bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0

Transcription

bioelisa
bioelisa HIV-1+2 3.0
READ HIGHLIGHTED CHANGES
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
ELISA test for the detection of antibodies to Human Immunodeficiency Viruses (HIV) type 1 (group M-O) or
type 2 in human serum or plasma samples in clinical laboratories and as a first-line screening assay in
blood centres.
Summary
Serological evidence of infection with HIV may be obtained by testing for presence of HIV antigens or antibodies in
serum of individuals suspected for HIV infection. Antigen can generally be detected during both acute phase and
the symptomatic phase of AIDS only. The antibodies to HIV-1 and/or HIV-2 can be detected throughout virtually the
whole infection period, starting at or shortly after the acute phase and lasting till the end stage of AIDS. Therefore,
the use of highly sensitive antibody assays is the primary approach in serodiagnosis of HIV infection. Apart from
sexual transmission, the principal route of infection with HIV is blood transfusion. HIV can present both in cellular
and cell-free fractions of human blood. Therefore, all donations of blood or plasma should be tested because due
to the risk of HIV transmission through contaminated blood. This can be effectively achieved by testing for the
antibodies to HIV-1 and HIV-2 by using a highly sensitive ELISA tests.
Principle
bioelisa HIV-1+2 3.0 is a two step incubation antigen “sandwich” enzyme immunoassay kit, in which the wells of a
microplate are coated with recombinant HIV antigens expressed in E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and
recombinant HIV-2 gp-36). Serum or plasma samples are added to these wells. If specific HIV1/2 antibodies are
present in the sample, they will form stable complexes with the HIV recombinant antigens. The microwells are then
washed to remove unbound serum proteins. A second set of recombinant antigens conjugated with peroxidase and
expressing the same epitopes are added to the wells. During the second incubation step, these antigens will bind
to the specific captured antibodies. After a second wash to remove unbound conjugate a Chromogen solutions are
added to the wells. In wells containing the antigen-antibody-antigen “sandwich” immunocomplex, the colorless
Chromogens are hydrolyzed by the bound conjugate to a blue colored product. The blue color changes to yellow
after blocking the reaction with sulfuric acid. The intensity of colour can be measured and is proportional to the
anti-HIV 1/2 antibodies concentration in the sample. Wells containing negative samples remain colourless.
Components
1. MCPL MICROPLATE:
12 x 8 wells coated with recombinant HIV 1/2 antigens (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and recombinant
HIV-2 gp36). The microwell strips are for SINGLE USE only. Do not use if the vacuum sealing has been
damaged when first time taken of out the box.
2.
CONTROL + 1 HIV-1 POSITIVE CONTROL:
Antibodies to HIV-1 diluted in protein stabilized buffer. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and red
dye. Ready to use.
3.
CONTROL + 2 HIV-2 POSITIVE CONTROL:
Antibodies to HIV-2 diluted in protein stabilized buffer. Contains 0.1% ProClinTM 300 as preservative and red
dye. Ready to use.
4.
CONTROL – NEGATIVE CONTROL:
Protein stabilized buffer tested negative for HBsAg and for antibodies to HIV-1, HIV-2, HCV and TP. Contains
0.1% ProClinTM 300 as preservative and yellow dye. Ready to use.
5.
CONJ CONJUGATE:
HIV-1 and HIV-2 recombinant antigens conjugated with peroxidase. Contains 0.1% ProClinTM 300 as
preservative and red dye. Ready to use.
6.
WASH SOLN 20x CONCENTRATE WASHING SOLUTION:
Concentrate PBS buffer pH 7.4 (20x). Contains Tween-20 as detergent. To be diluted 1/20 in distilled or
deionised water before use.
7.
CHROM A CHROMOGEN SOLUTION A:
Urea peroxide solution. Ready to use.
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN
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8.
CHROM B CHROMOGEN SOLUTION B:
TMB solution (Tetramethyl benzidine dissolved in citric acid).
9.
H2SO4 0.5M STOPPING SOLUTION:
0.5M sulphuric acid. Ready to use.
10. SEALS ADHESIVE SEALS:
To cover the microplate during incubations.
11. BAG RESEALABLE BAG:
For storage of unused strips.
Precautions
bioelisa HIV-1+2 3.0 is intended for IN VITRO diagnostic use.
For professional used only.
IVD
WARNING: Materials from human origin may have been used in the preparation of the negative control of the kit.
These materials have been tested with tests kits with accepted performance and found negative for antibodies to
HIV 1/2, HCV, TP and HBsAg. However, there is no analytical method that can assure that infectious agents in the
specimens or reagents are completely absent. Therefore, handle reagents and specimens with extreme caution as
if capable of transmitting infectious diseases. Bovine derived sera have been used for stabilizing of the positive and
negative controls. Bovine serum albumin (BSA) and fetal calf sera (FCS) are derived from animals from BSE/TSE
free-geographical areas.
The Negative Control, HIV-1 Positive Control, HIV-2 Positive Control and Conjugate contains 0.1% ProClinTM
as preservative. The following are the appropriate risk (R) and safety (S) phrases:
R43 May cause sensitisation by skin contact.
S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
S28 After contact with skin, wash immediately with plenty of water.
S36/37/39 Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection.
S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible).
S60 This material and its container must be disposed of as hazardous waste.
S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/ Safety data sheets.
The ELISA assays are time and temperature sensitive. To avoid incorrect result, strictly follow the test
procedure steps and do not modify them.
1.
Do not exchange reagents from different lots or use reagents from other commercially available kits. The
components of the kit are precisely matched for optimal performance of the tests.
2.
Make sure that all reagents are within the validity indicated on the kit box and of the same lot. Never use
reagents beyond their expiry date stated on labels or boxes.
3.
CAUTION - CRITICAL STEP: Allow the reagents and specimens to reach room temperature (18-30°C) before
use. Shake reagent gently before use. Return at 2-8°C immediately after use.
4.
Use only sufficient volume of sample as indicated in the procedure steps. Failure to do so, may cause in low
sensitivity of the assay.
5.
Do not touch the bottom exterior of the wells; fingerprints or scratches may interfere with the reading. When
reading the results, ensure that the plate bottom is dry and there are no air bubbles inside the wells.
6.
Never allow the microplate wells to dry after the washing step. Immediately proceed to the next step. Avoid the
formation of air bubbles when adding the reagents.
7.
Avoid assay steps long time interruptions. Assure same working conditions for all wells.
2
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8.
Calibrate the pipette frequently to assure the accuracy of samples/reagents dispensing. Use different disposal
pipette tips for each specimen and reagents in order to avoid cross-contaminations.
9.
Assure that the incubation temperature is 37°C inside the incubator.
10. When adding specimens, do not touch the well’s bottom with the pipette tip.
11. When measuring with a plate reader, determine the absorbance at 450 nm or at 450/620-630 nm.
12. The enzymatic activity of the conjugate might be affected from dust and reactive chemical and substances like
sodium hypochlorite, acids, alkalis etc. Do not perform the assay in the presence of these substances.
13. If using fully automated equipment, during incubation, do not cover the plates with the plate cover. The tapping
out of the remainders inside the plate after washing, can also be omitted.
14. All specimens from human origin should be considered as potentially infectious. Strict adherence to GLP
(Good Laboratory Practice) regulations can ensure the personal safety.
15. Never eat, drink, smoke, or apply cosmetics in the assay laboratory. Never pipette solutions by mouth.
16. Chemical should be handled and disposed of only in accordance with the current GLP (Good Laboratory
Practices) and the local or national regulations.
17. The pipette tips, vials, strips and specimen containers should be collected and autoclaved for not less than
2 hours at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite for 30 minutes to decontaminate before any further
steps of disposal. Solutions containing sodium hypochlorite should NEVER be autoclaved. Materials Safety
Data Sheet (MSDS) available upon request.
18. Some reagents may cause toxicity, irritation, burns or have carcinogenic effect as raw materials. Contact with
the skin and the mucosa should be avoided but not limited to the following reagents: Stopping solution, the
Chromogens, and the washing solution.
INDICATIONS OF INSTABILITY DETERIORATION OF THE REAGENT: Values of the positive or negative
controls, which are out of the indicated quality control range, are indicators of possible deterioration of the reagents
and/or operator or equipment errors. In such case, the results should be considered as invalid and the samples
must be retested. In case of constant erroneous results and proven deterioration or instability of the reagents,
immediately substitute the reagents with new one or contact your local distributor or Biokit technical support for
further assistance.
Storage and stability
The components of the kit will remain stable through the expiration date indicated on the label and package when
stored between 2-8°C, do not freeze. To assure maximum performance of bioelisa HIV-1+2 3.0 kit, during storage
protect the reagents from contamination with microorganism or chemicals. The microwell strips can be broken to
be used separately. Place unused wells or strips in the plastic sealable storage bag together with the desiccant
and return to 2-8°C. Once open the microplate is stable one month at 2-8°C. The negative control, HIV-1 positive
control, HIV-2 positive control, conjugate, chromogen solution A, chromogen solution B and stopping solution, once
open are stable one month at 2-8°C. The washing solution, once diluted, is stable for one week at room
temperature or for two weeks at 2-8°C.
Available packaging
-
1 plate kit (96 tests), REF 3000-1168.
Contains: 1 plate, 1 x 1 ml negative control, 1 x 1 ml HIV-1 positive control, 1 x 1 ml HIV-2 positive control,
1 x 12 ml conjugate, 1 x 50 ml washing solution, 1 x 8 ml chromogen solution A, 1 x 8 ml chromogen solution B,
1 x 8 ml stopping solution, 1 plastic bag and adhesive seals (6 units).
-
5 plates kit (5 x 96 tests), REF 3000-1169.
Contains: 5 plate, 3 x 1 ml negative control, 3 x 1 ml HIV-1 positive control, 3 x 1 ml HIV-2 positive control,
5 x 12 ml conjugate, 2 x 125 ml washing solution, 1 x 60 ml chromogen solution A, 1 x 60 ml chromogen solution B,
1 x 60 ml stopping solution, 1 plastic bag and adhesive seals (20 units).
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Material required not provided
Distilled or deionized water.
Disposable gloves and timer.
Appropriate waste containers for potentially contaminated materials.
Disposable V-shaped troughs.
Dispensing system and/or pipette (single or multichannel) and disposable pipette tips.
Absorbent tissue or clean towel.
Dry incubator or water bath, 37 ± 1°C.
Microshaker for dissolving and mixing conjugate with samples.
Microplate reader with a 450 nm filter. Reference filter of 620 nm or 630 is advisable.
Manual or automated wash system.
Sample collection transporting and storage
1. No special patient’s preparation required. Collect the specimen in accordance with the normal laboratory
practice. Either fresh serum or plasma specimens can be used with this assay. Blood collected by venipuncture
should be allowed to clot naturally and completely – the serum/plasma must be separated from the clot as early
as possible as to avoid haemolysis. Care should be taken to ensure that the serum specimens are clear and not
contaminated by microorganisms. Any visible particulate matters in the specimen should be removed by
centrifugation at 3000 RPM (round per minutes) for 20 minutes at room temperature or by filtration.
2. Plasma specimens collected into EDTA, sodium citrate or heparin may be tested, but highly lipaemic, icteric,
or hemolytic specimens should not be used as they can give false results in the assay. Do not heat
inactivate specimens. This can cause deterioration of the target analyte. Samples with visible microbial
contamination should never be used.
3. bioelisa HIV-1+2 3.0 is intended ONLY for testing of individual serum or plasma samples. Do not use the
assay for testing of cadaver samples, saliva, urine or other body fluids, or pooled (mixed) blood.
4. Transportation and Storage: Store specimens at 2-8°C. Specimens not required for assaying within 3 days
should be stored frozen (-20°C or lower). Multiple freeze-thaw cycles should be avoided. For shipment,
samples should be packaged and labeled in accordance with the existing local and international regulations for
transportation of clinical samples and etiological agents.
Automatic processing
Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any
automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using
manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the
programming and setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor.
PROCEDURE (see procedural flow chart)
Previous operations
Allow all the reagents to reach room temperature (20-25°C) before running the assay. Check the washing solution
concentrate for the presence of salt crystals. If crystals have formed, resolubilize by warming at 37°C until crystals
dissolve. Dilute 1:20 the washing solution as indicated in the washing step instructions. Use distilled or deionized
water and only clean vessels to dilute the buffer. All other reagents are READY TO USE.
Washing step instructions
A good washing procedure is essential in order to obtain correct and precise analytical data. Is therefore recommended
to use a good quality ELISA microplate washer, maintained at the best level of washing performances. In general no less
than 5 automatic washing cycles of 350-400 µl/well are sufficient to avoid false positive reactions and high background.
To avoid cross-contaminations of the plate with specimen or conjugate, after incubation do not discard the content of the
wells but allow the microplate washer to aspirate it automatically. Assure that the microplate washer liquid dispensing
channels are not blocked or contaminated and sufficient volume of washing solution is dispensing each time into the wells.
In case of manual washing, we suggest to carry out 5 washing cycles, dispensing 350-400 µl/well and aspirating the
liquid for 5 times. If poor results (higher background) are observed, increase the washing cycles or soaking time per well.
In any case, the liquid aspirated out the strips should be treated with a sodium hypochlorite solution at a final
concentration of 2.5% for 24 hours, before they are wasted in an appropriate way.
The concentrated washing solution should be diluted 1:20 before use. If less than a whole plate is used, prepare
the proportional volume of solution.
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Step 1
Preparation: Mark three wells as negative control (e.g. B1, C1, D1), two wells as positive control
(e.g. E1 for HIV-1 and F1 for HIV-2) and one Blank (e.g. A1, neither samples or conjugate should be
added into the Blank well). If the results will be determined by using dual wavelength plate reader, the
requirement for use of Blank well could be omitted. Use only number of strips required for the test.
Step 2
Adding Sample: Add 100 μl of samples, and 100 μl of positive and negative controls into their
respective wells.
NOTE: Use a separate disposable pipette tip for each specimen, negative and positive control as to
avoid cross-contamination.
Step 3
Incubating Sample: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes. It
is recommended to use thermostat-controlled water tank to assure the temperature stability and
humidity during incubation. If dry incubator is used, do not open the door frequently.
Step 4
Washing(1): After the end of the incubation, remove and discard the plate cover. Wash each well
5 (five) times with diluted Washing buffer. Each time allow the microwells to soak for 30-60 seconds.
After the final washing cycle, turn down the plate onto blotting paper or clean towel and tap it to
remove any remainders.
Step 5
Adding Conjugate: Add 100 μl of conjugate reagent into each well except the Blank.
Step 6
Incubating Conjugate: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes.
Step 7
Washing(2): As Step 4.
Step 8
Coloring: Add 50 μl of chromogen A and 50 μl of chromogen B solutions into each well including the
Blank. Incubate the plate at 37°C for 15 minutes avoiding light. The enzymatic reaction between
the chromogen solutions and the conjugate produces blue color in positive control and HIV 1/2
positive sample wells.
Step 9
Stopping Reaction: Using a multichannel pipette or manually, add 50 µl of stopping solution into each
well and mix gently. Intensive yellow color develops in positive control and HIV 1/2 positive sample wells.
Step 10
Measuring the Absorbance: Calibrate the plate reader with the Blank well and read the absorbance at
450 nm. If a dual filter instrument is used, set the reference wavelength at 620 nm or 630 nm.
Calculate the cut-off value and evaluate the results. (NOTE: read the absorbance within 10 minutes
after stopping the reaction).
Quality control
It is recommended that each laboratory must establish appropriate quality control system with quality control
material similar to or identical with the patient sample being analyzed.
-
The Absorbance value of the Blank well, which contains only chromogen and stopping solution, must be less
than 0.080 at 450 nm.
The Absorbance value of the positive control must be ≥ 0.800 at 450/620-630 nm or at 450 nm after
subtracting the blank.
Each individual absorbance value of the negative control must be less than 0.100 at 450/620-630 nm or at
450 nm after subtracting the blank.
If one of the negative control values does not meet the Quality Control criteria, it should be discarded and the mean
value calculated again using the remaining two values. If more than one negative control Absorbance values do not
meet the Quality Control Range specifications, the test is invalid and must be repeated.
Results
Each microplate should be considered separately when calculating and interpreting the results of the assay,
regardless of the number of plates concurrently processed. The results are calculated by relating each specimen
absorbance (S) value to the cut-off value (CO) of the plate. If the cut-off reading is based on single filter plate
reader, the results should be calculated by subtracting the Blank well A value from the print report values of
specimens and controls. In case the reading is based on dual filter plate reader, do not subtract the Blank well A
value from the print report values of specimens and controls.
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Calculate the cut-off value by adding 0.120 to the mean absorbance of the negative control.
Cut-off = NCx + 0.120
Example:
Blank well Absorbance value: A1= 0.025 at 450 nm (NOTE: blanking is required only when reading with single filter
at 450 nm).
Well No.:
Neg Ctrl:
Well No.:
Pos Ctrl:
B1
0.012
E1
2.363
C1
0.010
F1
2.436
D1
0.011
All controls values are within the stated quality control range.
Calculation of the NCx = (0.012 + 0.010 + 0.011)/3 = 0.011
Calculation of the cut-off: (CO) = 0.011 + 0.120 = 0.131
Interpretation of results
Divide the sample absorbance by the cut-off value. (S/CO)
Negative Results (S/CO < 1): Specimens giving absorbance less than the cut-off value are negative for this assay,
which indicates that no anti-HIV 1/2 antibodies have been detected with bioelisa HIV-1+2 3.0 kit. A negative result
does not exclude the possibility of exposure or infection with HIV.
Positive Results (S/CO ≥ 1): Specimens giving an absorbance equal to or greater than the cut-off value are
considered initially reactive, which indicates that anti-HIV 1/2 antibodies have probably been detected using
bioelisa HIV-1+2 3.0. All initially reactive specimens should be retested in duplicates using bioelisa HIV-1+2 3.0
before the final assay results interpretation. Repeatedly reactive specimens can be considered positive for
antibodies to HIV 1/2 with bioelisa HIV-1+2 3.0.
Borderline (S/CO = 0.9-1.1): Specimens with absorbance to cut-off ratio between 0.9 and 1.1 are considered
borderline and retesting of these specimens in duplicates is required to confirm the initial results.
Follow-up, confirmation and supplementary testing of any positive specimen with other analytical system
(e.g. WB, PCR) is required. Clinical diagnosis should not be established based on a single test result. It should
integrate clinical and other laboratory data and findings.
INITIAL RESULTS INTERPRETATION AND FOLLOW-UP ALL INITIALY REACTIVE OR BORDERLINE SAMPLES
Rep. in duplicate
○,+○,+
○,+○,-
○,-○,-
Interpretation +
Follow-up
S/CO ≥ 0.9
Interpretation
S/CO < 0.9
IND
-
IND = non interpretable
-
-
If, after retesting of the initially reactive samples, both wells are negative results (S/CO < 0.9), these samples
should be considered as non-repeatable positive (or, false positive) and recorded as negative. As with many
very sensitive ELISA assays, false positive results can occur due to the several reasons, most of which are
connected with, but not limited to, inadequate washing step. For more information regarding bioelisa
troubleshooting, please refer to bioelisa Troubleshooting Guide.
If after retesting in duplicates, one or both wells are positive results, the final result from this ELISA test should
be recorded as repeatedly reactive. Repeatedly reactive specimens can be considered positive for antibodies
to HIV 1/2 and therefore the patient is probably infected with HIV 1/2 and the blood unit must be discarded.
After retesting in duplicates, samples with values close to the cut-off value should be interpreted with caution
and considered as " borderline" zone sample, or uninterpretable for the time of testing.
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Limitations of the procedure
1. Positive results must be confirmed with another available method and interpreted in conjunction with the
patient clinical information.
2. Antibodies may be undetectable during the early stage of the disease and in some immunosuppressed
individuals. Therefore, negative results obtained with bioelisa HIV-1+2 3.0 are only indication that the sample
does not contain detectable level of anti-HIV 1 or 2 antibodies and any negative result should not be
considered as conclusive evidence that the individual is not infected with HIV 1 or 2.
3. The most common assay mistakes are: using kits beyond the expiry date, bad washing procedures,
contaminated reagents, incorrect assay procedure steps, insufficient aspiration during washing, failure to add
specimens or reagents, improper operation with the laboratory equipment, timing errors, the use of highly
heamolysed specimens or specimens containing fibrin, incompletely clotted serum specimens.
4. The prevalence of the marker will affect the assay’s predictive values.
5. This assay cannot be utilize to test pooled (mixed) plasma. bioelisa HIV-1+2 3.0 has been evaluated only
with individual serum or plasma specimens.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 is a qualitative assay and the results cannot be use to measure antibodies concentrations.
This assay cannot distinguish between infections with HIV-1 and HIV-2.
Performance characteristics
Evaluation study carried in Alkmaar, the Netherlands, between April and November 2005, demonstrated the
following performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0.
The diagnostic specificity of the kit was 99.85% as determined on all negative samples (5471) that were
investigated. When examined on the unselected donors only (random and first time donors), the specificity was
99.92% (95% CI 99.84-100%).
bioelisa HIV-1+2 3.0 test results on unselected donors:
Panel
Number tested
Random serum donor
Random plasma donor
First time donor
2,654
1,400
989
Total
5,043
Positive (S/CO ≥ 1)
Number
%
2
0.08
1
0.07
1
0.10
4
0.08
Negative (S/CO < 1)
Number
%
2,652
99.92
1,399
99.93
988
99.90
5,039
99.92
All panels of HIV-1, HIV-1 subtype O and HIV-2 confirmed antibody positive samples that were used in this study
were also tested reactive with bioelisa HIV-1+2 3.0 which resulted in diagnostic sensitivity of 100%.
A total of 32 seroconversion panels, which represent 210 samples tested. 13 samples not classified from PRB918
and PRB917 because there are not data of Antigen or RNA determination required for the classification. 41
samples classified as negative. RNA and or Antigen negative. 61 samples classified as early-seroconversion. 95
samples classified as seroconversion.
The testing results also show that bioelisa HIV-1+2 3.0 is a state-of-the-art compare to most of the currently
available on the market CE-marked tests.
The analytical sensitivity was evaluated on PeliCheck anti-HIV panels. The analytical sensitivity of
bioelisa HIV-1+2 3.0 on the PeliCheck anti-HIV standard dilutions was comparable to other anti-HIV assays.
Analytical specificity:
bioelisa HIV-1+2 3.0 test results on samples from hospitalised patients and samples containing potentially
cross-reacting blood-specimens:
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bioelisa
Type of sample
Number tested
Mononucleosis
Pregnant woman
RF+
Anti-TPO
Anti-smooth muscle
Elevated IgG Levels
296
101
17
5
5
4
Total
428
Positive (S/CO ≥ 1)
Number
%
4
1.35
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
Negative (S/CO < 1)
Number
%
292
98.65
101
100
17
100
5
100
5
100
4
100
0.93
424
99.07
In a separate study, the following specificity results were obtained:
-
Possible high dose hook effect is eliminated due to the implementation of two-step procedure.
Frozen positive/negative specimens have been tested to check for interferences due to collection and storage.
The performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0 were not affected for at least 3 freeze/thaw cycles.
Samples from patients infected with hepatitis A,B,C and E viruses as well as samples from patients infected
with Treponema pallidum were tested with no cross-reactive reactions observed.
25 positive fresh serum samples tested in INSTITUTE FOR TROPICAL MEDICINE, BELGIUM have been
tested with bioelisa HIV-1+2 3.0. All 25 positive fresh serum samples have been positive with
bioelisa HIV-1+2 3.0.
Accuracy:
The below tables represent the results of analytical sensitivity and reproducibility of bioelisa HIV-1+2 3.0 as
controlled with PeliSpyMulti-Marker run control and with Internal QC sample tested in every plate, the 1:2048 dilution
of the anti-HIV standard in this PeliSpy sample was consistently detected in all plates. Internal QC sample was always
detected in all plates.
PeliSpyMulti-Marker results:
Dilution
n
Average
1:2048
80
3.08
Percentiles
5
95th
1.76
4.39
Measured
Min
Max
1.70
4.96
th
Internal QC sample results:
A
B
C
D
E
F
G
H
n
Average
160
7.71
Percentiles
5th
95th
5.32
10.10
Measured
Min
Max
4.37
10.89
EXAMPLE SCHEME OF CONTROL/SAMPLES DISPENSING
1
2
3
4
5
6
7
…
…
Blank
SMP3
Neg
…
Neg
…
Neg
Pos (HIV-1)
Pos (HIV-2)
SMP 1
SMP 2
8
12
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bioelisa
bioelisa: Troubleshooting guide
Problem
Possible causes
Solution
1. Controls out of
validation.
1a. Incorrect temperature,
timing or pipetting.
1b. Improper preparation of
reagents, error of dilution,
reagents not well mixed.
1c. Cross-contamination of
controls.
Check procedure. Repeat
assay.
Check procedure. Repeat
assay.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. No colour or only a light
colour developed at the
end of the assay.
2a.
2b.
2c.
2d.
Pipette carefully. Do not
interchange caps. Repeat
assay.
Incorrect reading filter.
Check that the wavelenght of
the filter used is 450 nm. If no
reference 620 - 630 nm is
used, absorbance increases
approximately 0.050.
Interference in the optical Check the reader. Clean or
pathway.
dry the bottom of microplate.
Check for air bubbles. Repeat
reading.
Used components from
Do not use components from
different lots.
different lots as they are
adjusted for each batch
released.
Expired reagents.
Check the kit expiry date. Use
a non- expired kit.
One or more reagents not Check procedure. Repeat
added or added in wrong assay.
sequence.
Inactive conjugate:
Check for contamination.
improper conservation.
Recheck procedure. Repeat
assay.
Inactive microplate:
Always keep unused strips in
Improper conservation.
the bag very well closed, with
the desiccant inside. Repeat
assay.
Inactive chromogen
Use disposable containers or
solutions A and/or B:
wash with acid or ethanol and
improper conservation.
rinse with deionised water
The container used affects before re-use. Recheck
chromogen stability, cross- procedure. Repeat assay.
contamination with the
stopping solution.
9
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bioelisa
bioelisa: Troubleshooting guide
Problem
Possible causes
3. Too much colour in all
microplate wells.
3a. Contaminated, oxidised
chromogen solutions A
and/or B
4. Poor reproducibility
or high number of
non-repeatable reactive
samples.
Solution
Check that chromogen
solutions A and B are
colourless, discard if blue.
Use acid or ethanol washed
or disposable containers.
Repeat assay.
3b. Contaminated or
Check for contamination
improperly prepared
(turbid aspect). Check
reagents.
dilutions. Repeat assay.
3c. Contaminated washing
Check the quality of distilled
solution (1x).
or deionised water used for
dilution. Repeat assay.
3d. Insufficient washing
Check the washing device. Fill
or washing not consistent: wells with washing solution
Filling volume and/or
close to the top, aspirate
aspiration insufficient
completely. Increase the
or not uniform. Insufficient number of wash cycles.
number of washing
After washing, blot the
cycles, contaminated
inverted microplate on tissue
device.
paper.
3e. Using of a washing
Use only the washing solution
solution from other kit.
supplied with the kit.
4a. Washing problems.
