Thèse sabrine - Université d`Oran

Transcription

Université d’Oran Es-Sénia
Faculté des Sciences – Département de Biologie
Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique
MEMOIRE
En vue de l’obtention du diplôme de
MAGISTER
En Nutrition Clinique et Métabolique
Présenté par
Soutenu le 24 juin 2008 devant le jury
Président
BOUCHENAK M.
Examinateurs
MEKKI K.
ABI AYAD S.M.E.A.
Professeur, Université d’Oran Es-Sénia
Maître de conférences, Université d’Oran Es-Sénia
Directeur
SENHADJI-LAMRI M.Y.
Co-directeur
BOUALGA A.
Chargé de cours, Université d’Oran Es-Sénia
Année Universitaire 2007/2008
Ce travail de thèse a été réalisé au Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique, Département de
Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran Es-Sénia et a été Financé par le Projet National de
Recherche (PNR Code 011)
Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à :
Madame BOUCHENAK M. Professeur à l’Université d’Oran Es-Sénia, pour la confiance qu’elle m’a
accordée en m’accueillant au sein de son laboratoire mais aussi de m’avoir fait bénéficier tout au long de
mon enseignement supérieur de ses hautes compétences dans le domaine de la nutrition et qui me fait
aujourd’hui l’immense honneur de présider ce jury.
Qu’elle veuille bien accepter l’expression de mon profond respect.
Madame MEKKI K. Maître de conférences à l’Université d’Oran Es-Sénia pour l’honneur qu’elle me fait
en acceptant de juger ce travail.
Qu’elle trouve ici l’expression de mes remerciements les plus respectueux.
Mr ABI AYAD S.M.E.A. Maître de conférences à l’Université d’Oran Es-Sénia pour son honorable
présence en acceptant de poser un regard critique sur ce travail.
Qu’il trouve ici le témoignage de mes sincères remerciements.
Madame SENHADJI-LAMRI MY. Maître de conférences à l’Université d’Oran Es-Sénia. Directrice de
thèse, pour son aide constante, sa rigueur scientifique et ses conseils judicieux, mais surtout, pour son grand
dévouement et sa grande patience deux qualités qui font d’elle une excellente enseignante.
Jamais ces quelques lignes pourront être à la hauteur de tout ce que je lui dois.
Monsieur BOUALGA A. Chargé de cours à l’Université d’Oran Es-Sénia. Co-encadreur, pour sa grande
disponibilité, l'intérêt marqué pour mon travail dont il a fait preuve par ses encouragements, et surtout la
qualité et la pertinence de ses remarques et son esprit de synthèse me serviront toujours d'exemple.
Qu’il trouve ici le témoignage de toute ma reconnaissance.
J’adresse mes remerciements à l’ensemble du personnel du Laboratoire de Nutrition Clinique et
Métabolique. Enseignants, étudiants de doctorat et magister pour l’aide et les encouragements qu’ils m’ont
prodigué durant les moments les plus difficiles.
Qu’ils trouvent ici le témoignage de toute ma reconnaissance.
Ce travail n’aurait jamais pu être mené jusqu’au bout sans l’aide combien précieuse de trois personnes :
Mme BELARBI- NEGAOUI H., Melle GOURINE H. et Melle REDOUANE D.
Qu’elles trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
Communication internationale
5ème Congrès Annuel NSFA (Nouvelle Société Française d’athérosclérose) – Biarritz.1214 juin 2008 (accepté)
Louala S., Hamza-Reguig S., Boualga A., Benyahia A., Bouderbala S., Lamri-Senhadji MY.
& Bouchenak M.
La protéine de sardine comparée à la caséine ne modifie pas la cholestérolémie et la
triglycéridémie mais améliore le transport inverse du cholestérol, chez le rat
hypercholestérolémique.
Introduction.................................................................................................................. 1
Revue bibliographique................................................................................................. 4
I. Athérosclérose, hypercholestérolémie et désordres métaboliques..................................... 4
I. 1. Rôle des LDL dans l'athérogènese ....................................................................... 4
I. 2. Rôle athéroprotecteur des HDL ........................................................................... 6
II. Nutrition et métabolisme des lipides ................................................................................ 8
II. 1. Effets des lipides alimentaire, en particulier celui du cholestérol...................... 9
II. 2. Effets des protéines alimentaires, en particulier les protéines de poisons ....... 11
II. 2. 1. Effets sur les lipides sériques ................................................................... 11
II. 2. 2. Effets sur les lipides hépatiques ............................................................... 14
III. Mécanismes d'action des protéines de poisson sur le métabolisme lipidique ............... 14
III. 1. Hypothèse gastro-intestinale ........................................................................... 14
III. 2. Hypothèse post-absoptive ................................................................................ 14
IV. Choix du modèle animal .............................................................................................. 16
Matériel et Méthodes ................................................................................................. 18
I. Extraction et purification des protéines de sardine .......................................................... 18
I. 1. Choix de l'échantillon......................................................................................... 18
I. 2. Extaction des protéines....................................................................................... 18
I. 3. Estimation du degré de pureté des protéines...................................................... 18
II. Animaux et régimes........................................................................................................ 20
III. Bilans nutritionnels ....................................................................................................... 22
III. 1. Détermination de l'azote urinaire protéique et non protéique ........................ 22
III. 1. 1. Dosage de l'urée...................................................................................... 22
III. 1. 2. Dosage de la créatinine .......................................................................... 22
III. 1. 3. Dosage de l'acide urique......................................................................... 22
III. 2. Détermination des lipides totaux et du cholestérol total ................................. 23
IV. Prélèvement des échantillons de sang, foie et aorte...................................................... 23
V. Analyses biochimiques................................................................................................... 23
V. 1. Détermination des teneurs en protéines totales du foie et du sérum................. 23
V. 2. Dosage de l'albumine sérique ........................................................................... 24
V. 3. Dosage des apolipoprotéines (apo) sériques .................................................... 24
V. 3. 1. Dosage de l'apo A-I ................................................................................. 24
V. 3. 2. Dosage de l'apo B..................................................................................... 24
V. 4. Détermination des lipides totaux du foie et du sérum ....................................... 24
V. 5. Détermination des teneurs sériques et hépatiques en différents lipides ........... 25
V. 5. 1. Dosage des triglycérides .......................................................................... 25
V. 5. 2. Dosage du cholestérol total, libre et estérifié........................................... 25
V. 5. 3 Dosage des phospholipides ....................................................................... 25
V. 6. Détermination du cholestérol au niveau de l'aorte ........................................... 25
VI. Séparation et Analyse des teneurs et composition des différentes fractions
de lipoprotéines par précipitation........................................................................................ 25
VI. 1. Séparation des VLDL et des LDL-HDL1 .......................................................... 26
VI. 2. Séparation des HDL2 et HDL3 ......................................................................... 26
VI. 3. Analyse de la teneur et composition en lipides et en apolipoprotéines
des lipoprotéines......................................................................................................... 26
VII. Détermination de l'activité de la lécithine: cholestérol acyl transférase (LCAT, EC 2.3.1.43)29
VIII. Analyse statistique...................................................................................................... 29
Résultats...................................................................................................................... 30
I. Efficacité nutritionnele des différents régimes ................................................................ 30
I. 1. Croissance pondérale et nourriture ingérée ...................................................... 30
I. 2. Poids absolu et relatif du foie............................................................................. 31
I. 3. Azote ingéré et azote excrété (urinaire et fécal)................................................. 31
I. 4. Bilan azoté (BA), Coefficient d'Utilisation Digestive Apparente de
l'Azote (CUDN) et Rapport d'Efficacité Protéique (REP) et Nutritionnelle (REN) ... 33
I. 5. Lipides ingérés et excétés, cholestérol ingéré et excrété, et
Coefficient d'Utilisation Digestive Apparente des Lipides (CUDL) .......................... 34
II. Étude comparée des teneurs en protéines et en lipides du foie et du sérum................... 35
II. 1. Teneurs en protéines totales et en lipides totaux du foie et du sérum............... 35
II. 2. Teneurs sériques et hépatiques des différents lipides ....................................... 37
III. Teneurs en cholestérol total, libre et esters de cholestérol au niveau de l'aorte............ 37
IV. Répartition du cholestérol total (CT) et des triglycérides (TG) entre les
différentes fractions de lipoprotéines .................................................................................. 39
IV. 1. Répartition du CT entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3 .................... 39
IV. 2. Répartition des TG entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3 ................... 40
V. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des différentes fractions
de lipoprotéines .................................................................................................................. 40
V. 1. Teneurs et composition des VLDL..................................................................... 40
V. 2. Teneurs et composition des LDL-HDL1 ............................................................ 42
V. 3. Teneurs et composition des HDL2 ..................................................................... 42
V. 4. Teneurs et composition des HDL3 ..................................................................... 45
VI. Activité de la lécithine: cholestérol acyltransférase (LCAT)........................................ 45
VII. Rapports d'athérogénicité et de fluidité membranaire ................................................. 47
Discussion.................................................................................................................... 48
Conclusion ................................................................................................................. 58
Références bibliographiques ..................................................................................... 61
Annexes ...................................................................................................................... 75
AG :
Acides gras
AGMI :
Acides gras monoinsaturés
AGPI :
Acides gras polyinsaturés
AGS :
Acides gras saturés
Apo :
Apolipoprotéine
BA :
Bilan azoté
CAS :
Caséine
CE :
Cholestérol estérifié
CL :
Cholestérol libre
CT :
Cholestérol total
CUDL :
Coefficient d’Utilisation Digestive Apparente des Lipides
CUDN :
Coefficient d’Utilisation Digestive Apparente de l’Azote
EC :
Esters de cholestérol
HDL :
Lipoprotéine de haute densité
LCAT :
Lécithine: cholestérol acyltransférase
LDL :
Lipoprotéine de faible densité
LPL :
Lipoprotéine lipase
PL :
Phospholipides
PS :
Protéines de sardine
REN :
Rapport d’Efficacité Nutritionnelle
REP :
Rapport d’Efficacité Protéique
TG :
Triglycérides
VLDL :
Lipoprotéine de très faible densité
Tableau I.
Composition de différentes sources protéiques en acides aminés impliqués
dans l’effet hypo ou hypercholestérolémiant .......................................................................... 15
Tableau II.
Composition des régimes ............................................................................ 21
Tableau III.
Poids des rats, poids absolu et relatif du foie ............................................. 31
Tableau IV.
Azote (N) ingéré et azoté excrété .............................................................. 32
Tableau V.
Azote urinaire, uréique, créatinique, de l’acide urique et azote fécal ........ 32
Tableau VI.
Bilan azoté (BA), Coefficient d’Utilisation Digestive Apparente de l’Azote
(CUDN) et Rapport d’Efficacité Protéique (REP) et Nutritionelle (REN) ............................. 33
Tableau VII.
Lipides ingérés et excrétés, cholestérol ingéré et excrété, et Coefficient
d’Utilisation Digestive Apparente des Lipides (CUDL) ........................................................ 34
Tableau VIII.
Teneurs sériques en albumine et en apolipoprotéines A-I et B ................... 35
Tableau IX.
Teneurs de l’aorte en cholestérol total, libre et esters de cholestérol.................... 37
Tableau X.
Répartition du cholestérol total entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3 . 39
Tableau XI.
Répartition des triglycérides entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3 ..... 40
Tableau XII.
Activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase .................................. 45
Tableau XIII.
Rapports d’athérogénicité et rapport de fluidité membranaire .................. 47
Tableau XIV.
Evolution du poids corporel ....................................................................... 75
Tableau XV.
Nourriture ingérée ...................................................................................... 75
Tableau XVI.
Teneurs sériques et hépatiques en protéines totales et en lipides totaux ... 76
Tableau XVII.
Teneurs sériques en cholestérol total et en triglycérides à J0 .................... 76
Tableau XVIII. Teneurs sériques en cholestérol total, triglycérides, cholestérol libre, esters
de cholestérol et phospholipides ............................................................................................ 77
Tableau XIX.
Teneurs hépatiques en cholestérol total, triglycérides, cholestérol libre, esters
de cholestérol et phospholipides ............................................................................................ 77
Tableau XX.
Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des VLDL ....... 78
Tableau XXI.
Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des LDL-HDL1 78
Tableau XXII.
Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL2 ......... 79
Tableau XXIII. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL3 ........ 79
Figure 1.
Métabolisme des lipoprotéines ............................................................................. 5
Figure 2.
Sécrétion, acquisition des lipides et maturation des HDL .................................. 7
Figure 3.
Action des lipases hépatiques sur les HDL et facteurs de transfert lipidique ............. 8
Figure 4.
Profil lipoprotéique de différentes espèces ......................................................... 17
Figure 5.
Diagramme d’extraction et de purification des protéines de sardine.................. 19
Figure 6.
Séparation des différentes fractions de lipoprotéines ......................................... 27
Figure 7.
Purification des différentes fractions de lipoprotéines........................................ 28
Figure 8.
Croissance pondérale des animaux et nourriture ingérée ................................... 30
Figure 9.
Teneurs en protéines totales et en lipides totaux du sérum et du foie................. 36
Figure 10. Teneurs sériques et hépatiques en différents lipides........................................... 38
Figure 11. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des VLDL ................ 41
Figure 12. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des LDL-HDL1 ....... 43
Figure 13. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL2 ................. 44
Figure 14. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL3 ................. 46
Introduction
Les maladies cardiovasculaires (MCV) représentent la première cause de mortalité
dans les pays industrialisés et sa prévalence augmente dans les pays en cours de
développement (Hansson, 2005). L’athérosclérose qui se caractérise par la formation de
plaques d’athéromes (constituant des sites inflammatoires dans la paroi artérielle avec
accumulation de lipides) est une des causes les plus fréquentes des MCV (Lahoz & Mostaza,
2007). Son développement est associé à plusieurs facteurs de risque liés au style de vie,
comme le tabagisme et la sédentarité ainsi que d'autres facteurs liés ou non à une
prédisposition génétique comme l’obésité, l'hypertension artérielle, le diabète et
l'hypercholestérolémie (Gebbers, 2007).
Actuellement, il est bien établi que l’hypercholestérolémie est un problème de santé
qui augmente de manière significative le risque cardiovasculaire (Penumathsa et al., 2007).
La responsabilité de l’élévation des taux sanguins de cholestérol total (CT), essentiellement
du cholestérol des lipoprotéines de faible densité (C-LDL), et de la baisse du cholestérol des
lipoprotéines de haute densité (C-HDL) dans l’évolution de la maladie coronaire est
largement démontrée (Lamant et al., 2006). Les données des études cliniques et
expérimentales ont révélé que des taux élevés de C-LDL sont associés à l'athérosclérose et à
un plus grand risque d’évènements cardiovasculaires (Levine et al., 1995 ; Ballantyne, 1998 ;
Karnik, 2001 ; Sabouret, 2006). Par ailleurs, plusieurs hypothèses suggèrent
que les
concentrations du C-HDL exercent un effet antiathérogène en atténuant l’oxydation des LDL
(Assmann & Nofer, 2003 ; Black, 2003 ; Assmann & Gotto, 2004).
L’influence de l’alimentation sur le développement des maladies cardiovasculaires est
un fait d’observation prouvé depuis plusieurs années (Urquiaga et al., 2004 ; Getz & Reardon,
2007). Il est actuellement évident que les facteurs nutritionnels jouent un rôle majeur dans le
risque de survenue des maladies liées à l’athérosclérose. Ces facteurs sont trop souvent réduits
à leur seul impact sur les paramètres lipidiques et la cholestérolémie (Paillard, 2002). Si ceux–
ci jouent un rôle important, d’autres mécanismes sont probablement impliqués dans
l’évolution ou la protection de l’athéro-thrombose et de ses manifestations cliniques (Getz &
Reardon, 2007). En effet, plusieurs données épidémiologiques et cliniques ont démontré
l’ampleur du bénéfice de certaines mesures nutritionnelles sur l’événement cardiovasculaire et
en l’occurrence la consommation de poisson (Zampelas et al., 2005). Les études révèlent qu’il
existe une relation inverse entre la consommation de poisson et l’incidence des maladies
coronariennes (Hu et al., 2002 ; Kris-Etherton et al., 2002 ; Hu et al., 2003), par une
diminution de la mortalité cardiaque (Daviglus et al.,1997 ; Hu et al., 2002) et la mort subite
(Albert et
al., 1998 ; Dallongeville et al ., 2003). Cependant, un certain nombre
1
Introduction
d’investigations ont affirmé que la consommation élevée de poissons (≥ 2 fois / semaine)
assure un effet protecteur vis-à-vis du risque cardiovasculaire (He et al., 2004 ; Bouzan et al.,
2005 ; König et al., 2005 ; Iso et al., 2006). Cette corrélation négative avec l’événement
cardiovasculaire est attribuée à l’effet hypotriglycéridémiant, anti-inflammatoire et
hypothrombogénique ainsi qu’à l’impact positif sur la fonction endothéliale des acides gras
polyinsaturés
(AGPI)
de
la
série
(n-3):
acides
eicosapentaénoїque
(EPA)
et
docosapentaéinoїque (DHA) contenus dans le poisson (Harris, 1997; Minihane et al., 2000 ;
Nestel et al., 2002 ; Thies et al., 2003 ; Calder, 2004 ; Balk et al., 2006).
La protéine qui est un autre nutriment actif présent dans le poisson pourrait influencer le
métabolisme des lipides et avoir un effet cardioprotecteur. Il semble qu’elle agisse sur les
mêmes paramètres que la protéine de soja, mais par des mécanismes différents (Wergedahl et
al., 2004). En effet, quelques études expérimentales ont depuis lors permis d’étayer cette
hypothèse. Demonty et al., (2003) ont démontré l’effet protecteur de la protéine de morue
contre l’hypercholestérolémie en diminuant le CT sérique et dans la prévention de l’insulinorésistance (Lavigne et al., 2000) chez le rat soumis à un régime supplémenté en cholestérol.
Wergedahl et al., (2004) ont montré que la protéine de saumon tend à diminuer le CT
plasmatique et augmenter le rapport C-HDL/CT chez le rat Zucker. Par ailleurs, une étude a
révélé que la protéine de sardine n’a aucun effet sur la cholestérolémie alors qu’elle augmente
la fibrinolyse et prolonge le temps de coagulation du sang chez le rat (Murata et al., 2004).
Ces deux derniers effets complémentaires pourraient être bénéfiques pour les individus à
risque de thromboses. L’étude de Kawasaki et al., (2000) a mis en évidence, chez des
personnes modérément hypertendues, qu’un peptide isolé (Valine-Tyrosine) de la sardine
aurait un effet hypotenseur après quatre semaines d’intervention nutritionnelle.
Peu d’études se sont intéressées à l’effet des protéines de sardine sur
l’hypercholestérolémie provoquée expérimentalement par un régime enrichi en cholestérol.
Cette étude est réalisée dans le but de voir si la protéine de sardine pourrait moduler le
métabolisme
lipidique
comparativement
à
la
caséine
chez
le
rat
rendu
hypercholestérolémique. Le rat Wistar est pris comme modèle car il est souvent utilisé dans
les recherches physiologiques et métaboliques (Russell & Proctor, 2006).
