domaine senseur de CnrX détecte les ions
métalliques, comment se fait la sélection spécifique du Nickel ou du Cobalt, et quelle est
la nature du signal permettant cela.
Plusieurs hypothèses ont été faites, et afin de les vérifier, j’ai effectué quatre
mutagénèses : il s’agit d’introduire une mutation dans la séquence du gène codant pour
la protéine d’intérêt permettant de modifier la séquence de la protéine afin de déterminer
si la partie remplacée jouait bien un rôle dans sa fonction.
J’ai ainsi pu réaliser une PCR, une transformation et amplification de bactéries, ainsi
qu’une miniprep (purification d’ADN) afin d’envoyer l’ADN au séquençage pour
vérifier si la mutation a fonctionné.
Malheureusement, la transformation n’a pas fonctionné pour trois mutations, je n’ai
donc pas obtenu de colonies en présence de l’antibiotique de sélection, et je n’ai pas eu
le temps de refaire les manipulations avant de partir. Mais la quatrième a fonctionné et
les résultats du séquençage ont montré que la mutation avait bien marché.
2. Réunions d’accueil à l’IBS
J’ai participé à la réunion d’accueil de l’IBS : on nous a fait visiter les salles où nous
étions susceptibles de travailler, les lieux où trouver les différents types de produits, et
on nous a expliqué certaines règles, notamment concernant le tri des déchets. On nous a
aussi montré comment retirer de l’azote liquide et expliqué les dangers liés à ce produit.
J’ai aussi participé à une conférence et à une réunion de sécurité concernant les
dispositifs mis en place nous permettant de travailler dans des conditions optimales de
sécurité, ainsi que sur les gestes et comportements à avoir dans certaines situations.
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