See 3c, 3d, 3e.
4b. Uncalibrated pipettes
Use only calibrated pipettes,
or tips not well fitted.
with well fitted tips and pipette
Improper pipetting.
carefully, without bubbles and
splashing. Repeat assay.
4c. Reagents and sera not
Equilibrate reagents to room
at room temperature or
temperature and mix
not well mixed before
thoroughly before using.
using.
4d. Air currents over the
Keep the microplate protected
microplate during
from air currents.
incubations.
4e. Too long time for addition Develop consistent and
of samples and/or
uniform technique.
reagents. Inconsistency in
time intervals. Air
bubbles.
4f. Interference in the optical See 1e.
pathway.
10
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bioelisa
LEER CAMBIOS SOMBREADOS
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) tipo 1
(grupos M-O) o tipo 2 en muestras de suero o plasma humano para ser utilizado en laboratorios clínicos y
como análisis de cribado de primera línea en bancos de sangre.
Sumario
La demostración serológica de infección por HIV puede obtenerse comprobando la presencia de antígenos o
anticuerpos HIV en el suero de personas con sospecha de infección por HIV. En general, el antígeno sólo se
puede detectar en la fase aguda y en la fase sintomática del SIDA. Los anticuerpos frente a HIV-1 o HIV-2 pueden
detectarse casi durante todo el periodo de infección, comenzando en la fase aguda o poco después de esta y
manteniéndose hasta la fase terminal del SIDA. Por lo tanto, la utilización de análisis de anticuerpos altamente
sensibles es el primer abordaje en el serodiagnóstico de la infección por HIV. Aparte de la transmisión sexual, la
principal vía de infección por HIV es la transfusión de sangre. El HIV puede aparecer tanto en las fracciones
globulares como en las no globulares de la sangre humana. Por ello deberían analizarse todas las donaciones de
sangre o plasma debido al riesgo de transmisión de HIV a través de sangre contaminada. Esto se puede conseguir
eficazmente mediante la detección de anticuerpos frente al HIV-1 y HIV-2 en pruebas ELISA de alta sensibilidad.
Principio
bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método inmunoenzimático directo, tipo “sándwich”, de dos pasos de incubación, en
donde los pocillos de un microplaca están recubiertos con antígenos recombinantes de HIV expresados en E. coli
(recombinantes de HIV-1 gp41 y gp120 y recombinante de HIV-2 gp-36). A estos pocillos se les añade muestras
de suero o plasma a analizar. Si en la muestra existen anticuerpos HIV-1/2 específicos, formarán complejos
estables con los antígenos recombinantes del HIV. A continuación, se lavan los micropocillos para eliminar las
proteínas séricas no ligadas. Se añade a los pocillos un segundo juego de antígenos recombinantes conjugados
con la peroxidasa y que expresan los mismos epítopos. Durante la segunda fase de incubación, estos antígenos
se unirán a los anticuerpos específicos capturados. Tras un segundo lavado para eliminar el conjugado no unido
se añaden a los pocillos las soluciones de cromógeno. En los pocillos que contienen el inmunocomplejo
"sándwich" antígeno-anticuerpo-antígeno, los cromógenos incoloros son hidrolizados por el conjugado ligado
formando un producto de color azul. El color azul vira a amarillo tras bloquear la reacción con ácido sulfúrico. La
intensidad del color es mensurable y proporcional a la concentración de anticuerpos anti-HIV 1/2 en la muestra.
Los pocillos que contienen muestras negativas permanecen incoloros.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocillos recubiertos con antígenos HIV 1/2 recombinantes (HIV-1 recombinante gp41, gp120 y
HIV-2 recombinante gp36). Las tiras de micropocillos son para UN SOLO USO. No utilizarla si el sellado al
vacio ha sido dañado cuando se extrae por primera vez de la caja.
2.
CONTROL + 1 CONTROL POSITIVO HIV-1:
Anticuerpos frente a HIV-1 diluidos en tampón proteínico estabilizado. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como
conservante y colorante rojo. Listo para usar.
3.
CONTROL + 2 CONTROL POSITIVO HIV-2:
Anticuerpos frente a HIV-2 diluidos en tampón proteínico estabilizado. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como
4.
CONTROL – CONTROL NEGATIVO:
Tampón proteínico estabilizado negativo frente a HBsAg y anticuerpos HIV-1, HIV-2, HCV y TP. Contiene 0,1% de
ProClinTM 300 como conservante y colorante amarillo. Listo para usar.
5.
CONJ CONJUGADO:
Antígenos recombinantes HIV-1 y HIV-2 conjugados con peroxidasa. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como
6.
WASH SOLN 20x SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA:
Tampón PBS concentrado de pH 7,4 (20x). Contiene Tween-20 como detergente. Diluir 1/20 en agua
destilada o desionizada antes del uso.
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bioelisa
7.
CHROM A SOLUCIÓN DE CROMÓGENO A:
Solución de peróxido de urea. Listo para usar.
8.
CHROM B SOLUCIÓN DE CROMÓGENO B:
Solución TMB (tetrametilbencidina disuelta en ácido cítrico).
9.
H2SO4 0,5M SOLUCIÓN DE PARADA:
Ácido sulfúrico 0,5M. Listo para usar.
10. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS:
Para cubrir la microplaca durante las incubaciones.
11. BAG BOLSA DE PLÁSTICO:
Para guardar las tiras sin usar.
Precauciones
bioelisa HIV-1+2 3.0 es para el diagnóstico IN VITRO.
Para uso exclusivo por profesionales.
IVD
ADVERTENCIA: En la preparación del control negativo del kit se han podido utilizar materiales de origen humano.
Estos materiales se han analizado con kits analíticos de eficacia comprobada y su resultado ha dado negativo a
anticuerpos frente a HIV 1/2, HCV, TP y HBsAg. No obstante, no existe ningún método analítico que garantice la
total ausencia de agentes infecciosos en muestras o reactivos. Por tanto, los reactivos y las muestras deben
manejarse con extrema precaución, como si pudieran transmitir enfermedades. Para la estabilización de los
controles positivos y negativos se han utilizado sueros de origen bovino. La albúmina de suero bovino (ASB) y el
suero fetal bovino (SFB) provienen de animales de áreas geográficas libres de EEB/EET.
El Control Negativo, el Control Positivo HIV-1, el Control Positivo HIV-2 y el Conjugado contienen 0,1% de
TM
ProClin como conservante. A continuación se presentan las frases de riesgo (R) y de seguridad (S) aplicables:
R43 Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.
S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.
S28 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua.
S36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
S45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
S60 Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos.
S61 Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de
seguridad.
Los análisis ELISA son sensibles al tiempo y la temperatura. Para evitar un resultado incorrecto, seguir
estrictamente los pasos del procedimiento de prueba y no modificarlos.
1.
No intercambiar reactivos de diferentes lotes ni usar reactivos de otros kits comerciales. Los componentes del
kit están ajustados con precisión para ofrecer un rendimiento óptimo de los tests.
2.
Comprobar que todos los reactivos se encuentran dentro del periodo de validez indicado en la caja del kit y
que pertenecen al mismo lote. No usar nunca reactivos después de la fecha de caducidad declarada en las
etiquetas o las cajas.
3.
PRECAUCIÓN - PASO CRÍTICO: Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (18-30°C) antes
de su uso. Agitar suavemente el reactivo antes de usarlo. Llevar de nuevo a 2-8°C inmediatamente después
del uso.
4.
Usar sólo el volumen suficiente de muestra según lo indicado en los pasos del procedimiento. En caso
contrario, el análisis puede perder sensibilidad.
5.
No tocar la base exterior de los pocillos; las huellas de dedos o los arañazos pueden interferir en la lectura. Al
efectuar la lectura de los resultados, asegurarse de que la base de la placa está seca y de que no existen
burbujas de aire dentro de los pocillos.
6.
No dejar secar nunca los pocillos de la microplaca después del paso de lavado. Pasar inmediatamente al
siguiente paso. Evitar la formación de burbujas de aire al añadir los reactivos.
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7.
Evitar interrupciones muy prolongadas durante los pasos del análisis. Asegurar las mismas condiciones de
trabajo en todos los pocillos.
8.
Calibrar la pipeta con frecuencia para garantizar la exactitud de la dispensación de muestras/reactivos. Usar
diferentes puntas de pipetas desechables con cada muestra y reactivo para evitar contaminaciones cruzadas.
9.
Asegurar una temperatura de incubación de 37°C dentro del incubador.
10. Al añadir las muestras, no tocar la base del pocillo con la punta de la pipeta.
11. En la medición con un lector de placas, determinar la absorbancia a 450 nm o a 450/620-630 nm.
12. La actividad enzimática del conjugado podría resultar afectada por el polvo y reactivos y sustancias químicas
como hipoclorito sódico, ácidos, álcalis, etc. No realizar el análisis en presencia de estas sustancias.
13. Si se utiliza un equipo totalmente automático durante la incubación, no cubrir las placas con la lámina
adhesiva. También puede omitirse la acción de golpear la placa después del lavado para eliminar los restos
que quedan dentro de ella.
14. Todas las muestras de origen humano deben considerarse potencialmente infecciosas. El cumplimiento
estricto de las normas BPL (Buena Práctica de Laboratorio) puede garantizar la seguridad del personal.
15. No comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio de análisis. No pipetear las soluciones con la boca.
16. Los productos químicos deben manipularse y eliminarse sólo conforme a las normas BPL (Buena Práctica de
Laboratorio) vigentes y a las regulaciones locales o nacionales.
17. Las puntas de pipetas, viales, tiras y envases de muestras deben recogerse y esterilizarse en autoclave
durante no menos de 2 horas a 121°C o tratarse con hipoclorito sódico al 10% durante 30 minutos para
descontaminar antes de desecharlas. Las soluciones que contienen hipoclorito sódico NUNCA deben
esterilizarse en autoclave. Se dispondrá de una ficha de datos de seguridad (FDS).
18. Las materias primas de algunos reactivos pueden causar toxicidad, irritación, quemaduras o ser
carcinógenos. Debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas, entre otros, con los siguientes reactivos:
solución de parada, cromógenos y solución de lavado.
SIGNOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DEL REACTIVO: Los valores de los controles positivo o negativo
que se encuentren fuera de los límites de control de calidad indicados son indicadores de un posible deterioro de
los reactivos o errores del operario o del instrumento. En tal caso los resultados deben considerarse no válidos y
las muestras deben ser reanalizadas. En el caso de resultados erróneos constantes y deterioro o inestabilidad
demostrados de los reactivos, sustituir inmediatamente estos por unos nuevos o ponerse en contacto con su
distribuidor local o servicio técnico de Biokit para más información.
Conservación y estabilidad
Los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta y en el envase, si se
almacenan entre 2-8°C y no se congelan. Para garantizar el máximo rendimiento del kit bioelisa HIV-1+2 3.0,
durante el almacenamiento proteger los reactivos de la contaminación con microorganismos o productos químicos.
Se pueden romper las tiras de micropocillos para usarlas por separado. Para el almacenamiento colocar los pocillos
o tiras no utilizados en la bolsa de plástico sellable junto con el desecante y llevarlos de nuevo a 2-8°C. Una vez
abierta, la microplaca es estable 1 mes a 2-8°C. Una vez abiertos, el control negativo, el control positivo HIV-1, el
control positivo HIV-2, el conjugado, la solución de cromógeno A, la solución de cromógeno B y la solución de
parada son estables 1 mes a 2-8°C. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante 1 semana a
temperatura ambiente o durante 2 semanas a 2-8°C.
Presentaciones disponibles
Kit de 1 placa (96 tests), REF 3000-1168.
Contiene: 1 placa, 1 x 1 ml control negativo, 1 x 1 ml control positivo HIV-1, 1 x 1 ml control positivo HIV-2,
1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solución de lavado, 1 x 8 ml solución cromógeno A, 1 x 8 ml solución cromógeno B,
1 x 8 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas (6 unidades).
-
Kit de 5 placas (5 x 96 tests), REF 3000-1169.
Contiene: 5 placas, 3 x 1 ml control negativo, 3 x 1 ml control positivo HIV-1, 3 x 1 ml control positivo HIV-2,
5 x 12 ml conjugado, 2 x 125 ml solución de lavado, 1 x 60 ml solución cromógeno A, 1 x 60 ml solución
cromógeno B, 1 x 60 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas (20 unidades).
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bioelisa
Material necesario no incluido
Agua destilada o desionizada.
Guantes desechables y cronómetro.
Recipientes de desecho adecuados para materiales potencialmente contaminados.
Palanganas desechables en forma de V.
Sistema de dispensación o pipeta (simple o multicanal) y puntas de pipeta desechables.
Paños absorbentes o toallitas secas.
Incubador seco o baño maría, 37°C ± 1°C.
Microagitador para disolver y mezclar el conjugado con las muestras.
Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 ó 630 nm.
Sistema de lavado manual o automático.
Recogida, transporte y almacenamiento de muestras
1. No se necesita una preparación especial del paciente. Recoger la muestra conforme a la práctica normal de
laboratorio. En este análisis se pueden utilizar muestras de suero o plasma fresco. Se puede recoger la sangre
por venopunción para su coagulación natural y completa: el suero/plasma debe separarse del coágulo lo antes
posible para evitar la hemólisis. Asegurarse de que las muestras séricas son transparentes y no están
contaminadas por microorganismos. Eliminar cualquier partícula visible en la muestra por centrifugación a
3000 rpm (revoluciones por minuto) durante 20 minutos a temperatura ambiente o por filtración.
2. Pueden utilizarse muestras de plasma recogidas en EDTA, citrato sódico o heparina, aunque no deben
utilizarse muestras muy lipémicas, ictéricas o hemolíticas, ya que pueden dar resultados falsos en el
análisis. No usar muestras inactivadas, ya que se puede deteriorar el analito diana. No usar nunca
muestras con contaminación microbiana visible.
3. bioelisa HIV-1+2 3.0 está diseñado para analizar ÚNICAMENTE muestras de suero o plasma. No usar para
examinar muestras de cadáveres, saliva, orina u otros líquidos corporales, o sangre agrupada (mixta).
4. Transporte y almacenamiento: Almacenar las muestras a 2-8°C. Las muestras no necesarias para los análisis
de los próximos 3 días deberán congelarse (-20°C o menos). Evitar repetir ciclos de congelación-descongelación.
Para el envío embalar y etiquetar las muestras conforme a las normativas locales e internacionales existentes
sobre transporte de muestras clínicas y sustancias etiológicas.
Procesamiento automático
Puede utilizarse un análisis automático o semiautomático con diferentes instrumentos. Es muy importante validar
cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a
las obtenidas con el análisis manual. Se recomienda al usuario la validación periódica del instrumento. Si tiene
dificultades para programar y ajustar los procesadores automáticos Biokit, póngase en contacto con su
distribuidor.
PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento)
Operaciones previas
Antes de iniciar el análisis, llevar todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25°C). Examinar el tampón de
lavado concentrado en busca de sales cristalinas. Si se han formado cristales, disolver calentando a 37°C hasta
que se disuelvan los cristales. Diluir 1:20 la solución de lavado según se indica en las instrucciones del paso de
lavado. Usar agua destilada o desionizada y limpiar sólo los recipientes para diluir el tampón. Todos los demás
reactivos están LISTOS PARA USAR.
Instrucciones del paso de lavado
Es esencial un buen lavado para obtener datos analíticos correctos y precisos. Por tanto, se recomienda usar un
lavador de microplacas ELISA de buena calidad, mantenido en condiciones óptimas para ofrecer el mejor
rendimiento de lavado. En general son suficientes no menos de 5 ciclos de lavado automático de
350-400 µl/pocillo para evitar reacciones falsas positivas y un ruido de fondo elevado.
Para evitar contaminaciones cruzadas de la placa con las muestras o el conjugado, después de la incubación no
desechar el contenido de los pocillos pero dejar que el lavador de microplacas lo aspire automáticamente. Asegurar que
los canales de dispensación del líquido de lavado de las microplacas no estén obturados o contaminados y que
continuamente se dispensa un volumen suficiente de solución de lavado en los pocillos.
En el caso de lavado manual sugerimos realizar 5 ciclos de lavado que dispensen 350-400 µl/pocillo y aspiren el
líquido 5 veces. Si se observan resultados insuficientes (ruido de fondo), aumentar los ciclos de lavado o el tiempo
de inmersión por pocillo.
En cualquier caso, el líquido aspirado de las tiras debe tratarse con una solución de hipoclorito sódico a una
concentración final del 2,5% durante 24 horas, antes de eliminarlo adecuadamente.
El tampón de lavado concentrado debe diluirse 1:20 antes del uso. Si no se utiliza la placa completa, preparar el
volumen proporcional de la solución.
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bioelisa
Paso 1
Preparación: Marcar 3 pocillos como control negativo (p. ej., B1, C1, D1), 2 pocillos como control
positivo (p. ej., E1 para HIV-1 y F1 para HIV-2) y un blanco (p. ej., A1; no deben añadirse muestras o
conjugado en el pocillo del blanco). Si los resultados se determinarán utilizando el lector de placas de
longitud de onda doble, puede suprimirse el uso del pocillo del blanco. Utilizar sólo el número de tiras
necesarias para el test.
Paso 2
Adición de la muestra: Añadir 100 μl de las muestras y 100 μl de los controles positivo y negativo
en sus respectivos pocillos.
NOTA: utilizar una punta de pipeta desechable nueva para cada muestra, control negativo y positivo
para evitar la contaminación cruzada.
Paso 3
Incubación de la muestra: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante
30 ± 1 minutos. Se recomienda usar un recipiente con agua controlado con termostato para
garantizar la estabilidad de la temperatura y la humedad durante la incubación. Si se utiliza un
incubador seco, intentar abrir la puerta lo menos posible.
Paso 4
Lavado (1): Después del final de la incubación, retirar y eliminar la lámina adhesiva de la placa.
Lavar cada pocillo 5 (cinco) veces con solución de lavado diluida. Remojar cada vez los
micropocillos durante 30-60 segundos. Después del ciclo de lavado final, volcar la placa sobre
papel secante o un paño limpio y golpear para desprender los restos.
Paso 5
Adición del conjugado: Añadir 100 μl del reactivo conjugado en cada pocillo excepto el del blanco.
Paso 6
Incubación del conjugado: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante
30 ± 1 minutos.
Paso 7
Lavado (2): Como el Paso 4.
Paso 8
Tinción: Añadir 50 μl de solución de cromógeno A y 50 μl de solución de cromógeno B en cada
pocillo, incluido el blanco. Incubar la placa a 37°C durante 15 minutos en oscuridad. La reacción
enzimática entre las soluciones de cromógeno y el conjugado produce un color azul en los pocillos
del control positivo y de la muestra positiva a HIV-1/2.
Paso 9
Parada de la reacción: Con una pipeta multicanal o manualmente, añadir 50 µl de solución de
parada en cada pocillo y mezclar suavemente. Se desarrolla un color amarillo intenso en los pocillos
del control positivo y de la muestra positiva a HIV-1/2.
Paso 10
Medición de la absorbancia: Calibrar el lector de placas con el pocillo del blanco y efectuar la lectura
de la absorbancia a 450 nm. Si se usa un instrumento de filtro doble, ajustar la longitud de onda de
referencia a 620 nm o 630 nm. Calcular el valor umbral y evaluar los resultados. (NOTA: Efectuar la
lectura de la absorbancia en el plazo máximo de 10 minutos después de parar la reacción).
Control de calidad
Se recomienda a los laboratorios establecer un sistema de control de calidad adecuado con material de control de
calidad similar o idéntico a la muestra del paciente a analizar.
-
El valor de la absorbancia del pocillo del blanco, que contiene sólo solución de cromógeno y solución de
parada, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm.
El valor de la absorbancia del control positivo debe ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm después de
restar el blanco.
Cada valor de la absorbancia individual del control negativo debe ser menor que 0,100 a 450/620-630 nm o a
450 nm después de restar el blanco.
Si uno de los valores del control negativo no cumple los criterios del control de calidad, debe desecharse y calcular
de nuevo el valor medio de los dos valores restantes. Si más de un valor de absorbancia del control negativo no
cumple las especificaciones de los límites del control de calidad, el test no es válido y debe repetirse.
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bioelisa
Resultados
Cada microplaca debe considerarse por separado para calcular e interpretar los resultados del análisis,
independientemente del número de placas procesadas al mismo tiempo. Los resultados se calculan relacionando
el valor de la absorbancia (S) de cada muestra con el valor umbral (CO) de la placa. Si la lectura del valor umbral
se hace con el lector de placas de un solo filtro, los resultados se calcularán restando el valor del pocillo A del
blanco de los valores de muestras y controles del informe impreso. En caso de que la lectura se efectúe con un
lector de placas de filtro doble, no restar el valor del pocillo A del blanco de los valores de muestras y controles del
informe impreso.
Calcular el valor umbral añadiendo 0,120 a la absorbancia media del control negativo.
Valor umbral = CNx + 0,120
Ejemplo:
Valor de la absorbancia del pocillo del blanco: A1 = 0,025 a 450 nm (NOTA: el blanco sólo es necesario si se
efectúa la lectura con un filtro simple a 450 nm).
Pocillo n.º:
Control negativo:
Pocillo n.º:
Control positivo:
B1
0,012
E1
2,363
C1
0,010
F1
2,436
D1
0,011
Todos los valores de los controles se encuentran dentro del intervalo del control de calidad declarado.
Cálculo de CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011
Cálculo del valor umbral: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131
Interpretación de los resultados
Dividir la absorbancia de la muestra (S) por el valor umbral (S/CO).
Resultados negativos (S/CO < 1): Las muestras que den una absorbancia inferior al valor umbral son negativas
para este análisis, lo cual indica que no se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2 con el kit bioelisa HIV-1+2 3.0.
Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición a HIV o infección por este virus.
Resultados positivos (S/CO ≥ 1): Las muestras que den una absorbancia igual o superior al valor umbral se
consideran inicialmente reactivas, lo que indica que probablemente se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2
con bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas las muestras inicialmente reactivas deben reanalizarse por duplicado usando
bioelisa HIV-1+2 3.0 antes de la interpretación final de los resultados analíticos. Las muestras repetidamente
reactivas pueden considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0.
Dudosos (S/CO = 0,9-1,1): Las muestras con una relación absorbancia/valor umbral entre 0,9 y 1,1 se consideran
dudosas y es necesario reanalizarlas por duplicado para confirmar los resultados iniciales.
Es necesario seguir, confirmar y realizar análisis complementarios de cualquier muestra positiva con otro sistema
analítico (p. ej., WB, PCR). El diagnóstico clínico no debe establecerse basándose en el resultado de un solo test,
sino que debe integrar datos y resultados clínicos y analíticos.
INTERPRETACIÓN INICIAL DE LOS RESULTADOS Y SEGUIMIENTO DE TODAS LAS MUESTRAS
INICIALMENTE REACTIVAS O DUDOSAS
Rep. por duplicado ○,+○,+
Interpretación +
Seguimiento
○,+○,-
○,-○,-
S/CO ≥ 0,9
S/CO < 0,9
Interpretación IND
-
IND = no interpretable
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-
-
-
Si después de reanalizar las muestras inicialmente reactivas ambos pocillos arrojan resultados negativos
(M/VU < 0,9), estas muestras deben considerarse como positivas no repetibles (o positivos falsos) y registrarse
como negativas. Al igual que con muchos análisis ELISA muy sensibles, pueden aparecer resultados falsos
positivos por diversos motivos, la mayoría de ellos relacionados, entre otros, con un paso de lavado inadecuado.
Para más información sobre la solución de problemas de bioelisa, consulte la Guía de Problemas.
Si después de reanalizar los duplicados uno o ambos pocillos dan resultados positivos, el resultado final de
este análisis ELISA se anotará como repetidamente reactivo. Las muestras repetidamente reactivas pueden
considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 y, por tanto, el paciente está probablemente
infectado con HIV-1/2 y deberá desecharse la unidad de sangre.
Después de reanalizar los duplicados, las muestras con valores cercanos al valor umbral deben interpretarse
con precaución y considerarse como muestra en zona "dudosa" no interpretable en el momento de la prueba.
Limitaciones del procedimiento
1. Los resultados positivos deben confirmarse con otro método disponible e interpretarse conjuntamente con la
información clínica del paciente.
2. Los anticuerpos pueden ser indetectables durante la fase temprana de la enfermedad y en algunas personas
inmunodeprimidas. Por tanto, los resultados negativos obtenidos con bioelisa HIV-1+2 3.0 únicamente indican
que la muestra no contiene un nivel detectable de anticuerpos anti-HIV-1/2 y el resultado negativo no debe
considerarse una prueba concluyente de que la persona no está infectada por HIV-1 o -2.
3. Los errores más frecuentes del análisis son: uso de los kits después de su fecha de caducidad,
procedimientos deficientes de lavado, reactivos contaminados, pasos incorrectos del procedimiento analítico,
aspiración insuficiente durante el lavado, omitir la adición de muestras o reactivos, operación inadecuada con
los equipos de laboratorio, errores de temporización, uso de muestras muy hemolizadas o de muestras que
contienen fibrina o muestras de suero coaguladas de modo incompleto.
4. La prevalencia del marcador afectará al valor pronóstico del análisis.
5. Este análisis no puede utilizarse para analizar plasma conjunto (mixto). bioelisa HIV-1+2 3.0 sólo se ha
evaluado con muestras de suero o plasma individuales.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 es un análisis cualitativo y los resultados no pueden utilizarse para medir
concentraciones de anticuerpos. Este análisis no distingue entre infecciones por HIV-1 o HIV-2.
Características funcionales
El estudio de evaluación, realizado en Alkmaar, Países Bajos, entre abril y noviembre de 2005, demostró las
siguientes características funcionales del bioelisa HIV-1+2 3.0.
La especificidad diagnóstica del kit fue del 99,85%, determinado en todas las muestras negativas (5471) que
fueron investigadas. Examinada sólo en donantes no seleccionados (donantes al azar y donantes por primera vez),
la especificidad fue del 99,92% (IC 95%: 99,84-100%).
Resultados del análisis bioelisa HIV-1+2 3.0 en donantes no seleccionados:
Tipo de muestra
Donante de suero al azar
Donante de plasma al azar
Donante por primera vez
Total
Cantidad
examinada
2654
1400
989
5043
Positivas (S/CO ≥ 1)
Número
%
2
0,08
1
0,07
1
0,10
4
0,08
Negativas (S/CO < 1)
Número
%
2652
99,92
1399
99,93
988
99,90
5039
99,92
Todos las muestras positivas confirmadas para anticuerpos HIV-1, HIV-1 subtipo O y HIV-2 utilizadas en este estudio
también fueron reactivas con bioelisa HIV-1+2 3.0 cuyo resultado fue una sensibilidad diagnóstica del 100%.
Un total de 32 paneles de seroconversión, que representan 210 muestras analizadas. Hay 13 muestras no clasificadas
de PRB918 y PRB917 porque no hay datos de antígeno o determinación de ARN necesarios para la clasificación. 41
muestras clasificadas como negativas. ARN y/o antígeno negativas. 61 muestras clasificadas como seroconversión
temprana. 95 muestras clasificadas como seroconversión.