Après avoir déterminé l’efficacité nutritionnelle des régimes contenant soit des
protéines de sardine soit de la caséine, nous nous sommes posés la question quant à leurs
effets sur :
les teneurs en protéines et en différents lipides du sérum et du foie.
2
Introduction
les teneurs et la composition en lipides et en apolipoprotéines des différentes
lipoprotéines sériques (VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3).
le transport inverse du cholestérol par la détermination de l’activité de la lécithine :
cholestérol acyltransférase (LCAT, EC 2.3.1.43).
Avant de présenter nos résultats, un rappel succinct est réalisé sur :
l’hypercholestérolémie et son risque athérogène.
l’effet des lipides alimentaires, en particulier celui du cholestérol sur le métabolisme
des lipides.
l’influence des protéines de poisson sur le métabolisme des lipides et les mécanismes
impliqués dans la variation de la cholestérolémie.
3
Revue bibliographique
I. Athérosclérose, hypercholestérolémie et désordres métaboliques
L’athérosclérose constitue un désordre métabolique multifactoriel qui est associé au
développement des maladies cardiovasculaires (MCV) dans les pays industrialisés (Lahoz &
Mostaza, 2007) et son incidence semble augmenter nettement dans les pays en voie de
développement (Buemi et al., 2005). L’hypercholestérolémie joue un rôle primordial dans la
morbidité et la mortalité cardiovasculaire, en participant à la genèse de l’athérosclérose (Jia et
al., 2007). Cette anomalie biologique se définit par des taux élevés de CT et C-LDL liés à une
augmentation du risque coronarien par la formation de la plaque d’athérome, le
dysfonctionnement endothélial et le stress oxydatif (Penumathsa et al., 2007). Le risque
coronarien augmente de façon linéaire avec la cholestérolémie et ce, à partir de 2,5 g.L-1
(Sabouret, 2006). Une augmentation de la cholestérolémie de 1% accroît ce risque d’environ
2% (Lahoz & Mostaza, 2007). Cette relation entre la cholestérolémie et la maladie coronaire
est dépendante du cholestérol des LDL et des HDL dont les taux sont déterminés
essentiellement par le mode de vie et d’alimentation (Karlsson et al., 2006). Le risque élevé
du C-LDL est nettement majoré au-delà d’un taux supérieur à 1,6 g.L-1 (Sabouret, 2006), en
revanche un grand nombre d’études épidémiologiques et d’essais thérapeutiques ont démontré
le rôle protecteur des HDL vis-à-vis du risque cardiovasculaire (Mazzone, 2007). Une
augmentation de 1% du C-HDL est associée à une diminution de 3 à 4% du risque coronaire,
et un taux au dessous de 0,40 g.L-1 est considéré comme un facteur de risque des MCV
(Lahoz & Mostaza, 2007).
I. 1. Rôle des LDL dans l’athérogènese
Les LDL représentent la classe des lipoprotéines qui véhicule la majeure partie du
cholestérol se trouvant dans la circulation sanguine (Karlsson et al., 2006). À l’état normal, les
LDL sont éliminées par l’intermédiaire de récepteurs auxquels elles se lient en interagissant
avec l’apo B100 (Karlsson et al., 2006) (Fig. 1). Leur captation par ces récepteurs diminue la
synthèse intracellulaire du cholestérol, limite l’expression de ces récepteurs à la surface des
cellules par un mécanisme de rétrocontrôle et permet l’élimination du cholestérol au niveau du
foie par la voie biliaire (Karlsson et al., 2006). Un taux élevé de C-LDL prolonge la demie vie
de ces particules et mène de ce fait au risque d’être hydrolyser par plusieurs enzymes tels que la
triglycéride lipase hépatique (HTGL) (Santamarina-Fojo et al., 2004), la lipase endothéliale
(LE) (Broedl et al., 2004 ; Kluz & Adamiec, 2006), la lipoprotéine lipase (LPL) (Stein & Stein,
2003), ou la phospholipase A2 (Flood et al., 2004), aboutissant à la formation d’une particule
plus dense de LDL, considérée comme athérogène (Karlsson, 2006).
4
Fig. 1. Métabolisme des lipoprotéines (Sabouret, 2006).
ABCA1: Transporteur ATP binding cassette A1. CE: Cholestérol estérifié. CETP: Protéine de transfert du
cholestérol estérifié. CL: Cholestérol libre. LCAT: Lécithine: cholestérol acyltransférase. LPL: Lipoprotéine
lipase. LRP: Protéine récepteur des LDL. SR-B1: Récepteur scavenger de la classe B. SR-A: Récepteur
scavenger de la classe A.
Transport exogène et endogène du cholestérol
Sécrétion d’apolipoprotéine A-I
Synthèse des pré-β-HDL naissantes
Maturation des pré-β-HDL
Retour du cholestérol par la voie des SR-B1 hépatiques
Retour du cholestérol par la voie des récepteurs LDL hépatiques
5
Les particules LDL denses seraient particulièrement susceptibles de participer au processus
inflammatoire, à cause de leur affinité pour les protéoglycans subintimaux (Camejo et al.,
1998) et leur tendance à être plus facilement oxydées (Sacks & Campos, 2003). Les LDL
oxydées sont reconnues par les macrophages grâce à leur récepteurs scavenger de la classe
CD36 (Itabe, 2003) participant ainsi, à la formation des cellules spumeuses avec une
accumulation du cholestérol (Karlsson et al., 2006).
I. 2. Rôle athéroprotecteur des HDL
Les HDL sont de petites lipoprotéines (8-10 nm de diamètre) responsables du transport
de 25 à 30% du cholestérol total plasmatique (Luc, 2007). La densité élevée de ces
lipoprotéines est attribuable à leur contenu relativement élevé en protéines, dont la plus
importante est l’apo A-I (70% du contenu protéique) (Lewis & Rader, 2005). Les mécanismes
des effets athéroprotecteurs des HDL sont multiples. En effet, il a été montré que ces
particules possèdent des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, anti-thrombotique et
préservent l’intégrité endothéliale (Birjmohun et al., 2006 ; Garber et al., 2006). Cependant,
l’effet athéroprotecteur des HDL est principalement attribué à leur rôle dans le transport
inverse du cholestérol (Luc, 2007). Cette fonction est liée à la fois aux interactions cellulaires
des HDL et à leur remodelage dans le compartiment plasmatique (Rader, 2006).
À l’origine de la voie métabolique antiathérogène, ce sont les HDL naissantes (pré-βHDL) de forme discoïdale, qui constituent les accepteurs initiaux du cholestérol cellulaire.
Elles sont constituées principalement d’apo A-I et de phospholipides (PL) qui sont sécrétées
par le foie et l’intestin (Lewis & Rader, 2005). Ces particules HDL se chargent en cholestérol
au contact des membranes cellulaires par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques comme le
récepteur scavenger-B1 (SR-B1) et des transporteurs comme l’ATP binding cassette A1
(ABCA1), qui reconnaissent l’apo A-I des particules (Fig. 2) (Rader, 2006). Une enzyme
plasmatique, la lécithine:cholestérol acyl-transférase (LCAT), estérifie par la suite les
molécules de cholestérol par transfert de chaînes d’acides gras appartenant aux
phospholipides (PL) de la lipoprotéine (Fig. 2) (Rader, 2006). La LCAT est essentielle pour
entretenir un métabolisme normal des HDL. Un déficit de cette enzyme induit chez l'homme
(Kuivenhoven et al., 1997) et chez la souris (Ng, 2004) des niveaux nettement réduits de CHDL. Le cholestérol une fois estérifié migre au centre de l’édifice et les pré-β-HDL
deviennent des α-HDL matures, de forme sphérique (Lewis & Rader, 2005).
6
Fig. 2. Sécrétion, acquisition des lipides et maturation des HDL
(Lewis & Rader, 2005).
ABCA1: Transporteur ATP binding cassette A1. CE: Cholestérol estérifié. CL: Cholestérol libre. LCAT:
Lécithine: cholestérol acyltransférase. LPL: Lipoprotéine lipase. PL: Phospholipides.
Chez l’Homme, les particules α-HDL acquièrent des molécules de triglycérides grâce à
l’action d’une enzyme plasmatique, la protéine de transfert du cholestérol estérifié (CETP)
qui catalyse le transfert de molécules d’esters de cholestérol des α-HDL vers les VLDL et
LDL (Gauthier et al., 2005) qui seront ultérieurement prises en charge par les hépatocytes
(Fig. 3) pour être excrétées après modifications enzymatiques sous forme de sels biliaires
(Rader, 2006). Une autre enzyme plasmatique, la protéine de transfert des phospholipides
(PLTP), catalyse le transfert de molécules de phospholipides des VLDL et LDL vers les
particules α-HDL (Huuskonen et al., 2001). L’action simultanée de la HTGL et la LE, mène à
la formation de particules plus petites et plus denses ayant une affinité élevée pour la SR-B1,
ce qui induit une prise en charge sélective des esters de cholestérol (EC) par les hépatocytes et
les cellules productrices d’hormones (Rader, 2006). Les molécules d’apo A-I, se retrouvent à
nouveau sous forme de molécules relativement délipidées, viennent régénérer le pool d’apo
A-I/pré-β-HDL. Elles peuvent ainsi à nouveau s’infiltrer dans l’espace extravasculaire pour
induire l’efflux de cholestérol et réinitier le cycle du transport inverse du cholestérol (Lewis &
7
Rader, 2005). L’apo A-I est catabolisée au niveau du rein, préférentiellement sous sa forme
délipidée, où elle est filtrée et catabolisée par les cellules tubulaires grâce au système
cubiline/mégaline (Fig. 3) (Hammad et al., 2000 ; Moestrup & Nielsen, 2005).
Fig. 3. Action des lipases sur les HDL et facteurs du transfert lipidique
(Lewis & Rader, 2005).
CETP: Protéine de transfert du cholestérol estérifié. EC: Esters de cholestérol. LH: Lipase hépatique. LPL:
Lipoprotéine lipase. PL: Phospholipides. PLTP: Protéine de transfert des phospholipides. SR-B1: Récepteur
scavenger de la classe B. TG: Triglycérides.
II. Nutrition et métabolisme des lipides
De très nombreuses études épidémiologiques, cliniques et physiopathologiques ont
montré que l’alimentation influence le métabolisme des lipides dans l’organisme et participe
au développement de l’athérosclérose (Martins e Silva & Saldanha, 2007). En effet, il est bien
établi que le type de régime consommé par les individus est associé au développement de
quelques maladies chroniques, y compris les maladies cardiovasculaires (Urquiaga et al.,
2004). Un régime de type occidental (riche en graisses saturées, sucres simples et sel,
8
et pauvre en poissons, légumes et fibres) a une tendance à des effets pro-inflammatoires, prooxydantes et pro-thrombotiques et à un risque cardiovasculaire plus élevé (Martins e Silva &
Saldanha, 2007). En revanche, un régime de type Méditerranéen (avec moins de viande et
plus de poissons, fibres, fruits, légumes et d’huile d’olive) semble expliquer la diminution du
risque cardiovasculaire pour ceux qui le consomme (Martins e Silva & Saldanha, 2007).
L’adoption du régime méditerranéen est associée à la diminution de toute cause de mortalité
et améliore les niveaux de facteurs de risque cardiovasculaire (Assmann et al., 1997 ; Pitsavos
et al., 2002; Martinez-Gonzalez et al., 2002 ; Trichopoulou et al., 2003 ; Psaltopoulou et al.,
2004 ; Esposito et al., 2004 ; Chrysohoou et al., 2004 ; Cereda et al., 2005) en particulier,
l’hypertension artérielle, l’hypercholestérolémie, le diabète et l’obésité (Panagiotakos et al.,
2007).
II. 1. Effets des lipides alimentaires, en particulier celui du cholestérol
La
contribution
du
cholestérol
alimentaire
dans
le
développement
de
l’hypercholestérolémie est controversée car, il est difficile de prévoir précisément son effet
sur les concentrations du CT et des lipoprotéines plasmatiques (Herron et al., 2003). Le
cholestérol alimentaire semble agir de façon modérée sur le taux de cholestérol sérique autant
chez les sujets normolipémiques que chez les sujets hypercholestérolémiques (Mc Namara,
1995).
Les
données
hypercholestérolémiques
rapportées
dans
répondraient
cette
moins
étude
au
suggèrent
cholestérol
que
les
alimentaire
individus
que
les
normolipémiques. Dans certaines études cliniques, l’augmentation de l’apport en cholestérol
entraîne un accroissement modéré des taux de CT et de LDL (Lichtenstein et al, 1994).
Plusieurs études ont montré qu’une augmentation de 100 mg de cholestérol alimentaire peut
entraîner une augmentation modérée de 0,05-0,06 mmol.L-1du CT sérique (Weggemans et al.,
2001 ; Mc Namara, 2000). En effet, cette quantité de cholestérol dans le régime induit une
élévation de 0,065 mmol.L-1des teneurs en CT, une augmentation du C-LDL, C-HDL et du
rapport LDL/HDL ainsi qu’une élévation de l’activité de la CETP et de la LCAT chez des
hommes adultes normolipémiques (Herron et al., 2003) qui sont classés ainsi
hyperrépondeurs au cholestérol alimentaire. Par ailleurs, chez des jeunes hommes
normolipémiques, la consommation d’un régime enrichi en cholestérol augmente les teneurs
sériques en CT, C-LDL et C-HDL ainsi que celles de l’apo B et prolonge la demi-vie des
remnants de chylomicrons favorisant ainsi le développement des MCV (César et al., 2006).
L’élévation du C-HDL observée dans certains cas (Herron et al., 2003 ; César et al., 2006)
semble dépendre des acides gras (AG) consommés simultanément avec le cholestérol
9
(Lichtenstein et al, 1994). Plusieurs facteurs moduleraient chez l’homme les effets du
cholestérol alimentaire sur les lipides plasmatiques : la quantité utilisée, les différences
individuelles d’absorption et l’efficacité des mécanismes de feedback entraînant une
diminution de la synthèse du cholestérol quand l’apport alimentaire est élevé (Mc Namara,
1990), ainsi que la présence des différents types d’AG contenus dans le régime (Hegsted et
al., 1993 ; Lichtenstein et al., 1994).
Chez le rat, il a aussi été observé une augmentation des taux de CT plasmatique
(Fungwe et al., 1992 ; Smit et al., 1993 ; Adamopoulos & Papamichael, 1996) et de C-LDL
(Lu & Wu, 1994) en réponse au cholestérol alimentaire. Contrairement à ce qui avait été noté
chez l’homme, certaines études ont rapporté une diminution des teneurs sériques en C-HDL
(Fungwe et al., 1992 ; Lu & Wu, 1994). En plus d’une élévation de la cholestérolémie, la
consommation de cholestérol favorise aussi l’augmentation des concentrations plasmatiques
en triglycérides (TG) (Fungwe et al., 1992 ; Adamopoulos & Papamichael, 1996) et des
lipoprotéines de très faible densité (VLDL) (Fungwe et al., 1992). Quant aux effets du
cholestérol alimentaire sur les lipides hépatiques, ils consistent en une augmentation des
teneurs en TG et en EC (Fungwe et al., 1992 ; Lu & Wu, 1994 ; Lee et al., 1991 ; Fungwe et
al., 1993). Les effets du cholestérol alimentaire sur les lipides plasmatiques et hépatiques
semblent être liés à la quantité incorporé dans le régime (Fungwe et al., 1992 ; Lee et al.,
1991).
L’hypercholestérolémie provoquée chez l’homme par un apport alimentaire élevé de
cholestérol serait due principalement à une incapacité de supprimer la synthèse du cholestérol
endogène, laquelle dépendrait en partie du phénotype de l’apo E (Mc Namara, 1990). Chez les
rats hyperrépondeurs au cholestérol exogène, le problème se situerait plutôt au niveau de la
captation hépatique et de l’incorporation du cholestérol dans les acides biliaires (lmaizumi et
al., 1992). De plus, chez les rats présentant une résistance à l’élévation des taux de cholestérol
plasmatique normalement induite par un apport accru de cholestérol exogène, les EC seraient
convertis plus efficacement en acides biliaires (Smit et al., 1993). Une augmentation des taux
de synthèse et de sécrétion hépatique des lipoprotéines ainsi qu’une diminution de la captation
hépatique des LDL et VLDL seraient aussi impliquées (Mc Namara, 1990 ; Packard et al.,
1983 ; Spady & Dietschy, 1988). Cette dernière serait due à une diminution de la transcription
du gène et de la synthèse des récepteurs des LDL subséquente à l’accumulation de cholestérol
au niveau du foie (Mc Namara, 1990 ; Spady & Dietschy, 1985).
Le degré de saturation des AG alimentaires joue aussi un rôle important dans la
modulation des concentrations du cholestérol sanguin et la détermination du risque des MCV
10
(Moreno & Mitjavila, 2003). Bien que, les acides gras saturés (AGS) sont identifiés comme
étant le seul facteur alimentaire qui a le plus grand effet néfaste sur les concentrations du CLDL (Hu et al., 2001), les AGS à chaîne moyenne semblent avoir un effet neutre sur la
cholestérolémie et les teneurs en C-LDL chez le hamster (Woollett et al., 1992a) ou chez
l’homme (Temme et al., 1997). Les AGS à longue chaîne comparés aux acides gras
monoinsaturés (AGMI) et aux acides gras polyinsaturés (AGPI) élèvent le taux de CT et celui
du C-LDL mais ne modifient pas ou peu la teneur en C-HDL chez le hamster (Woollett et al.,
1992b), le rat (Ventura et al., 1989) ou chez l’homme (Grundy & Denke, 1990 ; Denke &
Grundy, 1991). Cependant, aucun effet n’a été observé sur la teneur plasmatique en TG chez
le rat (Ventura et al., 1989 ; Spady, 1993).
II. 2. Effets des protéines alimentaires, en particulier les protéines de poisson
Le poisson est considéré comme l’un des principaux composants d’un régime sain
(Chrysohoou et al., 2007), et les études récentes ont clairement démontré les bénéfices
alimentaires de sa consommation (Iso et al., 2006 ; Lara et al., 2007) et particulièrement les
AGPI n-3 qui lui ont attribué l’effet cardio-protecteur (Domingo, 2007). Cependant, un autre
constituant important contenu dans le poisson tel que les protéines mais qui est moins bien
étudié, peut jouer probablement un rôle protecteur à l’événement cardiovasculaire et
influencer le métabolisme des lipides.
Par ailleurs, il est bien établi que les protéines d’origine végétale ont un effet favorable
sur le métabolisme des lipides chez l’Homme et chez l’animal comparées à la caséine. En
revanche, l’effet des protéines de poisson sur le métabolisme du cholestérol et des
triglycérides est moins bien connu (Shukla et al., 2006).