Los resultados de las pruebas también muestran que bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método de última generación
comparable a la mayoría de los ensayos con marca CE disponibles en la actualidad en el mercado.
Se evaluó la sensibilidad analítica en muestras anti-HIV PeliCheck. La sensibilidad analítica de bioelisa HIV-1+2 3.0
en las diluciones estándar anti-HIV PeliCheck fue comparable a la de otros análisis anti-HIV.
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bioelisa
Especificidad analítica:
Resultados del análisis bioelisa HIV-1+2 3.0 en muestras de pacientes hospitalizados y muestras potenciales de
contaminación cruzada:
Cantidad
examinada
296
101
17
5
5
Tipo de muestra
Mononucleosis
Mujeres embarazadas
FR+
Anti-TPO
Anti-músculo liso
Concentraciones
elevadas de IgG
Total
Positivas (S/CO ≥ 1)
Número
%
4
1,35
0
0
0
0
0
0
0
0
Negativas (S/CO < 1)
Número
%
292
98,65
101
100
17
100
5
100
5
100
4
0
0
4
100
428
4
0,93
424
99,07
En un estudio aparte se obtuvieron los siguientes resultados de la especificidad:
-
Con la implementación del procedimiento de dos pasos se elimina el posible efecto gancho de dosis elevada.
Se han examinado muestras positivas/negativas congeladas para comprobar las interferencias derivadas de
la recogida y el almacenamiento. Las características funcionales de bioelisa HIV-1+2 3.0 no resultaron
afectadas durante al menos 3 ciclos de congelación/descongelación.
Se examinaron muestras de pacientes infectados con virus de la hepatitis A, B, C y E y muestras de pacientes
infectados con Treponema pallidum sin que se observasen reacciones cruzadas.
25 muestras de suero frescos positivos probadas en el INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA
fueron examinadas con el bioelisa HIV-1+2 3.0. Las 25 muestras de sueros frescos positivos han sido
positivas con el bioelisa HIV-1+2 3.0.
Precisión:
Las tablas siguientes representan los resultados de la sensibilidad analítica y la reproducibilidad de
bioelisa HIV-1+2 3.0 controlado con el control de serie PeliSpyMulti-Marker y con una muestra de CC (control de
calidad) interno examinada en cada placa; la dilución 1:2048 del patrón anti-HIV en esta muestra PeliSpy se
detectó sistemáticamente en todas las placas. La muestra de CC interno se detectó siempre en todas las placas.
Resultados de PeliSpyMulti-Marker:
Dilución
n
Media
1:2048
80
3,08
Percentiles
5%
95%
1,76
4,39
Mín.
1,70
Medidos
Máx.
4,96
Resultados de la muestra de CC interno:
n
Media
160
7,71
Percentiles
5%
95%
5,32
10,10
Mín.
4,37
Medidos
Máx.
10,89
ESQUEMA DE EJEMPLO DE LA DISPENSACIÓN DE CONTROLES/MUESTRAS
1
2
3
4
5
6
7
…
…
12
A Blanco
SMP3
B Negativo
…
C Negativo
…
D Negativo
E Positivo (HIV-1)
F Positivo (HIV-2)
G SMP 1
H SMP 2
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bioelisa
bioelisa: Guía de Problemas
Problema
Posibles causas
Solución
1. Controles fuera de
validación.
1a. Temperatura, incubación
o pipeteo incorrecto.
1b. Preparación incorrecta de
reactivos, error en las
diluciones, reactivos no
mezclados
correctamente.
1c. Contaminación cruzada
entre controles.
Comprobar el procedimiento.
Repetir el ensayo.
Repetir el ensayo.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Sin color o poco color al
final del ensayo.
2a.
2b.
2c.
2d.
Pipetear cuidadosamente. No
intercambiar los tapones de
los viales. Repetir el ensayo.
Filtro de lectura
Comprobar que el filtro de
incorrecto.
lectura sea de 450 nm. Si no
se usa filtro de referencia de
620-630 nm, las absorbancias
aumenta aprox. 0,050.
Interferencia en el camino Comprobar el lector. Limpiar o
óptico.
secar el fondo de la
microplaca. Comprobar la
presencia de burbujas de aire.
Repetir la lectura.
Se han utilizado
No utilizar componentes de
componentes de lotes
lotes diferentes puesto que
diferentes
están ajustados para cada
lote en particular.
Reactivos caducados.
Comprobar la caducidad del
kit y sus componentes. No
utilizar un kit o reactivos
caducados.
Uno o más reactivos no
añadidos o añadidos en
Repetir el ensayo.
secuencia incorrecta.
Conjugado inactivo:
Comprobar si ha habido
conservación incorrecta. contaminación, comprobar el
procedimiento. Repetir el
ensayo.
Microplaca inactiva:
Mantener siempre las tiras no
conservación incorrecta. utilizadas dentro de la bolsa
bien cerrada, con el
desecante dentro. Repetir el
ensayo.
Soluciones de cromógeno Usar contenedores
A o B inactivas:
desechables o lavados con
conservación inadecuada. ácido o etanol y aclarar con
El contenedor utilizado
agua desionizada antes de
afecta a la estabilidad del
reutilizarlos. Comprobar el
cromógeno, contaminación procedimiento. Repetir el
cruzada con la solución de ensayo.
parada.
19
3000-1168 R03 08.2015 spa
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bioelisa
bioelisa: Guía de Problemas
Problema
Posibles causas
3. Demasiado color en
todos los pocillos de la
microplaca.
3a. Soluciones de cromógeno Comprobar que las
A o B oxidadas,
soluciones de cromógeno A y
contaminadas
B son incoloras; desechar si
son azules. Usar
contenedores desechables o
lavados con ácido o etanol.
Repetir el ensayo.
3b. Reactivos contaminados Comprobar la contaminación
o preparados de forma
(aspecto turbio). Comprobar
incorrecta
las diluciones. Repetir el
ensayo.
3c. Solución de lavado
Comprobar la calidad del
contaminada (1x).
agua destilada o desionizada
utilizada para preparar la
dilución. Repetir el ensayo.
3d. Lavado insuficiente o no Comprobar el lavador. Llenar
consistente: llenado o
los pocillos con solución de
aspiración insuficiente o lavado casi hasta arriba,
no uniforme. Número
aspirar totalmente.
insuficiente de ciclos de
Incrementar el número de
lavado, dispositivo
ciclos de lavado y tiempo
contaminado.
de remojo. Después de lavar,
invertir la microplaca y secarla
sobre papel secante.
3e. Se ha utilizado solución
Usar únicamente la solución
de lavado de otro
de lavado suministrada con el
fabricante.
kit.
4a. Problemas de lavado.
Véanse 3c, 3d, 3e.
4b. Pipetas mal calibradas o Usar únicamente pipetas
puntas mal encajadas.
calibradas, con puntas bien
Técnica de pipeteo
encajadas y pipetear con
incorrecta.
cuidado, sin burbujas ni
salpicaduras. Repetir el
ensayo.
4c. Reactivos y muestra no
Atemperar muestras y
llevados a temperatura
reactivos y mezclarlos bien
ambiente o mal
antes de utilizarlos.
mezclados antes de usar
4d. Corrientes de aire sobre
Proteger la microplaca de las
la microplaca durante las corrientes de aire.
incubaciones.
4e. Tiempo de adición de
Desarrollar una técnica
muestras o reactivos
uniforme y consistente.
demasiado prolongado.
Inconsistencia en los
intervalos de tiempo.
Burbujas de aire.
4f. Interferencia en el camino Véase 1e.
óptico.
4. Reproducibilidad
deficiente o número
elevado de muestras
reactivas no repetibles.
Solución
20
3000-1168 R03 08.2015 spa
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bioelisa
HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen Humane Immundefizienz-Viren (HIV) Typ 1
(Gruppe M-O) oder Typ 2 in humanen Serum- oder Plasmaproben zur Verwendung in klinischen Laboren
und als Erstlinienassay in Blutbanken.
Zusammenfassung
Serologischer Beweis von Infektionen mit HIV kann durch Testen auf Vorhandensein von HIV-Antigenen oder
-Antikörpern im Serum von Personen, bei denen eine HIV-Infektion vermutet wird, erfolgen. Antigene können
normalerweise nur während der akuten Phase und der symptomatischen Phase von AIDS nachgewiesen werden.
Die Antikörper gegen HIV-1 und/oder HIV-2 können praktisch während des gesamten Infektionszeitraums,
beginnend kurz nach der akuten Phase, anhaltend bis zum Endstadium von AIDS, nachgewiesen werden. Deshalb
ist der Gebrauch von hochempfindlichen Antikörper-Assays der Hauptansatz bei der Serodiagnose einer
HIV-Infektion. Abgesehen von der sexuellen Übertragung ist der Hauptinfektionsweg mit HIV die Bluttransfusion.
HIV kann sowohl in der zellulären als auch der zellfreien Fraktion von menschlichem Blut vorhanden sein. Deshalb
sollten alle Blut- oder Plasmaspenden wegen des Risikos der HIV-Übertragung über infiziertes Blut getestet
werden. Dies kann in wirksamer Weise durch Testen auf die Antiköper gegen HIV-1 und HIV-2 mittels
hochempfindlicher ELISA-Tests erfolgen.
Prinzip
bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ein „Sandwich“-Enzym-Immunassay-Kit mit zwei Inkubationsphasen, bei welchem die
Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit rekombinanten, in E. coli exprimierten HIV-Antigenen (rekombinantes HIV-1
gp41, gp120 und rekombinantes HIV-2 gp-36) beschichtet sind. Zu analysierende Serum- oder Plasmaproben
werden in diese Vertiefungen hinzugefügt. Falls in der Probe spezifische HIV-1/2-Antikörper vorhanden sind,
werden sie stabile Komplexe mit den rekombinanten HIV-Antigenen bilden. Die Vertiefungen werden dann
gewaschen, um ungebundene Serumproteine zu entfernen. Ein zweites Set von rekombinanten Antigenen,
konjugiert mit Peroxidase, welche dieselben Epitope exprimieren, werden in die Vertiefungen hinzugefügt.
Während des zweiten Inkubationsschrittes werden diese Antigene an spezifische Capture-Antikörper binden. Nach
dem zweiten Waschen zur Entfernung von ungebundenem Konjugat werden Chromogenlösungen in die
Vertiefungen hinzugefügt. In Vertiefungen, welche den Antigen-Antiköper-Antigen-„Sandwich“-Immunkomplex
enthalten, werden die farblosen Chromogene vom gebundenem Konjugat hydrolysiert und es entsteht ein blau
gefärbtes Produkt. Nach Blockieren der Reaktion mit Schwefelsäure wechselt die blaue Färbung zu gelb. Die
Intensität der Färbung kann gemessen werden und ist proportional zur Konzentration der HIV-1/2-Antikörper in der
Probe. Vertiefungen, die negative Proben enthalten, bleiben farblos.
Bestandteile
1. MCPL MIKROTITERPLATTE:
12 x 8 Vertiefungen beschichtet mit rekombinanten HIV 1/2-Antigenen (rekombinantes HIV-1 gp41, gp120 und
rekombinantes HIV-2 gp36). Die Mikrotiterstreifen sind nur zum EINMALGEBRAUCH bestimmt. Nicht
verwenden, wenn bei erstmaliger Entnahme aus der Box die Vakuumversiegelung beschädigt ist.
2.
CONTROL + 1 HIV-1-POSITIVKONTROLLE:
HIV-1-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel
und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
3.
CONTROL + 2 HIV-2-POSITIVKONTROLLE:
HIV-2-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel
und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
4.
CONTROL – NEGATIVE KONTROLLE:
Proteinstabilisierender Puffer negativ getestet für HBsAg, and HIV-1,HIV-2, HCV und TP-Antikörper. Enthält
0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel und gelben Farbstoff. Gebrauchsfertig.
5.
CONJ KONJUGAT:
HIV-1 und HIV-2 rekombinante Antigene konjugiert mit Peroxidase. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als
Konservierungsmittel und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
6.
WASH SOLN 20x KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG:
PBS-Pufferkonzentrat pH 7,4 (20x). Enthält Tween-20 als Waschmittel. Vor der Anwendung 1:20 mit
destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnen.
21
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bioelisa
7.
CHROM A CHROMOGENLÖSUNG A:
Harnstoffperoxidlösung. Gebrauchsfertig.
8.
CHROM B CHROMOGENLÖSUNG B:
TMB-Lösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Zitronensäure).
9.
H2SO4 0,5M STOPPLÖSUNG:
0,5M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.
10. SEALS HAFTFOLIEN:
Zum Abdecken der Mikrotiterplatte während der Inkubationen.
11. BAG WIEDERVERSCHLIEßBARER FOLIENBEUTEL:
Zur Lagerung unbenutzter Streifen.
Vorsichtsmaßnahmen
bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt.
Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.
IVD
WARNHINWEIS: Humane Materialien können für die Zubereitung der negativen Kontrollen des Kits verwendet
worden sein. Diese Materialien wurden mit Testkits mit einer akzeptierten Leistungsfähigkeit getestet und für
negativ auf Antikörper gegen HIV 1/2, HCV, TP und HBsAg befundet worden. Es gibt jedoch keine analytische
Methode, die versichern kann, dass infektiöse Agenzien in den Proben oder Reagenzien komplett fehlen. Deshalb
sind Reagenzien und Proben mit extremer Vorsicht, als wären sie imstande, infektiöse Krankheiten zu übertragen,
zu behandeln. Rinderseren wurden angewendet, um positive und negative Kontrollen zu stabilisieren.
Rinderalbumin (BSA) und fetales Kälberserum (FKS) stammen von Tieren aus BSE/TSE-freien Gebieten.
Negative Kontrolle, HIV-1-Positivkontrolle, HIV-2-Positivkontrolle und Konjugat enthalten 0,1% ProClinTM als
Konservierungsmittel. Die zutreffenden Risiko- (R) und Sicherheitssätze (S) sind nachfolgend aufgeführt:
R43 Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich.
S26 Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren.
S28 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser.
S36/37/39 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen).
S60 Dieses Produkt und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen.
Die ELISA-Assays sind zeit- und temperaturempfindlich. Folgen Sie genau den Arbeitsschritten des Tests und
verändern Sie diese nicht, um falsche Ergebnisse zu vermeiden.
1.
Tauschen Sie keine Reagenzien von verschiedenen Chargen oder verwenden Sie keine Reagenzien von
anderen im Handel erhältlichen Kits. Die Bestandteile des Kits sind für optimale Ergebnisse der Tests genau
aufeinander abgestimmt.
2.
Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien innerhalb der auf der Schachtel des Kits angegebenen Gültigkeit
liegen und zur gleichen Charge gehören. Verwenden Sie niemals Reagenzien nach Ablauf des auf den
Aufklebern oder Schachteln angegebenen Haltbarkeitsdatums.
3.
ACHTUNG - ENTSCHEIDENDER SCHRITT: Warten Sie vor Gebrauch ab, bis Reagenzien und Proben
Raumtemperatur (18-30°C) erreicht haben. Vor Anwendung vorsichtig schütteln. Sofort nach Gebrauch wieder
bei 2-8°C aufbewahren.
4.
Benutzen Sie nur ausreichende Volumina von Proben, wie in den Arbeitsschritten beschrieben. Wenn dies
nicht erfolgt, kann das eine niedrige Sensitivität des Assays zur Folge haben.
5.
Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen von außen, da sich Fingerabdrücke und Kratzer störend auf
das Lesen auswirken können. Stellen Sie beim Lesen der Ergebnisse sicher, dass der Boden der Platte
trocken ist und sich keine Luftblasen in den Vertiefungen befinden.
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6.
Lassen Sie niemals zu, dass die Vertiefungen der Mikrotiterplatte nach dem Waschschritt komplett
austrocknen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Vermeiden Sie beim Hinzufügen der
Reagenzien, dass sich Luftblasen bilden.
7.
Vermeiden Sie lange Unterbrechungen zwischen
Arbeitsbedingungen für alle Vertiefungen sicher.
8.
Kalibrieren Sie die Pipette regelmäßig, um die Genauigkeit bei der Verteilung der Proben/Reagenzien
sicherzustellen. Verwenden Sie unterschiedliche Einmal-Pipettenspitzen für jede Probe und jedes Reagens,
um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
9.
Stellen Sie sicher, dass die Inkubationstemperatur im Inkubator 37°C beträgt.
den Arbeitsschritten.
Stellen
Sie
die
gleichen
10. Berühren Sie beim Hinzufügen der Proben den Boden der Vertiefungen nicht mit der Pipettenspitze.
11. Bestimmen Sie die Absorption bei 450 nm oder bei 450/620-630 nm, wenn Sie mit einem Plattenlesegerät
messen.
12. Die enzymatische Aktivität des Konjugats kann durch Staub und reaktionsfähige Chemikalien und Substanzen
wie Natriumhypochlorit, Säuren, Basen etc. beeinflusst werden. Führen Sie den Assay nicht in Gegenwart
dieser Substanzen durch.
13. Bedecken Sie während der Inkubation die Platten nicht mit der Haftfolie, falls Sie automatisierte Ausrüstung
benutzen. Das Abklopfen der Rückstände innerhalb der Platte nach dem Waschen kann ebenfalls
weggelassen werden.
14. Alle Proben humanen Ursprungs sollten als potentiell infektiös betrachtet werden. Genaues Einhalten von
GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) kann die persönliche Sicherheit gewährleisten.
15. Essen, trinken, rauchen Sie niemals und tragen Sie niemals Kosmetika im Assaylabor auf. Pipettieren Sie
keine Lösungen mit dem Mund.
16. Chemikalien sollten nur in Übereinstimmung mit den derzeitigen GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) sowie den
lokalen und nationalen Gesetzgebungen angewendet und entsorgt werden.
17. Die Pipettenspitzen, Reagenzgläser, Streifen und Probenbehälter sollten gesammelt und zur Dekontamination
vor der Entsorgung für mindestens 2 Stunden bei 121°C autoklaviert bzw. 30 Minuten mit 10%
Natriumhypochlorit behandelt werden. Lösungen die Natriumhypochlorit sollten NIEMALS autoklaviert werden.
Das Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich.
18. Einige Reagenzien können Toxizität, Irritation, Verätzungen verursachen oder haben als Ausgangsstoffe
krebserregende Wirkung. Kontakt mit der Haut und der Schleimhaut sollte vermieden werden, aber ist nicht
beschränkt auf die folgenden Reagenzien: Stopplösung, Chromogene und Waschpuffer.
INDIKATOREN FÜR INSTABILITÄTSSCHÄDIGUNG DER REAGENZIEN: Werte der positiven oder negativen
Kontrolle, die außerhalb des angegebenen Qualitätskontrollbereichs liegen, sind Indikatoren für eine mögliche
Schädigung der Reagenzien und/oder Anwender und/oder Gerätefehler. In diesem Fall sollten die Ergebnisse als
ungültig betrachtet werden und die Proben müssen nochmals getestet werden. Im Fall von konstant fehlerhaften
Ergebnissen und nachgewiesener Schädigung oder Instabilität der Reagenzien ersetzen Sie die Reagenzien
umgehend durch neue oder nehmen Sie für weitere Hilfe Kontakt zu Ihrem lokalen Händler oder dem Technischen
Support von biokit auf.
Lagerung und Stabilität
Die Bestandteile des Kits bleiben bis zum Ende des auf dem Aufkleber und der Verpackung angegebenen
Haltbarkeitsdatums stabil, wenn sie zwischen 2-8°C gelagert werden. Frieren Sie das Kit nicht ein. Schützen Sie die
Reagenzien während der Lagerung vor Kontamination mit Mikroorganismen oder Chemikalien, um die maximale
Leistung des bioelisa HIV-1+2 3.0 Kits zu gewährleisten. Die Mikrotiterplattenstreifen können zum separaten Gebrauch
abgetrennt werden. Lagern Sie unbenutzte Vertiefungen oder Streifen in den wiederverschließbaren Folienbeuteln
zusammen mit dem Trocknungsmittel bei 2-8°C. Nachdem die Mikrotiterplatte geöffnet wurde, ist sie einen Monat lang
bei 2-8°C stabil. Die negativ Kontrolle, HIV-1-Positivkontrolle, HIV-2-Positivkontrolle, Konjugat, Chromogenlösung A,
Chromogenlösung B und Stopplösung sind nach dem Öffnen einen Monat lang bei 2-8°C stabil. Die Waschlösung ist
nach dem Verdünnen eine Woche lang bei Raumtemperatur und zwei Wochen lang bei 2-8°C stabil.
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3000-1168 R03 08.2015 ger
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bioelisa
Packungsinhalt
Kit mit 1 Mikrotiterplatte (96 Tests), REF 3000-1168.
Enthält: 1 Mikrotiterplatte, 1 x 1 ml negative Kontrolle, 1 x 1 ml HIV-1-Positivkontrolle, 1 x 1 ml HIV-2-Positivkontrolle,
1 x 12 ml Konjugat, 1 x 50 ml Waschlösung, 1 x 8 ml Chromogenlösung A, 1 x 8 ml Chromogenlösung B,
1 x 8 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien (6 Einheiten).
-
Kit mit 5 Mikrotiterplatten (5 x 96 Tests), REF 3000-1169.
Enthält: 5 Mikrotiterplatten, 3 x 1 ml negative Kontrolle, 3 x 1 ml HIV-1-Positivkontrolle, 3 x 1 ml
HIV-2-Positivkontrolle, 5 x 12 ml Konjugat, 2 x 125 ml Waschlösung, 1 x 60 ml Chromogenlösung A,
1 x 60 ml Chromogenlösung B, 1 x 60 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien (20 Einheiten).
Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material
Destilliertes oder entionisiertes Wasser.
Wegwerfhandschuhe und Zeitmesser.
Geeignete Abfallbehälter für potentiell kontaminierte Materialien.
V-förmige Wegwerfwannen.
Dosiersystem und/oder Pipette (Ein- oder Mehrkanal) und Wegwerfpipettenspitzen.
Saugpapier oder sauberes Handtuch.
Trockeninkubator oder Wasserbad, 37 ± 1°C.
Mikroshaker zum Auflösen und Mischen der Konjugate mit den Proben.
Lesegerät für Mikrotiterplatten mit einem 450 nm Filter. Referenzfilter von 620 nm oder 630 nm sind zu empfehlen.
Manuelles oder automatisiertes Waschsystem.
Entnahme, Transport und Lagerung der Proben
1. Keine besondere Patientenvorbereitung erforderlich. Probenentnahme in Übereinstimmung mit der normalen
Laborpraxis. Es können entweder frische Serum- oder Plasmaproben für diesen Assay benutzt werden. Durch
Venenpunktion entnommenes Blut sollte man natürlich und vollständig gerinnen lassen – das Serum/Plasma
muss so früh wie möglich von dem Koagulat separiert werden, um Hämolyse zu vermeiden. Dies sollte vorsichtig
erfolgen, um sicherzustellen, dass die Serumprobe klar und nicht durch Mikroorganismen verunreinigt ist.
Jegliche sichtbare Partikel sollten durch Zentrifugation bei 3000 rpm (Umdrehungen pro Minute) für 20 Minuten
bei Raumtemperatur oder durch Filtration entfernt werden.
2. In EDTA entnommene Plasmaproben, Natriumcitrat oder Heparin können verwendet werden, jedoch sollten
hochgradig lipämische, ikterische oder hämolytische Proben nicht verwendet werden, da sie falsche
Ergebnisse im Assay ergeben können. Verwenden Sie keine inaktivierten Proben. Dies kann zur Schädigung
des Zielanalyts führen. Proben mit sichtbarer mikrobieller Verunreinigung sollten nie verwendet werden.
3. bioelisa HIV-1+2 3.0 ist NUR zum Testen von Serum- oder Plasmaproben vorgesehen. Nicht zum Testen
von Leichenproben, Speichel, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten oder Mischblut verwenden.
4. Transport und Lagerung: Lagern Sie die Proben bei 2-8°C. Proben, die nicht dazu vorgesehen sind
innerhalb von 3 Tagen untersucht zu werden, sollten eingefroren werden (-20°C oder niedriger). Mehrmaliges
Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Zum Versand sollten die Proben gemäß den lokalen und
internationalen Gesetzen zum Transport von klinischen Proben und ätiologisch Agenzien verpackt und
gekennzeichnet werden.
Automatisierte Verarbeitung
Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten
eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die
erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das
Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der
automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung.
DURCHFÜHRUNG (siehe schematischer Ablauf)
Vorbereitung
Alle Reagenzien müssen vor Beginn des Tests auf Raumtemperatur (20-25°C) gebracht worden sein. Überprüfen
Sie das Waschpufferkonzentrat auf das Vorhandensein von Salzkristallen. Erwärmen Sie auf 37°C, falls sich
Kristalle gebildet haben, um diese aufzulösen. Verdünnen Sie den Waschpuffer 1:20 wie in der Anleitung zum
Wascharbeitsschritt beschrieben. Benutzen Sie destilliertes oder entionisiertes Wasser und reinigen Sie die
Gefäße nur, um den Puffer zu verdünnen. Alle anderen Reagenzien sind GEBRAUCHSFERTIG.
Waschschritt-Anleitung
Eine gutes Waschverfahren ist unverzichtbar, um korrekte und genaue analytische Daten zu erhalten. Daher wird
empfohlen, ein ELISA-Mikrotiterplattenwaschgerät von guter Qualität zu benutzen, das auf dem besten Level von
Waschleistung arbeitet. Im Allgemeinen sind nicht weniger als 5 automatisierte Waschzyklen 350-400 µl/Vertiefung
ausreichend, um falsch-positive Reaktionen und laute Hintergrundgeräusche zu vermeiden.
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bioelisa
Verwerfen Sie den Inhalt der Vertiefungen nicht nach der Inkubation, sondern lassen Sie ihn automatisch vom
Waschgerät aspirieren, um Kreuzkontaminationen der Platte mit Probe oder Konjugat zu verhindern. Stellen Sie sicher,
dass die Flüssigkeitsverteilkanäle des Mikrotiterplattenwaschgeräts nicht verstopft oder verunreinigt sind und dass jedes
Mal ausreichend Volumen von Waschpuffer in die Vertiefungen dosiert wird.
Im Falle von manuellem Waschen empfehlen wir 5 Waschzyklen durchzuführen und 350-400 µl/Vertiefung zu dosieren
und die Flüssigkeit fünfmal zu aspirieren. Erhöhen Sie die Waschzyklen sowie die Durchtränkungszeit pro Vertiefung,
falls schlechte Ergebnisse (hoher Hintergrund) beobachtet werden.
Auf jeden Fall sollte die aus den Streifen aspirierte Flüssigkeit mit Natriumhypochlorit in einer Konzentration von
2,5% für 24 Stunden behandelt werden, bevor sie in geeigneter Weise entsorgt wird.
Das Waschpufferkonzentrat sollte vor Verwendung 1:20 verdünnt werden. Bereiten Sie das proportionale Volumen
der Lösung vor, falls weniger als die gesamte Platte benutzt wird.