II. 2. 1. Effets sur les lipides sériques
L’effet de la protéine de poisson sur le taux de cholestérol sérique varie d’une étude à
une autre. Cela peut être dû aux différentes quantités de lipides et de cholestérol contenus
dans le régime ou du modèle expérimental utilisé.
Chez le lapin, il semble que la proportion et le type de lipides alimentaires ont un rôle
important dans la modulation de l’impact de la protéine de poisson sur la cholestérolémie. En
effet, lorsque la protéine de poisson fait partie d’un régime pauvre en lipides (1% d’huile de
maïs), elle aurait un effet hypercholestérolémiant semblable à celui de la caséine,
comparativement à la protéine de soja (Carroll & Hamilton, 1975). Par contre, lorsque
l’apport en lipides est élevé, la protéine de poisson aurait un effet hypocholestérolémiant
11
comparée à la caséine, si la composition lipidique du régime alimentaire : AGS (14% d'huile
de coco) (Kritchevsky et al., 1982) ou de cholestérol (11% d'huile de maïs et 0,06% de
cholestérol) (Bergeron et al., 1992a) favorise initialement l’hypercholestérolémie chez le
lapin. Cependant, la protéine de poisson comparée à la caséine entraîne des taux de
cholestérol sérique semblables en présence d’une proportion élevée (11% d’huile de maïs)
(Bergeron et al., 1991) ou réduite (1% d’huile de maïs) (Carroll & Hamilton,1975) d’AGPI.
Toutefois, lorsque l’apport lipidique est modéré (5% de lipides dont 4% d’huile de noix de
coco et 1% d’huile de maïs), l’effet de la protéine de poisson serait intermédiaire à celui de la
caséine et de la protéine de soja (Kritchevsky et al., 1982). En dépit des effets variables sur la
cholestérolémie selon l’apport lipidique, la protéine de poisson comparativement à la caséine
(Kritchevsky et al., 1982 ; Bergeron & Jacques,1989 ; Bergeron et al., 1991) et à la protéine
de soja (Bergeron & Jacques, 1989 ; Bergeron et al., 1991) favoriserait une élévation du CHDL chez le lapin quelle que soit la quantité de lipides incorporée dans le régime.
Des résultats semblables ont été retrouvés chez le rat. En effet, incorporée a un régime
pauvre en lipides (1% d’huile de maïs), la protéine de poisson aurait un effet
hypercholestérolémiant similaire à celui de la caséine, comparée à la protéine de soja (Sugano
et al., 1984). Par contre, en présence de cholestérol et d’une proportion relativement élevée en
graisses saturés (7% d’huile de noix de coco et 1% d’huile de maïs) (Hurley et al., 1995) ou
(9% d’huile de noix de coco et environ 1% d’huile de maïs) (Zhang & Beynen, 1993), la
protéine de poisson comparée à la caséine entraîne une diminution de la cholestérolémie
semblable à celle induite par la protéine de soja. D’autres travaux ont montré que chez le rat
consommant un régime supplémenté avec 1% de cholestérol, la protéine de morue comparée à
la caséine diminue le CT sérique (Lavigne et al., 2000), et quelle que soit la nature des lipides
qui lui sont combinées (10% d’huile de menhaden ou de graisse de bœuf) (Demonty et al.,
2003). Chez le rat Zucker, Wergedahl et al., (2004) ont démontré que l’hydrolysat de
protéines de saumon combiné à 10% d’huile de soja entraîne une réduction du CT et du CHDL comparé à la caséine , alors que son effet est similaire à celui des protéines de soja. Des
résultats similaires ont été retrouvés chez des rats Sprague-dawley consommant un régime
hyperlipidique (10% de saindoux + 0,5% de cholestéro) contenant des protéines de merlan
(Shukla et al., 2006).
Quant à l’impact des protéines de poisson sur la cholestérolémie chez l’homme, il a
été étudié à l’aide de régimes contenant du poisson maigre (dont le constituant majeur est la
protéine) comparés à des régimes à base de protéines d’origine animale (bœuf, porc, volaille,
12
oeufs et produits laitiers) (Jacques et al., 1992 ; Gascon et al., 1996 ; Lacaille et al., 2000;
Beauchesne-Rondeau et al., 2003). Des travaux réalisés chez des femmes post-ménopausées
(Jacques et al., 1992) et pré-ménopausées (Gascon et al., 1996) normolipémiques
consommant un régime à base de poisson maigre pendant quatre semaines, ont révélé un
maintien des valeurs élevées de CT sérique, C-HDL et apo B-LDL comparativement aux
régimes à base d’autres protéines d’origine animale (bœuf, porc, volaille, oeufs et produits
laitiers). Par ailleurs, chez des sujets normolipémiques (Lacaille et al., 2000) et des sujets
hypercholestérolémiques (Beauchesne-Rondeau et al., 2003), la consommation de poisson
maigre induit une élévation du C-HDL et du rapport C-HDL2/C-HDL3. Une autre étude
controversée a montré chez des femmes post-ménopausées et des hommes normolipémiques
une réduction des taux de C-HDL avec un régime à base de poisson maigre (Li et al., 2004).
L’influence de la protéine de poisson sur la triglycéridémie varie selon le modèle étudié
et les régimes utilisés. Chez l’homme, plusieurs études ont mis en évidence une diminution
des teneurs en TG-VLDL induite par un régime contenant du poisson maigre
comparativement au régime à base d’autres protéines animales (bœuf, porc, volaille, oeufs et
produits laitiers) (Gascon et al., 1996 ; Lacaille et al., 2000 ; Beauchesne-Rondeau et al.,
2003). Cet effet pourrait aussi être dû à la présence d’acide gras polyinsaturés n-3 dans le
régime poisson (Gascon et al., 1996 ).
Chez le lapin, il apparaît que la protéine de poisson entraîne des concentrations de
triglycérides sériques semblables ou supérieures a celles obtenues avec la caséine selon que,
le régime contient du sucrose et une quantité importante de lipides (14%) (Kritchevsky et al.,
1982) ou de fécule de maïs et une quantité modérée de lipides (5%) (Bergeron et al., 1989).
Par contre, d’autres études ont révélé que la protéine de morue comparée à la caséine dans un
régime supplémenté en cholestérol diminue les TG-VLDL (Bergeron et al., 1991) et
augmente l’activité de la lipoprotéine lipase (LPL) ( Bergeron et al., 1992b).
Chez le rat, la protéine de poisson induit des taux de TG sériques équivalents à ceux
obtenus avec la protéine de soja mais plus faibles qu’avec la caséine (Hurley et al., 1995). Les
études réalisées sur la protéine de morue (Lavigne et al., 2000) et la protéine de merlan
(Shukla et al., 2006) ont bien démontré l’effet hypotriglycéridémiant de ces protéines par
rapport à la caséine avec réduction de la masse des VLDL-LDL de leur contenu en TG.
13
II. 2. 2. Effets sur les lipides hépatiques
Les études effectuées chez l’animal ont démontré l’effet de la consommation des
protéines de poisson sur les taux de lipides hépatiques. Il semble que la protéine de poisson
comparée à la caséine favorise chez le lapin une diminution des teneurs en cholestérol
hépatique similaire à celle observée avec la protéine de soja (Lovati et al., 1990). Chez le rat
par contre, cet effet n’est pas toujours observé puisque, l’étude de Hurley et al., (1995) n’a
montré aucune variation du cholestérol hépatique avec la protéine de poisson comparée à la
caséine. Néanmoins, Shukla et al., (2006) ont trouvé que la protéine de merlan par rapport à la
caséine entraîne une augmentation des EC au niveau du foie.
III. Mécanismes d'action des protéines de poisson sur le métabolisme lipidique
Bien que certaines études ont attribué à la protéine de poisson des effets sur le
métabolisme lipidique dont une élévation du C-HDL comparativement aux autres protéines
alimentaires, en particulier les protéines d’origine animale. Les mécanismes impliqués dans la
variation de la cholestérolémie ne sont pas bien élucidés. Les hypothèses émises peuvent être
regroupées en deux classes: celles qui soutiennent que l’effet des protéines de poisson a lieu
au niveau gastro-intestinal, et celles qui impliquent des voies métaboliques post-absorptives.
III. 1. Hypothèse gastro-intestinale
Les études montrent des effets variables de la protéine de poisson sur la circulation
entéro-hépatique du cholestérol et des acides biliaires. Chez le rat, il a été observé une
augmentation (lritani et al., 1985 ; Shukla et al., 2006) ou une diminution de l’excrétion des
acides biliaires (Gascon et al., 1996 ) ainsi qu’une augmentation de l’excrétion fécale des
stérols neutres (Sugano et al., 1984 ; lritani et al., 1985) avec la protéine de poisson comparée
à la caséine alors qu’une autre étude, n’a montré aucun effet de la protéine de poisson sur ces
deux paramètres (Lapré et al.,1989). L’excrétion élevée d’acides biliaires observée avec la
protéine de poisson a été soutenue par une activité plus élevée de la cholestérol 7-α
hydroxylase, enzyme impliquée dans la synthèse des acides biliaires (Shukla et al., 2006).
III. 2. Hypothèse post-absorptive
Les acides aminés tels que la méthionine, glycine, arginine ou la lysine pourraient être
responsables des différents effets des protéines alimentaires sur le métabolisme des lipides
(Sugiyama et al., 1996 ; Sugiyama et al., 1997 ; Giroux et al., 1999 ; Gudbrandsen et al.,
2005). Les teneurs en lysine et en méthionine des régimes semblent être étroitement liées avec
leur effet hypercholestérolémiant (Kurowska & Carroll, 1995). De plus, une corrélation
14
positive est trouvée entre la teneur sérique en cholestérol et les concentrations en méthionine
ou en valine (Sugiyama et al., 1996). Le rapport méthionine/glycine élevé dans la caséine
peut être responsable de l’élévation du cholestérol sérique (Morita et al., 1997) (Tableau I).
La supplémentation de la glycine à la caséine réduit la teneur sérique en cholestérol chez le rat
(Sugiyama et al., 1986).
Tableau I. Composition de différentes sources protéiques en acides aminés1 impliqués dans
l’effet hypo ou hypercholestérolémiant.
Acides aminés
Sardinea
Morueb
Saumonc
Merland
Sojad
Caséined
Arginine
4,48
6,29
4,71
5,35
5,8
2,3
Glycine
8,56
5,39
7,13
3,95
3,45
1,7
Lysine
7,95
9,41
4,94
8,7
5,05
7,3
Méthionine
2,81
1,98
1,54
2,85
1,25
2,6
Lysine/Arginine
1,77
1,49
1,05
1,62
0,87
2,28
Méthionine/Glycine
0,33
0,37
0,21
0,72
0,36
1,52
1
(g/100g de protéines)
(a : Garcia-Arias et al., 2003 ; b : Lavigne et al., 2000 ; c : Wergedahl et al., 2004 ; d : Shukla
et al., 2006).
Chez le lapin, l’effet similaire de la protéine de poisson et la protéine de soja sur la
cholestérolémie comparé à la caséine a été incriminé au faible rapport lysine/arginine
(Kritchevsky et al., 1982 ; Kritchevsky & Czarnecki, 2000). D’autres études ont suggéré que
le contenu élevé en acides aminés essentiels tels que la lysine et la méthionine dans la
protéine de poisson par rapport au soja (Kurowska & Carroll, 1990 ; 1994), soit responsable
en partie de l’hypercholestérolémie observée dans certains cas suite à l’ingestion d’un régime
contenant des protéines de poisson. Le lien entre les faibles rapports lysine/arginine et
méthionine/glycine, et le taux de cholestérol sérique a été démontré chez le rat soumis à un
régime hyperlipidique (Lavigne et al., 2000 ; Shukla et al., 2006) et chez le rat Zucker
(Wergedahl et al., 2004).
Chez le lapin, l’élévation des HDL et la diminution des TG-VLDL observées avec la
protéine de poisson comparativement à la protéine de soja seraient liées à une augmentation
de l’activité de la LPL (Jacques et al., 1995). Le mécanisme par lequel la protéine de poisson
module l’activité de la LPL ne semble pas être lié à une modification des concentrations
plasmatiques d’insuline à jeun (Bergeron et al., 1992b). Cependant, chez le rat il a été mis en
évidence un rapport insuline/glucagon plus élevé suite à l’ingestion de protéines de poisson
15
comparé à celui de la caséine ou de la protéine de soja (Hurley et al., 1995). L’augmentation
du cholestérol et des triglycérides hépatiques observée avec la protéine de poisson en
comparaison avec la protéine de soja pourrait être due à l’élévation du rapport
insuline/glucagon (Hurley et al., 1995), cette dernière favorisant la lipogenèse hépatique
(Kissebah & Schectman, 1987).
IV. Choix du modèle animal
De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour étudier les effets des régimes sur
le métabolisme du cholestérol. Toutefois, la plupart de ces modèles diffèrent du modèle
humain dans la distribution du cholestérol et dans le profil des lipoprotéines dans le
compartiment plasmatique (Fernandez & Volek, 2006) (Fig. 4). Le rat est un modèle animal
fréquemment utilisé dans les études du métabolisme lipidique. Il se révèle particulièrement
adéquat pour l’étude des effets des régimes alimentaires sur le métabolisme des TG sanguins.
Il a d’ailleurs été utilisé très souvent dans des protocoles expérimentaux visant a déterminer
les effets des AGPI n-3 sur la triglycéridemie (Harris et al., 1997 ; Demonty et al., 1998;
Demonty et al., 2003). Le rat a aussi été largement utilisé pour l’étude du métabolisme du
cholestérol en réponse aux modifications du régime alimentaire notamment, l’effet des
protéines alimentaires sur la cholestérolémie (Zhang & Beynen, 1993 ; Hurley et al., 1995;
Sanchez-Muniz et al., 2003 ; Wergedahl et al., 2004 ; Shukla et al., 2006). Cependant, dans
ce cas, l’extrapolation des résultats à l’humain doit être faite avec prudence, les profils
lipidiques, et sans doute le métabolisme de différentes fractions lipoprotéiques sont différents
chez le rat et l’Homme (Bozoky et al., 2006). Chez le rat, la majorité du cholestérol
plasmatique est transporté par les HDL (60 à 80%), alors que seulement 10% sont transportés
par les LDL (Bozoky et al., 2006) ce qui rend le rat résistant à l’athérosclérose (Russell &
Proctor, 2006). Chez l’homme par contre, les LDL transportent la plus grande proportion du
cholestérol plasmatique (60 à 80%), alors que les HDL n’en contiennent que 27 à 35%
(Lizenko et al., 2007). Il semble qu’une élimination plasmatique plus rapide de l’apo B des
VLDL chez le rat puisse expliquer les niveaux plus faibles de LDL observés chez cet animal
en comparaison avec les niveaux observés chez l’homme (Bozoky et al., 2006). De plus,
l’activité de la triglycéride lipase hépatique pourrait jouer un rôle dans la genèse de différents
profils lipidiques notés selon l’espèce, alors que l'activité de la LPL est élevée chez les
différentes espèces animales (activité post-héparine = 350 mU/mL chez l’homme et 440
mU/mL chez le rat), l’activité de la triglycéride lipase hépatique varie beaucoup d’une espèce
16
à une autre (activité post-heparine = 370 mU/mL chez l’homme et 700 mU/mL chez le rat)
(Olivecrona & Bengtsson-Olivecrona, 1993).
Rat
Souris
Hamster Lapin CETP
trang
ApoBKO
Porc
Homme
Fig. 4. Profil lipoprotéique de différentes espèces
(Fernandez & Volek, 2006).
CETP trang :
Souris transgénique exprimant la Protéine de Transfert des Esters de Cholestérol humaine.
ApoB-KO :
Souris déficiente pour le gène de l’apo B.
17
Matériel et méthodes
I. Extraction et purification des protéines de sardine.
I. 1. Choix de l’échantillon
La sardine (Sardina pilchardus), appartenant à la famille des Clupéidés, est une espèce
de poisson très consommée au niveau de la région méditerranéenne, en particulier par la
population oranaise en raison de son faible prix.
Photo 1. Sardina pilchardus
I. 2. Extraction des protéines
Les protéines de sardine sont extraites selon un procédé d’extraction lipidique. Le
principe général consiste à séparer l’eau et l’huile de la matière sèche selon la technique de
Guillaume et al., (1999) (Fig. 5). Les sardines sont éviscérées, lavées et hachées puis placées
dans une étuve (Tan Steril, Italy) à 80-85 °C pendant 20 minutes. À ce niveau, une première
séparation a lieu entre une phase solide (protéines coagulées) et une phase liquide (eau et
huile). Un pressage parachève cette opération, le gâteau obtenu est émietté et séché à l’étuve
(40-45°C) pendant 24 heures. L’eau de presse est décantée et centrifugée (Eppendorf,
Centrifuge 5702, Germany) pour séparer l’huile et le soluble est réincorporé au gâteau. Après
broyage, les protéines de sardine sont délipidées avec de l’hexane (Biochem chemopharma,
UK) dans un extracteur de lipides (Soxhlet, Labo Tech LT.6, Germany) pendant 5 heures à
50 °C.
I. 3. Estimation du degré de pureté des protéines
Le degré de pureté des protéines obtenues après délipidation est déterminé par un
dosage d’azote (N) selon la méthode de Nessler. Il s’agit d’un dosage colorimétrique réalisé
après minéralisation de l’azote de l’échantillon (50 mg). Une gamme étalon est réalisée à
partir du sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4) (Merck, Germany) à 100 µg d’azote/mL.
18
Sardines
Éviscération et lavage
Hachage (manuel)
Cuisson (80-85 °C pendant 20 min)
Pressage
Gâteau
Décantation
Émiettement
Boue
Eau de presse
Centrifugations successives à
3500 trs/min
(20 min à T° ambiante)
Séchage (40-45 °C pendant 24 h)
Refroidissement
Eau de presse
délipidée
Huile de
sardine
Broyage
Farine de sardine
(protéines non délipidées)
Délipidation (soxhlet, 50 °C pendant 5 h)
Protéines purifiées
Fig. 5. Diagramme d’extraction1 et de purification des protéines de sardine
1 : Selon la méthode de Guillaume et al., (1999).
19
Il se développe une coloration jaune qui est proportionnelle à la quantité d’azote contenu dans
l’échantillon. La lecture est effectuée au spectrophotomètre (Jasco V-530, Japan) à 500 nm.
La quantité de protéines (N x 6,25) est exprimée en %.
II. Animaux et régimes
Dix huit rats mâles de souche Wistar (Iffa Crédo, l’arbresle, Lyon, France), âgés de 5
semaines et pesant 80 ± 5 g sont utilisés dans cette étude. 12 rats (groupe expérimentale) sont
soumis à un régime contenant 20% de caséine combinée à 5% d’un mélange d’huiles
végétales (3,9% olive + 1% noix + 0,1% tournesol avec 13% d’AGS, 58% d’AGMI et 29%
d’AGPI et un rapport n-6/n-3 = 7), supplémenté avec 1,5% de cholestérol (Sigma-Aldrich
Chemie, Germany) et 0,75% d’acide cholique (Sigma-Aldrich Chemie, Germany) pendant 10
jours afin de provoquer une hypercholestérolémie. Un autre groupe (n=6) consomme le même
régime mais sans cholestérol et sert de contrôle (groupe CAS).
Après cette phase et au poids de 100 ± 5 g, les rats du groupe expérimentale rendus
hypercholestérolémiques (4,86 ± 1,19 mmol.L-1 versus les valeurs normales < 2,5 mmol.L-1
chez le rat) (Pandya et al., 2006), sont répartis en 2 groupes homogènes (n=6) consommant
chacun pendant 28 jours soit :
Groupe PSc : 20% de protéines de sardine + 5% du mélange d’huiles végétales + 1,5%
de cholestérol + 0,75 d’acide cholique.
Groupe CASc : 20% de caséine + 5% du mélange d’huiles végétales + 1,5% de
cholestérol + 0,75 d’acide cholique.
Le groupe CAS continue à consommer le même régime (20% de caséine + 5% du mélange
d’huiles végétales).
La composition pondérale des régimes est présentée dans le Tableau II. La nourriture
et l’eau sont données ad libitium. Les animaux sont placés dans une animalerie où la
température est maintenue à 24 °C avec une alternance jour/nuit de 12 heures et une
hygrométrie de 50-60%. Les conseils pour la protection et l’utilisation des animaux de
laboratoire sont suivis (Council of European Communities, 1986).
20
Tableau II. Composition des régimes en g/100 g de régime1
Ingrédients
+
cholestérol
-
Caséine
+
cholestérol
20
Caséine
20
-
-
57,75
57,75
60
Saccharose5
4
4
4
Huile végétale6
5
5
5
5
5
5
4
4
4
2
2
2
1,5
1,5
-
0,75
0,75
-
Caséine2
Amidon de maїs
Cellulose
3
4
7
Mélange minéral
8
Mélange vitaminique9
Cholestérol10
Acide cholique
11
20
1
les régimes sont isoénergétiques (1,778 MJ/100g de régime) et donnés sous forme de poudre préparés au
Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique (LNCM).
2
Prolabo-Paris, France.
3
Protéines de sardine extraites selon la technique de Guillaume et al., (1999) et purifiées
4
ONAB, Sidi Bel Abbès, Algérie.
5
Sucre cristallisé, ENASUCRE, Sfisef, Algérie.
6
Produit du commerce : Huile d’olive (15% AGS, 75% AGMI, 10% AGPI : 9% n-6 et 1% n-3) Ifri olive,
Bejaїa, Algérie. Huile de noix (11% AGS, 18% AGMI, 71% AGPI : 58 % n-6 et 13% n-3) Lesieur, France.
Huile de tournesol (13% AGS, 22% AGMI, 65% AGPI : 65 % n-6) Cévital, SPA, Bejaїa, Algérie.
7
Prolabo-Paris, France.
8
UAR 205 B (Villemoisson, 91360, Epinay/S/Orge, France), Mélange minéral (mg/kg de régime) CaHPO4,
17200 ; KCl, 4000 ; NaCl, 4000 ; MgO2, 420 ; MgSO4, 2000 ; Fe2O3, 120 ; FeSO4, 7H2O, 200 ; MnSO4,
H2SO4, H2O, 98 ; CuSO4, 5H2O, 20 ; ZnSO4, 80 ; CuSO4, 80 ; CuSO4, 7H2O ; KI, 0.32.
9
UAR 200 (Villemoisson,91360, Epinay/S/Orge, France), Mélange vitaminique (mg/kg de régime) : Vit A,
39600 UI ; Vit D3, 5000UI, Vit B1, 40 ; Vit B2, 30 ; Vit B3, 140 ; Vit B6, 20 ; Vit B7, 300 ; Vit B12, 0,1 ;
Vit C, 1600 ; Vit E, 340 ; Vit K, 3,80 ; Vit PP, 200 ; choline, 2720 ; Acide folique, 10 ; Acide paraaminobenzoїque (PAB), 180 ; Biotine, 0,6 ; cellulose, qsp, 20g.
10,11
Sigma-Aldrich Chemie, Germany.
21
III. Bilans nutritionnels
Afin d’estimer l’efficacité nutritionnelle des différents régimes, un bilan azoté et
lipidique est réalisé sur les six rats de chaque groupe placés individuellement durant toute
l’expérimentation dans des cages à métabolisme. Les animaux et la nourriture ingérée sont
pesés quotidiennement. Les urines et les fèces sont collectées durant 7 jours, du 21ème au 28ème
jour. Les urines sont recueillies sur un antiseptique (thymol-isopropanol à 10% P/V, Merck,
Germany) puis filtrées et conservées à 4 °C. Une partie des fécès est débarrassée de toute
nourriture est séchée dans une étuve à 40 °C puis finement broyée. L’autre partie est
conservée à -20 °C.
III. 1. Détermination de l’azote urinaire protéique et non protéique
La teneur en azote des régimes, des urines et des fèces est déterminée par la méthode
de Nessler (décrite précédemment) sur 0,1 mL d’urine ou 50 mg de régime ou de fèces.
III. 1. 1. Dosage de l’urée
L’urée urinaire est déterminée par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit
Biocon, Germany). L’urée présente dans l’échantillon donne en présence d’uréase et de
nitroprusside un indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie (Jasco V-530, Japan).
La lecture se fait à une longueur d’onde λ = 600 nm.
III. 1. 2. Dosage de la créatinine
La créatinine urinaire est déterminée par une méthode colorimétrique (Kit Biocon,
Germany). La créatinine présente dans l’échantillon réagit avec le picrate en milieu alcalin,
pour donner un complexe coloré. La vitesse de formation de ce complexe est mesurée dans
des périodes initiales courtes, en évitant ainsi l’interférence d’autres composés. La lecture se
fait à une longueur d’onde λ = 500 nm.
III. 1. 3. Dosage de l’acide urique
L’acide urique urinaire est déterminé par une méthode colorimétrique enzymatique
(Kit Biocon, Germany). L’acide urique présent dans l’échantillon donne en présence
d’uricase, un indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie. La lecture se fait à une
longueur d’onde λ = 546 nm.
Le bilan azoté (BA), le coefficient d’utilisation digestif apparente de l’azote (CUDN),
les rapports d’Efficacité protéique (REP) et nutritionnelle (REN) sont calculés.
22
III. 2. Détermination des lipides totaux et du cholestérol total
La teneur en lipides totaux des régimes et des fèces est déterminée selon la technique
de Delsal (1944). Il s’agit d’une extraction à froid des lipides sur 1g d’échantillon en présence
d’un mélange chloroforme/méthanol (Biochem chemopharma, UK), (4/1, V/V). L’extrait
lipidique est débarrassé des solvants par évaporation sous vide à 48 °C (Évaporateur rotatif
Büchi, Germany) pendant 2 heures. La teneur en lipides totaux est estimée par la différence
entre le poids final du ballon contenant l’extrait lipidique et le poids initial du ballon vide
exprimée en pourcentage. Les lipides sont repris dans 10 mL d’isopropanol pour le dosage
des différents composants lipidiques. Le coefficient d’utilisation digestif apparente des lipides
(CUDL) est ensuite calculé. Sur les régimes et les fèces, le cholestérol total (CT) est dosé par
une méthode colorimétrique enzymatique (Kit Biocon, Germany). Le cholestérol libre et le
cholestérol estérifié présents dans l’échantillon donnent après hydrolyse enzymatique et
oxydation un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie (Jasco V-530, Japan).
L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde d’hydrogène et du 4-aminoantipirine en présence de phénol et de la peroxydase. La lecture se fait à une longueur d’onde
λ = 546 nm.
IV. Prélèvement des échantillons de sang, foie et aorte
Au 28ème jour de l’expérimentation, après 12 heures de jeûne, les 6 rats de chaque
groupe (PSc, CASc et CAS) sont pesés puis anesthésiés par injection intrapéritonéale d’une
solution de pentobarbital sodique (à 60 mg/100 g de poids corporel) (Coopération
Pharmaceutique Française, 77000, Melun). Le sang est prélevé par ponction de l’aorte
abdominale puis recueilli dans des tubes secs. Les échantillons sanguins sont centrifugés à
3500 trs/min pendant 20 min à 4 ºC (SIGMA, 4K10 Bioblock Scientific, Germany). De
l’EDTA-Na2 à 0,1% (P/V) (Merck, Germany) est rajouté au sérum comme conservateur. Le
foie et l’aorte sont rincés avec une solution de NaCl à 0,9% (P/V) (Merck, Germany), excisés,
séchés et pesés. Tous les échantillons prélevés sont conservés à -20 °C jusqu’aux analyses.
V. Analyses biochimiques
V. 1. Détermination des teneurs en protéines totales du foie et du sérum
Les protéines sériques et hépatiques sont dosées selon la méthode de Lowry et al.,
(1951). La sérum albumine bovine (SAB) (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA)
est utilisée pour établir la courbe étalon. En milieu alcalin, le complexe formé par les ions
Cu2+ et les groupements tyrosine et tryptophane des protéines est réduit par le réactif de Folin
23
(Sigma-Aldrich Chemie, Germany). Il se développe alors une coloration bleue dont l’intensité
est proportionnelle à la quantité de protéines de l’échantillon et la lecture se fait à une
V. 2. Dosage de l’albumine sérique
L’albumine sérique est déterminée par une méthode colorimétrique (Kit Spinreact,
Spain). L’albumine présente dans l’échantillon donne après sa liaison avec le vert de
bromocrésol un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie. L’intensité de la
coloration est proportionnelle à la concentration d'albumine dans l'échantillon. La lecture se
fait à une longueur d’onde λ = 630 nm.
V. 3. Dosage des apolipoprotéines (apo) sériques
V. 3. 1. Dosage de l’apo A-I
L’apolipoprotéine A-I est déterminée par immuno-précipitation en phase liquide (Kit
Orion Diagnostica, Finland). L’antisérum apo A-I, contenant des anticorps anti-apo A-I,
utilisé pur ou dilué dans du tampon phosphate, est ajouté à une partie aliquote de l’échantillon
(20 µL de sérum) à analyser. Les anticorps anti-apo A-I agglutinent l’apo A-I présente dans
l’échantillon. Le changement de turbidité mesuré par spectrophotométrie à 340 nm est
proportionnel à la quantité d’apo A-I présente dans l’échantillon.
V. 3. 2. Dosage de l’apo B
L’apolipoprotéine B est mesurée par immuno-précipitation en phase liquide (Kit Orion
Diagnostica, Finland). L’antisérum apo B, contenant des anticorps anti-apo B, utilisé pur ou
dilué dans le tampon phosphate, est ajouté à 20 µL de sérum. Les anticorps anti-apo B
agglutinent l’apo B présente dans l’échantillon. La variation de turbidité mesurée par
spectrophotométrie à 340 nm est proportionnelle à la quantité d’apo B présente dans
l’échantillon.
V. 4. Détermination des lipides totaux du foie et du sérum
Les lipides totaux sériques et hépatiques sont extraits selon la méthode de Delsal
(1944) décrite précédemment, à partir de 1 mL de sérum ou 1 g de foie.
24
V. 5. Détermination des teneurs sériques et hépatiques en différents lipides
V. 5. 1. Dosage des triglycérides
Les triglycérides (TG) sont déterminés par une méthode colorimétrique enzymatique
(Kit Biocon, Germany). Les TG présents dans l’échantillon donnent après hydrolyse
enzymatique et oxydation un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie.
L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde d’hydrogène et du 4aminoantipirine et du chlorophénol sous l’action de la peroxydase. La lecture se fait à une
V. 5. 2. Dosage du cholestérol total, libre et estérifié
Le cholestérol total (CT) est déterminé par une méthode colorimétrique enzymatique
(Kit Biocon, Germany) (décrite précédemment). Le cholestérol libre (CL) est estimé par une
méthode colorimétrique enzymatique (Kit Wako, Germany). Le CL présent dans l’échantillon
donne après hydrolyse enzymatique et oxydation un complexe coloré quantifiable par
spectrophotométrie. L’indicateur, la quinonéimine est formée à partir du peroxyde
d’hydrogène et du 4-amino-antipirine en présence de phénol et de la peroxydase. La lecture se
fait à une longueur d’onde λ = 546 nm. Le cholestérol estérifié (CE) est obtenu par différence
entre le CT et le CL puis multiplié par 1,67 (poids moléculaire moyen d’un acide gras qui
estérifie le cholestérol) pour calculer les esters de cholestérol (EC).
V. 5. 3. Dosage des phospholipides
Les phospholipides (PL) sont déterminés par une méthode colorimétrique enzymatique
(Kit Cypress, Belgium). Les PL (lécithine, lysolécithine et sphingomyéline) sont hydrolysés
par la phospholipase D et la choline libérée est ensuite oxydée par l’oxydase de choline
(CHO) en peroxyde d’hydrogène. Ce dernier oxyde le phénol et le 4-amino-antipyrine grâce à
la peroxydase (POD). La lecture s’effectue à une longueur d’onde λ = 505 nm.
V. 6. Détermination du cholestérol au niveau de l’aorte
Le CT, CL et les EC au niveau de l’aorte sont déterminés par les méthodes
colorimétriques enzymatiques décrites auparavant.
VI. Séparation et Analyse des teneurs et composition des différentes fractions de
lipoprotéines par précipitation
La séparation des différentes fractions de lipoprotéines est réalisée par précipitation,
selon la technique de Burstein et al., (1970 ; 1989). Les lipoprotéines de faible densité (VLDL
25
et LDL-HDL1) sont précipitées par du phosphotungstate (Sigma-Aldrich Chemie, Germany)
et du MgCl2 (Merck, Germany) et les lipoprotéines de haute densité (HDL2 et HDL3) sont
précipitées par du sulfate de dextran (Wt 500 000) (Sigma Chemical Company, St Louis) et
du MgCl2. Toutes les centrifugations sont effectuées à 4000 trs/min pendant 30 min à 20 °C.
VI. 1. Séparation des VLDL et des LDL-HDL1
25 µL d’une solution de phosphotungstate (pH 7,6) et 100 µL d’une solution de MgCl2
(2 M) sont ajoutés à 2 mL de sérum. Après 30 min d’incubation à température ambiante, le
mélange est centrifugé et le surnageant est séparé du précipité contenant les VLDL (précipité
I). Cette fraction de lipoprotéine peut aussi apparaître sous forme d’un anneau à la surface du
tube. Au surnageant sont ajoutés 100 µL de chacune des deux solutions précédentes. Après
incubation et centrifugation, le précipité obtenu contient les LDL-HDL1 (précipité II) (Fig. 6).
VI. 2. Séparation des HDL2 et HDL3
80 µL de sulfate de dextran à 5% et 200 µL de MgCl2 (2 M) sont ajoutés au
surnageant. Après une nuit d’incubation, le précipité obtenu après centrifugation correspond à
la fraction HDL2 (précipité III). Le pH du surnageant voisin de 7,6 est ajusté à 5,4 par du HCl
(1 N) (Cheminova, Espagne) une précipitation immédiate a lieu. Après centrifugation, le
précipité contenant les HDL3 (précipité IV) est séparé du surnageant qui correspond aux
protéines plasmatiques (Fig. 6).
Afin de minimiser la contamination par les protéines sériques, les différentes fractions
de lipoprotéines sont purifiées par des lavages successifs selon le diagramme représenté dans
la Fig.7.
VI. 3. Analyse de la teneur et composition en lipides et en apolipoprotéines des
lipoprotéines
Les teneurs en apolipoprotéines totales (apo), triglycérides (TG), phospholipides (PL),
cholestérol total (CT), cholestérol libre (CL) et cholestérol estérifié (CE) des VLDL, LDL-HDL1,
HDL2 et HDL3 sont déterminées par des méthodes biochimiques décrites précédemment. La
masse de chaque fraction de lipoprotéines représente la somme des contenus des différents
constituants lipidiques et protéiques (apo, TG, PL, CL et EC) exprimée en g.L-1.
26
2 mL de sérum
25 µL de phosphotungstate
100 µL de MgCl2 (2 M)
pH=7,6
Homogénéisation, incubation (20 °C, 30 min)
Centrifugation à 4000 trs/min (30 min à 20°C)
Précipité I=VLDL
Surnageant
I
100 µL de phosphotungstate
100 µL de MgCl2 (2M)
Conditions précédentes
Précipité II=LDL-HDL1
Surnageant
II
80 µL de sulfate de dextran (5%)
100 µL de MgCl2 (2M)
Homogénéisation, incubation une
nuit à 20 °C.
Précipité III=HDL2
Surnageant
III
HCl (1 N)
pH=7,6
pH=5,4
Précipitation immédiate
Centrifugation à 4000 trs/min
(30 min à 20 °C).
Précipité IV=HDL3
Surnageant
IV
Fig. 6. Séparation des différentes fractions de lipoprotéines selon la méthode de
Burstein et al., (1989)
27
Précipité I et II
Précipité III
1 mL de tampon Tris
alcalin
Précipité IV
654 µL de tampon Tris
alcalin
Précipitation avec
40 µL de sulfate de dextran
(0,05%)
50 µL de MgCl2 (0,05%)
Précipitation avec
65 µL de MgCl2 (2 M)
65 µL d’oxalate de
Potassium (1 M)
Ajuster le pH à 9,5 avec
du NaOH (1 N)
Centrifugation à 4000 trs/min (30 min à 20 °C)
Surnageants
I et II
Précipités
I et II
potassium (0,5 M)
Surnageant
III
Précipité
III
Complexe
non soluble
HDL3
purifiées
potassium (0,5 M)
Centrifugation à 4000 trs/min, 30 min à 20 °C
VLDL et
LDL-HDL1
purifiées
Complexe
non soluble
HDL2
purifiées
Complexe
non soluble
Fig.7. Purification des différentes fractions de lipoprotéines selon la méthode de
Burstein et al., (1970 ;1989)
28
VII. Détermination de l’activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT, EC
2.3.1.43)
L’activité de la LCAT est déterminée par une méthode endogène selon la technique de
Chen & Lacko, (1986) sur du sérum frais. Cette technique est basée sur la disparition des
molécules du cholestérol libre (CL) qui sont transformées en cholestérol estérifié (CE) sous
l’action de la LCAT après 4 heures d’incubation à 37 °C, à partir d’un acide gras et de la
lécithine. Le cholestérol libre est dosé par méthode enzymatique colorimétrique (kit Wako,
Germany). L’activité de la LCAT est exprimée en nanomoles de cholestérol estérifié.h-1.ml-1
de sérum. Elle est calculée selon la formule suivante :
Activité LCAT = (CLt0 h - CLt4 h)/4 h d’incubation
VIII. Analyse statistique
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard de 6 rats par
groupe. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test
de rang de multiple de Dancan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1, Statsoft 97) entre
les trois groupes. Les moyennes portant des lettres (a, b, c) sont significativement
différentes (P<0,05).
29
Résultats
I. Efficacité nutritionnelle des différents régimes
I. 1. Croissance pondérale et nourriture ingérée (Fig. 8)
La consommation des protéines de sardine supplémentées en cholestérol (PSc)
entraîne une croissance pondérale similaire à la caséine supplémentée (CASc) ou non (CAS)
en cholestérol.