Schritt 1
Vorbereitung: Markieren Sie drei Vertiefungen als negative Kontrolle (z. B. B1, C1, D1), zwei
Vertiefungen als positive Kontrolle (z. B. E1 für HIV-1 und F1 für HIV-2) und eine Blindprobe (z. B. A1,
weder Proben noch Konjugat sollten in die Vertiefung der Blindprobe hinzugefügt werden). Wenn die
Ergebnisse mit einem dualen Wellenlängenplattenlesegerät bestimmt werden, kann die Forderung für
den Gebrauch einer Blindprobe weggelassen werden. Benutzen Sie nur die Anzahl der Vertiefungen,
die Sie für den Test benötigen.
Schritt 2
Hinzufügen der Probe: Füllen Sie 100 μl der Probe sowie 100 μl der positiven und negativen
Kontrolle in die entsprechenden Vertiefungen.
ANMERKUNG: Benutzen Sie eine Einmal-Pipettenspitze für jede Probe, negative und positive
Kontrolle, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Schritt 3
Inkubation der Probe: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie sie bei 37°C für
30 ± 1 Minuten. Es wird empfohlen, einen thermostatkontrollierten Wasserbehälter zu verwenden,
um die Temperaturstabilität und Luftfeuchte während der Inkubation zu gewährleisten. Öffnen Sie die
Tür nicht oft, falls ein Trockeninkubator benutzt wird.
Schritt 4
Waschen (1): Entfernen Sie nach Ende der Inkubation die Haftfolie und verwerfen Sie sie. Waschen
Sie jede Vertiefung 5 (fünf) Mal mit verdünntem Waschpuffer. Erlauben Sie jeweils 30-60 Sekunden
Durchtränken der Vertiefungen. Drehen Sie nach dem letzten Waschgang die Platte auf Saugpapier
oder ein sauberes Handtuch um und entfernen Sie jegliche Reste.
Schritt 5
Konjugat hinzufügen: Fügen Sie 100 μl des Konjugats in jede Vertiefung außer der Blindprobe
hinzu.
Schritt 6
Inkubation des Konjugats: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie bei 37°C
für 30 ± 1 Minuten.
Schritt 7
Waschen (2): Wie Schritt 4.
Schritt 8
Färben: Fügen Sie 50 μl Chromogen A- und 50 μl Chromogen B-Lösung in jede Vertiefung
einschließlich der Blindprobe hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 15 Minuten im Dunkeln.
Die Enzymreaktion zwischen den Chromogenlösungen und dem Konjugat produziert eine
Blaufärbung in der positiven Kontrolle und den Vertiefungen der HIV 1/2-positiven Proben.
Schritt 9
Stoppreaktion: Füllen Sie die 50 µl Stopplösung unter Verwendung einer Multikanalpipette oder
manuell in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig. Die positive Kontrolle und HIV 1/2-positive
Proben entwickeln eine intensive Gelbfärbung.
Schritt 10 Messen der Absorption: Kalibrieren Sie das Plattenlesegerät mit der Blindprobe und lesen Sie die
Absorption bei 450 nm. Stellen Sie die Referenzwellenlänge auf 620 nm oder 630 nm, falls ein
Instrument mit dualem Filter benutzt wird. Berechnen Sie den Grenzwert und bewerten Sie die
Ergebnisse. (ANMERKUNG: messen Sie die Extinktion innerhalb von max. 10 Minuten nach
Beenden der Reaktion).
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen, dass jedes Labor ein geeignetes System zur Qualitätskontrolle etabliert, mit Materialien zur
Qualitätskontrolle, die ähnlich oder identisch zu den analysierten Patientenproben sind.
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bioelisa
-
Der Extinktionswert der Blindprobe, welche nur Chromogen und Stopplösung enthält, muss weniger als
0,080 bei 450 nm betragen.
Der Extinktionswert der positiven Kontrolle muss ≥ 0,800 bei 450/620-630 nm oder bei 450 nm nach
Subtrahieren der Blindprobe sein.
Jeder individuelle Extinktionswert der negativen Kontrolle muss weniger als 0,100 bei 450/620-630 nm oder
bei 450 nm nach Subtrahieren der Blindprobe sein.
Falls ein Wert der negativen Kontrollen die Kriterien der Qualitätskontrolle nicht erfüllt, sollte er verworfen werden
und der Mittelwert wieder aus den beiden verbleibenden Werten berechnet werden. Falls mehr als ein
Extinktionswert der negativen Kontrollen die Kriterien des Qualitätskontrollbereichs nicht erfüllen, ist der Test
ungültig und muss wiederholt werden.
Ergebnisse
Jede Mikrotiterplatte muss für die Berechnung und Interpretation der Ergebnisse des Assays separat betrachtet
werden, ungeachtet dessen, wie viele Platten gleichzeitig verarbeitet wurden. Die Ergebnisse werden berechnet,
indem der Extinktionswert (S) jeder Probe mit dem Grenzwert (CO) der Platte ins Verhältnis gesetzt wird. Falls der
Grenzwert auf einem Einfilterplattenlesegerät beruht, sollten die Ergebnisse berechnet werden, indem der A-Wert
der Blindprobe von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen subtrahiert wird. Subtrahieren Sie den
A-Wert der Blindprobe nicht von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen, für den Fall, dass die
Messungen auf einem Dualfilterplattenlesegerät basieren.
Berechnen Sie den Grenzwert, indem Sie zur durchschnittlichen Extinktion der negativen Kontrolle 0,120 addieren.
Grenzwert = NKx + 0,120
Beispiel:
Extinktionswert der Blindprobe: A1= 0,025 bei 450 nm (Anmerkung: Blindprobe ist nur bei Messung mit Einzelfilter
bei 450 nm erforderlich).
Vertiefung-Nr.:
Neg Kontrolle:
Vertiefung-Nr.:
Pos Kontrolle:
B1
0,012
E1
2,363
C1
0,010
F1
2,436
D1
0,011
Alle Kontrollwerte liegen innerhalb des angegebenen Qualitätskontrollbereichs.
Berechnung von NKx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011
Berechnung des Grenzwertes: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131
Auswertung der Ergebnisse
Dividieren Sie die Probenextinktion durch den Grenzwert (S/CO).
Negative Ergebnisse (S/CO < 1): Proben, die eine geringere Extinktion als den Grenzwert ergeben, sind in diesem
Assay negativ, was anzeigt, dass keine Anti-HIV1/2-Antikörper mit dem bioelisa HIV-1+2 3.0 Kit nachgewiesen
wurden. Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit der Exponierung oder Infektion mit HIV nicht aus.
Positive Ergebnisse (S/CO ≥ 1): Proben, die eine Extinktion ergeben, die genauso groß oder größer als der Grenzwert
ist, werden als zunächst als reaktiv betrachtet, was anzeigt, dass Anti-HIV1/2-Antikörper möglicherweise mit bioelisa
HIV-1+2 3.0 nachgewiesen wurden. Alle zunächst reaktiven Proben sollten vor der abschließenden Interpretation der
Assayergebnisse in Doppelwerten wiederholt mittels bioelisa HIV-1+2 3.0 getestet werden. Wiederholt reaktive Proben
können als positiv für Antikörper gegen HIV-1/2 mit bioelisa HIV-1+2 3.0 betrachtet werden.
Zweifelhafte Ergebnisse (S/CO = 0,9-1,1): Proben mit dem Verhältnis von Extinktion zu -Grenzwert zwischen
0,9 und 1,1 werden als zweifelhaft betrachtet. Wiederholtes Testen dieser Proben in Doppelwerten ist erforderlich,
um das erste Ergebnis zu bestätigen.
Follow-up, Bestätigung und zusätzliches Testen jeder positiven Probe mit einem anderen Testsystem (z. B. WB, PCR)
ist erforderlich. Die klinische Diagnose sollte nicht auf einem einzelnen Testergebnis beruhen. Sie sollte klinische und
andere Laborwerte und Befunde einbeziehen.
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bioelisa
INTERPRETATION DER ERSTERGEBNISSE UND FOLLOW-UP ALLER ZUNÄCHST
REAKTIVEN ODER ZWEIFELHAFTEN PROBEN
Rep. Als Doppelwert ○,+○,+
Interpretation +
Follow-up
○,+○,-
○,-○,-
S/CO ≥ 0,9
Interpretation
S/CO < 0,9
IND
-
IND = nicht interpretierbar
-
-
-
Falls nach wiederholtem Testen von zunächst reaktiven Proben beide Vertiefungen ein negatives Ergebnis
aufweisen (S/CO < 0,9), sollten diese Proben als nicht-wiederholt positiv betrachtet werden (oder fasch-positiv)
und als negativ verzeichnet werden. Wie bei vielen sehr empfindlichen ELISA-Assays können falsch-positive
Ergebnisse aus verschiedenen Gründen auftreten; die meisten stehen in Zusammenhang mit unzureichendem
Waschschritt, beschränken sich aber nicht darauf. Für weitere Informationen bezüglich bioelisa-Troubleshooting
konsultieren Sie bitte den bioelisa Leitfaden zur Problemlösung.
Falls nach wiederholtem Testen in Doppelwerten eine oder beide Vertiefungen ein positives Ergebnis haben,
sollte das Endergebnis dieses ELISA-Tests als wiederholt reaktiv verzeichnet werden. Wiederholt reaktive
Proben können als positiv für Antikörper gegen HIV-1/2 betrachtet werden und deshalb ist der Patient
wahrscheinlich mit HIV-1/2 infiziert und das Blut muss verworfen werden.
Nach wiederholtem Testen in Doppelwerten sollten Proben mit Werten nahe am Grenzwert mit Vorsicht interpretiert
werden und als „zweifelhafte“ Probe oder als nicht interpretierbar für den Testzeitraum betrachtet werden.
Begrenzung der Methode
1. Positive Ergebnisse müssen mittels einer anderen erhältlichen Methode bestätigt und in Zusammenhang mit
den klinischen Informationen zum Patienten interpretiert werden.
2. Antikörper können während des frühen Krankheitsstadiums und bei immunsupprimierten Personen nicht
nachweisbar sein. Deshalb sind negative Ergebnisse, die mit bioelisa HIV-1+2 3.0 erhalten wurden, nur ein
Indiz, dass die Probe keine nachweisbaren Level von Anti-HIV-1- oder HIV-2-Antikörper enthält, und alle
negativen Ergebnisse sollten nicht als endgültiger Beweis betrachtet werden, dass eine Person nicht mit HIV-1
oder -2 infiziert ist.
3. Die häufigsten Assay-Fehler sind: Anwenden von Kits nach Ablaufen des Haltbarkeitsdatums, schlechtes
Waschverfahren, verunreinigte Reagenzien, falsche Assay-Arbeitsschritte, ungenügende Aspiration während
des Waschens, Fehler beim Hinzufügen von Proben oder Reagenzien, unangebrachte Anwendung von
Laborinstrumenten, Zeitfehler, Anwendung von stark hämolysierten Proben oder Proben, die Fibrin enthalten,
unvollständig geronnene Serumproben.
4. Die Prävalenz des Markers beeinflusst den Vorhersagewert des Assays.
5. Dieser Assay kann nicht angewendet werden, um Mischplasma zu untersuchen. bioelisa HIV-1+2 3.0 wurde
nur für individuelle Serum- oder Plasmaproben evaluiert.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ein qualitativer Assay und die Ergebnisse können nicht angewendet werden, um
Antikörperkonzentrationen zu bestimmen. Dieser Assay kann nicht zwischen Infektionen mit HIV-1 und HIV-2
unterscheiden.
Charakteristika des Tests
Die Evaluierungsstudie, die in Alkmaar, Niederlande, zwischen April und November 2005 durchgeführt wurde, hat
die folgenden funktionellen Charakteristika von bioelisa HIV-1+2 3.0 gezeigt.
Die diagnostische Spezifität des Kits lag bei 99,85%, wie an allen negativen Proben (5471) bestimmt wurde, die
untersucht wurden. Als nur bei nicht-ausgewählten Spendern untersucht (zufällig und Erstspender) betrug die
Spezifität 99,92% (95% CI 99,84-100%).
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bioelisa
bioelisa HIV-1+2 3.0 Testergebnisse bei nicht-ausgewählten Spendern:
Panel
Zufällig Serumspender
Zufällig Plasmaspender
Erstspender
Gesamt
Anzahl
untersucht
2.654
1.400
989
5.043
Positiv (S/CO ≥ 1)
Anzahl
%
2
0,08
1
0,07
1
0,10
4
Negativ (S/CO < 1)
Anzahl
%
2.652
99,92
1.399
99,93
988
99,90
0,08
5.039
99,92
Alle Proben mit bestätigt positivem Antikörper für HIV-1, HIV-1 Subtyp O und HIV-2, die in dieser Studie benutzt
wurden, waren auch mit bioelisa HIV-1+2 3.0 reaktiv, was eine diagnostische Sensitivität von 100% ergab.
Insgesamt 32 Serokonversionspanels, die 210 getestete Proben darstellen. 13 Proben nicht aus PRB918 und
PRB917 klassifiziert, da keine zur Klassifizierung erforderlichen Daten zur Antigen- oder RNA-Bestimmung
vorliegen. 41 Proben als negativ klassifiziert. RNA- und/oder Antigen-negativ. 61 Proben als frühe Serokonversion
klassifiziert. 95 Proben als Serokonversion klassifiziert.
Die Testergebnisse zeigen auch, dass bioelisa HIV-1+2 3.0 im Vergleich zu den meisten derzeit im Handel
erhältlichen und CE-geprüften Tests dem neuesten Stand der Technik entspricht.
Die analytische Sensitivität wurde anhand von PeliCheck Anti-HIV-Panels bewertet. Die analytische Sensitivität
von bioelisa HIV-1+2 3.0 anhand der PeliCheck Anti-HIV-Standardverdünnungen war vergleichbar mit anderen
Anti-HIV-Assays.
Analytische Spezifität:
bioelisa HIV-1+2 3.0 Testergebnisse von Proben von Krankenhauspatienten und Proben, die potenziell kreuzreaktive
Blutproben enthalten:
Art der Probe
Mononukleose
Schwangere Frau
RF+
Anti-TPO
Anti-glatter Muskel
Erhöhte IgG-Werte
Gesamt
Anzahl
getestet
296
101
17
5
5
4
428
Positiv (S/CO ≥ 1)
Anzahl
%
4
1,35
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
Negativ (S/CO < 1)
Anzahl
%
292
98,65
101
100
17
100
5
100
5
100
4
100
0,93
424
99,07
In einer separaten Studie wurden die folgenden Ergebnisse für Spezifität erhalten:
-
Möglicher Hook-Effekt wird durch die Anwendung des Zwei-Schritt-Verfahrens eliminiert.
Gefrorene positive/negative Proben wurden getestet, um Beeinflussung durch Probengewinnung und
Lagerung zu überprüfen. Die Leistungscharakteristika von bioelisa HIV-1+2 3.0 wurden von wenigstens
3-maligem Einfrieren und Auftauen nicht beeinträchtigt.
Proben von Patienten, die mit Hepatitis-A, -B, -C und -E Viren infiziert sind, sowie Proben von Patienten, die
mit Treponema pallidum infiziert sind, wurden getestet, ohne dass kreuzreaktive Reaktionen beobachtet
wurden.
25 positive frische Serumproben, die am INSTITUT FÜR TROPENMEDIZIN, BELGIEN, getestet wurden,
wurden mit bioelisa HIV-1+2 3.0 getestet. Alle 25 positiven frischen Serumproben fielen unter bioelisa HIV-1+2
3.0 positiv aus.
Präzision:
Die unten stehenden Tabellen zeigen die Ergebnisse der analytischen Sensitivität und Reproduzierbarkeit von
bioelisa HIV-1+2 3.0, die mit PeliSpyMulti-Marker-Kontrolle und mit interner QC-Probe bei jeder Platte getestet
wurde, die 1:2048 Verdünnung des Anti-HIV-Standards in dieser PeliSpy-Probe wurde gleichbleibend bei allen
Platten nachgewiesen. Die interne QC-Probe wurde immer bei allen Platten analysiert.
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bioelisa
Ergebnisse der PeliSpyMulti-Marker:
Verdünnung
n
1:2048
80
Perzentile
5th
95th
1,76
4,39
Durchschnit
t
3,08
Gemessen
Min
Max
1,70
4,96
Ergebnisse der internen QC-Probe:
n
Durchschnitt
160
7,71
Perzentile
5
95th
5,32
10,10
th
Gemessen
Min
Max
4,37
10,89
BEISPIELSCHEMA FÜR DIE VERTEILUNG DER KONTROLLEN/PROBEN
1
2
3
4
5
6
7
…
…
12
A
Blindprobe
SMP3
B
Neg
…
C
Neg
…
D
Neg
E
Pos (HIV-1)
F
Pos (HIV-2)
G
SMP 1
H
SMP 2
29
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bioelisa
bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
Lösung
1. Kontrollen außerhalb
der Validierung.
1a. Temperatur, Inkubation
oder Pipettieren falsch.
1b. Unsachgemäße
Vorbereitung der
Reagenzien, falsche
Verdünnung, Reagenzien
nicht richtig durchgemischt.
1c. Kreuzkontamination
zwischen Kontrollen.
Überprüfen Sie die Arbeitsschritte.
Wiederholen Sie den Assay.
1d. Falscher Lesefilter.
1e. Interferenzen im optischen
Weg.
1f. Es wurden Komponenten
aus unterschiedlichen
Chargen verwendet.
1g. Abgelaufene Reagenzien.
2. Keine oder nur
schwache Färbung am
Ende des Tests.
Pipettieren Sie vorsichtig.
Vertauschen Sie nicht die
Reagenzflaschenverschlüsse.
Überprüfen Sie, ob ein Lesefilter
der Wellenlänge 450 nm eingesetzt
ist. Wird kein Referenzfilter mit 620630 nm eingesetzt, dann erhöht
sich die Extinktion um ca. 0,050.
Überprüfen Sie das Lesegerät.
Reinigen oder trocknen Sie den
Grund der Vertiefungen. Überprüfen
Sie auf Luftblasen. Wiederholen Sie
die Ablesung.
Mischen Sie keine Komponenten
aus unterschiedlichen Chargen, da
diese spezifisch für jede Charge
zusammengestellt sind.
Überprüfen Sie das Verfallsdatum
des Kits und der dazugehörigen
Komponenten. Verwenden Sie
keine Kits oder Reagenzien, deren
Verfallsdatum abgelaufen ist.
2a. Ein oder mehrere
Reagenzien nicht
hinzugefügt oder in der
falschen Reihenfolge
hinzugefügt.
2b. Inaktives Konjugat: Falsche Auf Verunreinigung überprüfen. Die
Konservierung.
Arbeitsschritte überprüfen.
2c. Inaktive Mikrotiterplatte:
Belassen Sie unbenutzte Platten
Falsche Konservierung.
immer gut verschlossen in der Tüte,
die das Trocknungsmittel enthält.
2d. Inaktive
Benutzen Sie Wegwerfbehälter
Chromogenlösungen A
oder waschen Sie sie vor
und/oder B: falsche
Wiederverwendung mit Säure oder
Konservierung. Der benutzte Ethanol und spülen Sie sie mit
Behälter beeinflusst die
entionisiertem Wasser aus.
Chromogenstabilität,
Nochmals die Arbeitsschritte
Kreuzkontamination mit der überprüfen. Wiederholen Sie den
Stopplösung.
Assay.
30
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bioelisa
bioelisa: Leitfaden zur Problemlösung
Problem
Mögliche Ursachen
Lösung
3. Zu viel Farbe in allen
Vertiefungen der
Mikrotiterplatte.
3a. Kontaminierte, oxidierte
Chromogenlösung A
und/oder B
Überprüfen Sie, ob die
Chromogenlösungen A und B
farblos sind, und verwerfen Sie sie
falls blau. Benutzen Sie mit Säure
oder Ethanol gewaschene Behälter
oder Wegwerfbehälter. Wiederholen
Sie den Assay.
Überprüfen Sie auf Kontaminationen
(hinsichtlich Trübung). Überprüfen
Sie die Verdünnungen. Wiederholen
Sie den Assay.
Überprüfen Sie die Qualität des
destillierten oder entionisierten
Wassers, welches zur Herstellung
der Verdünnung verwendet wurde.
Überprüfen Sie das Waschgerät.
Füllen Sie die Vertiefungen mit
Waschlösung bis fast zum Rand
und aspirieren Sie vollständig.
Erhöhen Sie die Anzahl der
Waschzyklen und die
Einweichzeit. Legen Sie die
Mikrotiterplatte nach dem Waschen
auf Saugpapier.
Verwenden Sie nur die mit dem Kit
gelieferte Waschlösung.
3b. Kontaminierte oder falsch
zubereitete Reagenzien.
3c. Kontaminierte
Waschlösung (1x).
4. Schlechte
Reproduzierbarkeit oder
große Anzahl von nicht
wiederholten reaktiven
Proben.
3d. Ungenügendes Waschen
oder nicht konsistentes
Waschen. Füllvolumen
und/oder Aspiration
ungenügend oder
ungleichförmig.
Ungenügende Anzahl von
Waschzyklen,
kontaminiertes Gerät.
3e. Es wurde eine
Waschlösung eines
anderen Herstellers
verwendet.
4a. Waschprobleme.
4b. Schlecht kalibrierte
Pipetten oder schlecht
eingesetzte
Pipettenspitzen.
Unsachgemäße
Pipettiertechnik.
4c. Reagenzien und Probe
nicht bei Raumtemperatur
oder vor Gebrauch
schlecht gemischt.
4d. Luftstrom über der
Mikrotiterplatte während
der Inkubationen.
4e. Zu langer Zeitraum für
Hinzufügen von Proben
und/oder Reagenzien.
Inkonsistente Zeitintervalle.
Luftblasen.
4f. Interferenzen im optischen
Weg.
Siehe 3c, 3d, 3e.
Benutzen Sie nur kalibrierte
Pipetten mit passenden Spitzen und
pipettieren Sie vorsichtig ohne
Blasen und Spritzen. Wiederholen
Sie den Assay.
Lassen Sie die Reagenzien
Raumtemperatur erreichen und
mischen Sie sie vor Gebrauch
gründlich.
Schützen Sie die Mikrotiterplatte vor
Luftströmen.
Entwickeln Sie eine einheitliche,
konsistente Technik.
Siehe 1e.
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bioelisa
LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
Test ELISA pour la détection d’anticorps contre le virus de l'immunodéficience humaine (HIV) de type 1
(groupe M-O) ou de type 2 dans le sérum humain ou les échantillons de plasma pour être utilisé dans les
laboratoires cliniques et comme un dépistage de premier choix dans les centres de transfusion sanguine.
Sommaire
Une preuve sérologique d’infection par le HIV peut être obtenue par des tests pour dépister les antigènes ou les
anticorps HIV présents dans le sérum de sujets susceptibles de présenter une infection par le HIV. L’antigène peut
généralement être détecté aussi bien pendant la phase aiguë que la phase symptomatique du SIDA uniquement.
Les anticorps du virus HIV-1 ou HIV-2 peuvent être détectés pratiquement pendant toute la période d’infection, à
partir de, ou peu de temps après, la phase aiguë, et ce, jusqu’à la phase finale du SIDA. Par conséquent,
l’utilisation de tests d’anticorps extrêmement sensibles constitue la première approche dans le sérodiagnostic de
l’infection par le HIV. Mise à part la transmission sexuelle, la principale voie d’infection du HIV est la transfusion
sanguine. Le HIV peut présenter à la fois des fractions cellulaires et acellulaires du sang humain. Par conséquent,
tous les dons de sang ou de plasma doivent être testés en raison du risque de transmission du HIV par du sang
contaminé. Cela peut être réalisé de manière efficace avec un test ELISA extrêmement sensible pour dépister les
anticorps du HIV-1 et du HIV-2.
Principe
bioelisa HIV-1+2 3.0 est un kit est une méthode immuno-enzymatique directe, de type «sandwich», impliquant
une incubation en deux étapes. Dans ce kit d’essai, les puits de la microplaque sont recouverts d’antigènes du HIV
recombinants exprimés en E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant HIV-2, gp-36). Les échantillons
de plasma ou de sérum à analyser sont versés dans ces puits. Si des anticorps HIV1/2 sont présents dans
l’échantillon, ils formeront des complexes stables avec les antigènes recombinants du HIV. Les micropuits sont
ensuite lavés afin d’enlever les protéines libres de sérum. Un second lot d’antigènes recombinants conjugués à la
peroxydase et exprimant les mêmes épitopes sont placés dans les puits. Pendant la seconde étape d’incubation,
ces antigènes vont se lier aux anticorps spécifiques capturés. Après un deuxième lavage pour enlever le conjugué
libre, des solutions chromogènes sont versées dans les puits. Dans les puits contenant le complexe en sandwich
antigène-anticorps-antigène, les chromogènes incolores sont hydrolysés par le conjugué pour donner un produit de
couleur bleue. La couleur bleue vire au jaune après l’arrêt de la réaction avec de l’acide sulfurique. L’intensité de la
couleur peut être mesurée : elle est proportionnelle à la concentration d’anticorps anti-HIV 1/2 présents dans
l’échantillon. Les puits contenant les échantillons négatifs restent incolores.
Composants
1. MCPL MICROPLAQUE:
12 x 8 puits recouverts d’antigènes recombinants HIV 1/2 (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant
HIV-2 gp36). Les bandelettes de micropuits sont destinées à une UTILISATION UNIQUE. Ne pas utiliser si
l'emballage sous vide a été endommagé lorsque le produit a été retiré pour la première fois de la boîte.
2.
CONTROL + 1 HIV-1 CONTRÔLE POSITIF:
Anticorps du HIV-1 dilués dans la solution tampon stabilisée de protéine. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme
conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi.
3.
CONTROL + 2 HIV-2 CONTRÔLE POSITIF:
Anticorps du HIV-2 dilués dans la solution tampon stabilisée de protéine. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme
4.
CONTROL – CONTRÔLE NÉGATIF:
Solution tampon stabilisée de protéine testée négative pour HBsAg et les anticorps du HIV-1, du HIV-2, du
HCV et du TP. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi.
5.
CONJ CONJUGUÉ:
Antigènes recombinants HIV-1 et HIV-2 conjugués avec la peroxydase. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme
6.
WASH SOLN 20x SOLUTION DE LAVAGE CONCENTRÉE:
Tampon concentré au PBS pH 7,4 (20x). Contient du Tween-20 comme détergent. À diluer 1/20 dans de l’eau
distillée ou désionisée avant utilisation.
32
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1293
bioelisa
7.
CHROM A SOLUTION CHROMOGÈNE A:
Solution de peroxyde d'urée. Prêt à l’emploi.
8.
CHROM B SOLUTION CHROMOGÈNE B:
Solution TMB (tétraméthyle benzidine dissous dans de l’acide citrique).
9.
H2SO4 0,5M SOLUTION D’ARRÊT:
Acide sulfurique solution 0,5M. Prêt à l’emploi.
10. SEALS LAMELLES ADHÉSIVES:
Pour couvrir la microplaque pendant l’incubation.
11. BAG SACHET REFERMABLE:
Pour le stockage des bandelettes non utilisées.
Précautions
bioelisa HIV-1+2 3.0 est destiné à un usage diagnostique IN VITRO.
Utisation réservée aux professionnels.