Le bilan nutritionnel réalisé du 21ème au 28ème jour de l’expérimentation montre que la
nourriture ingérée est identique et représente en moyenne 12 ± 2 g.j-1.rat-1 chez les trois
groupes PSc, CASc et CAS.
PSc
Poids corporel
200
CASc
CAS
(g)
160
120
80
40
0
J0
20
J7
J14
J21
Nourriture ingérée
J28 Jours
PSc
-1
g.j .rat
-1
CASc
15
CAS
10
5
0
Fig. 8. Croissance pondérale des animaux et nourriture ingérée
Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes PSc et CASc consomment les régimes à 20%
de protéines de sardine ou de caséine supplémentées avec 1,5% de cholestérol. Le groupe CAS consomme un régime
contenant 20% de caséine et sert de contrôle. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le
test de rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1, Statsoft 97) entre les trois groupes.
30
Résultats
I. 2. Poids absolu et relatif du foie
À J28, le poids du foie est 1,4- et 1,2-fois plus élevé chez les groupes PSc et CASc
respectivement comparés au groupe CAS. Cependant, le poids relatif du foie, qui renseigne
sur l’évolution de l’organe par rapport à celle de l’organisme entier est similaire chez les trois
groupes étudiés (Tableau III).
Tableau III. Poids des rats, poids absolu et relatif du foie
Poids des rats
(g)
Poids du foie
(g)
Poids relatif du foie
PSc
173 ± 22
9,11 ± 0,64a
5,85 ± 1,38
CASc
160 ± 7
8,27 ± 0,81a
5,16 ± 0,28
CAS
154 ± 4
7,06 ± 0,36b
4,58 ± 0,35
Groupes
test de rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1, Statsoft 97) entre les trois groupes. Les moyennes
portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05).
Poids relatif du foie =
Poids du foie (g)
× 100
Poids du rat (g)
I. 3. Azote ingéré et azote excrété (urinaire et fécal)
L’azote (N) ingéré est semblable chez les trois groupes consommant la protéine de
sardine (PSc) ou la caséine supplémentée (CASc) ou non (CAS) en cholestérol (Tableau IV).
En revanche, l’azote excrété est diminué de -30% et -27% chez le groupe PSc comparé aux
groupes CASc et CAS, respectivement.
La proportion de l’azote fécal par rapport à l’azote ingéré est réduite de -30% et -16%
avec la protéine de sardine comparée respectivement à celle des groupes consommant la
caséine avec ou sans cholestérol (Tableau IV). De même, les valeurs de l’azote urinaire par
rapport à l’azote ingéré sont plus faibles de -45% et -38% chez le groupe PSc
comparativement aux groupes CASc et CAS.
L’azote urinaire est réduit de -36% et -34% chez le groupe PSc comparé
respectivement a celui des groupes CASc et CAS, respectivement (Tableau V).
31
Résultats
Tableau IV. Azote ingéré et azote excrété
N ingéré
N excrété
(mg.j-1.rat-1)
(mg.j-1.rat-1)
PSc
405,33 ± 18,48
CASc
CAS
Groupes
N urinaire
N ingéré
(%)
N fécal
N ingéré
(%)
98,24 ± 2,06b
15,55 ± 0,57b
9,03 ± 0,31b
352,00 ± 90,51
140,83 ± 0,16a
28,39 ± 6,98a
12,99 ± 3,61a
384,00± 55,43
135,06 ± 2,81a
24,93 ± 4,10a
10,73 ± 1,47a
N excrété = N urinaire + N fécal
L’excrétion urinaire de l’urée est diminuée de -36% chez le groupe PSc comparé au
groupe CASc mais elle est similaire comparée au groupe contrôle. En revanche, l’azote
créatinique est augmenté de +27% chez les groupes PSc et CASc comparé à CAS, alors que
l’azote de l’acide urique est semblable chez les trois groupes de rats (Tableau V).
Chez le groupe ingérant la protéine de sardine, l’excrétion de l’azote fécal est réduite
de -18% et -11% comparée respectivement à celle des groupes CASc et CAS (Tableau V).
Tableau V. Azote (N) urinaire, uréique, créatinique, de l’acide urique et l’azote fécal
Groupes
N urinaire
(mg.j-1.rat-1)
N uréique
(mg.j-1.rat-1)
N créatinique
(mg.j-1.rat-1)
N de l’acide urique
(mg.j-1.rat-1)
N fécal
(mg.j-1.rat-1)
PSc
62,15 ± 1,25b
57,45 ± 8,27b
4,28 ± 0,90a
1,26 ± 0,07
36,10 ± 0,82b
CASc
96,75 ± 1,11a
90,27 ± 8,05a
4,20 ± 0,58a
1,15 ± 0,42
44,08 ± 0,95a
CAS
94,35 ± 1,18a
76,79 ± 2,70b
3,08 ± 0,09b
1,28 ± 0,10
40,71 ± 1,63a
32
Résultats
I. 4. Bilan azoté (BA), Coefficient d’Utilisation Digestive Apparente de l’Azote
(CUDN) et Rapport d’Efficacité Protéique (REP) et Nutritionnelle (REN)
La consommation des protéines de sardine ou de caséine supplémentées ou non en
cholestérol entraîne des valeurs de bilan azoté (BA) élevées (+28% et +17%) chez le groupe
PSc comparé aux groupes CASc et CAS, respectivement (Tableau VI).
La valeur du coefficient d’utilisation digestive apparente de l’azote (CUDN) qui
détermine la proportion de l’azote ingéré absorbée est identique chez les trois groupes de rats
(Tableau VI).
Les rapports d’efficacité protéique (REP) et nutritionnelle (REN) qui permettent de
déterminer respectivement, l’efficacité des protéines alimentaires et du régime alimentaire
vis-à-vis de la croissance pondérale sont semblables chez les trois groupes d’animaux (PSc,
CASc et CAS) (Tableau VI).
Tableau VI. Bilan azoté (BA), Coefficient d’Utilisation Digestive Apparente de l’Azote
(CUDN) et Rapport d’Efficacité Protéique (REP) et Nutritionnelle (REN)
BA
(%)
CUDN
(%)
REP
REN
PSc
75,41 ± 0,87a
90,97 ± 0,31
1,03 ± 0,20
0,21 ± 0,04
CASc
58,63 ± 8,59b
87,01 ± 3,61
0,98 ± 0,30
0,18 ± 0,06
CAS
64,33 ± 5,57b
89,27 ± 1,47
0,95 ± 0,10
0,19 ± 0,02
Groupes
BA =
N ingéré - (N urinaire + N fécal)
× 100
N ingéré
CUD N =
N ingéré - N fécal
× 100
N ingéré
REP =
Gain de poids (g)
Protéines ingérées pour obtenir ce gain de poids (g)
REN =
Gain de poids (g)
Nourriture ingérée pour obtenir ce gain de poids (g)
33
Résultats
I. 5. Lipides ingérés et excrétés, cholestérol ingéré et excrété, et Coefficient
d’Utilisation Digestive Apparente des Lipides (CUDL)
Au cours du bilan nutritionnel réalisé du 21ème au 28ème jour de l’expérimentation, les
trois groupes d’animaux consomment approximativement la même quantité de lipides (711 ±
135 mg.j-1.rat-1). Cependant, l’excrétion fécale des lipides est respectivement 3,3- et 2,8-fois
plus importante chez les groupes PSc et CASc comparée à celle notée chez le groupe CAS.
Chez les groupes hypercholestérolémiques, la protéine de sardine comparée à la caséine induit
une excrétion de lipides fécaux similaire (Tableau VII).
L’excrétion fécale du cholestérol est plus importante chez les groupes PSc (5,3-fois) et
CASc (8,4-fois) comparée à celle du groupe contrôle. Comparé au groupe CASc, le
cholestérol fécal chez le groupe PSc est 1,6-fois plus faible (Tableau VII).
Aucune différence significative n’est notée dans les valeurs du coefficient d’utilisation
digestive apparente des lipides (CUDL) chez les trois groupes d’animaux (Tableau VII).
Tableau VII. Lipides ingérés et excrétés, cholestérol ingéré et excrété, et Coefficient
d’Utilisation Digestive Apparente des Lipides (CUDL)
Lipides
ingérés
(mg.j-1.rat-1)
Lipides
excrétés
(mg.j-1.rat-1)
Cholestérol
ingéré
(mg.j-1.rat-1)
Cholestérol
excrété
(mg.j-1.rat-1)
CUDL
PSc
815 ± 49,50
80,78 ± 17,62a
190 ± 8,66
18,46 ± 0,11b
90,09 ± 2,77
CASc
715 ± 183,85
67,65 ± 3,96a
165 ± 42,43
29,36 ± 3,73a
90,29 ± 1,94
CAS
605 ± 106,07
24,40 ± 0,84b
-
3,48 ± 0,74c
92,43 ± 1,64
Groupes
(%)
portant des lettres différentes (a, b, c) sont significativement différentes (P<0,05).
CUD L =
Lipides ingérés - lipides excrétés
× 100
Lipides ingérés
34
Résultats
II. Étude comparée des teneurs en protéines et en lipides du foie et du sérum
II. 1. Teneurs en protéines totales et en lipides totaux du foie et du sérum.
Au niveau sérique et hépatique, les teneurs en protéines totales ne présentent aucune
différence significative chez les trois groupes de rats (Fig. 9).
La teneur sérique en albumine chez le groupe PSc, représente le double de la valeur
notée chez le groupe CASc, alors qu’elle est 1,3-fois plus faible chez le groupe CASc
comparativement à CAS (Tableau VIII).
La teneur sérique en apo A-I est 1,4-fois plus élevée chez le groupe PSc comparée à
celle notée chez le groupe CASc et 1,4-fois plus faible chez le groupe CASc versus CAS.
Chez les groupes consommant le cholestérol alimentaire, la teneur sérique en apo B est
réduite (1,9-fois) avec la protéine de sardine comparée à la caséine. Cependant, ces valeurs
sont similaires à celle du groupe CAS (Tableau VIII).
Tableau VIII. Teneurs sériques en albumine et en apolipoprotéines A-I et B
Albumine
(g.L-1)
Apo A-I
(g.L-1)
Apo B
(g.L-1)
PSc
24,84 ± 6,78a
0,57 ± 0,04a
0,12 ± 0,03b
CASc
13,05 ± 2,98b
0,40 ± 0,03b
0,23 ± 0,01a
CAS
17,58 ± 1,20a
0,55 ± 0,04a
0,17 ± 0,08ab
Groupes
test de rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1Statsoft 97) entre les trois groupes. Les moyennes
Au niveau sérique, les lipides totaux sont plus élevés chez le groupe PSc (1,5- et 1,1fois) comparés respectivement aux groupes CASc et CAS, alors qu’ils sont 1,4-fois plus
faibles chez le groupe CASc par rapport au groupe CAS (Fig. 9). Au niveau hépatique, les
teneurs en lipides totaux sont respectivement plus élevées (1,9- et 1,7-fois) chez les groupes
PSc et CASc comparés au groupe CAS.
35
Résultats
Sérum
Foie
Protéines totales
Protéines totales
PSc
100
CASc
250
g.L
-1
mg.g-1
CAS
50
0
125
0
J28
J28
Lipides totaux
Lipides totaux
4
250
a
a
-1
mg.g
mmol.L
-1
c
a
b
2
0
125
b
0
J28
J28
Fig. 9. Teneurs en protéines totales et en lipides totaux du sérum et du foie
test de rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1Statsoft 97) entre les trois groupes. Les moyennes
36
Résultats
II. 2. Teneurs sériques et hépatiques des différents lipides (Fig. 10)
À J28, une diminution des triglycérides (TG) sériques (2,3-fois) est notée chez les
deux groupes rendus hypercholestérolémiques (PSc et CASc) comparées à celles trouvée à J0.
En effet, les valeurs représentent 1,57 ± 0,07 mmol.L-1 à J0 et 0,67 ± 0,20 mmol.L-1 à J28 et
deviennent similaires à celles du groupe contrôle.
Les teneurs sériques en cholestérol libre (CL) sont 1,8-fois plus élevées chez le groupe
PSc comparé à CASc. De plus, les teneurs en esters de cholestérol (EC) sont 1,5-fois plus
élevées chez les groupes PSc et CASc comparés au groupe CAS. Les phospholipides (PL)
sériques sont 2- et 1,4-fois plus élevés chez le groupe PSc par rapport aux groupes CASc et
CAS, respectivement.
Au niveau hépatique, les valeurs des EC et des TG sont sensiblement les mêmes chez
les trois groupes PSc, CASc et CAS, alors que les teneurs en CL sont 1,2- et 2,3-fois plus
importantes chez le groupe PSc comparées respectivement à celles des groupes CASc et CAS.
De plus, le CL hépatique est 2- fois plus élevé chez le groupe CASc comparé à CAS. Par
ailleurs, les teneurs en PL du foie sont 1,4-et 1,8-fois plus élevées, respectivement chez les
groupes PSc et CASc comparés au groupe CAS. De plus, les PL sont 1,2-fois plus élevés chez
le groupe PSc comparé au groupe CASc.
III. Teneurs en cholestérol total, libre et en esters de cholestérol au niveau de l’aorte
Au niveau de l’aorte, les teneurs en CT et en EC chez le groupe PSc sont réduites
de moitié comparées à celle du groupe CASc, alors qu’elles sont 2-et 3-fois plus élevées
chez le groupe CASc comparé au groupe CAS (Tableau IX).
Tableau IX. Teneurs en cholestérol total, libre et en esters de cholestérol au niveau de l’aorte
Cholestérol total
(µmol.g-1)
Cholestérol libre
(µmol.g-1)
(µmol.g-1)
PSc
60,77 ± 17,39b
20,60 ± 5,93
67,08 ± 19,33b
CASc
104,15 ± 23,23a
32,82 ± 3,31
119,12 ± 35,74a
CAS
47,93 ±6,80b
25,77 ± 7,70
37,01± 4,07b
Groupes
37
Résultats
Sérum
Foie
Triglycérides
Triglycérides
1,2
PSc
CASc
150
µmol.g -1
mmol.L -1
CAS
0,6
75
0
0
J28
J28
Cholestérol libre
80
a
µmol.g -1
mmol.L -1
1,2
Cholestérol libre
ab
0,6
b
a
b
c
40
0
0
J28
J28
a
180
a
µmol.g -1
mmol.L -1
4,5
b
2,25
90
0
0
J28
J28
Phospholipides
Phospholipides
b
µmol.g
b
-1
mmol.L
90
a
1
a
b
-1
2
c
45
0
0
J28
J28
Fig. 10. Teneurs en protéines totales et en lipides totaux du sérum et du foie
38
Résultats
IV. Répartition du cholestérol total (CT) et des triglycérides (TG) entre les différentes
fractions de lipoprotéines
IV. 1. Répartition du CT entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3
À J28, les teneurs sériques en cholestérol total (CT) sont diminuées de -47% chez les
groupes PSc et CASc comparées à celles notées à J0 (4,86 ± 1,19 mmol.L-1) et tendent à se
rapprocher des valeurs du groupe contrôle. En effet, elles représentent (2,68 ± 0,50 et 2,37 ±
0,42 mmol.L-1) versus (1,86 ± 0,26 mmol.L-1) chez les groupes PSc et CASc comparés
respectivement au groupe CAS (Tableau X).
La distribution du CT sérique entre les différentes fractions de lipoprotéines montre
que le CT est principalement porté par les LDL-HDL1. Chez les groupes expérimentaux (PSc
et CASc), le C-LDL-HDL1 représente (45% et 50%) respectivement comparé à la valeur du
groupe contrôle (34%). Le cholestérol dans la fraction antiathérogène (C-HDL2) est
sensiblement similaire chez les groupes PSc et CASc comparé au groupe CAS. Néanmoins,
chez les rats consommant la protéine de sardine, le C-HDL2 représente 20%, alors qu’il est de
14% chez le groupe consommant la caséine enrichie en cholestérol (Tableau X).
Tableau X. Répartition du cholestérol total (CT) entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3
Groupes
CT
(mmol.L-1)
C-VLDL
(mmol.L-1)
C-LDL-HDL1
(mmol.L-1)
C-HDL2
(mmol.L-1)
C-HDL3
(mmol.L-1)
PSc
2,68 ± 0,50
0,59 ± 0,05
(21%)
1,12 ± 0,26a
(45%)
0,55 ± 0,05a
(20%)
0,357 ±0,007a
(14%)
CASc
2,37 ± 0,42
0,58 ± 0,03
(23%)
1,19 ± 0,03a
(50%)
0,32 ± 0,03b
(14%)
0,316 ± 0,004ab
(13%)
CAS
1,86 ± 0,26
0,57±0,02
(31%)
0,66 ± 0,01b
(34%)
0,41 ± 0,03ab
(19%)
0,282 ± 0,025b
(16%)
39
Résultats
IV. 2. Répartition des TG entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3
La part des TG entre les différentes fractions de lipoprotéines montre que la majeure
partie des TG est portée par les VLDL (64%) chez les trois groupes. Aucune différence
significative n’est trouvée dans la proportion des TG portés par les VLDL et les LDL-HDL1.
De plus, la proportion des TG portée par la fraction HDL2 est sensiblement la même chez les
trois groupes d’animaux. En revanche, chez les groupes soumis aux régimes supplémentés en
cholestérol, 4% des TG sont portés par les HDL3 comparativement à 7% chez le groupe
contrôle (Tableau XI).
Tableau XI. Répartition des triglycérides (TG) entre les VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3
Groupes
TG
(mmol.L-1)
TG-VLDL
(mmol.L-1)
TG-LDL-HDL1
(mmol.L-1)
TG-HDL2
(mmol.L-1)
TG-HDL3
(mmol.L-1)
PSc
0,67 ± 0,24
0,42 ± 0,03
(67%)
0,15 ± 0,01
(25%)
0,022 ± 0,002b
(4%)
0,022 ± 0,001b
(4%)
CASc
0,67 ± 0,16
0,42 ± 0,05
(64%)
0,16 ± 0,01
(26%)
0,033 ± 0,003a
(6%)
0,021 ± 0,001b
(4%)
CAS
0,84 ± 0,13
0,50 ± 0,01
(60%)
0,24 ± 0,12
(28%)
0,040± 0,002a
(5%)
0,056 ± 0,002a
(7%)
V. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des lipoprotéines.
V. 1. Teneurs et composition des VLDL (Fig. 11)
Quantitativement, la masse des VLDL (exprimée en g.L-1), qui représente la somme
des contenus en apolipoprotéines (apo), triglycérides (TG), phospholipides (PL), cholestérol
libre (CL) et esters de cholestérol (EC) est similaire chez les trois groupes d’animaux.
Qualitativement, les teneurs en apo sont semblables chez le groupe PSc en comparaison avec
les groupes CASc et CAS en raison des variations interindividuelles notées chez le groupe
PSc.
40
Résultats
VLDL
Masse
Apolipoprotéines
PSc
0,09
1,5
CASc
ab
CAS
g.L-1
0,75
b
0,045
0
0
J28
J28
Triglycérides
Phospholipides
0,8
0,6
b
ab
a
a
b
mmol.L -1
mmol.L -1
b
0,3
0
0,4
0
J28
J28
Cholestérol libre
0,24
1,2
b
0,12
mmol.L -1
a
ab
mmol.L -1
g.L-1
a
0,6
0
0
J28
J28
Fig. 11. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des VLDL
portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05). La masse représente la somme des teneurs en
apolipoprotéines (Apo), triglycérides (TG), phospholipides (PL), cholestérol libre (CL) et esters de cholestérol (EC).
41
Résultats
En revanche, les apo sont significativement plus importantes (+36%) chez le groupe
CASc comparé à CAS. Le contenu en TG dans la fraction VLDL est plus faible (-16%) chez
les groupes hypercholestérolémiques comparés au groupe CAS. Les PL- et le CL-VLDL chez
le groupe PSc sont identiques comparativement aux groupes CASc et CAS, alors qu’ils sont
réduits de -20% et -40% respectivement chez le groupe CASc par rapport à CAS. Les ECVLDL sont similaires chez les trois groupes de rats.
V. 2. Teneurs et composition des LDL-HDL1 (Fig. 12)
La masse des LDL-HDL1 est sensiblement la même chez le groupe PSc comparé aux groupes
CASc et CAS, alors qu’elle est 1,3-fois plus élevée chez le groupe CASc par rapport à CAS.
Les teneurs en apo-LDL-HDL1 sont 1,5-fois plus faibles chez le groupe PSc comparé à CASc,
alors qu’elles sont 1,7-fois plus importantes chez le groupe CASc comparativement à CAS.
En revanche, les valeurs des EC-LDL-HDL1 sont respectivement, 1,7- et 1,8-fois plus élevées
chez les groupes PSc et CASc comparés au groupe CAS. Le contenu en TG, CL et en PL dans
la fraction LDL-HDL1 ne présente aucune différence significative entre les trois groupes
d’animaux.
V. 3. Teneurs et composition des HDL2 (Fig. 13)
Chez les groupes PSc et CASc, la masse des HDL2 est diminuée respectivement de
-57% et -69% comparée à celle du groupe CAS toutefois, aucune différence n’est trouvée
entre les 2 groupes hypercholestérolémiques. En revanche, les valeurs des apo- et PLHDL2 sont augmentées respectivement de +16% et +55% chez le groupe PSc versus CAS.
Les teneurs en TG dans la fraction HDL2 sont diminuées respectivement de -33% et de
-45% chez le groupe PSc comparativement aux groupes CASc et CAS.
Une réduction de -14% et -19% est trouvée dans les teneurs en CL-HDL2 chez les
groupes PSc et CASc comparés respectivement au groupe contrôle. Les valeurs des EC-HDL2
sont élevées de +81% et +42% respectivement chez le groupe PSc comparé aux groupes
CASc et CAS, alors qu’elles sont réduites de -21% chez le groupe CASc par rapport au
groupe CAS.
42
Résultats
LDL-HDL1
Apolipoprotéines
M asse
1,8
PSc
CAS c
0,14
ab
a
CAS
a
g.L-1
g.L-1
b
0,9
b
b
0,07
0
0
J28
J28
Triglycérides
Phospholipides
0,4
mmol.L -1
mmol.L -1
0,8
0,2
0
0,4
0
J28
J28
Cholestérol libre
2,5
a
mmol.L -1
mmol.L -1
0,12
0,06
a
1,25
b
0
0
J28
J28
Fig. 12. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des LDL-HDL1
43
Résultats
HDL2
M asse
Apolipoprotéines
1,8
CAS c
0,07
a
PS c
a
ab
CAS
g.L-1
g.L-1
b
0,9
b
0,035
b
0
0
J28
J28
Phospholipides
Triglycérides
0,05
0,4
a
a
ab
0,025
mmol.L
-1
mmol.L -1
a
b
0
b
0,2
0
J28
J28
Cholestérol libre
0,05
a
b
mmol.L
-1
b
mmol.L -1
1,2
a
0,025
b
0,6
c
0
0
J28
J28
Fig. 13. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL2
portant des lettres différentes (a, b, c) sont significativement différentes (P<0,05). La masse représente la somme des teneurs
en apolipoprotéines (Apo), triglycérides (TG), phospholipides (PL), cholestérol libre (CL) et esters de cholestérol (EC).
44
Résultats
V. 4. Teneurs et composition des HDL3 (Fig. 14)
La masse des HDL3 est sensiblement la même chez les trois groupes étudiés.
Cependant, les teneurs en apo-HDL3 sont élevées de +22% et +11% chez le groupe PSc en
comparaison avec les groupes CASc et CAS, respectivement. En revanche, une diminution
des apo-HDL3 de -9% est trouvée chez le groupe CASc par rapport au groupe CAS.
Par ailleurs, les teneurs en TG- HDL3 sont abaissées (-62%) chez les deux groupes
expérimentaux comparés au groupe contrôle. Néanmoins, aucune différence significative
n’est observée entre les groupes PSc et CASc. De plus, une réduction significative des teneurs
des PL- et CL-HDL3 est notée chez le groupe PSc comparé aux groupes CASc et CAS
(P<0,05).
VI. Activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT)
L’activité de la LCAT est augmentée de +59% chez le groupe PSc comparé groupes
CASc et CAS. Cette augmentation est accompagnée d’une diminution en PL-HDL3, substrat
de la LCAT (-26% et -28%) et du CL-HDL3 accepteur du groupement acyl (-45% et -34%).
De plus, les apo-HDL3 cofacteur-activateur de la LCAT et les EC-HDL2 produit de la réaction
enzymatique de la LCAT sont augmentées de +22% et +81% chez le groupe PSc comparé au
groupe CASc (Tableau XII).
Tableau XII. Activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT)
Groupes
LCAT
(nmol.ml-1.h-1)
CL-HDL3
(mmol.L-1)
PL-HDL3
(mmol.L-1)
Apo-HDL3
(g.L-1)
EC-HDL2
(mmol.L-1)
PSc
69,60 ± 14,49a
0,038 ± 0,006b
0,669 ± 0,003b
0,270 ± 0,007a
0,87 ± 0,09a
CASc
45,82 ± 5,14b
0,069 ± 0,007a
0,906 ± 0,129a
0,222 ± 0,002c
0,48 ± 0,04c
CAS
42,92 ± 7,70b
0,058 ± 0,003a
0,927 ± 0,003a
0,244 ± 0,004b
0, 61 ± 0,05b
de protéines de sardine ou de caséine supplémentées avec 1,5% de cholestérol. Le groupe CAS consomment un régime
45
Résultats
HDL3
M asse
Apolipoprotéines
1,5
0,3
PSc
CASc
a
CAS
b
g.L-1
g.L-1
c
0,75
0
0,15
0
J28
J28
Phospholipides
Triglycérides
1,2
0,07
a
0,035
b
a
mmol.L -1
mmol.L -1
a
b
0
b
0,6
0
J28
J28
Cholestérol libre
0,6
0,09
a
b
mmol.L -1
mmol.L -1
a
0,045
b
a
b
0,3
0
0
J28
J28
Fig. 14. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL3
46
Résultats
VII. Rapports d’athérogénicité et de fluidité membranaire
Chez le groupe PSc comparé au groupe CASc, les rapports d’athérogénicité C-VLDLLDL-HDL1/C-HDL et Apo B/A-I sont significativement diminués de -32% et -48%,
respectivement. Ces rapports sont par contre semblables chez le groupe PSc comparativement au
groupe CAS (Tableau XIII).
Le rapport CL/PL marqueur de la fluidité membranaire est plus faible (-19% et -28%)
chez le groupe PSc comparé respectivement aux groupes CASc et CAS (Tableau XII).
Tableau XIII. Rapports d’athérogénicité et rapport de fluidité membranaire
CT/C-LDL
CT/C-HDL
C-VLDL-LDLHDL1/C-HDL
Apo B/A-I
CL/PL
PSc
2,54 ± 0,34
3,08 ± 0,46
1,89 ± 0,43b
0,21 ± 0,04b
0,38 ± 0,03 b
CASc
1,99 ± 0,04
3,72 ± 0,01
2,78 ± 0,14a
0,57 ± 0,01 a
0,47 ± 0,16 a
CAS
2,73 ± 0,50
2,59 ± 0,44
1,74 ± 0,02b
0,31 ± 0,13b
0,53 ± 0,02 a
Groupes
47
Discussion
Dans ce travail, l’effet comparé de la protéine de sardine et de la caséine sur les
teneurs en lipides du sérum, du foie et de l’aorte ainsi que sur les teneurs et la composition
des lipoprotéines sériques et l’activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT) est
étudié chez le rat rendu hypercholestérolémique par ingestion d’un régime enrichi en
cholestérol. De plus, l’efficacité nutritionnelle des protéines de sardine comparée à la caséine
est évaluée chez le rat Wistar (modèle animale idéal pour tester la valeur nutritive d’une
protéine) à partir de la croissance pondérale, des bilans azotés (BA), de la digestibilité (CUD)
des protéines et des lipides, et des rapports d’efficacité nutritionnelle (REN) et protéique
(REP).
Pour réduire au minimum les effets possibles des acides gras n-3 contenus dans la
sardine et qui peuvent en partie être responsables de la réduction du cholestérol et des
triglycérides, les protéines de sardine utilisées dans notre étude sont purifiées a +92%. Pour se
rapprocher du modèle du régime méditerranéen (riche en graisses d’origine végétale) et des
apports recommandés de l’Afssa (2003), nous avons choisi un mélange d’huiles végétales
(olive + noix + tournesol) contenant 13% d’AGS, 58% d’AGMI et 29 % d’AGPI avec un
rapport n-6/n-3 = 7. L’hypercholestérolémie est induite expérimentalement chez le rat par la
supplémentation du régime en cholestérol (1,5%).
Après 28 jours d’expérimentation, la consommation des protéines de sardine
supplémentées en cholestérol entraîne une croissance pondérale progressive et similaire à
celle de la caséine supplémentée ou non en cholestérol. De plus, le bilan nutritionnel réalisé
du 21ème au 28ème jour de l’expérimentation montre que la nourriture ingérée est similaire chez
les trois groupes de rats. Ce qui laisse suggérer que la protéine de sardine a bien été acceptée
par le rat. Des résultats semblables sont obtenus dans l’étude de Athmani et al., (2005) qui ont
rapporté que la croissance pondérale et la consommation alimentaire sont inchangées chez les
rats hypercholestérolémiques soumis aux régimes contenant 20% de protéines de sardine,
caséine ou de caséine supplémentée avec 1% de cholestérol combinées à 10% d’huile de
tournesol. De même, l’étude de Bastida et al., (2006) a montré qu’après 14 jours
d’expérimentation, la prise alimentaire et la croissance pondérale sont semblables chez des
rats Wistar rendus hypercholestérolémiques et ingérant un régime contenant 15% de protéines
de sardine ou de caséine supplémentées ou non en cholestérol (2%).
Chez le rat Sprague-dawley normolipémique, Murata et al., (2004) ont montré qu’après
21 jours d’expérimentation, le gain de poids et la consommation alimentaire sont semblables
avec les régimes à 20% de protéines purifiées de sardine ou de caséine combinées à 7%
d’huile de soja. L’étude de Demonty et al., (2003), réalisée chez le rat révèle qu’après 4
48
Discussion
semaines de régime supplémenté avec 1% de cholestérol, la prise alimentaire et le gain de
poids restent inchangés avec la protéine de morue comparée à la caséine. De même, la
protéine de merlan comparée à d’autres protéines d’origine animale (porc, bœuf, dinde et
caséine) entraîne après 3 semaines d’expérimentation, un poids corporel et une consommation
alimentaire semblables (Shukla et al., 2006). En revanche, Viejo et al., (2003) notent
qu’après 2 semaines d’expérimentation, une augmentation de 10% de la prise alimentaire
chez les rats Wistar hypercholestérolémiques consommant des régimes à 14% de protéines de
sardine comparée à celle des rats consommant 14% de caséine supplémentée ou non avec 2%
de cholestérol et ceci en dépit d’un poids corporel similaire. Cette augmentation de la
nourriture ingérée dans leur étude est expliquée par les facteurs organoleptiques tels que le
goût, l’odeur et la texture du régime contenant la protéine de sardine.
L’ingestion d’azote exprimée en mg.j-1.rat-1 est similaire avec la protéine de sardine
comparée à la caséine avec ou sans cholestérol. L’évaluation de l’azote excrété montre une
faible excrétion de l’azote urinaire chez les rats ingérant les protéines de sardine comparées à
la caséine supplémentée ou non en cholestérol. Les variations dans les pertes urinaires d’azote
peuvent être produites par des modifications dans la synthèse et/ou la dégradation des
protéines (Li & Wassner, 1984). En effet, Horigome & Cho, (1992) ont montré que l’azote
urinaire augmente si la consommation de protéines dépasse les besoins de l’animal. Ainsi, la
réduction de l’azote urinaire notée chez le groupe PSc est probablement due à une meilleure
ingestion de la protéine de sardine et non pas à la diminution de l’azote ingéré chez ce groupe.
De plus, la diminution du rapport azote urinaire/azote ingéré notée avec la protéine de sardine,
indique une bonne rétention d’azote dont la conséquence est une disponibilité en acides
aminés nécessaires pour la croissance et la synthèse protéique. Dans l’azote urinaire, l’azote
uréique représente la fraction la plus importante puisque c’est essentiellement sous forme
d’urée que s’élimine l’azote. L’augmentation de l’azote uréique témoigne soit d’une
importante activité de l’arginase hépatique, (enzyme clé de l’uréogenèse), soit d’une grande
quantité de substrat NH3 issu de la désamination oxydative des acides aminés. Lorsque le
régime est normal, l’urée représente 80% de l’azote urinaire (Luisot, 1983) mais cette
proportion diminue si le régime est pauvre en protéines. Dans notre étude, les valeurs de
l’azote uréique sont comprises entre 81% et 93% de l’azote urinaire puisque l’apport
protéique est de 20%.
La créatinine est assez indépendante du régime alimentaire. Elle reflète l’importance du
pool de la créatine musculaire et de ce faite, reflète la fonte musculaire lorsque l’apport
protéique est faible. La diminution de la créatinine indique une diminution de sa synthèse à
49
Discussion
partir de la créatinine phosphate musculaire. Néanmoins, l’augmentation de l’azote
créatinique chez les rats hypercholestérolémiques ne traduit pas un état de fonte musculaire
puisque les rats présentent une croissance pondérale normale. L’hypercholestérolémie est une
des manifestations majeures du syndrome néphrotique (Muntner et al., 1998). Cette
augmentation de la créatinine notée chez les groupes hypercholestérolémiques est due
probablement à la supplémentation du régime en cholestérol. Une étude a montré chez des
rats spontanément hypercholestérolémiques que le filet de poisson comparé à la caséine n’a
pas d’effets bénéfiques sur la régression de la fonction rénale (Liang et al., 2007).
L’azote fécal est diminué chez les rats ingérant la protéine de sardine comparé à celui
des rats consommant la caséine supplémentée ou non en cholestérol. Cette fraction ne
correspond pas seulement à l’azote alimentaire non digéré puisqu’une partie de l’azote fécal a
une origine endogène. En effet, le faible rapport azote fécal/azote ingéré noté chez ce même
groupe peut s’expliquer par une diminution de la fraction d’azote non absorbée et/ou par une
réduction de l’azote endogène, non proportionnelle à l’azote ingéré.
Le bilan azoté (BA) représente la différence entre les ingesta et les excréta azotés. Il est
significativement plus élevé chez le groupe PSc comparé aux groupes CASc et CAS. Ce qui
témoigne d’une bonne utilisation métabolique de l’azote alimentaire chez les rats ingérant la
protéine de sardine par rapport à la caséine supplémentée ou non en cholestérol. La
diminution du BA trouvée chez les groupes CASc et CAS est due probablement à une
augmentation des pertes azotées fécales et urinaires.
Les rapports d’efficacité protéique (REP) et nutritionnelle (REN) utilisent la croissance
du rat comme mesure de la valeur nutritive des protéines alimentaires. La similarité de ces
rapports notée chez les rats ingérant la protéine de sardine comparée à la caséine
supplémentée ou non en cholestérol témoigne de la prise de poids semblable notée chez les
trois groupes d’animaux. Ces résultats laissent suggérer que les protéines de sardine comme la
caséine permettent de couvrir les besoins nutritifs du rat. Nos résultats sont en accords avec
ceux obtenus par Sanchez-Muniz et al., (2003) qui montrent que les rapports d’efficacité
protéique et nutritionnel sont identiques chez les rats hypercholestérolémiques consommant
14% de protéines de sardine ou de caséine.
Au cours du bilan nutritionnel, la supplémentation des régimes avec 1,5% de cholestérol
d’une part, et l’origine de la protéine (sardine ou caséine), d’une autre part ne semble pas
altérer la digestion des lipides puisque la digestibilité et l’absorption des lipides sont
semblables chez tous les animaux.
50
Discussion
Il ressort de cette étude que chez le rat rendu hypercholestérolémique, la protéine de
sardine comme la caséine présente une bonne efficacité nutritionnelle. Toutefois, la
digestibilité des matières azotées est meilleure avec la protéine de sardine comparée à la
caséine supplémentée ou non en cholestérol. Au vu de ces résultats sur l’efficacité
nutritionnelle des régimes, qu'en est-il de l’effet de ces régimes sur la cholestérolémie? La
protéine de sardine pourrait-elle moduler l’effet hypercholestérolémiant induit par la
supplémentation du régime en cholestérol?
Le taux de cholestérol sérique est un facteur de risque majeur des maladies
cardiovasculaires. Parmi les nombreux facteurs de risque génétiques et environnementaux
impliqués dans l’athérosclérose, l’élévation du taux de cholestérol est le seul à pouvoir induire
le développement de la plaque d’athérome, même en l’absence d’autres facteurs de risque
(diabète, hypertension et obésité) (Gebbers et al., 2007). La modification des taux de lipides
sériques peuvent influencer la composition, la teneur et la distribution des sous-classes de
lipoprotéines sériques (Jia et al., 2007). Certaines études expérimentales ont révélé que les
protéines de poisson peuvent modifier le métabolisme du cholestérol chez des rats
consommant un régime supplémenté en cholestérol.
Le foie joue un rôle central dans l’homéostasie du cholestérol autant dans sa synthèse
que dans son excrétion. Une accumulation des lipides totaux au niveau hépatique est observée
chez les deux groupes hypercholestérolémiques résultant de l’enrichissement du régime en
cholestérol. La protéine de sardine ne semble pas atténuer la stéatose hépatique induite
expérimentalement. De plus, elle ne modifie pas le contenu du foie en différents lipides et en
particulier, celui du cholestérol. Ces résultats laissent suggérer que la protéine de sardine
n’augmente pas la capacité du foie à excréter le cholestérol puisque le cholestérol excrété est
significativement diminué chez les rats consommant la protéine de sardine comparés aux rats
ingérant la caséine supplémentée en cholestérol.