IVD
AVERTISSEMENT: des matières d’origine humaine ont été utilisées dans la préparation du témoin négatif du kit.
Ces matières ont été testées avec des kits de tests ayant des performances acceptées et ont donné des résultats
négatifs aux anticorps HIV1/2, HCV, TP et HBsAg. Cependant, il n’existe pas de méthode analytique pouvant
garantir que les échantillons ou les réactifs sont totalement exempts d’agents infectieux. C’est pourquoi il convient
de manipuler les réactifs et les échantillons avec une extrême prudence, car ils peuvent transmettre des maladies
infectieuses. Les sérums dérivés de bovins ont été utilisés pour la stabilisation des contrôles positifs et négatifs. La
séralbumine bovine (BSA) et le sérum de veau fœtal (SVF) sont des dérivés d’animaux des zones géographiques
exemptes d’ESB et d’EST.
Le contrôle négatif, contrôle positif HIV-1, contrôle positif HIV-2 et le conjugué contiennent 0,1% de ProClin
comme conservateur. Les phrases de risque (R) et de sécurité (S) appropriés sont énumérées ci-dessous:
TM
R43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau.
S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un
spécialiste.
S28 Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l’eau.
S36/37/39 Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du
visage.
S45 En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l'étiquette).
S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux.
S61 Éviter le rejet dans l'environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de données de sécurité.
Les tests ELISA sont limités dans le temps et sensibles à la température. Afin d’éviter tout résultat erroné, veuillez
suivre strictement les étapes de procédure du test ci-dessous et ne pas les modifier.
1.
N’échangez pas les réactifs entre différents lots et n’utilisez pas de réactifs provenant d’autres kits
commercialisés. Les composants du kit sont précisément adaptés pour un résultat optimal des tests.
2.
Assurez-vous que tous les réactifs ne sont pas périmés en vous référant à la date de péremption indiquée sur
la boîte du kit et vérifiez qu’ils appartiennent tous au même lot. N’utilisez jamais de réactifs au-delà de la date
de péremption mentionnée sur les étiquettes ou les boîtes.
3.
ATTENTION - ÉTAPE IMPORTANTE: attendez que les réactifs et les échantillons prennent une température
ambiante (18 à 30°C) avant utilisation. Secouez légèrement le réactif avant utilisation. Replacez les réactifs et
les échantillons à une température située entre 2 et 8°C immédiatement après utilisation.
4.
Utilisez uniquement la quantité suffisante d’échantillon comme indiqué dans la procédure. Dans le cas
contraire, le test pourrait perdre en sensibilité.
5.
Ne touchez pas l’extérieur du fond des puits; les traces de doigts et les rayures pourraient biaiser les résultats
du test. En lisant les résultats, assurez-vous que le dessous de la plaque est sec et qu’il n’y a pas de bulles
d’air à l’intérieur des puits.
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bioelisa
6.
Ne laissez jamais les puits de la microplaque sécher après le lavage. Passez immédiatement à la prochaine
étape. Évitez la formation de bulles d’air en ajoutant les réactifs.
7.
Évitez les interruptions longues des étapes du test. Assurez-vous de travailler dans les mêmes conditions pour
tous les puits.
8.
Étalonnez la pipette fréquemment pour assurer la précision de la dispensation échantillons/réactifs. Utilisez
des cônes de pipettes jetables pour chaque échantillon ou réactif afin d’éviter les contaminations croisées.
9.
Assurez-vous que la température d’incubation est de 37°C à l’intérieur de l’incubateur.
10. Lorsque vous ajoutez les échantillons, ne touchez pas le fond des puits avec l’embout de la pipette.
11. Lorsque vous étalonnez le lecteur de la plaque, positionnez le niveau d’absorbance à 450 nm ou à
450/620-630 nm.
12. L’activité enzymatique du conjugué pourrait être affectée par la poussière, les agents chimiques et les
substances des réactifs, comme l’hypochlorite de sodium, les acides, les alcalis, etc. Ne procédez pas au test
en présence de ces substances.
13. Si vous utilisez un équipement entièrement automatisé, pendant l’incubation, ne recouvrez pas les plaques
avec la lamelle adhésive. Il n’est pas également nécessaire de recouvrir le produit restant à l’intérieur de la
plaque après le lavage.
14. Tous les échantillons d’origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Respectez
rigoureusement les règles de BPL (bonnes pratiques de laboratoire) afin d’assurer la sécurité du personnel.
15. Ne jamais manger, boire, fumer ou appliquer de cosmétiques dans le laboratoire où le test est réalisé. Ne
jamais pipetter les solutions avec la bouche.
16. Les agents chimiques doivent être manipulés et rejetés uniquement conformément aux BPL (bonnes pratiques
de laboratoire) et aux réglementations locales ou nationales en vigueur.
17. Avant d’être utilisés lors des étapes successives ou d’être jetés, les cônes de pipette, les flacons, les
bandelettes et les conteneurs d’échantillon doivent être collectés et autoclavés pendant 2 heures minimum à
121°C ou traités avec 10% d’hypochlorite de sodium pendant 30 minutes pour décontamination. Les solutions
contenant de l’hypochlorite de sodium ne doivent JAMAIS être autoclavées. La fiche de données de sécurité
(FDS) est disponible sur demande.
18. Certains réactifs peuvent être toxiques et peuvent causer des irritations, des brûlures ou avoir des effets
cancérigènes lorsqu’ils sont utilisés comme matière première. Le contact avec la peau et les muqueuses doit
être évité mais pas limité aux réactifs suivants: solution d’arrêt, chromogènes et tampon de lavage.
INDICATIONS SUR L’INSTABILITÉ ET LA DÉTÉRIORATION DU RÉACTIF: valeurs des contrôles positifs et
négatifs, qui sont en dehors de l’intervalle de contrôle de la qualité, qui sont des indicateurs de détérioration
possible des réactifs voire d’erreurs de la part de l’opérateur ou du matériel. Dans un tel cas, les résultats doivent
être considérés comme invalides et les échantillons retestés. En cas de résultats fréquemment erronés et d’une
détérioration ou d’une instabilité prouvées des réactifs, remplacez immédiatement les réactifs ou contactez votre
distributeur local ou le soutien technique Biokit afin d’obtenir une aide supplémentaire.
Conservation et stabilité
Les composants du kit resteront stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette et le
conditionnement à condition qu’ils soient stockés à une température comprise entre 2 et 8°C. Ne congelez pas.
Afin de garantir des performances optimales du kit bioelisa HIV-1+2 3.0, protégez les réactifs d’une
contamination par un micro-organisme ou par des agents chimiques. Les bandelettes du micropuits peuvent se
détacher afin de les utiliser séparément. Placez les puits ou les bandelettes non utilisés dans le sachet en
plastique refermable avec le déshydratant et stockez à température comprise entre 2 et 8°C. Une fois ouverte, la
microplaque est stable pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. Le contrôle négatif, le contrôle
positif HIV-1, le contrôle positif HIV-2, le conjugué, la solution chromogène A, la solution chromogène B et la
solution d’arrêt, une fois ouverts, sont stables pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. La solution
de lavage, une fois diluée, est stable pendant une semaine à température ambiante ou pendant deux semaines à
une température comprise entre 2 et 8°C.
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bioelisa
Présentations disponibles
Coffret de 1 plaque (96 tests), REF 3000-1168.
Contient: 1 plaque, 1 x 1 ml de contrôle négatif, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-1, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-2,
1 x 12 ml de conjugué, 1 x 50 ml de solution de lavage, 1 x 8 ml de solution chromogène A, 1 x 8 ml de solution
chromogène B, 1 x 8 ml de solution d’arrêt, 1 sachet plastique et des lamelles adhésives (6 unités).
-
Coffret de 5 plaques (5 x 96 tests), REF 3000-1169.
Contient: 5 plaques, 3 x 1 ml de contrôle négatif, 3 x 1 ml de contrôle positif HIV-1, 3 x 1 ml de contrôle positif HIV-2,
5 x 12 ml de conjugué, 2 x 125 ml de solution de lavage, 1 x 60 ml de solution chromogène A, 1 x 60 ml de solution
chromogène B, 1 x 60 ml de solution d’arrêt, 1 sachet plastique et des lamelles adhésives (20 unités).
Matériel nécessaire non fourni
Eau distillée ou désionisée.
Gants jetables et chronomètre.
Conteneur de déchets adapté pour matériaux potentiellement contaminés.
Bacs jetables en forme de « V ».
Système de délivrance ou pipette (simple ou multicanal) et cônes de pipette jetables.
Tissu absorbant ou serviette propre.
Incubateur sec ou bain-marie, 37 ± 1°C.
Microshaker pour dissoudre et mélanger le conjugué avec les échantillons.
Lecteur de microplaque avec un filtre de 450 nm. Un filtre de référence de 620 nm ou 630 nm est
recommandé.
Système de lavage manuel ou automatique.
Prélèvement, transport et conservation des échantillons
1. Aucune préparation spéciale du patient n’est requise. Prélevez les échantillons conformément aux pratiques de
laboratoire habituelles. Des échantillons de sérum frais ou de plasma peuvent être utilisés pour le test. Le sang
prélevé par ponction veineuse doit se coaguler complètement et naturellement – le sérum/plasma doit être
séparé du caillot aussitôt que possible pour éviter l’hémolyse. Il convient de s’assurer que les échantillons de
sérum sont propres et non contaminés par des micro-organismes. Toute particule visible dans l’échantillon doit
être retirée par centrifugation à 3 000 tr/min (tour par minute) pendant 20 minutes à température ambiante ou par
filtration.
2. Les échantillons de plasma prélevés dans l’EDTA, le citrate de sodium ou l’héparine peuvent être utilisés; en
revanche, les échantillons hautement lipémiques, ictériques ou hémolytiques ne doivent pas être
utilisés, car ils peuvent biaiser les résultats du test. N’utilisezpas les échantillons inactifs, car cela pourrait
provoquer la détérioration de l’analyte cible. Les échantillons présentant une contamination microbienne
visible ne doivent jamais être utilisés.
3. bioelisa HIV-1+2 3.0 est conçu UNIQUEMENT pour les tests sur échantillons individuels de sérum ou de
plasma. Ne l’utilisez pas sur des échantillons de cadavre, de salive, d’urine ou de tout autre fluide corporel ou
de sang mis en commun (mélangé).
4. Transport et stockage: stockez les échantillons à une température comprise entre 2 et 8°C. Les échantillons
non utilisés dans le test sous trois jours doivent être congelés (-20°C ou moins). Évitez les cycles de gel-dégel
trop fréquents. Pour le transport, les échantillons doivent être conditionnés et étiquetés conformément aux
règlements locaux et internationaux concernant le transport des échantillons cliniques et des agents
éthologiques.
Traitement automatique
Ce test peut être utilisé de manière automatique ou semi-automatique avec divers instruments. Il est très important
de valider un système automatique pour démontrer que les résultats obtenus sur les échantillons sont équivalents
aux résultats d’un test manuel. Il est recommandé à l’utilisateur de valider l’instrument régulièrement. Si vous
rencontrez des difficultés dans la programmation et le réglage des processeurs automatiques de Biokit, veuillez
contacter votre distributeur.
PROCÉDURE (Voir schéma de la procédure)
Opérations préalables
Portez l’ensemble des réactifs à température ambiante (20 à 25°C) avant de procéder au test. Vérifiez la présence
de cristaux de sels dans le concentré de la solution tampon de lavage. Si des cristaux se sont formés, dissolvez en
chauffant à 37°C jusqu’à leur dissolution. Diluez 1:20 de solution tampon de lavage comme indiqué dans les
instructions de l’étape de lavage. Utilisez de l’eau distillée ou désionisée et lavez uniquement les cuves pour diluer
le tampon. Tous les autres réactifs sont PRÊT A L’EMPLOI.
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Instructions pour l’étape de lavage
Une procédure de lavage optimale est essentielle afin d’obtenir des données analytiques correctes et précises. Il
est donc recommandé d’utiliser un bon système de lavage des plaques ELISA, maintenu à son meilleur niveau de
performances. En général, un minimum de 5 cycles de lavages automatiques de 350 à 400 µl/puits est suffisant
pour éviter les réactions fausses positives et bruit de fond élevé.
Pour prévenir les contaminations croisées de la plaque avec un échantillon ou le conjugué, après l’incubation, ne rejetez
pas le contenu du puits, laissez plutôt le laveur de la microplaque l’aspirer automatiquement. Assurez-vous que les
canaux de distribution de liquide du laveur de la microplaque ne sont pas bloqués ou contaminés et qu’une quantité
suffisante de tampon de lavage est toujours distribuée dans les puits.
En cas de lavage manuel, nous vous recommandons d’effectuer 5 cycles de lavage, en distribuant 350 à 400 µl de
liquide par puits et en aspirant ceux-ci 5 fois de suite. Si vous observez de mauvais résultats (couleurs de fond plus
vives), augmenter les cycles de lavage ou le temps de trempage par puits.
Dans tous les cas, le liquide aspiré par les bandelettes doit être traité avec une solution d’hypochlorite de sodium à une
concentration finale de 2,5% pendant 24 heures, avant de les jeter d’une manière convenable.
Le tampon de lavage concentré doit être dilué à 1:20 avant utilisation. Si la plaque n’est pas utilisée dans sa
totalité, préparez une quantité de solution proportionnelle.
Étape 1
Préparation: marquez trois puits comme contrôle négatif (ex. B1, C1, D1), deux puits comme contrôle
positif (ex. E1 pour HIV-1 et F1 pour HIV-2) et un blanc (ex. A1, ni les échantillons ni le conjugué ne
doivent être versés dans le puits blanc). Si les résultats doivent être lus avec un lecteur de microplaque
à deux longueurs d’onde, l’utilisation du puits blanc peut être omise. Utilisez uniquement le nombre de
bandelettes nécessaire pour le test.
Étape 2
Ajout de l’échantillon: ajoutez 100 μl d’échantillons et 100 μl de contrôle positif et négatif dans leur
puits respectif.
REMARQUE: utilisez un embout de pipette jetable différent pour chaque échantillon et chaque
contrôle positif et négatif afin d’éviter une contamination croisée.
Étape 3
Incubation de l’échantillon: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C
pendant 30 ± 1 minutes. Il est recommandé d’utiliser un récipient avec de l’eau thermorégulé pour
assurer la stabilité de la température et le degré d’humidité pendant l’incubation. Si un incubateur à
sec est utilisé, évitez d’ouvrir la porte à plusieurs reprises.
Étape 4
Lavage (1): à la fin de l’incubation, retirez la lamelle adhésive et jetez-la. Lavez chaque puits 5 (cinq) fois
avec le tampon de lavage dilué. À chaque fois, laissez tremper les puits pendant 30 à 60 secondes.
À la fin du dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur du papier buvard ou une serviette propre et
tapotez pour enlever tout résidu.
Étape 5
Ajout du conjugué: ajoutez 100 μl de réactif conjugué dans chaque puits excepté le blanc.
Étape 6
Incubation du conjugué: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C pendant
30 ± 1 minutes.
Étape 7
Lavage (2): voir étape 4.
Étape 8
Coloration: ajoutez 50 μl de solution chromogène A et 50 μl de solution chromogène B dans chaque
puits, y compris le blanc. Incubez la plaque à 37°C pendant 15 minutes dans le noir. La réaction
enzymatique entre les solutions chromogènesne et le conjugué produit une couleur bleue dans les
puits contenant les échantillons contrôle positif et positifs HIV 1/2.
Étape 9
Réaction d’arrêt: en utilisant une pipette multicanal ou manuelle, ajoutez 50 µl de solution d’arrêt
dans chaque puits et mélangez doucement. Une vive couleur jaune apparaît dans les puits contenant
le contrôle positif et l’échantillon de contrôle positif au HIV 1/2.
Étape 10
Mesure du degré d’absorbance: étalonnez le lecteur de la plaque avec le puits blanc et lisez
l’absorbance à 450 nm. Si vous utilisez un instrument doté d’un double filtre, configurez la longueur
d’onde à 620 nm ou 630 nm. Calculez la valeur seuil et évaluer les résultats. (REMARQUE: lisez
l’absorbance dans un délai maximum de 10 minutes après l’arrêt de la réaction).
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Contrôle de qualité
Il est recommandé que chaque laboratoire établisse un système de contrôle de la qualité avec un matériau
similaire à l’échantillon du patient à analyser.
-
La valeur d’absorbance du puits blanc, qui contient uniquement les solutions de chromogène et d’arrêt, doit
être inférieure à 0,080 à 450 nm.
La valeur d’absorbance du contrôle positif doit être ≥ 0,800 à 450/620-630 nm ou à 450 nm après soustraction
du blanc.
Chaque valeur d’absorbance individuelle du contrôle négatif doit être inférieure à 0,100 à 450/620-630 nm ou
à 450 nm après soustraction du blanc.
Si l’une des valeurs du contrôle négatif ne satisfait pas aux critères de contrôle de la qualité, elle doit être écartée
et la valeur moyenne recalculée en utilisant les deux valeurs restantes. Si plus d’une valeur d’absorbance du
contrôle négatif ne satisfait pas aux spécifications de l’intervalle de contrôle de la qualité, le test est invalide et doit
être renouvelé.
Résultats
Chaque microplaque doit être considérée séparément lorsque vous calculez et interprétez les résultats du test,
indépendamment du nombre de plaques traitées parallèlement. Les résultats sont calculés en confrontant chaque
valeur (S) d’absorbance d’échantillon et la valeur seuil (CO) de la plaque. Si la lecture de la valeur seuil est basée
sur un lecteur de plaque à un filtre, les résultats doivent être calculés en soustrayant la valeur A du puits blanc des
valeurs rapportées des échantillons et des contrôles. Si la lecture est basée sur un lecteur de plaque à deux filtres,
ne soustrayez pas la valeur A du puits blanc des valeurs rapportées des échantillons et des contrôles.
Calculez la valeur seuil en ajoutant 0,120 à l’absorbance moyenne du contrôle négatif.
Seuil = CNx + 0,120
Exemple:
Valeur d’absorbance du puits blanc: A1= 0,025 à 450 nm (REMARQUE: le blanc est requis uniquement pour la
lecture avec un seul filtre à 450 nm)
o
Puits n :
Ctrl nég.:
Puits no:
Ctrl pos.:
B1
0,012
E1
2,363
C1
0,010
F1
2,436
D1
0,011
Toutes les valeurs des contrôles se trouvent dans l’intervalle du contrôle de la qualité susmentionné.
Calcul du CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011
Calcul du seuil: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131
Interprétation des résultats
Divisez l’absorbance de l’échantillon par la valeur seuil. (S/CO)
Résultats négatifs (S/CO < 1): les échantillons présentant une absorbance inférieure à la valeur seuil sont négatifs
pour le test, ce qui indique qu’aucun anticorps anti-HIV 1/2 n’a été détecté avec le kit bioelisa HIV-1+2 3.0.
Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’exposition ou d’infection par le HIV.
Résultats positifs (S/CO ≥ 1): les échantillons présentant une absorbance égale ou supérieure à la valeur seuil sont
considérés comme initialement réactifs, ce qui indique que des anticorps anti-HIV 1/2 ont probablement été détectés
grâce au test bioelisa HIV-1+2 3.0. Tous les échantillons initialement réactifs doivent être retestés deux fois en
utilisant bioelisa HIV-1+2 3.0 avant toute interprétation finale des résultats du test. Des échantillons réactifs à
plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs pour les anticorps du HIV 1/2 avec bioelisa HIV-1+2 3.0.
Douteux (S/CO = 0,9-1,1): les échantillons ayant un rapport d’absorbance-seuil situé entre 0,9 et 1,1 sont
considérés comme douteux; c’est pourquoi il convient de les retester deux fois pour confirmer les résultats initiaux.
Suivi, confirmation et test supplémentaire de tout échantillon positif avec un autre instrument d’analyse (ex. WB,
PCR). Un diagnostic clinique ne doit pas être établi sur la base d’un seul résultat de test. Il doit intégrer des
données cliniques et des données et conclusion d’autres laboratoires.
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bioelisa
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS INITIAUX ET SUIVI DE TOUS LES ÉCHANTILLONS
INITIALEMENT RÉACTIFS OU DOUTEUX
Rép. deux fois
○,+○,+
○,+○,-
○,-○,-
Interprétation +
Suivi
S/CO ≥ 0.9
Interprétation
S/CO < 0.9
IND
-
IND = non interprétable
-
-
-
Si, après avoir retesté les échantillons initialement réactifs, les deux puits présentent des résultats négatifs
(S/CO < 0,9), lesdits échantillons doivent être considérés comme positifs et non répétables (ou, faux positifs) et
enregistrés comme négatifs. Comme avec de nombreux tests ELISA très sensibles, les résultats faux positifs peuvent
survenir en raison de plusieurs facteurs, dont la plupart sont liés notamment à une mauvaise étape de lavage. Pour
plus d’informations concernant les dépannages du test bioelisa, veuillez vous reporter au guide de dépannage.
Si après avoir retesté les échantillons à deux reprises, un puits ou les deux présentent des résultats positifs, le
résultat final du test ELISA doit être enregistré comme réactif à plusieurs reprises. Les échantillons réactifs à
plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs aux anticorps du HIV 1/2; par conséquent, le patient
est probablement infecté par le HIV 1/2 et l’unité de sang peut être écartée.
Après avoir retesté les échantillons à deux reprises, ceux présentant des valeurs proches à la valeur seuil
doivent être interprétés avec prudence et considérés comme échantillon de zone « douteux », ou non
interprétables pendant la durée du test.
Limites de la procédure
1. Les résultats positifs doivent être confirmés avec une autre méthode disponible et interprétés par rapport aux
informations cliniques du patient.
2. Les anticorps peuvent être indétectables pendant la phase initiale de la maladie et chez certains sujets
immunocompromis. Par conséquent, les résultats négatifs obtenus avec bioelisa HIV-1+2 3.0 indiquent
seulement que l’échantillon ne contient pas un taux détectable d’anticorps anti-HIV 1 ou 2 et qu’aucun résultat
ne doit être considéré comme une preuve concluante que le sujet n’est pas infecté par le HIV 1 ou 2.
3. Les erreurs de tests les plus fréquentes sont les suivantes : utilisation de kit dont la date de péremption est
expirée, mauvaises procédures de lavage, réactifs contaminés, étapes de la procédure du test incorrectes,
aspiration insuffisante pendant le lavage, échec dans l’ajout d’échantillons ou de réactifs, manipulation
incorrecte de l’équipement du laboratoire, erreurs de chronométrage, utilisation d’échantillons hautement
hémolysés ou des échantillons contenant de la fibrine, trempage incomplet des échantillons de sérum.
4. La prévalence du marqueur affectera les valeurs prédictives du test.
5. Ce test ne peut pas être utilisé pour le plasma mis en commun (mélangé). bioelisa HIV-1+2 3.0 a été évalué
uniquement avec du sérum individuel ou des échantillons de plasma.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 est un test qualitatif et les résultats ne peuvent donc pas être utilisés pour mesurer les
concentrations d’anticorps. Ce test ne peut pas différencier les infections par le HIV-1 des infections par le HIV-2.
Caractéristiques fonctionnelles
Une étude d’évaluation menée à Alkmaar, Pays-Bas, entre avril et novembre 2005, a démontré les caractéristiques
fonctionnelles du test bioelisa HIV-1+2 3.0 présentées ci-dessous :
La spécificité diagnostique du kit était de 99,85%, telle que déterminée sur tous les échantillons négatifs (5471)
analysés. Lorsqu’elle était testée uniquement sur les donneurs non choisis (donneurs choisis de façon aléatoire et
participant pour la première fois), la spécificité était de 99,92% (95% CI 99,84-100%).
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bioelisa
Résultats du test bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les donneurs non choisis:
Panels
Nombre testé
Donneur de sérum
choisi de façon aléatoire
Donneur de plasma
choisi de façon aléatoire
Donneur participant
pour la première fois
Total
Positif (S/CO ≥ 1)
Nombre
%
Négatif (S/CO < 1)
Nombre
%
2 654
2
0,08
2 652
99,92
1 400
1
0,07
1 399
99,93
989
1
0,10
988
99,90
5 043
4
0,08
5 039
99,92
Tous les panels de HIV-1, HIV-1HIV sous-type O et HIV-2 ont confirmé que les échantillons positifs aux anticorps
ayant été utilisés dans cette étude ont également été testés réactifs avec bioelisa HIV-1+2 3.0, ce qui a engendré
une sensibilité diagnostique de 100%.
Un total de 32 panels de séroconversion, qui représentent 210 échantillons testés. 13 échantillons n'ont pas été
classés du PRB918 et du PRB917 car il n'y a pas de données relatives aux antigènes ou de détermination de
l'ARN requises pour la classification. 41 échantillons classés négatifs. ARN et/ou antigènes négatifs. 61
échantillons classés séroconversion précoce. 95 échantillons classés séroconversion.
Les résultats des tests indiquent également que bioelisa HIV-1+2 3.0 est à la pointe de la technologie par rapport à
la plupart des tests marqués CE actuellement commercialisés.
La sensibilité analytique a été évaluée sur les panels PeliCheck anti-HIV. La sensibilité analytique de
bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les dilutions étalons PeliCheck anti-HIV était comparable aux autres tests anti-HIV.
Spécificité analytique:
Résultat du test bioelisa HIV-1+2 3.0 portant sur des échantillons de patients hospitalisés et des échantillons
potentiels de contamination croisée:
Type d’échantillon
Nombre testé
Mononucléose
Femme enceinte
RF+
Anti-TPO
Antimuscle lisse
Concentration élevée d’IgG
296
101
17
5
5
4
Total
428
Positif (S/CO ≥ 1)
Nombre
%
4
1,35
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
Négatif (S/CO < 1)
Nombre
%
292
98,65
101
100
17
100
5
100
5
100
4
100
0,93
424
99,07
Dans une étude séparée, les résultats de spécificité suivants ont été obtenus:
-
La possibilité d’un effet crochet à haute concentration est écartée en raison de la mise en place d’une
procédure à deux étapes.
Les échantillons positifs/négatifs congelés ont été testés pour vérifier les interférences dues aux prélèvements
et au stockage. Les caractéristiques de performance bioelisa HIV-1+2 3.0 n’étaient pas affectées pendant au
moins 3 cycles de gel/dégel.
Les échantillons prélevés sur des patients infectés par les virus de l’hépatite A,B,C et E tout comme les
échantillons de patients infectés par Treponema pallidum n’ont pas présenté de réactions croisées.
25 échantillons de sérum frais positifs testés à l'INSTITUT DE MÉDECINE TROPICALE (BELGIQUE) ont été
testés avec bioelisa HIV-1+2 3.0. La totalité des 25 échantillons de sérum frais positifs ont été classés positifs
avec bioelisa HIV-1+2 3.0.
Précision:
Les tableaux ci-dessous affichent les résultats de la sensibilité analytique et de reproductibilité du test
bioelisa HIV-1+2 3.0 contrôlés avec PeliSpyMulti-Marker run control et avec un échantillon interne de CQ testé
dans chaque plaque; la dilution 1:2048 de l’étalon anti-HIV dans cet échantillon PeliSpy a été systématiquement
détecté dans chaque plaque. L’échantillon interne de CQ a toujours été détecté dans toutes les plaques.