Après 28 jours d’expérimentation, aucune différence significative n’est notée dans les
teneurs en CT du foie et du sérum entre les trois groupes. Néanmoins, à J28 quelle que soit la
protéine consommée enrichie en cholestérol, l’hypercholestérolémie notée à J0 diminue
drastiquement pour atteindre les valeurs du groupe contrôle. Cette baisse de cholestérol
trouvée est probablement due à des mécanismes d’adaptation au régime enrichi en cholestérol.
En effet, il a été rapportée que chez le rat présentant une résistance à l’élévation du taux de
cholestérol sanguin (Russell & Proctor, 2006) induite par des apports accrus en cholestérol
alimentaire, les esters de cholestérol seraient convertis plus efficacement en acides biliaires
51
Discussion
(Smit et al., 1993). Nos résultats vont dans le même sens que ceux trouvés par Athmani et al.,
(2005) qui ont constaté que la protéine de sardine entraîne une cholestérolémie similaire à la
caséine chez le rat rendu hypercholestérolémique. Par contre, la protéine de morue enrichie
avec 1% de cholestérol, diminue le cholestérol sérique et hépatique chez le rat (Demonty et
al., 2003) et que la protéine de merlan supplémentée avec 0,5% de cholestérol, exerce un effet
hypocholestérolemiant et provoque une accumulation du cholestérol au niveau du foie
(Shukla et al., 2006).
La composition en acides aminés des protéines alimentaires est un facteur affectant le
métabolisme du cholestérol (Kritchvisky, 1995). Deux acides aminés essentiels la lysine et la
méthionine ont été impliqués dans l’élévation du cholestérol sérique. Les effets de la protéine
de poisson pourraient être différents de ceux d’autres protéines en raison de leur composition
particulière en acides aminés (Jacques et al., 1995). En effet, l’élévation du cholestérol total et
du C-LDL observée dans certains cas suite à un régime contenant des protéines de poisson a
été incriminée à sa richesse en acides aminés essentiels tels que la lysine et la méthionine
(Kurowska & Carroll, 1990 ; 1994). La protéine de poisson s’avère être plus riche en ces deux
acides aminés essentiels comparée à la caséine ou d’autres protéines telles que les protéines
de soja et de boeuf (Jacques et al., 1986). Kritchevsky et al., (1982) ont suggéré que l’effet
hypocholestérolémiant de la protéine de poisson par rapport à celui de la caséine trouvé chez
le lapin pourrait être dû au faible rapport lysine/arginine. Par ailleurs, certaines études menées
chez le rat ont bien démontré l’impact de ce rapport dans les protéines de morue (Lavigne et
al., 2000) , de saumon (Wergedahl et al., 2004) et de merlan (Shukla et al., 2006). En dépit,
d’une teneur en glycine et en arginine dans la protéine de sardine (Sardina pilchardus) plus
importante comparée à celle de la caséine (Tableau I), nos résultats montrent que la protéine
de sardine entraîne une cholestérolémie similaire à la caséine. Malgré un rapport
méthionine/glycine 4-fois plus faible dans la protéine de sardine comparée à la caséine
(Tableau I), la cholestérolémie est semblable, d’autres mécanismes sont probablement mis en
jeu (conversion plus accrue du cholestérol en acides biliaires grâce à une stimulation de la
cholestérol 7 α-hydroxylase (enzyme impliquée dans la synthèse des acides biliaires) et/ou
une inhibition ou une réduction de la synthèse endogène du cholestérol par l’activité
l’hydroxy-méthyl-glutaryl-Co A réductase (HMG-CoA réductase) et/ou une augmentation de
l’acyl-CoA cholestérol acyltransférase (ACAT) enzyme impliquée dans l’estérification du
cholestérol au niveau cellulaire.
L’hypothèse de l’augmentation de l’activité de cholestérol 7 α-hydroxylase (enzyme
non dosée) étaye l’étude de Shukla et al., (2006) qui a montré que la protéine de merlan
52
Discussion
entraîne une excrétion fécale plus faible de cholestérol que celle observée avec la protéine de
soja ou la caséine, mais cette excrétion sous forme d’acides biliaires est significativement plus
élevée. D’autre part, il se pourrait que la diminution des teneurs en cholestérol sérique
observée avec la caséine enrichie soit due à une excrétion importante de cholestérol.
Par ailleurs, il s’avère que le muscle des poissons est riche en taurine (Divakaran, 2006)
qui se conjugue aux acides biliaires et facilite leur excrétion par l’augmentation de l’activité
de la cholestérol 7 α-hydroxylase (Yokogoshi & Oda, 2002). De plus, plusieurs études ont
montré que la taurine possède un effet hypolipémiant (Park et al., 1998 ; Yokogoshi & Oda,
2002), antiathérogène (Murakami et al.,1999) et hépatoprotecteur (Balkan et al., 2001 ;
Balkan et al., 2002 ; Waters et al., 2001). La protéine de sardine est reconnu comme étant
plus riche en taurine que la protéine de soja ou tout autre protéine (Shirai et al., 2002). Cette
hypothèse soutient le résultat de l’atténuation de l’hypercholestérolémie chez les rats
hypercholestérolémiques ingérant la protéine de sardine.
La composition en acides gras du mélange d’huiles végétales (olive – noix – tournesol)
utilisé dans notre étude a probablement modulée différemment l’effet des deux protéines
alimentaires (sardine ou caséine) sur l’hypercholestérolémie. En effet, de par les différentes
études menées chez le rat, il apparait que la protéine de poisson a des effets variables sur la
cholestérolémie et le profil des lipoprotéines selon le type, la quantité et la nature des lipides
contenus dans le régime. En effet, chez le rat Wistar, Zhang & Beynen (1993) ont montré que
la protéine de plie était plus hypocholestérolémiante que celle de morue et de merlan, et que
les protéines de soja et de morue diminuent la cholestérolémie par rapport à la caséine
combinée à 1% d’huile de soja et 9% d’huile de noix coco. Des résultats semblables sont
obtenus avec la protéine de morue combinée à 10% d’huile de noix de coco et 1% d’huile de
maїs et supplémentée avec 1% de cholestérol chez le rat Sprague-dawley (Demonty et al.,
1998) cependant, la teneur en cholestérol des VLDL-LDL et des HDL reste similaire.
L’implication du cholestérol et plus particulièrement le cholestérol des LDL dans
l’athérogènese n’est plus contesté. Les LDL font partie des lipoprotéines athérogènes dont les
taux sont étroitement associés au risque cardiovasculaire et à une athérosclérose précoce
(Lamant et al., 2006). Nos résultats indiquent que la consommation des protéines de sardine
comme la caséine enrichie en cholestérol, donne une masse des particules LDL-HDL1
sensiblement identique à celle trouvée avec la caséine supplémentée en cholestérol et qui
concomitante à leur contenu similaire en esters de cholestérol indiquant ainsi, un nombre de
particules LDL-HDL1 semblable chez les groupes PSc et CASc. Ces résultats permettent de
53
Discussion
suggérer que la protéine de poisson n’a probablement pas d’effet modulateur sur la captation
et le catabolisme des LDL-HDL1 par les récepteurs apoB/E.
Les HDL sont reconnus comme étant le seul facteur protecteur vis-à-vis du risque
cardiovasculaire (Luc, 2007). Ce rôle protecteur dépend de leur contenu en cholestérol et en
apolipoprotéine A-I. Nos résultats montrent que même si la protéine de sardine ne modifie pas
le cholestérol des LDL-HDL1, elle l’augmente au niveau des HDL et en particulier, dans la
fraction antiathérogène (HDL2) comparée à la caséine enrichie en cholestérol. De plus, dans
notre étude le dosage des apo A-I et B sériques permettant d'apprécier les lipoprotéines
athérogènes (LDL et VLDL) et antiathérogènes (HDL) (Thompson & Danesh, 2006), a
indiqué une élévation de la teneur sérique en apo A-I et une réduction de l’apo B chez les rats
hypercholstérolémiques ingérant la protéine de sardine comparée à la caséine. Ces données
montrent l’effet bénéfique de la protéine de sardine sur la structure des lipoprotéines
athéroprotecteurs. Ces résultats ne concordent pas avec ceux de Athmani et al., (2005) qui ont
constaté que la protéine de sardine ne modifie pas le C-HDL comparé à la caséine. De même
que l’étude de Bastida et al., (2006) chez le rat rendu hypercholestérolémique, le régime
contenant 15% de protéines de sardine combinées 10% d’huile d’olive + 2% de cholestérol
entraîne une diminution du cholestérol sérique et du C-LDL. Par ailleurs, une autre
investigation a montré chez le rat Sprague-dawley que la protéine de merlan combinée à 10%
de saindoux et supplémentée avec 0,5% de cholestérol, comparée à la caséine, diminue
significativement le CT sérique ainsi que le C-HDL mais ne modifie pas le C-VLDL et CLDL de même que le rapport C-LDL/C-HDL (Shukla et al., 2006).
Cette étude révèle que la protéine de sardine comparée à la caséine enrichie en
cholestérol ne modifie pas la cholestérolémie chez le rat rendu hypercholestérolémique mais
agit favorablement sur le profil des lipoprotéines antiathérogènes.
L’augmentation de la triglycéridémie consécutive à l’ingestion de graisses saturées ou
du cholestérol est reconnue comme un facteur de risque indépendant dans le développement
de l’athérosclérose (Eberly et al., 2003).
À J0, une hypertriglycéridémie (>1mmol.L-1) est notée chez les groupes expérimentaux
comparés au groupe contrôle, due probablement à la supplémentation du cholestérol (1,5%)
dans le régime. Après 28 jours de consommation, les valeurs des TG sériques sont réduites de
moitié et se rapprochent de celles du groupe contrôle. Ces résultats sont en accords avec ceux
de Athmani et al., (2005) qui ne trouvent aucune différence significative dans les teneurs en
TG sériques après 28 jours de consommation chez le rat rendu hypercholestérolémique. Par
54
Discussion
ailleurs, chez des rats normolipémiques, la protéine de sardine combinée à 7% d’huile de soja
entraîne une baisse de la triglycéridémie comparée à la caséine (Murata et al., 2004). Ces
effets discordants sont probablement dues à la quantité de cholestérol incorporée ou à la
nature de l’huile associée ou encore au modèle animal étudié (normolipémique ou
hypercholestérolémique).
Le foie est impliqué dans le métabolisme des VLDL. La diminution ou l’augmentation
des teneurs en triglycérides hépatiques génère des VLDL appauvris ou enrichis en TG. Le fait
que la protéine de sardine induit une triglycéridémie et des teneurs en TG-VLDL similaires à
la caséine chez le rat hypercholestérolémique laisse suggérer, une synthèse identique des TG
hépatiques ou un catabolisme des acides gras ou une sécrétion des triglycérides semblable du
foie via les VLDL. De plus, la masse restant inchangée indique un nombre similaire de
particules de VLDL. Il apparait que la protéine de sardine agit sur l’activité de la lipoprotéine
lipase (LPL) (enzyme responsable de l’hydrolyse de TG-VLDL, non dosée dans ce travail) de
façon similaire à la caséine contrairement à ce qui a été notée avec la protéine de morue chez
le lapin (Bergeron et al., 1992b) et chez le rat (Demonty et al., 1998 ; Demonty et al., 2003).
La protéine de morue combinée à l’huile de menhaden (source d’acides gras n-3)
diminue significativement les TG sériques comparée à la caséine, alors que cet effet n’est pas
retrouvé lorsqu’elle est combinée à l’huile de noix de coco (source d’acides gras saturés)
(Démonty et al., 1998) ou de graisse de bœuf (Demonty et al., 2003). Une étude controversée
indique que la protéine de merlan combinée à 10% de graisses saturées réduit les teneurs en
TG sériques et hépatiques, les TG-VLDL et les TG-HDL (Shukla et al., 2006).
Chez les rats consommant la protéine de sardine, la valeur des TG-HDL2 est diminuée
significativement comparée aux rats ingérant la caséine avec ou sans cholestérol
vraisemblablement par une augmentation de l’activité de la triglycéride lipase hépatique
(HTGL), enzyme hydrolysant les triglycérides et les phospholipides des HDL.
La protéine de sardine ne semble pas avoir d’effet sur la triglycéridémie, mais pourrait
avoir un effet favorable sur sa répartition au niveau de la fraction antiathérogène.
L’effet cardioprotecteur des HDL résulterait principalement d’une participation active
des HDL assurant le transport inverse du cholestérol grâce à la lécithine:cholestérol acyl
transférase (LCAT), enzyme ayant un rôle déterminant en intervenant dans le transport
inverse du cholestérol des tissus périphériques vers le foie (Rader, 2006). La LCAT, une
enzyme synthétisée par le foie et sécrétée dans le plasma, requiert un cofacteur-activateur
l’apo A-I. Elle catalyse l’estérification du cholestérol libre des HDL3 permettant ainsi la
55
Discussion
production des HDL2 qui se charge du transport du cholestérol jusqu’au foie, où il sera excrété
dans la bile (seule voie d’élimination possible).
L’activité
de
la
LCAT
est
significativement
plus
élevée
chez
les
rats
hypercholestérolémiques consommant la protéine de sardine comparée à la caséine et au
groupe contrôle. De plus, les contenus en apo A-I sérique et en EC-HDL2 sont augmentés. À
l’inverse, une diminution des PL-HDL3 (substrats de la LCAT) et du CL-HDL3 (accepteur du
groupement acyl de la lécithine) est notée. L’augmentation de l’activité de la LCAT pourrait
être due à l’augmentation de son cofacteur activateur l’apo A-I et/ou à sa synthèse accrue au
niveau du foie. Cette hypothèse rejoint celle émise par Shukla et al., (2006) qui ont démontré
que la protéine de merlan par rapport à la caséine entraîne au niveau du foie une élévation de
l’expression des gènes hépatiques impliqués dans la synthèse de l’apo A-I et de la LCAT chez
le rat soumis à un régime hyperlipidique. Cependant, nos résultats ne concordent pas avec
ceux de Athmani et al., (2005) qui ont rapporté que chez le rat hypercholestérolémique, les
régimes à base de protéines de sardine ou de caséine avec ou sans cholestérol affectent la
composition quantitative et qualitative des HDL2 et HDL3, alors que l’activité LCAT reste
inchangée. Cette discordance des résultats pourrait s’expliquer par le fait que dans leur étude,
les régimes expérimentaux n’étaient pas enrichis en cholestérol. De plus, la composition
(huile de tournesol) et la proportion (10%) de l’huile utilisée sont différentes. Enfin, le degré
de pureté des protéines de sardine pourrait aussi être impliqué dans ses variations.
Ces résultats laissent suggérer que la protéine de sardine enrichie en cholestérol
comparée à la caséine améliore le transport inverse du cholestérol des tissus périphériques
vers le foie en augmentant l’activité enzymatique de la LCAT et assurant ainsi un
enrichissement des HDL2 en esters de cholestérol.
Les
rapports
d’athérogénicité
C-VLDL-LDL-HDL1/C-HDL
et
apoB/A-I sont
significativement diminués chez les rats consommant la protéine de sardine comparée à la
caséine supplémentée en cholestérol. Ces rapports sont en revanche identiques à ceux trouvés
avec le régime contrôle. De plus, le rapport CL/PL qui est le principal modulateur de la
fluidité membranaire est significativement diminué chez les rats ingérant la protéine de
sardine comparés aux rats ingérant la caséine avec ou sans cholestérol. Ce qui indique, une
importante substitution du cholestérol libre en faveur des phospholipides au niveau des
membranes cellulaires chez les animaux de ce groupe.
L'athérosclérose est une maladie coronarienne caractérisée par les dépôts lipidiques
riches en cholestérol, en particulier au niveau des artères coronaires (Bonomini et al., 2008).
56
Discussion
L’accumulation réduite des esters de cholestérol au niveau de l’aorte notée avec la
protéine de sardine comparée à la caséine supplémentée en cholestérol est probablement la
conséquence des faibles rapports d’athérogénicité trouvés dans notre travail.
La diminution des esters de cholestérol de l’aorte chez les rats ingérant la protéine de
sardine peut être due à sa richesse en taurine. En effet, il a été démontré que la taurine possède
un effet inhibiteur de la sévérité des lésions athéromateuses chez le rat rendu
hypercholestérolémique, en améliorant le profil des lipoprotéines sériques et en diminuant
l’accumulation des lipides au niveau vasculaire (Kamata et al., 1996). Ces résultats laissent
suggérer que la composition en acides aminés de la protéine de sardine lui confère un profil
antiathérogène comparée à la caséine.
La participation d’un processus inflammatoire apparaît de plus en plus être un facteur
déterminant au cours du développement et de l’évolution de l’athérosclérose (Djousse et al.,
2003). Les marqueurs biochimiques de la réponse inflammatoire vasculaire tels que
l’albumine sérique permettent de prédire ce risque cardiovasculaire (Nelson, 2000). Une
méta-analyse a mis en évidence qu’une faible concentration d’albumine sérique est un risque
de développement de pathologie cardiovasculaire (Schalk et al., 2006). Dans notre étude, la
consommation des protéines de sardine a entraîné probablement une augmentation de la
synthèse de l’albumine puisque la valeur notée chez le groupe PSc est plus importante
comparée au groupe CASc, ce qui peut refléter un moindre risque cardiovasculaire. Ces
résultats permettent de suggérer que chez le rat hypercholestérolémique, la protéine de sardine
possède un effet antiathérogène et anti-inflammatoire comparée à la caséine.
L’ensemble des résultats obtenus, indique qu’en dépit d’une cholestérolémie et une
triglycéridémie similaire, la protéine de sardine comparée à la caséine pourrait avoir un
effet protecteur vis-à-vis du risque cardiovasculaire en améliorant la voie métabolique
antiathérogène du cholestérol et des triglycérides et en diminuant l’accumulation des
lipides au niveau de l’aorte.
57
Conclusion
L’influence des protéines de sardine comparées à la caséine combinées à un mélange
d’huiles végétales (olive + noix + tournesol) sur le métabolisme des lipides, en particulier
celui du cholestérol est étudiée chez le rat rendu hypercholestérolémique par ingestion d’un
régime enrichi en cholestérol.