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bioelisa
Résultats du PeliSpy Multi-Marker:
Dilution
n
Moyenne
1:2048
80
3,08
Centiles
5e
1,76
Mesuré
95e
4,39
Min
1,70
Max
4,96
Résultats de l’échantillon interne de CQ :
A
B
C
D
E
F
G
H
n
Moyenne
160
7,71
Centiles
e
Mesuré
e
5
5,32
95
10,10
Min
4,37
Max
10,89
EXEMPLE DE SCHÉMA DE RÉPARTITION CONTRÔLE/ÉCHANTILLON
1
2
3
4
5
6
7
…
…
12
Blanc
Éch. 3
Nég.
…
Nég.
…
Nég.
Pos. (HIV-1)
Pos. (HIV-2)
Échantillon 1
Échantillon 2
40
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1293
bioelisa
Bioelisa: Guide de problèmes
Problème
Causes éventuelles
Solution
1. Contrôles hors
validation.
1a. Température, incubation
ou pipettage incorrects.
1b. Préparation incorrecte
des réactifs, erreur dans
les dilutions, réactifs non
mélangés correctement.
1c. Contamination croisée
entre contrôles.
Vérifier la procédure. Refaire
le test.
le test.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Incolore ou faible couleur 2a.
à la fin du test.
2b.
2c.
2d.
Pipeter soigneusement. Ne
pas échanger les bouchons
des flacons. Refaire le test.
Filtre de lecture incorrect. S’assurer que le filtre de
lecture soit bien de 450 nm. Si
le filtre de référence de 620630 nm n’est pas utilisé, les
absorbances augmentent
d’environ 50 milliunités.
Interférence sur le chemin Vérifier le lecteur. Nettoyer ou
optique.
sécher le fond des puits.
S’assurer de l’absence de
bulles d’air. Répéter la
lecture.
Des composants de lots
Ne pas utiliser de lots
différents ont été utilisés. différents dans la mesure où
ils sont faits pour chaque lot
en particulier.
Réactifs périmés.
Vérifier la date d’expiration du
coffret. Ne pas utiliser de
coffret ni de réactifs périmés.
Un ou plusieurs réactifs
n’ont pas été ajoutés ou
le test.
l’ont été dans une
séquence erronée.
Conjugué inactif :
Vérifier la contamination.
mauvaise conservation.
Revérifier la procédure.
Refaire le test.
Microplaque inactive :
Toujours conserver les
barrettes non usagées dans
un sac bien fermé, avec le
desséchant à l’intérieur.
Refaire le test.
Solutions chromogène A
Utiliser des conteneurs
ou B inactive(s) :
jetables ou les laver avec de
l’acide ou de l’éthanol et
Le conteneur utilisé altère rincez avec de l’eau
la stabilité du substrat.
désionisée avant réutilisation.
Contamination croisée
Vérifier la procédure.
avec la solution d’arrêt.
Refaire le test.
41
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bioelisa
Bioelisa: Guide de problème
Problème
Causes éventuelles
3. Trop de couleur dans les
puits de la microplaque.
3a. Solutions chromogènes A Vérifier que les solutions
ou B contaminées,
chromogènes A et B sont
oxydées.
incolores, les jeter si elles
sont bleues. Utiliser des
conteneurs préalablement
lavés à l’acide ou à l’éthanol
ou des conteneurs jetables.
Refaire le test.
3b. Réactifs contaminés ou
Vérifier la présence de
mal préparés.
contamination (aspect
turbide). Vérifier les dilutions.
Refaire le test.
3c. Solution de lavage (1x)
Vérifier la qualité de l’eau
contaminée.
distillée ou désionisée utilisée
pour la dilution. Refaire le
test.
3d. Lavage insuffisant ou non Vérifier le lavoir. Vérifier le
consistant: remplissage
lavoir. Remplir les puits
ou aspiration insuffisant
jusqu’en haut et aspirer
ou non uniforme, nombre complètement. Augmenter le
de cycles de lavage
nombre de cycles de lavage
insuffisant. Lavoir
et le temps de trempage.
contaminé.
Taper la plaque inversée
contre le papier buvard.
3e. Une solution de lavage
Utiliser la solution de lavage
d’un autre coffret a été
du biokit.
utilisée.
4a. Problèmes de lavage.
Voir rubriques 3c, 3d, 3e.
4b. Pipettes mal calibrées ou Utiliser des pipettes calibrées
cônes mal encastrés.
avec des cônes bien ajustés.
Technique de pipetage
Pipeter soigneusement sans
incorrecte.
faire de bulles et sans
éclaboussures. Refaire le test.
4c. Réactifs et sérums non
Porter les réactifs à
placés à température
température ambiante et
ambiante ou non
mélanger minutieusement
correctement mélangés
avant utilisation.
avant l’usage.
4d. Courants d’air sur la
Mettre la microplaque à l’abri
microplaque pendant
des courants d’air.
l’incubation.
4e. Trop de temps dans
Développer une technique
l’addition des échantillons uniforme et reproductible.
et/ou des réactifs.
Inconsistance dans les
intervalles de temps,
bulles d’air.
4f. Interférence sur le chemin Voir 1e.
optique.
4. Reproductibilité pauvre
ou élevé nombre
d’échantillons réactifs
qui ne se répètent pas.
Solution
42
3000-1168 R03 08.2015 fre
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bioelisa
VEDI CAMBI RISALTATI
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
Test ELISA per la determinazione degli anticorpi contro i virus dell’immunodeficienza umana (HIV) tipo 1
(gruppo M-O) o tipo 2 nei campioni di siero o plasma umani a uso dei laboratori clinici e come screening di
prima linea nelle banche del sangue.
Sommario
L’evidenza sierologica dell’infezione da HIV si può ottenere mediante analisi finalizzate alle ricerca della presenza
di antigeni o anticorpi HIV nel siero di soggetti in cui si sospetta un’infezione da HIV. In genere, l’antigene può
essere individuato solo durante la fase acuta o la fase sintomatica dell’AIDS. Gli anticorpi contro l’HIV-1 e/o l’HIV-2
possono essere determinati durante l’intero periodo dell’infezione, a partire dalla fase acuta, o appena dopo, e fino
alla fase terminale dell'AIDS. Quindi, l'impiego di test per anticorpi altamente sensibili è l'approccio principale nella
sierodiagnosi dell'infezione da HIV. Oltre alla trasmissione sessuale, la principale via di infezione è rappresentata
dalle trasfusioni di sangue. L'HIV può essere presente sia nelle frazioni cellulari sia in quelle acellulari del sangue
umano. Quindi, tutto il sangue o il plasma proveniente da donazioni deve essere analizzato a causa del rischio di
trasmissione dell’HIV attraverso sangue contaminato. Tale obiettivo può essere perseguito in modo efficace
ricercando gli anticorpi contro l’HIV-1 e l'HIV-2 con test ELISA altamente sensibili.
Principio
Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è un metodo immuno-enzimatico di tipo “sandwich”, in cui i pozzetti di una micropiastra
sono stati ricoperti con antigeni ricombinanti di HIV espressi in E. coli (ricombinanti di HIV-1 gp41 e gp120, e
ricombinante di HIV-2 gp-36). I campioni di siero o plasma da analizzare vengono aggiunti in questi pozzetti. Se nel
campione sono presenti anticorpi specifici anti-HIV1/2, essi formeranno complessi stabili con gli antigeni HIV
ricombinanti. I micropozzetti vengono quindi lavati per rimuovere le proteine sieriche non legate. Nei pozzetti viene
aggiunta una seconda serie di antigeni ricombinanti coniugati con perossidasi che esprimono gli stessi epitopi.
Durante la seconda fase di incubazione, questi antigeni si legheranno agli specifici anticorpi di cattura. Dopo un
secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, vengono aggiunte soluzioni di cromogeno nei pozzetti. Nei
pozzetti contenenti l’mmunocomplesso a “sandwich” antigene-anticorpo-antigene, i cromogeni incolori vengono
idrolizzati da parte del coniugato legato, dando origine ad un prodotto di colore blu. Il colore blu virerà al giallo dopo
l’arresto della reazione con acido solforico. L’intensità del colore può essere misurata e sarà proporzionale alla
concentrazione di anticorpi anti-HIV 1/2 presente nel campione. I pozzetti contenenti campioni negativi rimarranno
incolori.
Componenti
1. MCPL MICROPIASTRA:
12 x 8 pozzetti rivestiti con antigeni HIV 1/2 ricombinanti (HIV-1 gp41 e gp120 ricombinanti, e HIV-2 gp36
ricombinante). Le strisce di micropozzetti sono esclusivamente MONOUSO. Non utilizzare se la sigillatura
sottovuoto è stata danneggiata durante la prima estrazione dalla scatola.
2.
CONTROL + 1 CONTROLLO POSITIVO HIV-1:
Anticorpi anti-HIV-1 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come
conservante e colorante rosso. Pronto all’uso.
3.
CONTROL + 2 CONTROLLO POSITIVO HIV-2:
Anticorpi anti-HIV-2 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come
conservante e colorante rosso. Pronto all’uso.
4.
CONTROL – CONTROLLO NEGATIVO:
Tampone proteico stabilizzato negativo rispetto HBsAg e agli anticorpi anti-HIV-1, anti-HIV-2,
anti-HCV e anti-TP. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come conservante e colorante giallo. Pronto all’uso.
5.
CONJ CONIUGATO:
Antigeni HIV-1 e HIV-2 ricombinanti coniugati con perossidasi. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come
conservante e colorante rosso. Pronto all'uso.
6.
WASH SOLN 20x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA:
Tampone PBS concentrato pH 7,4 (20x). Contiene Tween-20 come detergente. Da diluire 1/20 in acqua
distillata o acqua deionizzata prima dell’uso.
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bioelisa
7.
CHROM A SOLUZIONE DI CROMOGENO A:
Soluzione di perossido di urea. Pronta all’uso.
8.
CHROM B SOLUZIONE DI CROMOGENO B:
Soluzione TMB (tetrametilbenzidina dissolta in acido citrico).
9.
H2SO4 0,5M SOLUZIONE BLOCCANTE:
Acido solforico 0,5M. Pronta all’uso.
10. SEALS FOGLI ADESIVI:
Per coprire la micropiastra durante le incubazioni.
11. BAG SACCHETTO DI PLASTICA:
Per conservare le strisce non adoperate.
Precauzioni
Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è per uso diagnostico IN VITRO.
Solo per uso professionale.
IVD
ATTENZIONE: per la preparazione del controllo negativo di questo kit possono essere stati utilizzati materiali di
origine umana. Questi materiali sono stati testati utilizzando kit con prestazioni accettate e sono risultati negativi
per gli anticorpi contro HIV 1/2, HCV, TP e HBsAg. Tuttavia, poiché non esiste un metodo analitico che possa
garantire la totale assenza di agenti infettivi nei campioni o nei reagenti, occorre trattare reagenti e campioni con
estrema cautela, come se fossero in grado di trasmettere malattie infettive. Per stabilizzare i controlli positivi e
negativi sono stati utilizzati sieri di derivazione bovina. L’albumina sierica bovina (BSA) e il siero fetale di vitello
(FCS) derivano da animali provenienti da aree geografiche dove non è presente BSE/TSE.
Controllo negativo, controllo positivo HIV-1, controllo positivo HIV-2 e coniugato contengono lo 0,1% di
TM
ProClin come conservante. Di seguito sono riportate le indicazioni di rischio (R) e sicurezza (S) appropriate:
R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un
medico.
S28 In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente con abbondante acqua.
S36/37/39 Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia.
S45 In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta).
S60 Questo materiale e il suo contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi.
S61 Non disperdere nell'ambiente. Riferirsi alle istruzioni speciali/ schede informative in materia di sicurezza.
I test ELISA sono sensibili al trascorrere del tempo e alla temperatura. Per evitare risultati non corretti, seguire
rigorosamente le fasi della procedura senza apportare alcuna modifica.
1.
Non scambiare i reagenti provenienti da lotti differenti o impiegare reagenti di altri kit in commercio. I
componenti del kit sono abbinati con precisione al fine di assicurare un’ottimale esecuzione dei test.
2.
Assicurarsi che tutti i reagenti siano entro la data di validità riportata sulla scatola del kit e che appartengano
allo stesso lotto. Non usare mai reagenti oltre la data di scadenza indicata sulle etichette o sulle scatole.
3.
ATTENZIONE! Prima dell’uso, attendere che i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente
(18-30°C). Agitare con delicatezza il reagente prima dell'uso. Riportare ad una temperatura di 2-8°C subito
dopo l’uso.
4.
Usare solo la quantità di campione indicata nella procedura. La mancata osservanza di questa indicazione
può far diminuire la sensibilità del test.
5.
Non toccare la parte inferiore esterna dei pozzetti: impronte o graffi possono interferire con la lettura dei
risultati. Quando si leggono i risultati, assicurarsi che il fondo della piastra sia asciutto e che non vi siano bolle
d'aria all'interno dei pozzetti.
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bioelisa
6.
Evitare che i pozzetti della micropiastra si asciughino dopo il lavaggio. Passare immediatamente alla fase
successiva. Evitare la formazione di bolle d’aria quando si aggiungono i reagenti.
7.
Evitare lunghi intervalli tra le varie fasi del test. Assicurare le stesse condizioni di lavoro per tutti i pozzetti.
8.
Calibrare frequentemente le pipette per assicurare che la distribuzione di campioni/reagenti avvenga in modo
preciso. Usare un puntale per pipette monouso diverso per ciascun campione e reagente, onde evitare
contaminazioni crociate.
9.
Assicurarsi che la temperatura di incubazione all’interno dell’incubatore sia di 37°C.
10. Quando si aggiungono i campioni, non toccare il fondo del pozzetto con il puntale della pipetta.
11. Quando si esegue una misurazione con un lettore di micropiastre, determinare l’assorbanza a 450 nm o a
450/620-630 nm.
12. L’attività enzimatica del coniugato potrebbe essere influenzata da polvere, reattivi chimici e sostanze come
ipoclorito di sodio, acidi, alcali, ecc. Non eseguire il test in presenza di queste sostanze.
13. Se si impiega un’attrezzatura completamente automatica, durante l’incubazione, non coprire le piastre con il
foglio adesivo. Dopo il lavaggio, si può anche evitare di estrarre i residui all’interno della piastra.
14. Tutti i campioni di origine umana devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Una stretta
osservanza delle norme di buona pratica di laboratorio può garantire la sicurezza delle persone.
15. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nel laboratorio di analisi. Non aspirare mai le soluzioni con la
bocca direttamente dalla pipetta.
16. Le sostanze chimiche devono essere maneggiate e smaltite in conformità con le norme di buona pratica di
laboratorio vigenti e con le normative locali o nazionali.
17. I puntali delle pipette, le fiale, le strisce ed i contenitori dei campioni, devono essere raccolti e sterilizzati in
autoclave per almeno 2 ore a 121°C o trattati con ipoclorito di sodio al 10% per 30 minuti per decontaminarle
prima di ogni ulteriore fase di smaltimento. Le soluzioni contenenti ipoclorito di sodio non devono MAI essere
sterilizzate in autoclave. Le Schede di Sicurezza dei Materiali (MSDS) sono disponibili su richiesta.
18. Alcuni reagenti allo stato grezzo possono causare tossicità, irritazione, ustioni o avere un effetto cancerogeno.
Evitare il contatto di cute e mucose con i seguenti reagenti (in via esemplificativa, ma non esaustiva):
soluzione bloccante, cromogeni e tampone di lavaggio.
INDIZI DI INSTABILITÀ E DETERIORAMENTO DEL REAGENTE: i valori dei controlli positivo o negativo al di fuori
del range del controllo di qualità indicato, sono indicatori di un possibile deterioramento dei reagenti e/o di errori
dell’operatore o dell’attrezzatura. In tal caso, i risultati devono essere considerati non validi e i campioni devono
essere nuovamente testati. In caso di risultati erronei costanti e di provato deterioramento o instabilità dei reagenti,
sostituire immediatamente il reagente con uno nuovo o contattare il distributore locale o il supporto tecnico Biokit
per ottenere assistenza.
Conservazione e stabilità
I componenti del kit si manterranno stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta e sulla confezione, se
conservati a 2-8°C. Non congelare. Per assicurare le massime prestazioni del kit bioelisa HIV-1+2 3.0, durante la
conservazione proteggere i reagenti dalla contaminazione da parte di microrganismi o agenti chimici. Le strisce di
micropozzetti si possono rompere ed essere utilizzate separatamente. Conservare i pozzetti o le strisce non
utilizzati nel sacchetto di plastica richiudibile ermeticamente insieme al deumidificante e riportare a 2-8°C. Una
volta aperta, la micropiastra è stabile per un mese a 2-8°C. Dopo l’apertura, il controllo negativo, il controllo
positivo HIV-1, il controllo positivo HIV-2, il coniugato, la soluzione di cromogeno A, la soluzione di cromogeno B e
la soluzione bloccante sono stabili per un mese a 2-8°C. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, è stabile per
una settimana a temperatura ambiente o per due settimane a 2-8°C.
Confezioni disponibili
Kit da 1 piastra (96 test), REF 3000-1168.
Contiene: 1 piastra, 1 x 1 ml controllo negativo, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-2,
1 x 12 ml coniugato, 1 x 50 ml soluzione di lavaggio, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 8 ml soluzione di
cromogeno B, 1 x 8 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi (6 unità).
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bioelisa
-
Kit da 5 piastre (5 x 96 test), REF 3000-1169.
Contiene: 5 piastre, 3 x 1 ml controllo negativo, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-2,
5 x 12 ml coniugato, 2 x 125 ml soluzione di lavaggio, 1 x 60 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 60 ml soluzione di
cromogeno B, 1 x 60 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi (20 unità).
Materiale necessario non incluso
Acqua distillata o deionizzata.
Guanti monouso e timer.
Contenitori adeguati per lo smaltimento di materiali potenzialmente contaminati.
Condotti a V monouso.
Sistema di distribuzione e/o pipetta (singola o multicanale) e puntali per pipetta monouso.
Carta assorbente o asciugamano pulito.
Incubatore a secco o bagno d’acqua, 37 ± 1°C.
Microagitatore per sciogliere e mescolare il coniugato con i campioni.
Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 nm o 630 nm.
Sistema di lavaggio manuale o automatico.
Raccolta, trasporto e conservazione del campione
1. Non è necessaria una particolare preparazione del paziente. Prelevare il campione secondo la normale pratica di
laboratorio. Per il test possono essere utilizzati campioni di siero o plasma freschi. Il sangue prelevato mediante
venipuntura deve essere lasciato coagulare completamente e in modo naturale (il siero/plasma deve essere
separato dal coagulo il più presto possibile per evitare l’emolisi). Prestare particolare attenzione per assicurarsi
che i campioni di siero siano limpidi e non contaminati da microrganismi. Tutte le particelle di materia visibili nel
campione devono essere rimosse mediante centrifugazione a 3000 RPM (giri al minuto) per 20 minuti a
temperatura ambiente o mediante filtraggio.
2. È possibile utilizzare campioni di plasma prelevati in EDTA, citrato di sodio o eparina, ma non si devono
impiegare campioni altamente lipemici, itterici o emolitici poiché possono dare risultati falsi. Non
inattivare a caldo i campioni in quanto ciò potrebbe causare il deterioramento dell’analita bersaglio. Non si
devono mai utilizzare campioni con contaminazione microbica visibile.
3. Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è pensato SOLO per l’analisi di campioni di siero o plasma. Non eseguire il test su
campioni prelevati da cadavere, saliva, urina o altri fluidi corporei, o sangue accumulato (mescolato).
4. Trasporto e conservazione: conservare i campioni a 2-8°C. I campioni che non devono essere analizzati
entro 3 giorni devono essere congelati (-20°C o temperatura inferiore). Evitare ripetuti cicli di
congelamento/scongelamento del campione. Per il trasporto, i campioni devono essere imballati ed etichettati
secondo la vigente normativa locale e internazionale per il trasporto di campioni clinici e agenti etiologici.
Trattamento automatico
Questo test è utilizzabile con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per
dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile
validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori
automatici Biokit, contattare il proprio distributore.
PROCEDURA (vedere schema del procedimento)
Operazioni preliminari
Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25°C) prima di cominciare il test. Controllare il tampone
di lavaggio concentrato per determinare la presenza di cristalli di sale. Se si sono formati cristalli, solubilizzare
riscaldando a 37°C finché i cristalli non si dissolvono. Diluire il tampone di lavaggio 1:20, come indicato nelle
istruzioni per il lavaggio. Utilizzare acqua distillata o deionizzata e solo recipienti puliti per diluire il tampone. Tutti
gli altri reagenti sono PRONTI ALL’USO.
Istruzioni per il lavaggio
Una buona procedura di lavaggio è essenziale per ottenere dati analitici corretti e precisi. Si raccomanda di
utilizzare un lavatore per micropiastre ELISA di buona qualità, mantenuto al miglior livello delle prestazioni di
lavaggio. Generalmente sono necessari almeno 5 cicli di lavaggio automatico da 350-400 µl/pozzetto per evitare
false reazioni positive ed un rumore di fondo elevato.
Per evitare contaminazioni crociate della piastra con campione o coniugato, dopo l’incubazione non eliminare il
contenuto dei pozzetti ma lasciare che il lavatore per micropiastre lo aspiri automaticamente. Assicurarsi che i canali
dispensatori del liquido del lavatore per micropiastre non siano ostruiti o contaminati e che una quantità sufficiente di
tampone di lavaggio venga ogni volta distribuita nei pozzetti.
In caso di lavaggio manuale, si suggerisce di eseguire 5 cicli di lavaggio dispensando 350-400 µl/pozzetto e aspirando il
liquido per 5 volte. Se si osservano scarsi risultati (rumore di fondo più elevato), aumentare i cicli di lavaggio o il tempo di
ammollo dei pozzetti.
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bioelisa
In ogni caso, prima che possa essere smaltito in modo adeguato, il liquido aspirato dalle strisce deve essere
trattato con una soluzione di ipoclorito sodico a una concentrazione finale di 2,5% per 24 ore.
Il tampone di lavaggio concentrato deve essere diluito a 1:20 prima dell’uso. Se non si usa tutta la piastra,
preparare un volume di soluzione proporzionale all’uso.
Fase 1
Preparazione: contrassegnare tre pozzetti come controllo negativo (ad es. B1, C1, D1), due pozzetti
come controllo positivo (ad es. E1 per HIV-1 e F1 per HIV-2) e uno come bianco (ad es. A1, nel
pozzetto del bianco non vanno aggiunti né campioni né coniugato). Se i risultati saranno determinati
mediante l’uso di un lettore di piastra a lunghezza d’onda doppia, si può evitare l'impiego del pozzetto
del bianco. Utilizzare solamente il numero di strisce necessario per il test.
Fase 2
Aggiunta del Campione: aggiungere 100 μl di campioni e 100 μl di controlli positivo e negativo nei
rispettivi pozzetti.
NOTA: usare un puntale monouso per pipetta diverso per ciascun campione, controllo negativo e
positivo per evitare contaminazioni crociate.
Fase 3
Incubazione del campione: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per
30 ± 1 minuti. È consigliabile utilizzare un recipiente con acqua controllata con termostato per
assicurare che temperatura e umidità rimangano stabili durante l’incubazione. Se viene utilizzato un
incubatore a secco, non aprire lo sportello frequentemente.
Fase 4
Lavaggio (1): al termine dell’incubazione, rimuovere ed eliminare il foglio adesivo. Lavare ciascun
pozzetto 5 (cinque) volte con tampone di lavaggio diluito. Lasciare ogni volta i micropozzetti in
ammollo per 30-60 secondi. Dopo l’ultimo ciclo di lavaggio, capovolgere la piastra su carta
assorbente o su un asciugamano pulito e asciugarla per rimuovere eventuali residui.
Fase 5
Aggiunta del coniugato: aggiungere 100 μl di reagente coniugato in ciascun pozzetto, tranne che
in quello del bianco.
Fase 6
Incubazione del coniugato: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per
30 ± 1 minuti.
Fase 7
Lavaggio (2): come nella Fase 4.
Fase 8
Colorazione: aggiungere 50 μl di soluzione di cromogeno A e 50 μl di soluzione di cromogeno B in
ciascun pozzetto, incluso il bianco. Incubare la piastra a 37°C per 15 minuti al riparo dalla luce. La
reazione enzimatica tra le soluzioni di cromogeno ed il coniugato dà luogo a una colorazione blu nei
pozzetti del controllo positivo e dei campioni positivi HIV 1/2.
Fase 9
Reazione bloccante: aggiungere 50 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto manualmente o
impiegando una pipetta multicanale e mescolare delicatamente. Nei pozzetti del controllo positivo e
dei campioni positivi HIV 1/2 si sviluppa un colore giallo intenso.
Fase 10
Misurazione dell’assorbanza: calibrare il lettore di piastra con il pozzetto del bianco e leggere
l’assorbanza a 450 nm. Se viene impiegato uno strumento a doppio filtro, regolare la lunghezza
d’onda di riferimento a 620 nm o 630 nm. Calcolare il valore di soglia e valutare i risultati.
(NOTA: leggere l’assorbanza entro un massimo di 10 minuti dall’arresto della reazione.)
Controllo di qualità
Ciascun laboratorio dovrebbe definire un adeguato sistema di controllo di qualità con materiali di controllo della
qualità simili o identici a quelli del campione dei pazienti analizzato.
-
Il valore di assorbanza del pozzetto del bianco, che contiene solo soluzioni di cromogeno e bloccante, deve
essere inferiore a 0,080 a 450 nm.
Il valore di assorbanza del controllo positivo deve essere ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm dopo la
sottrazione del bianco.
Ogni singolo valore di assorbanza del controllo negativo deve essere inferiore a 0,100 a 450/620-630 nm o
a 450 nm dopo aver sottratto il bianco.
Se uno dei valori del controllo negativo non rientra nei criteri del controllo di qualità, deve essere scartato e il valore
medio va ricalcolato utilizzando i due valori rimanenti. Se più di un valore di assorbanza del controllo negativo non
rientrano nell’intervallo del controllo di qualità, il test non è valido e deve essere ripetuto.
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bioelisa
Risultati
Ciascuna micropiastra deve essere considerata separatamente quando si calcolano e si interpretano i risultati
del test, indipendentemente dal numero di piastre processate contemporaneamente. I risultati vengono calcolati
mettendo in relazione il valore di assorbanza (S) di ciascun campione con il valore di soglia (CO) della piastra.
Se la lettura del valore di soglia si basa su un lettore di piastra a filtro singolo, i risultati vanno calcolati
sottraendo il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Nel caso di un
lettore di piastra a doppio filtro, non si deve sottrarre il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei
campioni e dei controlli.
Calcolare il valore di soglia aggiungendo 0,120 all’assorbanza media del controllo negativo.
Valore di soglia = CNx + 0,120
Esempio:
Valore di assorbanza del pozzetto del bianco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: il pozzetto del bianco è necessario solo
per la lettura con filtro singolo a 450 nm).
Pozzetto n.:
Ctrl Neg:
Pozzetto n.:
Ctrl Pos:
B1
0,012
E1
2,363
C1
0,010
F1
2,436
D1
0,011
Tutti i valori dei controlli sono entro il range del controllo di qualità stabilito.
Calcolo del CNx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011
Calcolo del valore di soglia: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131
Interpretazione dei risultati
Dividere l’assorbanza del campione per il valore di soglia. (S/CO)
Risultati negativi (S/CO < 1): i campioni con un’assorbanza inferiore al valore di soglia sono negativi per questo
test: ciò significa che non sono stati determinati anticorpi anti-HIV 1/2 con il kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Un risultato
negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HIV.
Risultati positivi (S/CO ≥ 1): i campioni con un’assorbanza uguale o maggiore al valore di soglia sono considerati
inizialmente reattivi: ciò indica che, probabilmente, impiegando bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati rilevati anticorpi
anti-HIV 1/2. Prima dell’interpretazione finale dei risultati del test, tutti i campioni inizialmente reattivi devono essere
testati nuovamente in duplicato con bioelisa HIV-1+2 3.0. I campioni ripetutamente reattivi possono essere
considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0.
Dubbi (S/CO = 0,9-1,1): i campioni con un rapporto assorbanza / valore di soglia compreso tra 0,9 e 1,1 sono
considerati dubbi ed è necessario un nuovo test in duplicato di questi campioni per confermare i risultati
iniziali.
Sono necessari follow-up, conferma e test supplementari dei campioni positivi con altri sistemi di analisi
(ad es. WB, PCR). La diagnosi clinica non deve essere stabilita basandosi sul risultato di un singolo test, ma deve
integrare i dati clinici con altri dati e reperti di laboratorio.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI INIZIALI E FOLLOW-UP DI TUTTI I CAMPIONI
INIZIALMENTE REATTIVI O DUBBI
Rip. in duplicato
○,+○,+
Interpretazione +
Follow-up
○,+○,-
○,-○,-
S/CO ≥ 0,9
Interpretazione
S/CO < 0,9
IND
-
IND = non interpretabile
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bioelisa
-
-
-
Se, dopo la ripetizione del test dei campioni inizialmente reattivi, entrambi i pozzetti danno risultati negativi
(S/CO < 0,9), questi campioni devono essere considerati positivi non ripetibili (o falsi positivi) e registrati come
negativi. Come per molti test ELISA molto sensibili, i falsi positivi possono verificarsi per svariate ragioni, la
maggior parte delle quali connesse, ma non limitate, ad un lavaggio inadeguato. Per maggiori informazioni
relative alla risoluzione dei problemi del test bioelisa, fare riferimento alla Guida per la soluzione dei problemi.
Se dopo la ripetizione del test in duplicato, uno o entrambi i pozzetti danno risultati positivi, il risultato finale di
questo test ELISA deve essere registrato come ripetutamente reattivo. I campioni ripetutamente reattivi
possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 e quindi il paziente presenta probabilmente
infezione da HIV 1/2 e l’unità di sangue deve essere smaltita.
Dopo la ripetizione del test in duplicato, campioni con valori prossimi al valore di soglia dovranno essere
interpretati con cautela e considerati come campioni in zona "dubbia" o non interpretabili al momento del test.
Limitazioni della procedura
1. I risultati positivi devono essere confermati con un altro metodo disponibile e interpretati congiuntamente alle
informazioni cliniche del paziente.
2. È possibile che durante la fase iniziale della malattia e in alcuni soggetti immunodepressi gli anticorpi non
siano determinabili. Pertanto, i risultati negativi ottenuti con il test bioelisa HIV-1+2 3.0 indicano soltanto che il
campione non contiene un livello rilevabile di anticorpi anti-HIV 1/2 e che ogni risultato negativo non va
considerato come un’evidenza conclusiva di infezione da HIV-1 o HIV-2.
3. Gli errori più comuni relativi al test sono: impiego di kit scaduti, procedure di lavaggio non corrette, reagenti
contaminati, fasi della procedura non corrette, aspirazione insufficiente durante il lavaggio, mancata aggiunta di
campioni o reagenti, utilizzo inadeguato dell’attrezzatura del laboratorio, errore nel calcolo dei tempi, uso di
campioni altamente emolizzati o di campioni contenenti fibrina, campioni di siero non completamente coagulati.
4. La prevalenza del marker inciderà sui valori predittivi del test.
5. Questo test non può essere utilizzato per analizzare plasma accumulato (mescolato). Il test bioelisa HIV-1+2 3.0
è stato validato solo per l’analisi di campioni di siero o plasma singoli.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 è un test qualitativo ed i risultati non possono essere impiegati per misurare la concentrazione
degli anticorpi. Questo test non consente di effettuare una distinzione tra infezioni da HIV-1 e da HIV-2.
Caratteristiche di funzionalità
Lo studio di valutazione condotto ad Alkmaar, Paesi Bassi, tra aprile e novembre 2005, ha dimostrato le seguenti
caratteristiche di funzionalità di bioelisa HIV-1+2 3.0.
La specificità diagnostica del kit è stata del 99,85% come determinato su tutti i campioni negativi analizzati (5471).
Quando la specificità è stata studiata solo su donatori non selezionati (donatori casuali e alla prima donazione),
è risultata del 99,92% (IC 95%, 99,84-100%).
Risultati del test bioelisa HIV-1+2 3.0 su donatori non selezionati:
Pannello
Donatori casuali siero
Donatori casuali plasma
Donatori alla prima donazione
Totale
Positivo (S/CO ≥ 1)
Numero
%
2
0,08
1
0,07
1
0,10
Numero
testati
2654
1400
989
5043
4
Negativo (S/CO < 1)
Numero
%
2652
99,92
1399
99,93
988
99,90
0,08
5039
99,92
Tutti i pannelli di campioni positivi confermati per gli anticorpi anti-HIV-1, HIV-1 sottotipo O e HIV-2 utilizzati in
questo studio, sono anche risultati reattivi con il test bioelisa HIV-1+2 3.0, determinando una sensibilità
diagnostica del 100%.
Un totale di 32 pannelli di sieroconversione, che rappresentano 210 campioni testati. 13 campioni non classificati
da PRB918 e PRB917 a causa dell'assenza dei dati sulla determinazione dell'RNA o dell'antigene necessari per la
classificazione. 41 campioni classificati come negativi. Negativi per l'RNA e/o l'antigene. 61 campioni classificati
come sieroconversione precoce. 95 campioni classificati come sieroconversione.
I risultati del test mostrano anche che bioelisa HIV-1+2 3.0 è un test all'avanguardia rispetto alla maggior parte dei
test con marchio CE attualmente disponibili sul mercato.
La sensibilità analitica è stata valutata su pannelli anti-HIV PeliCheck. La sensibilità analitica di bioelisa HIV-1+2 3.0
sulle diluizioni standard anti-HIV PeliCheck è risultata comparabile a quella di altri test anti-HIV.
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bioelisa
Specificità analitica:
I risultati del test bioelisa HIV-1+2 3.0 su campioni prelevati da pazienti ospedalizzati e su campioni con possibile
reattività crociata:
Numero di
campioni
testati
296
101
17
5
5
4
Tipo di campione
Mononucleosi
Donna in gravidanza
RF+
Anti-TPO
Anti- muscolo liscio
Livelli di IgG elevati
Totale
428
Positivi (S/CO ≥1)
Negativi (S/CO <1)
Numero
4
0
0
0
0
0
%
1,35
0
0
0
0
0
Numero
292
101
17
5
5
4
%
98,65
100
100
100
100
100
4
0,93
424
99,07
In un altro studio, sono stati ottenuti i seguenti risultati di specificità:
-
Il possibile effetto gancio alle alti dosi viene eliminato a causa dell’esecuzione di una procedura a due fasi.
Sono stati analizzati campioni positivi/negativi congelati per verificare le interferenze dovute al prelievo e alla
conservazione. Non sono stati osservati effetti sulle caratteristiche delle prestazioni di bioelisa HIV-1+2 3.0
per almeno 3 cicli di congelamento/scongelamento.
Sono stati testati campioni prelevati da pazienti con virus dell’epatite A, B, C ed E, nonché campioni prelevati
da pazienti con infezione da Treponema pallidum, e non è stata osservata alcuna reattività crociata.
Con il bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati testati 25 campioni di siero fresco positivi, analizzati presso l'ISTITUTO
DI MEDICINA TROPICALE, BELGIO. Tutti i 25 campioni di siero fresco positivi sono risultati positivi al bioelisa
HIV-1+2 3.0.
Precisione:
Le seguenti tabelle riportano i risultati della sensibilità analitica e della riproducibilità di bioelisa HIV-1+2 3.0 con
run control PeliSpy Multi-Marker e con campione QC interno testato in ciascuna piastra; la diluizione 1:2048 dello
standard anti-HIV in questo campione PeliSpy è stata rilevata in modo coerente in tutte le piastre. In tutte le piastre
è stato sempre determinato un campione QC interno.
Risultati con PeliSpy Multi-Marker:
Diluizione
n
Media
1:2048
80
3,08
Percentili
5°
95°
1,76
4,39
Misurati
Min
1,70
Max
4,96
Risultati con campione QC interno:
n
Media
160
7,71
Percentili
5°
95°
5,32
10,10
Misurati
Min
4,37
Max
10,89
MODELLO DI SCHEMA DELLA DISTRIBUZIONE DEI CONTROLLI/CAMPIONI
1
2
3
4
5
6
7
…
…
12
A
Bianco
CAMP 3
B
Neg
…
C
Neg
…
D
Neg
E
Pos (HIV-1)
F
Pos (HIV-2)
G
CAMP 1
H
CAMP 2
50
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bioelisa
bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi
Problema
Possibili cause
Soluzione
1. Controlli non
convalidanti.
1a. Temperatura,
incubazione o pipettaggio
erronei.
1b. Preparazione erronea dei
reagenti, errore nelle
diluizioni, reagenti non
correttamente mescolati.
1c. crociata Inquinamento
incrociato dei controlli.
Verificare procedimento.
Ripetere il test.
1d.
1e.
1f.
1g.
2. Senza colore o con poco
colore alla fine della
prova.
2a.
2b.
2c.
2d.
Ripetere il test.
Pipettare con attenzione. Non
scambiare i tappi. Ripetere il
test.
Filtro di lettura erroneo.
Controllare che il filtro di
lettura sia di 450 nm. Se non
si usa un filtro di riferimento di
620-630 nm, le assorbanze
aumentano di circa 0,050.
Interferenza nella via
Controllare il lettore. Pulire o
ottica.
asciugare il fondo della
micropiastra. Verificare
l’assenza di bolle d’aria.
Ripetere la lettura.
Sono stati usati
Non utilizzare componenti di
componenti di lotti diversi. lotti diversi dato che sono
dosati per ogni singolo lotto.
Reagenti scaduti.
Controllare la scadenza del kit
e dei suoi componenti. Non
usare kit o reagenti scaduti.
Uno o più reagenti non
sono stati aggiunti o sono Ripetere il test.
stati aggiunti in sequenza
sbagliata.
Coniugato inattivo:
Controllare se vi è stato
conservazione erronea.
inquinamento. Verificare il
procedimento. Ripetere il test.
Micropiastra inattiva:
Conservare sempre le strisce
conservazione erronea.
non utilizzate nel sacchetto
ben chiuso con il
deumidificante dentro.
Ripetere il test.
Soluzioni di cromogeno A Utilizzare contenitori monouso
e/o B inattive:
oppure lavati con acido o
conservazione erronea. Il
etanolo e sciacquati con
contenitore utilizzato
acqua deionizzata prima del
influisce sulla stabilità del
riutilizzo. Verificare il
cromogeno, inquinamento procedimento. Ripetere il test.
incrociato con la soluzione
bloccante.
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bioelisa
bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi
Problema
Possibili cause
Soluzione
3a. Soluzioni di cromogeno A Controllare che le soluzioni di
e/o B contaminate,
cromogeno A e B siano
ossidate.
incolori, scartarle se sono blu.
Utilizzare contenitori lavati con
acido o etanolo oppure
monouso. Ripetere il test.
3b. Reagenti contaminati o
Controllare l’inquinamento
preparati in modo
(aspetto torbido). Controllare
sbagliato.
le diluizioni. Ripetere il test.
3c. Soluzione di lavaggio (1x) Controllare la qualità
inquinata.
dell’acqua distillata o
deionizzata per utilizzata per
preparare la diluizione.
Ripetere il test.
3d. Lavaggio insufficiente o
Controllare il lavatore.
impreciso: riempimento
Riempire i pozzetti fino all’orlo
e/o aspirazione
con la soluzione di lavaggio e
insufficienti o non
aspirare completamente.
uniformi. Numero di cicli
Aumentare il numero dei
di lavaggio insufficiente,
cicli di lavaggio e il tempo di
contaminato lavatore
ammollo. Dopo il lavaggio,
inquinato.
asciugare la micropiastra
capovolta su carta assorbente.
3e. È stata adoperata una
Utilizzare solo la soluzione di
soluzione di lavaggio di
lavaggio fornita con il kit.
differente marca diversa.
4a. Problemi di lavaggio.
4. Troppo colore in tutti i
Vedere 3c, 3d, 3e.
pozzetti della micropiastra. 4b. Pipette calibrate male o
Usare solo pipette calibrate,
puntali incastrati male.
con puntali ben fissati e
Tecnica di pipetaggio
pipettare accuratamente,
erronea.
senza fare bolle né schizzi.
Ripetere il test.
4c. Reagenti e campione non Portare a temperatura
a temperatura ambiente o ambiente i campioni e i
non mescolati
reagenti e miscelare bene
correttamente prima
prima dell’uso.
4d. Correnti d’aria sulla
Mantenere la micropiastra al
micropiastra durante le
riparo dalle correnti d’aria.
incubazioni.
4e. Tempi troppo lunghi
La tecnica deve essere
nell’aggiunta di campioni uniforme e precisa.
e/o reagenti. Imprecisione
negli intervalli di tempo.
Bolle d’aria.
4f. Interferenza nella via
Vedere 1e.
ottica.
3. Troppo colore in tutti i
pozzetti della
micropiastra.
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bioelisa
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
3000-1168
1 x 96 TESTS
3000-1169
5 x 96 TESTS (480)
Teste de ELISA para a detecção de anticorpos dos Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) tipo 1
(grupo M-O) ou tipo 2 em amostras de soro ou plasma humanos em laboratórios clínicos e como teste de
rastreamento de primeira linha nos centros hematológicos.
Sumário
As evidências serológicas de infecção por HIV podem ser obtidas testando a presença de antígenos ou anticorpos
no soro de indivíduos com suspeita de infecção por HIV. Normalmente, o antígeno só pode ser detectado na fase
aguda e na fase sintomática da AIDS. Os anticorpos de HIV-1 e/ou HIV-2 podem ser detectados em praticamente
todo o período de infecção, começando na, ou pouco depois da fase aguda, e durando até a fase final da AIDS.
Assim, o uso de testes de anticorpos altamente sensíveis é a abordagem primária nos serodiagnósticos da
infecção por HIV. Além da transmissão sexual, a principal via de transmissão do HIV é a transfusão sanguínea O
HIV pode estar presente nas frações celulares ou nas frações acelulares do sangue humano. Portanto, todas as
doações de sangue ou plasma devem ser testadas devido ao risco de transmissão de HIV através de sangue
contaminado. Isso pode ser realizado eficazmente testando a presença de anticorpos de HIV-1 e de HIV-2 usando
testes ELISA altamente sensíveis.
Princípio
O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método imunoenzimático direto, de tipo “sanduíche” de dois passos de incubação,
em que os pocinhos de uma microplaca são recobertos com antígenos recombinantes de HIV expressos em
E. coli (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2 recombinante gp-36). As amostras de soro ou plasma são
adicionadas a esses pocinhos para análise. Se estiverem presentes anticorpos específicos de HIV1/2 na amostra,
irão formar complexos estáveis com os antígenos de HIV recombinante. Os micropocinhos são depois lavados
para remover proteínas séricas não ligadas. Adiciona-se aos pocinhos um segundo conjunto de antígenos
recombinantes conjugados com peroxidase e expressando os mesmos epítopos. Durante o segundo passo de
incubação, esses antígenos vão ligar-se a anticorpos capturados específicos. Depois de uma segunda lavagem
para remover o conjugado não ligado, é adicionada uma solução Cromogênica aos pocinhos. Nos pocinhos que
contêm o imunocomplexo do tipo sanduíche antígeno-anticorpo-antígeno, os Cromogênios incolores são
hidrolisados pelo conjugado ligado, a um produto de cor azul. A cor azul muda para amarelo depois do bloqueio da
reação com ácido sulfúrico. A intensidade da cor pode ser medida e é proporcional à concentração de anticorpos
anti-HIV 1/2 da amostra. Os pocinhos que contêm amostras negativas permanecem incolores.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocinhos recobertos com antígenos recombinantes HIV 1/2 (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2
recombinante gp36). As tiras de micropocinhos são para USO ÚNICO. Não utilizar se a vedação a vácuo
estiver danificada ao retirá-las da caixa pela primeira vez.
2.
CONTROL + 1 HIV-1 CONTROLE POSITIVO:
Anticorpos de HIV-1 diluídos em solução tampão estabilizada com proteínas. Contém 0,1% ProClinTM 300 como
conservante e corante vermelho. Pronto para usar.
2.
CONTROL + 2 HIV-2 CONTROLE POSITIVO:
Anticorpos de HIV-2 diluídos em solução tampão estabilizada com proteínas. Contém 0,1% ProClinTM 300 como
4.
CONTROL – CONTROLE NEGATIVO:
Solução tampão estabilizada com proteínas negativa perante HBsAg, HIV-1, HIV-2, HCV e TP. Contém 0,1%
ProClinTM 300 como conservante e corante amarelo. Pronto para usar.
5.
CONJ CONJUGADO:
Antígenos recombinantes HIV-1 e HIV-2 conjugados com peroxidase. Contém 0,1% ProClinTM 300 como
6.
WASH SOLN 20x SOLUÇÃO DE LAVAGEM CONCENTRADA:
Solução tampão PBS concentrada pH 7,4 (20x). Contém Tween-20 como detergente. A diluir 1/20 em água
destilada ou desionizada antes de usar.
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bioelisa
7.
CHROM A SOLUÇÃO CROMOGÊNICA A:
Solução de peróxido de ureia. Pronto para usar.
8.
CHROM B SOLUÇÃO CROMOGÊNICA B:
Solução TMB (Tetrametilbenzidina dissolvida em ácido cítrico).
9.
H2SO4 0,5M SOLUÇÃO DE BLOQUEIO:
Ácido sulfúrico 0,5M. Pronto para usar.
10. SEALS FOLHAS ADESIVAS:
Para recobrir as microplacas durante as incubações.
BOLSAS DE PLÁSTICO:
11. BAG
Para guardar as tiras não utilizadas.
Precauções
O bioelisa HIV-1+2 3.0 é para o diagnóstico IN VITRO.
Para uso exclusivamente por profissionais.
IVD
AVISO: Podem ter sido usados materiais de origem humana na preparação do Controle Negativo do kit. Esses
materiais foram testados com kits de teste com desempenho aceite e considerados negativos a anticorpos de HIV
1/2, HCV, TP e HBsAg. No entanto, não existe qualquer método analítico que possa garantir a ausência total de
agentes infecciosos das amostras ou dos reagentes. Assim, os agentes e as amostras devem ser manuseados
com extrema precaução como se fossem material potencialmente infeccioso. Foram usados soros derivados de
bovinos para estabilizar os controles positivo e negativo. A albumina de soro bovino (BSA) e os soros fetais de
vitela (FCS) são derivados de animais de zonas geográficas isentas de EEB/EET.
O Controle negativo, o controle positivo HIV-1, o controle positivo HIV-2 e o Conjugado contêm 0,1% de
TM
ProClin como conservante. A seguir, indicam-se as frases de risco (R) e de segurança (S) adequadas:
R43 Pode causar sensibilização em contato com a pele.
S26 Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista.
S28 Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente com bastante água.
S36/37/39 Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento protector para os olhos/face adequados.
S45 Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente o médico (se possível mostrar-lhe o rótulo).
S60 Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos.
S61 Evitar a libertação para o ambiente. Obter instruções específicas/fichas de segurança.
Os testes ELISA são sensíveis ao tempo e à temperatura. Para evitar resultados incorretos, cumpra exatamente
os passos do procedimento do teste e não os modifique.
1.
Não troque reagentes de lotes diferentes, nem use reagentes de outros kits à venda no mercado. Os
componentes desse kit correspondem exatamente a um desempenho ótimo dos testes.
2.
Assegure-se que todos os reagentes se encontram no prazo de validade indicado na caixa do kit e são do
mesmo lote. Nunca use reagentes depois da data de validade indicada nas etiquetas ou nas caixas.
3.
PRECAUÇÃO - PASSO CRÍTICO: Deixe que todos os reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente
(18-30ºC) antes de usar. Agite suavemente o reagente antes de usar. Volte a colocar a uma temperatura entre
2 e 8°C imediatamente depois de usar.
4.
Use apenas o volume de amostra suficiente, como indicado nos passos do procedimento. Caso contrário,
pode provocar uma baixa sensibilidade do teste.
5.
Não toque na parte exterior do fundo dos pocinhos; dedadas ou arranhões podem interferir na leitura. Ao ler os
resultados, assegure-se que a parte inferior da placa está seca e que não existem bolhas de ar nos pocinhos.
6.
Nunca deixe os pocinhos da microplaca secarem depois do passo de lavagem. Passe imediatamente para o
passo seguinte. Evite a formação de bolhas de ar quando adicionar os reagentes.
7.
Evite interrupções demoradas entre os passos do teste. Assegure-se que as condições de trabalho são iguais
para todos os pocinhos.
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bioelisa
8.
Calibre a pipeta frequentemente para garantir a exatidão da dispensa das amostras e dos reagentes. Use
ponteiras de pipeta diferentes para cada amostra e reagente para evitar contaminações cruzadas.
9.
Assegure-se que a temperatura da incubação é de 37°C no interior do incubador.
10. Quando adicionar as amostras, não toque na parte inferior do pocinho com a ponteira da pipeta.
11. Quando medir com um leitor de placas, determine a absorvância a 450 nm ou a 450/620-630 nm.
12. A atividade enzimática do Conjugado pode ser afetada por pó, produtos e substâncias químicas como o
hipoclorito de sódio, ácidos, bases, etc. Não efetue o teste na presença dessas substâncias.
13. Se usar equipamento totalmente automatizado, durante a incubação, não tape as placas com a folha adesiva.
A parte de bater na placa para retirar os resíduos depois da lavagem também pode se omitida.
14. Todas as amostras de origem humana devem ser consideradas como potencialmente infecciosas. A adesão
estrita aos regulamentos de Boas Práticas Laboratoriais (GLP) pode garantir a segurança pessoal.
15. Nunca coma, beba, fume ou aplique cosméticos no laboratório de testes. Nunca pipete as soluções com a boca.
16. Os produtos químicos devem ser manuseados e eliminados apenas de acordo com as Boas Práticas
Laboratoriais (GLP) atuais e com os regulamentos nacionais ou locais.
17. As ponteiras das pipetas, os frascos, as tiras e os recipientes das amostras devem ser recolhidos e colocados
em autoclave durante um período nunca inferior a 2 horas a 121°C ou tratados com hipoclorito de sódio a
10% durante 30 minutos para descontaminação, antes de qualquer outro passo de eliminação. As soluções
que contêm hipoclorito de sódio NUNCA devem ser colocadas em autoclave. Ficha de dados de segurança
do material (MSDS) disponível a pedido.
18. Alguns reagentes podem causar toxicidade, irritação, queimaduras ou ter efeitos carcinogênicos como
matérias-primas. O contacto com a pele e as mucosas deve ser evitado e não se limita aos seguintes
reagentes: Solução de bloqueio, os Cromogênios e o Tampão de lavagem.
INDICAÇÕES DE INSTABILIDADE E DETERIORAÇÃO DO REAGENTE: Os valores dos controles Positivo e
Negativo que estão fora do intervalo de controle de qualidade indicado, são indicadores da possível deterioração
dos reagentes e/ou erros do operador ou do equipamento. Nesse caso, os resultados devem ser considerados
inválidos e as amostras devem ser testadas novamente. No caso de resultados errados constantes e deterioração
ou instabilidade comprovada dos reagentes, substitua de imediato os reagentes por um novo reagente ou contate
o distribuidor local ou a assistência técnica do biokit para obter ajuda.
Conservação e estabilidade
Os componentes do kit irão permanecer estáveis até a data de validade indicada na etiqueta e na embalagem quando
armazenados entre 2 e 8°C. Não congelar. Para garantir o máximo desempenho do kit bioelisa HIV-1+2 3.0,
durante o armazenamento, proteja os reagentes de contaminação com microrganismos ou produtos químicos. As
tiras do micropocinhos podem ser separadas para uso individual. Coloque os pocinhos ou as tiras não usados na
bolsa de plástico para armazenamento junto com o dessecante e volte a colocar entre 2 e 8°C. Depois de aberta,
a microplaca é estável durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. O Controle Negativo, o Controle
Positivo HIV-1, o Controle Positivo HIV-2, o Conjugado, a Solução Cromogênica A, a Solução Cromogênica B e a
Solução de Bloqueio, depois de abertos, são estáveis durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. A
Solução de Lavagem, depois de diluída, é estável durante uma semana à temperatura ambiente ou durante duas
semanas a uma temperatura entre 2 e 8°C.
Apresentações disponíveis
Kit de 1 placa (96 testes), REF 3000-1168.
Contendo: 1 placa, 1 x 1 ml controle negativo, 1 x 1 ml controle positivo HIV-1, 1 x 1 ml controle positivo HIV-2,
1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solução de lavagem, 1 x 8 ml solução cromogênica A, 1 x 8 ml solução
cromogênica B, 1 x 8 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas (6 unidades).
-
Kit de 5 placas (5 x 96 testes), REF 3000-1169.
Contendo: 5 placas, 3 x 1 ml controle negativo, 3 x 1 ml controle positivo HIV-1, 3 x 1 ml controle positivo HIV-2,
5 x 12 ml conjugado, 2 x 125 ml solução de lavagem, 1 x 60 ml solução cromogênica A, 1 x 60 ml solução
cromogênica B, 1 x 60 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas (20 unidades).
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3000-1168 R03 08.2015 por
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bioelisa
Material necessário não incluído
Água destilada ou desionizada
Luvas descartáveis e temporizador.
Recipientes de resíduos adequados para material potencialmente contaminado.
Recipientes descartáveis em V.
Sistema de dispensa e/ou pipeta (simples ou multicanal) e ponteiras de pipeta descartáveis.
Tecido absorvente ou toalha limpa.
Incubadora a seco ou em banho-maria, 37 ± 1°C.
Microagitador para dissolver e misturar o conjugado com as amostras.
Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Recomenda-se um filtro de referência de 620 nm ou 630.
Sistema de lavagem manual ou automático.
Coleta, transporte e armazenamento de amostras
1. Não é necessária uma preparação especial do doente. Recolha a amostra de acordo com as práticas
laboratoriais normais. Esse teste permite a utilização de amostras frescas de soro ou plasma. O sangue
coletado por punção venosa deve coagular totalmente de forma natural – o soro ou plasma deve separar-se do
coágulo o mais depressa possível para evitar a hemólise. Devem ser tomadas precauções para garantir que as
amostras de soro são límpidas e não estão contaminadas por microrganismos. Qualquer partícula visível na
amostra deve ser removida por centrifugação a 3000 RPM (rotações por minuto) durante 20 minutos à
temperatura ambiente ou por filtração.
2. Podem ser utilizadas amostras de plasma coletadas em EDTA, citrato de sódio ou heparina, mas não devem
ser usadas amostras altamente lipêmicas, ictéricas ou hemolíticas, pois podem originar resultados falsos
no teste. Não utilizar amostras inativadas. Isso pode causar a deterioração do analito alvo. Nunca devem
ser usadas amostras com contaminação microbinana visível.
3. O bioelisa HIV-1+2 3.0 destina-se APENAS para o teste de amostras individuais de soro ou plasma. Não
usar o teste em amostras de cadáveres, saliva, urina ou outros fluidos corporais ou sangue agrupado
(misturado).
4. Transporte e armazenamento: Armazenar as amostras a uma temperatura entre 2 e 8°C. As amostras que
não sejam testadas em um prazo de 3 dias devem ser congeladas (-20°C ou menos). Devem ser evitados
vários ciclos de congelamento-descongelamento. Para o envio, as amostras devem ser embaladas e
etiquetadas conforme os regulamentos locais e internacionais de transporte de amostras clínicas e agentes
etiológicos.
Processamento automático
Os testes automáticos ou semiautomáticos podem ser realizados com diferentes instrumentos. É muito importante
validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são
equivalentes aos resultados obtidos usando testes manuais. Recomenda-se que o usuário valide periodicamente o
instrumento. Em caso de dificuldade na programação e configuração dos processadores automáticos Biokit,
contate seu distribuidor.
PROCEDIMENTO (Ver esquema do procedimento)
Operações prévias
Deixe que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente (20-25°C) antes de efetuar o teste. Verifique a
presença de cristais de sal no tampão de lavagem concentrado. Se houver formação de cristais, volte a solubilizar
aquecendo a 37°C até que os cristais se dissolvam. Dilua o tampão de lavagem a 1:20 como indicado nas
instruções do passo de lavagem. Use água destilada ou desionizada e apenas recipientes limpos para diluir o
tampão. Todos os outros reagentes estão PRONTOS A USAR.
Instruções do passo de lavagem
É essencial um procedimento de lavagem correto para obter dados analíticos corretos e precisos. Assim,
recomenda-se a utilização de um purificador de microplacas ELISA de boa qualidade e que seja mantido no
melhor nível de desempenho de lavagem. Em geral, é necessário um mínimo de 5 ciclos de lavagem automática
de 350-400 µl/pocinho para evitar reações falsas positivas e uma alta interferência de fundo.
Para evitar contaminações cruzadas da placa com amostra ou conjugado, depois da incubação não destape o
conteúdo dos pocinhos, deixando que o purificador de microplacas o aspire automaticamente. Assegure-se que os
canais de dispensa de líquido do purificador de microplacas não estão bloqueados ou contaminados e que é sempre
dispensado um volume suficiente de tampão de lavagem nos pocinhos.
No caso de lavagem manual, sugerimos que efetue 5 ciclos de lavagem, dispensando 350-400 µl/pocinho e aspirando o
líquido 5 vezes. Se forem observados resultados fracos (alta interferência de fundo), aumente os ciclos de lavagem ou o
tempo de molho por pocinho.
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3000-1168 R03 08.2015 por
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bioelisa
Em qualquer caso, o líquido aspirado para fora das tiras deve ser tratado com uma solução de hipoclorito de sódio
em uma concentração final de 2,5% durante 24 horas, antes de serem eliminadas de forma adequada.
O Tampão de lavagem concentrado deve ser diluído a 1:20 antes de ser usado. Se usar menos de uma placa,
prepare um volume proporcional de solução.
Passo 1
Preparação: Marque três pocinhos como Controle Negativo (por ex., B1, C1, D1), dois pocinhos como
Controlo Positivo (por ex., E1 para HIV-1 e F1 para HIV-2) e um Branco (por ex., A1, não devem ser
adicionadas amostras, nem Conjugado no pocinho Branco). Se for usado um leitor de placas com
duplo comprimento de onda, o requisito de uso de Branco pode ser omitido. Use apenas o número de
tiras necessário para o teste.
Passo 2
Adicionar a amostra: Adicione 100 μl de amostras e 100 μl de controles Positivo e Negativo nos
respectivos pocinhos.
NOTA: Use uma ponteira de pipeta descartável separada para cada amostra, Controle Positivo e
Negativo para evitar contaminação cruzada.
Passo 3
Incubar a amostra: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante
30 ± 1 minutos. Recomenda-se a utilização de um recipiente com água controlado por termostato
para garantir a estabilidade da temperatura e da umidade durante a incubação. Se usar uma
incubadora a seco, não abra a porta frequentemente
Passo 4
Lavagem (1): Depois do final da incubação, retire e elimine a folha adesiva. Lave bem cada um dos
pocinhos 5 (cinco) vezes com Tampão de lavagem diluído. Deixe sempre os micropoços embebidos
durante 30 a 60 segundos. Depois do ciclo de lavagem final, volte a placa para baixo em papel
absorvente ou em uma toalha limpa e bata para remover todo o conteúdo.
Passo 5
Adicionar o Conjugado: Adicione 100 μl de Reagente conjugado em cada pocinho, exceto o Branco.
Passo 6
Incubar o Conjugado: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante
30 ± 1 minutos.
Passo 7
Lavagem (2): Como o Passo 4.
Passo 8
Coloração: Adicione 50 μl da solução Cromogênica A e 50 μl da solução Cromogênica B em cada
poço, incluindo o Branco. Faça a incubação da placa a 37°C durante 15 minutos, evitando a luz.
A reação enzimática entre as soluções Cromogênicas e o Conjugado produz uma cor azul nos
pocinhos do controle Positivo e de amostras positivas para HIV 1/2.
Passo 9
Reação de Bloqueio: Usando uma pipeta multicanal ou manualmente, adicione 50 µl de Solução de
bloqueio em cada pocinho e misture suavemente. Desenvolve-se uma cor amarela intensa nos
pocinhos do controlo Positivo e da amostra positiva para HIV 1/2.
Passo 10
Medição da Absorvância: Calibre o leitor de placas com o pocinho Branco e leia a absorvância a
450 nm. Se usar um instrumento de filtro duplo, defina o comprimento de onda de referência para
620 nm ou 630 nm. Calcule o valor do Cut-off e avalie os resultados. (NOTA: leia a absorvância no
prazo máximo de 10 minutos depois do bloqueio da reação).
Controle de qualidade
Recomenda-se que cada laboratório defina um sistema de controle de qualidade adequado com material de
controle de qualidade semelhante ou idêntico à amostra do doente que está a ser analisada.
-
O valor da Absorvância do pocinho Branco, que contém apenas Cromagênio e a Solução de bloqueio, deve
ser inferior a 0,080 a 450 nm.
O valor da Absorvância do controle Positivo deve ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm ou a 450 nm depois de ser
subtraído o branco.
Cada valor da Absorvância individual do controle Negativo deve ser inferior a 0,100 a 450/620-630 nm ou a
450 nm depois de ser subtraído o branco.
Se um dos valores do controle Negativo não cumprir os critérios de Controle de Qualidade, deverá ser eliminado e
o valor médio deverá ser novamente calculado usado os dois valores restantes. Se as especificações do Intervalo
do Controle de Qualidade não forem cumpridas por mais de um valor de Absorvância do controlo Negativo, o teste
não será válido e deverá ser repetido.
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bioelisa
Resultados
Cada microplaca dever ser considerada separadamente quando os resultados do teste são calculados e
interpretados, independentemente do número de placas processadas em simultâneo. Os resultados são
calculados relacionando o valor da absorvância (S) de cada amostra com o valor do Cut-off (CO) da placa. Se a
leitura do Cut-off se basear em um leitor de placas de filtro simples, os resultados devem ser calculados
subtraindo o valor A do pocinho do Branco a partir dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles.
Se a leitura se basear em um leitor de placas de filtro duplo, não subtraia o valor A do pocinho do Branco a partir
dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles.
Calcule o valor do cut-off adicionando 0,120 à absorvância média do controle negativo.
Cut-off = NCx + 0,120
Exemplo:
Valor da Absorvância do pocinho do Branco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: o Branco só é necessário quando a
leitura é efetuada com um filtro simples a 450 nm)
N.º do pocinho:
Ctrl. Neg.:
N.º do pocinho:
Ctrl. Pos.:
B1
0,012
E1
2,363
C1
0,010
F1
2,436
D1
0,011
Todos os valores dos controles estão dentro do intervalo do controle de qualidade indicado.
Cálculo de NCx = (0,012 + 0,010 + 0,011)/3 = 0,011
Cálculo do Cut-off: (CO) = 0,011 + 0,120 = 0,131
Interpretação dos resultados
Dividir a absorvância da amostra pelo valor do cut-off. (S/CO)
Resultados Negativos (S/CO < 1): As amostras com resultados de absorvância inferiores ao valor do Cut-off
são negativas para esse teste, o que indica que não foram detectados anticorpos anti-HIV 1/2 com o kit
bioelisa HIV-1+2 3.0. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HIV.
Resultados Positivos ( S/CO ≥ 1): As amostras com resultados de absorvância iguais ou superiores ao valor do
Cut-off são consideradas como inicialmente reativas, o que indica que, provavelmente, foram detectados anticorpos
anti-HIV 1/2 usando o kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as amostras inicialmente reativas devem ser testadas
novamente em duplicados usando o bioelisa HIV-1+2 3.0 antes da interpretação final dos resultados. As amostras
repetidamente reativas podem ser consideradas positivas a anticorpos HIV 1/2 com o bioelisa HIV-1+2 3.0.
Duvidoso (S/CO = 0,9-1,1): As amostras com uma relação de absorvância para Cut-off entre 0,9 e 1,1 são
consideradas duvidosas e é necessário voltar a testar essas amostras em duplicado para confirmar os resultados
iniciais.
É necessário efetuar testes de seguimento, confirmação e suplementares de todas as amostras positivas
usando outro sistema de análises (por ex., WB, PCR). Não deve ser determinado um diagnóstico clínico com base
em um único resultado de teste. Este deve integrar outros dados e conclusões clínicas e laboratoriais.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS INICIAIS E ACOMPANHAMENTO DE TODAS AS AMOSTRAS
INICIALMENTE REATIVAS OU DUVIDOSAS
Rep. em duplicado
○,+○,+
Interpretação +
Seguimento
○,+○,-
○,-○,-
S/CO ≥ 0,9
Interpretação
S/CO < 0,9
IND
-
IND = não é possível interpretar
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bioelisa
-
-
-
Se, depois da repetição do teste das amostras inicialmente reativas, ambos os pocinhos tiverem resultados
negativos (S/CO < 0,9), essas amostras devem ser consideradas como positivas não repetíveis (ou falso
positivo) e registradas como negativas. Tal como em muitos testes ELISA de alta sensibilidade, podem ocorrer
resultados falsos positivos por diversas razões, estando a maioria delas relacionada, mas não se limitando a,
um passo de lavagem inadequado. Para mais informações sobre o bioelisa, consulte a Guia de problemas do
bioelisa.
Se, depois da repetição do teste em duplicado, um ou ambos os pocinhos tiverem resultados positivos, o
resultado final desse teste ELISA deve ser registrado como repetidamente reativo. As amostras repetidamente
reativas podem ser consideradas positivas para anticorpos de HIV 1/2 e, assim, o doente está, provavelmente
infectado com HIV 1/2 e a unidade de sangue deve ser eliminada.
Depois da repetição do teste em duplicado, as amostras com valores próximos do valor do Cut-off devem ser
interpretadas com precaução e consideradas como amostra na zona “duvidosa” ou como não sendo possível
interpretar durante o período do teste.
Limitações do procedimento
1. Os resultados positivos podem ser confirmados com outro método disponível e interpretados em conjunto
com a informação clínica do doente.
2. Os anticorpos podem não ser detectáveis durante as fases precoces da doença e em alguns indivíduos
imunodeprimidos. Assim, os resultados negativos obtidos com o bioelisa HIV-1+2 3.0 indicam apenas que a
amostra não contém um nível detectável de anticorpos anti-HIV 1 ou 2 e qualquer resultado negativo não
deve ser considerado como evidência conclusiva de que o indivíduo não está infectado por HIV 1 ou 2.
3. Os erros mais comuns nos testes são: usar os kits depois da data de validade, procedimentos de lavagem
incorretos, reagentes contaminados, passos incorretos do procedimento do teste, aspiração insuficiente
durante a lavagem, não adicionar amostras ou reagentes, utilização inadequada do equipamento laboratorial,
erros de temporização, utilização de amostras altamente hemolizadas ou amostras que contêm fibrina,
amostras de soro não totalmente coagulado.
4. A prevalência do marcador irá afetar os valores preditivos do teste.
5. Este teste não pode ser usado para testar plasma agrupado (misturado). O bioelisa HIV-1+2 3.0 foi avaliado
apenas com amostras de soro ou plasma individuais.
6. O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um teste qualitativo e os resultados não podem ser usados para medir as
concentrações de anticorpos. Este teste não consegue fazer a distinção entre as infecções por HIV-1
e HIV-2.
Características funcionais
O estudo de avaliação efetuado em Alkmaar, nos Países Baixos, entre Abril e Novembro de 2005, demonstrou as
seguintes características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0.
A especificidade diagnóstica do kit foi de 99,85% conforme determinado em todas as amostras negativas (5471)
que foram investigadas. Examinamos apenas doadores não selecionados (doadores aleatórios e de primeira vez),
a especificidade foi de 99,92% (95% IC 99,84-100%).
Resultados do teste bioelisa HIV-1+2 3.0 em doadores não selecionados:
Número testado
Painel
Doador de soro aleatório
Doador de plasma aleatório
Doador de primeira vez
2654
1400
989
Total
5043
Positivos (S/CO ≥ 1)
Número
%
2
0,08
1
0,07
1
0,10
4
0,08
Negativos (S/CO <1)
Número
%
2652
99,92
1399
99,93
988
99,90
5039
99,92
Todos os painéis de HIV-1, HIV-1 subtipo O e HIV-2 confirmaram amostras positivas a anticorpos usadas nesse
estudo que também foram reativas com o bioelisa HIV-1+2 3.0, resultando em uma sensibilidade diagnóstica
de 100%.
Total de 32 painéis de soroconversão, representando 210 amostras testadas. 13 amostras de PRB918 e PRB917
não classificadas devido à ausência de dados de determinação de antígeno ou de RNA necessários para a
classificação. 41 amostras classificadas como negativas. Negativo para RNA e/ou antígeno. 61 amostras
classificadas como soroconversão precoce. 95 amostras classificadas como soroconversão.
Os resultados dos testes também indicam que o bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método de última geração, comparável
à maioria dos testes disponíveis atualmente no mercado com a marca CE.
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bioelisa
A sensibilidade analítica foi avaliada em painéis PeliCheck anti-HIV. A sensibilidade analítica do
bioelisa HIV-1+2 3.0 nas diluições padrão anti-HIV PeliCheck foi comparável à de outros testes anti-HIV.
Especificidade analítica:
Resultados do teste bioelisa HIV-1+2 3.0 em amostras de doentes hospitalizados e amostras potenciais de
contaminação cruzada:
Número
testado
296
101
17
5
5
4
Tipo de amostra
Mononucleose
Mulheres grávidas
RF+
Anti-TPO
Anti-músculo liso
Níveis de IgG elevados
Total
428
Positivos (S/CO ≥ 1)
Número
%
4
1,35
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
Negativos (S/CO <1)
Número
%
292
98,65
101
100
17
100
5
100
5
100
4
100
0,93
424
99,07
Em um estudo separado, foram obtidos os seguintes resultados de especificidade:
-
Possibilidade de efeito de gancho por dose elevada eliminado devido à implementação do procedimento de
dois passos.
Foram testadas amostras positivas/negativas congeladas para verificar interferências na coleta e
armazenamento. As características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0 não foram afetadas durante pelo menos
3 ciclos de congelamento/descongelamento.
As amostras de doentes infectados pelos vírus da hepatite A, B, C e E, bem como amostras de doentes
infectados por Treponema pallidum foram testadas, sem que tenham sido observadas reações reativas
cruzadas.
25 amostras positivas de soro fresco foram testadas no INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA,
com bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as 25 amostras de soro fresco apresentaram resultado positivo com o
bioelisa HIV+1+2 3.0.
Precisão:
As tabelas abaixo representam os resultados da sensibilidade analítica e da reprodutibilidade do bioelisa HIV-1+2 3.0
tal como controlado pelo controle executado PeliSpyMulti-Marker e pela amostra de CQ Interno testada em cada placa;
a diluição a 1:2048 do padrão anti-HIV nesta amostra PeliSpy foi consistentemente detectada em todas as placas. A
amostra de CQ Interno foi sempre detectada em todas as placas.
Resultados do PeliSpyMulti-Marker:
Diluição
n
Média
1:2048
80
3,08
Percentis
5º
1,76
Medido
95º
4,39
Mín.
1,70
Máx.
4,96
Resultados da amostra de CQ Interno:
A
B
C
D
E
F
G
H
n
Média
160
7,71
Percentis
5º
95º
5,32
10,10
Medido
Mín.
4,37
Máx.
10,89
EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISPENSA DE CONTROLES/AMOSTRAS
1
2
3
4
5
6
7
…
…
12
Branco
SMP3
Neg
…
Neg
…
Neg
Pos (HIV-1)
Pos (HIV-2)
SMP 1
SMP 2
60
3000-1168 R03 08.2015 por
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bioelisa
bioelisa: Guia de problemas
Problema
Causas possíveis
Solução
1. Controles fora de
validação.
1a. Temperatura, incubação
ou pipetagem incorreta.
1b. Preparação incorreta dos
reativos, erro de diluição.
Reativos não
homogenizados
corretamente.
1c. Contaminação cruzada
entre controles.
Verificar o procedimento.
Repetir o ensaio.
Verificar o procedimento.
Repetir o ensaio.
1d. Filtro de leitura incorreto.
1e. Interferência no caminho
ótico.
1f. Foram utilizados
componentes de lotes
diferentes.
1g. Reagentes vencidos.
2. Sem cor ou pouca cor ao 2a. Um ou mais reativos não
foram adicionados ou
final do ensaio.
foram adicionados na
sequencia incorreta.
2b. Conjugado inativado:
conservação incorreta.
2c. Microplaca inativada:
conservação incorreta.
2d. Soluções cromogênicas A
e/ou B inativas:
conservação incorreta. O
recipiente utilizado afeta a
estabilidade do substrato,
contaminação cruzada
com a solução de
bloqueio.
Pipetar com cuidado. Não
intercambiar as tampas dos
frascos. Repetir o ensaio.
Comprovar que o filtro de
leitura seja de 450 nm. Se
não se usa a referência de
620 - 630 nm, a absorvância
aumenta cerca de 0,050.
Comprovarar o leitor. Limpar
ou secar a parte inferior da
microplaca. Verificar a
presença de bolhas de ar.
Repetir a leitura.
Não utilizar componentes de
lotes diferentes já que os
mesmos são ajustados para
cada lote em particular.
Verificar a data de validade
do kit e de seus
componentes. Não utilizar kits
ou reagentes vencidos.
Comprovar o procedimento.
Repetir o ensaio.
Comprovar se há
contaminação, verificar o
procedimento. Repetir o
ensaio.
Manter sempre as tiras não
usadas na bolsa de plástico
bem fechada, com o
dessecante no interior.
Repetir o ensaio.
Utilizar recipientes
descartáveis ou lavados com
ácido ou etanol e enxaguar
com água desionizada antes
de voltar a utilizar. Voltar a
verificar o procedimento.
Repetir o ensaio.
61
3000-1168 R03 08.2015 por
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bioelisa
bioelisa: Guia de problemas
Problema
Causas possíveis
3. Demasiada cor em todos
os pocinhos da
microplaca.
3a. Soluções cromogênicas A Verificar se as soluções
e/ou B oxidadas,
cromogênicas A e B são
contaminadas
incolores, eliminar se
estiverem azuis. Usar
recipientes lavados com ácido
ou etanol ou descartáveis.
Repetir o ensaio.
3b. Reativos contaminados
Verificar a presença de
ou preparados de forma
contaminação (aspecto turvo).
incorreta.
Comprovar as diluições.
Repetir o ensaio.
3c. Solução de lavagem (1x) Verificar a qualidade da água
contaminada.
destilada ou desionizada
utilizada para preparara
diluição. Repetir o ensaio.
3d. Lavagem insuficiente ou Verificar o dispositivo de
não consistente: Volume lavagem. Encher os pocinhos
dispensado e/ou
com solução de lavagem até
aspiração insuficiente ou o topo, aspirar
não uniforme. Número
completamente. Aumentar o
insuficiente de ciclos de
número de ciclos de
lavagem, dispositivo
lavagem e o tempo de
contaminado.
molho. Depois de lavar, limpe
as microplacas invertidas em
papel absorvente.
3e. Foi utilizada solução de
Utilizar somente a solução de
lavagem de outro
lavagem fornecida com o kit.
fabricante.
4a. Problemas de lavagem.
Ver 3c, 3d, 3e.
4b. Pipetas mal calibradas ou Utilizar apenas pipetas
ponteiras mal
calibradas com ponteiras bem
encaixadas. Técnica de
encaixadas e pipetar com
pipetagem incorreta.
cuidado, sem bolhas e
salpicos. Repetir o ensaio.
4c. Reativos e amostras não Deixar que os reativos
estão à temperatura
alcancem a temperatura
ambiente ou não foram
ambiente e misture-os bem
bem misturados antes de antes de usar.
usar.
4d. Correntes de ar sobre a
Manter a microplaca
microplaca durante a
protegida de correntes de ar.
incubação.
4e. Demasiado tempo até a
Desenvolver técnica
adição das amostras e/ou consistente e uniforme.
reativos. Inconsistência
nos intervalos de tempo.
Bolhas de ar.
4f. Interferência no caminho Ver 1e.
ótico.
4. Reprodutibilidade pobre
ou elevado número de
amostras reativas que
não se repetem.
Solução
62
3000-1168 R03 08.2015 por
1293
bioelisa
3000-1168
3000-1169
1 x 96 TESTS
5 x 96 TESTS (480)
Bibliography - Bibliografía - Literatur - Bibliographie - Bibliografia - Bibliografia
1.
Barbé F, Klein M, Badonnel Y. Early detection of antibodies to human immunodeficiency virus 1 by a
third-generation enzyme immunoassay. A comparative study with the results of second-generation
immunoassays and western blot. Ann. Biol. Clin. 1994; 52: 341-45.
2.
Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamarat S, Gruest J, et al. Isolation of a
T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science.
1984; 220: 868-71.
3.
Chandrasekhar K, Profy AT, Dyson HJ. Solution conformational preferences of immunogenic peptides derived
from the principal neutralizing determinant of the HIV-1 envelope glycoprotein gp120. Biochemistry. 1991;
30: 9187-94.
4.
Constantine NT. Serologic test for the retroviruses: approaching a decade of evolution. AIDS. 1993; 7: 1-13
5.
Gnann JW, McCormick JB, Mitchell S, Nelson JA, Oldstone MB. Synthetic peptide immunoassay distinguished
HIV type 1 and HIV type 2 infections. Science. 1987; 237: 1346-49.
6.
Barr PJ, Steimer KS, Sabin EA, Parkes D, Geroge-Nascimento C, Stephans JC, et al. Antigenicity and
immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. Vaccine. 1987; 5:90-01
63
3000-1168 R02 08.2015 bibliography
1293
bioelisa
3000-1168
3000-1169
1 x 96 TESTS
5 x 96 TESTS (480)
Procedural flow chart / Esquema del procedimiento / Schematischer Ablauf /
Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimento
Pipette Samples: 100 µl/well
Dispensar Muestras: 100 µl/pocillo
Proben verteilen: 100 µl/Vertiefung
Dispenser Échantillons: 100 µl/puits
Dispensare Campioni: 100 µl/pozzetto
Pipetar Amostras: 100 µl/pocinho
Ð
Pipette Controls: 100 µl/well
Dispensar Controles: 100 µl/pocillo
Kontrollen verteilen: 100 µl/Vertiefung
Dispenser Contrôles: 100 µl/puits
Dispensare Controlli: 100 µl/pozzetto
Pipetar Controles: 100 µl/pocinho
Ð
Incubate 30 minutes at 37°C
Incubar 30 minutos a 37°C
30 Minuten bei 37°C inkubieren
Incuber 30 minutes à 37°C
Incubare 30 minuti a 37°C
Ð
Wash 5x / Lavar 5x
Waschen 5x / Laver 5x
Lavare 5x / Lavar 5x
Ð
Pipette Conjugate: 100 µl/well
Dispensar el Conjugado: 100 µl/pocillo
Konjugat pipettieren: 100 µl/Vertiefung
Dispenser le Conjugué: 100 µl/puits
Dispensare il Coniugato: 100 µl/pozzetto
Pipetar o Conjugado: 100 µl/pocinho
Ð
Ð
Wash 5x / Lavar 5x
Waschen 5x / Laver 5x
Lavare 5x / Lavar 5x
Ð
Pipette Chromogen A: 50 µl/well
Dispensar el Cromogeno A: 50 µl/pocillo
Chromogen A pipettieren: 50 µl/Vertiefung
Dispenser le Chromogène A: 50 µl/puits
Dispensare il Cromogeno A: 50 µl/pozzetto
Pipetar o Cromogênio A: 50 µl/pocinho
Ð
Pipette Chromogen B: 50 µl/well
Dispensar el Cromogeno B: 50 µl/pocillo
Chromogen B pipettieren: 50 µl/Vertiefung
Dispenser le Chromogène B: 50 µl/puits
Dispensare il Cromogeno B: 50 µl/pozzetto
Pipetar o Cromogênio B: 50 µl/pocinho
Ð
Ð
Pipette Stopping Solution: 50 µl/well
Dispensar la Solución de Parada: 50 µl/pocillo
Stopplösung zufügen: 50 µl/Vertiefung
Dispenser la Solution d’Arrêt: 50 µl/puits
Dispensare la Soluzione Bloccante: 50 µl/pozzetto
Pipetar a Solução de Bloqueio: 50 µl/pocinho
Ð
Cut-off: NCx + 0.120
Valor umbral: CNx + 0,120
Schwellenwert: CKx + 0,120
Valeur seuil: CNx + 0,120
Valore di soglia: CNx + 0,120
Cut-off: CNx + 0,120
Read at 450 nm
Leer a 450 nm
Bei 450 nm ablesen
Lire à 450 nm
Leggere a 450 nm
Ler a 450 nm
64
3000-1168 R02 08.2015 procedural flow chart
1293
3800-4257 R02

bioelisa bioelisa HIV-1+2 3.0

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