L’étude de l’efficacité nutritionnelle montre que la protéine de sardine comme la
caséine permet de couvrir les besoins nutritionnels du rat. En effet, la protéine de sardine
assure une croissance pondérale similaire à la caséine avec ou sans cholestérol. Toutefois, le
bilan nutritionnel effectué du 21ème au 28ème jour de l’expérimentation montre une meilleure
digestibilité des matières azotées avec la protéine de sardine supplémentée en cholestérol
comparée à la caséine avec ou sans cholestérol. La digestibilité et l’absorption des lipides ne
sont pas influencées par l’enrichissement du régime en cholestérol puisque le coefficient
d’utilisation digestive des lipides (CUDL) est similaire chez les trois groupes de rats. De plus,
ce résultat témoigne d’une bonne utilisation du mélange d’huiles végétales utilisées dans nos
régimes. Après 28 jours de consommation des régimes enrichis en cholestérol, le cholestérol
total est diminué significativement chez les rats rendus hypercholestérolémiques comparé à la
valeur notée au début de l’étude et est similaire à celle du groupe contrôle. Ce résultat montre
que le rat Wistar développe des mécanismes d’adaptation à l’hypercholestérolémie provoquée
expérimentalement par la supplémentation du régime en cholestérol. En dépit d’une prise de
cholestérol alimentaire identique chez les 2 groupes de rats rendus hypercholestérolémiques,
la protéine de sardine comparée à la caséine induit une plus faible excrétion de cholestérol
fécal. Ce mécanisme distinct entre les deux protéines pourrait être incriminé d’une part, à leur
composition particulière en acides aminés et/ou à un mécanisme de feedback plus efficace
avec la protéine de sardine entraînant une diminution de la synthèse endogène du cholestérol,
d’une autre part modulant ainsi l’hypercholestérolémie.
L’accumulation plus importante des lipides totaux au niveau du foie observée avec la
protéine de sardine comparée à la caséine enrichie en cholestérol montre que la protéine de
sardine ne semble pas atténuer la stéatose hépatique induite expérimentalement. De plus, la
protéine de sardine comparée à la caséine enrichie en cholestérol n’a pas d’effet significatif
sur le cholestérol des VLDL et des LDL-HDL1. En revanche, elle augmente le cholestérol des
HDL, en particulier celui de la fraction antiathérogène (HDL2), essentiellement sous forme
d’esters de cholestérol grâce à une activité plus importante de la lécithine:cholestérol
acyltransférase. Ce résultat permet de suggérer que la protéine de sardine comparée à la
caséine améliore l’efflux de cholestérol des tissus périphériques vers le foie et entraîne
vraisemblablement une conversion plus importante des HDL3 en HDL2.
58
Conclusion
La protéine de sardine induit une triglycéridémie et des teneurs en TG-VLDL
comparables à la caséine, ce qui laisse suggérer une synthèse des TG hépatiques, un
catabolisme des acides gras ou une sécrétion des triglycérides similaires. La protéine de
sardine comparée à la caséine agirait probablement de la même façon sur l’activité de la
lipoprotéine lipase. En revanche, la diminution des TG-HDL2 observée avec la protéine de
sardine est probablement due à une augmentation de l’activité de la triglycéride lipase
hépatique. Chez le rat hypercholestérolémique, la protéine de sardine comparée à la caséine
ne modifie pas le profil des lipoprotéines pro-athèrogénes (VLDL et LDL) mais améliore
celui de la fraction antiathèrogène (HDL2).
Les rapports d’athérogénicité (C-VLDL-LDL-HDL1/C-HDL et Apo B/A-I) et le
rapport CL/PL (marqueur de la fluidité membranaire) sont diminués chez les rats ingérant la
protéine de sardine comparée à la caséine supplémentée en cholestérol. Ces rapports réduits
sont concomitants avec la faible accumulation des esters de cholestérol trouvée au niveau de
l’aorte. De plus, le marqueur de l’inflammation est significativement plus important chez les
rats consommant la protéine de sardine comparativement à la caséine, suggérant une
meilleure
protection
contre
l’inflammation
périphérique
chez
le
rat
rendu
hypercholestérolémique.
Malgré une cholestérolémie et une triglycéridémie similaire à la caséine, les protéines
de sardine ou certains de ses peptides pourraient avoir un rôle protecteur contre
l’hypercholestérolémie et de ses complications en améliorant la voie antiathérogène du
métabolisme des lipides et en ralentissant le processus inflammatoire, facteur déterminant au
cours du développement et de l’évolution de l’athérosclérose.
Afin de mieux élucider les mécanismes impliqués dans les variations quantitative et
qualitative des teneurs et composition des lipoprotéines, il serait intéressant de compléter cette
étude par :
la détermination de l’activité des enzymes impliquées dans le métabolisme des lipides
à savoir : l’hydroxy-méthyl-glutaryl-CoA réductase (HMG-CoA réductase), la
cholestérol 7-α hydroxylase, l’acyl-CoA cholestérol acyltransférase (ACAT), et les
lipoprotéines lipases tissulaires (LPL) et la lipase endothéliale (LE).
l’évaluation de la composition en acides gras du foie, de l’aorte et des différentes
lipoprotéines sériques.
59
Conclusion
l’estimation des acides biliaires et des stérols neutres fécaux.
De plus, il serait très intéressant d’améliorer ce travail en identifiant et en isolant les
molécules bioactives de la protéine de sardine telles que les acides aminées ou les
peptides responsables de son effet antiathérogène.
60
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74
Annexes
Tableau XIV. Evolution du poids corporel (g)
Groupes
J0
J7
J14
J21
J28
PSc
100 ± 5
144 ± 11
156 ± 18
171 ± 28
173 ± 22
CASc
100 ± 5
130 ±17
143 ± 11
151 ± 13
160 ± 7
CAS
100 ± 5
127 ± 7
141 ± 3
150 ± 9
154 ± 4
test de rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1, Statsoft 97) entre les trois groupes.
Tableau XV. Nourriture ingérée (g)
J0
J7
J14
J21
J28
PSc
14,50 ± 1,84
15,20 ± 1,10a
15,82 ± 1,96a
13,20 ± 0,27
12,80 ± 2,02
CASc
12,75 ± 1,26
12,75 ± 0,31b
13,52 ± 0,41b
11,50 ± 1,15
12,00 ± 1,73
CAS
12,5 ± 0,58
12,25 ± 0,29b
13,06 ± 0,65b
11,50 ± 1,73
12,00 ± 1,15
Groupes
75
Annexes
Tableau XVI. Teneurs sériques et hépatiques en protéines totales et en lipides totaux
Groupes
Sérum
Protéines totales
Lipides totaux
(g.L-1)
(mmol.L-1)
Foie
Protéines totales
(mg.g-1)
Lipides totaux
(mg.g-1)
PSc
79,80 ± 10,78
3,28 ± 0,05a
188,40 ± 47,08
198,03 ± 6,45a
CASc
80,47 ± 9,38
2,22 ± 0,54c
173,25 ± 43,44
179,99 ± 10,25a
CAS
71,83 ± 4,26
3,03 ± 0,05b
145,50 ± 10,97
104,32 ± 0,16b
Tableau XVII. Teneurs sériques en cholestérol total et en triglycérides à J0
Groupes
CT
(mmol.L-1)
TG
(mmol.L-1)
4,86 ± 1,19 a
1,57 ± 0,07a
2,07 ± 0,83b
0,56 ± 0,08b
PSc
CASc
CAS
76
Annexes
Tableau XVIII. Teneurs sériques en cholestérol total, triglycérides, cholestérol libre, esters
de cholestérol et phospholipides
Groupes
CT
(mmol.L-1)
TG
(mmol.L-1)
CL
(mmol.L-1)
EC
(mmol.L-1)
PL
(mmol.L-1)
PSc
2,68 ± 0,50
0,67 ± 0,24
0,72 ± 0,25a
3,28 ± 0,58a
1,78 ± 0,04a
CASc
2,37 ± 0,42
0,67 ± 0,16
0,41 ± 0,03b
3,27 ± 0,57a
0,90 ± 0,43b
CAS
1,86 ± 0,26
0,84 ± 0,13
0,59 ± 0,12ab
2,11 ±0,50b
1,25 ± 0,09b
Tableau XIX. Teneurs hépatiques en cholestérol total, triglycérides, cholestérol libre, esters
de cholestérol et phospholipides
CT
(µmol.g-1)
TG
(µmol.g-1)
CL
(µmol.g-1)
EC
(µmol.g-1)
PL
(µmol.g-1)
PSc
133,13 ± 26,80
104,94 ± 32,52
65,30 ± 5,43a
113,27 ± 44,31
71,75 ± 3,60a
CASc
102,63 ± 30,38
96,20 ± 31,13
52,48 ± 7,22b
83,74 ± 46,30
62,56 ± 6,42b
CAS
99,92 ± 13,08
73,90 ± 34,89
28,12 ± 8,65c
119,91 ± 17,20
39,60 ± 0,46c
Groupes
77
Annexes
Tableau XX. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des VLDL
Masse
(g.L-1)
Apo
(g.L-1)
TG
(mmol.L-1)
PL
(mmol.L-1)
CL
(mmol.L-1)
EC
(mmol.L-1)
PSc
1,277 ± 0,073
0,059 ± 0,018ab
0,42 ± 0,03b
0,58 ± 0,10ab
0,16 ± 0,05 ab
0,73 ± 0,16
CASc
1,135 ± 0,111
0,061 ± 0,002a
0,42 ± 0,05b
0,47 ± 0,05b
0,11 ± 0,02 b
0,78 ± 0,10
CAS
1,245 ±0,012
0,045 ± 0,003b
0,50 ± 0,01a
0,59 ± 0,01a
0,18 ± 0,03 a
0,60 ± 0,10
Groupes
Tableau XXI. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des LDL-HDL1
Masse
(g.L-1)
Apo
(g.L-1)
TG
(mmol.L-1)
PL
(mmol.L-1)
CL
(mmol.L-1)
EC
(mmol.L-1)
PSc
1,384 ± 0,261ab
0,067 ± 0,008b
0,15 ± 0,01
0,62 ± 0,14
0,07 ± 0,04
1,74 ± 0,37a
CASc
1,439 ± 0,020a
0,106 ± 0,007a
0,16 ± 0,01
0,62 ± 0,02
0,06 ± 0,02
1,88 ± 0,03a
CAS
1,077 ± 0,086b
0,062 ± 0,002b
0,24 ± 0,12
0,51 ± 0,01
0,05 ± 0,01
1,01 ± 0,03b
Groupes
78
Annexes
Tableau XXII. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL2
Masse
(g.L-1)
Apo
(g.L-1)
TG
(mmol.L-1)
PL
(mmol.L-1)
CL
(mmol.L-1)
EC
(mmol.L-1)
PSc
0,665 ± 0,02b
0,059 ±0,002a
0,022 ± 0,002b
0,31 ± 0,01a
0,036 ± 0,002b
0,87 ± 0,09a
CASc
0,473 ± 0,06b
0,050 ± 0,008ab
0,033 ± 0,003a
0,25 ± 0,04ab
0,034 ± 0,001b
0,48 ± 0,04c
CAS
1,555 ± 0,09a
0,051 ± 0,001b
0,040± 0,002a
0,20 ± 0,01b
0,042 ± 0,001a
0,61 ± 0,05b
Groupes
Tableau XXIII. Teneurs et composition en lipides et en apolipoprotéines des HDL3
Masse
(g.L-1)
Apo
(g.L-1)
TG
(mmol.L-1)
PL
(mmol.L-1)
CL
(mmol.L-1)
EC
(mmol.L-1)
PSc
1,029 ± 0,004
0,270 ± 0,007a
0,022 ± 0,001b
0,669 ± 0,003b
0,038 ±0,006b
0,532± 0,001a
CASc
1,130 ± 0,100
0,222 ± 0,002c
0,021 ± 0,001b
0,906 ± 0,129a
0,069 ±0,007a
0,411 ± 0,004b
CAS
1,179 ± 0,007
0,244 ± 0,004b
0,056 ± 0,002a
0,927 ± 0,003a
0,058 ±0,003a
0,373 ± 0,046b
Groupes
79
The compared effect of sardine protein and casein on liver, serum, aorte lipids concentrations, the
contents and composition of lipoproteins and the activity of lecithin: cholesterol acyltransferase
(LCAT) was studied in hypercholesterolemic rats. Male Wistar rats (n=18) 5 weeks old and weighing
80±5 g were divided into 2 groups. An experimental group (n=12) was fed a diet containing 20%
casein combined with 5% of a mixture of vegetable oils (olive + nut + sunflower) containing saturated
fatty acids (SFA) 13%, monounsaturated fatty acids (MUFA) 58% and polyunsaturated fatty acids
(PUFA) 29% with n-6/n-3=7 and supplemented with 1.5% of dietary cholesterol, for 10 days.
Hypercholesterolemic rats (Total cholesterol (TC) value = 4.86 ± 1.19 mmol.L-1 vs normal value 2.5
mmol.L-1) were then randomly divided into 2 groups (n=6) fed diets containing sardine protein (PSc)
or casein (CASc) with cholesterol, for 28 days. A control group (n=6) was fed a standard diet
containing 20% casein (CAS). The three diets involved a similar growth. The nutritional balance
carried out from d21 to d28 of experiment showed that food intake was similar, however nitrogen
balance was higher (+28% and +17%), respectively in PSc compared to CASc and CAS groups.
Indeed, intake cholesterol was similar, whereas fecal cholesterol was 1.6-fold lower in PSc compared
to CASc. At d28, sardine protein induced a cholesterolemia and triglyceridemia similar to casein
enriched or not with cholesterol. Serum cholesteryl esters (CE) were 1.5-fold higher in PSc and CASc
compared to CAS however, aortic cholesteryl esters were two-fold lower with sardine protein
compared to casein enriched by dietary cholesterol. Liver concentrations of TC, triacylglycerols (TG)
and CE were similar in the three groups. Whereas, free cholesterol (FC) contents were 1.3- and 2.3fold higher in PSc compared to CASc and CAS, respectively. In hypercholesterolemic groups, the CLDL-HDL1 represented 40% and 50% compared to control group 34% though, the C-HDL2 content
represented 20% compared to casein 14%. The VLDL transported 64% of TG in the three groups;
however in groups fed sardine protein or casein enriched by cholesterol, 4% of TG were transported
by HDL3 fraction compared to 7% in control group. The sardine protein compared to casein did not
modified lipoproteins proatherogens (VLDL et LDL) but improved the one of antiatherogenic fraction
(HDL2). With sardine protein, the LCAT activity was higher by +59% compared to casein enriched or
not with cholesterol. This increase was accompanied by a reduction in phospholipids (PL)-HDL3, the
substrate of LCAT (-26% and -28%, respectively) and CL-HDL3 the acceptor of acyl group (45% and
34%), respectively in PSc compared to CASc and CAS groups. Indeed, the apolipoproteins (apo)HDL3 cofactor-activator of LCAT and CE-HDL2, product of LCAT reaction were higher by (+22% et
+81%), respectively in PSc group compared to CASc group. The atherogenic ratios, C-VLDL-LDLHDL1/C-HDL, apo B/A-I and CL/PL ratio, a marker of membrane fluidity were significantly
decreased by -32%,
-48% and -19% in PSc group compared to CASc group. Moreover, the serum albumin content, a
marker of inflammation was higher by (+47%) in PSc group compared to CASc.
In conclusion, it appears that sardine protein compared with casein had no effect on cholesterolemia
and triglyceridemia in hypercholesterolemic rats. However, the sardine protein reduced aortic EC
accumulation and improved reverse cholesterol transport with increased LCAT activity. This can be in
favour of the protector effect against the cardiovascular risk.
Key words: Rats – Hypercholesterolemia – Sardine proteins – Casein – Lipids – Lipoproteins –
Lecithin: cholesterol acyltransferase
L’effet comparé de la protéine de sardine et de la caséine sur les teneurs en lipides du sérum, du foie et
de l’aorte, les teneurs et la composition des lipoprotéines sériques et l’activité de la lécithine :
cholestérol acyltransférase (LCAT) est étudié chez le rat rendu hypercholestérolémique par la
supplémentation du régime en cholestérol. Des rats mâles de souche Wistar (n=18) âgés de 5 semaines
et pesant 80±5 g sont divisés en 2 groupes. Un groupe expérimental (n=12) consomme pendant 10
jours, 20% de caséine combinée à 5% d’un mélange d’huiles végétales (olive+ noix +tournesol)
contenant 13% d’acides gras (AG) saturés, 58% d’AG monoinsaturés et 29% d’AG polyinsaturés avec
n-6/n-3=7 et 1,5% de cholestérol. Les rats rendus hypercholestérolémiques (cholestérol total (CT) de
4,86 ± 1,19 mmol.L-1 versus la valeur normale 2,5 mmol.L-1) sont ensuite divisés en 2 groupes
homogènes (n=6) consommant chacun pendant 28 jours un régime supplementé en cholestérol et
contenant 20% de protéines de sardine (PSc) ou de caséine (CASc). Un groupe contrôle (CAS) (n=6)
consomme durant toute l’expérimentation un régime standard contenant 20% de caséine. Les trois
régimes entraînent une croissance pondérale similaire chez les trois groupes de rats. Le bilan
nutritionnel réalisé du 21ème au 28ème jour de l’expérimentation montre que la nourriture ingérée est
similaire, alors que le bilan azoté (BA) est élevé (+28% et +17%) respectivement chez le groupe PSc
comparé aux groupes CASc et CAS. De plus, le cholestérol ingéré est identique, alors que le
cholestérol fécal est 1,6-fois plus faible chez le groupe PSc comparé à CASc. À J28, la protéine de
sardine induit une cholestérolémie et une triglycéridémie semblable à la caséine avec ou sans
cholestérol. Au niveau sérique, les esters de cholestérol (EC) sont 1,5-fois plus élevés chez les groupes
PSc et CASc comparé à CAS alors qu’au niveau de l’aorte, les EC sont réduits de moitié avec la
protéine de sardine comparativement à la caséine supplémentée en cholestérol. Au niveau hépatique,
les valeurs du CT, EC et triglycérides (TG) sont sensiblement les mêmes chez les trois groupes alors
que les teneurs en cholestérol libre (CL) sont respectivement 1,3- et 2,3-fois plus élevées chez le
groupe PSc comparativement aux groupes CASc et CAS. Chez les groupes hypercholestérolémiques,
le C-LDL-HDL1 représente 45% et 50% comparés à 34% chez le contrôle. Le C-HDL2 est de 20%
avec la protéine de sardine comparée à 14% avec la caséine. Les VLDL transportent
approximativement 64% des TG chez les trois groupes de rats. En revanche, chez les groupes
consommant la protéine de sardine ou la caséine supplémentée en cholestérol, 4% des TG sont portés
par les HDL3 comparativement à 7% chez le groupe contrôle. La protéine de sardine comparée à la
caséine ne modifie pas le profil des lipoprotéines pro-athèrogénes (VLDL et LDL) mais améliore celui
de la fraction anti-athèrogène (HDL2). En effet, avec la protéine de sardine, l’activité de la LCAT est
augmentée de +59% comparée à la caséine avec ou sans cholestérol. Cette élévation est accompagnée
d’une diminution des phospholipides (PL)-HDL3, substrat de la LCAT (-26% et -28%) et du CL-HDL3
accepteur du groupement acyl (-45% et -34%) respectivement chez le groupe PSc comparé aux
groupes CASc et CAS. De plus, les apo-HDL3 cofacteur-activateur de la LCAT et les EC-HDL2
produit de la réaction enzymatique de la LCAT sont respectivement plus élevés (+22% et +81%) chez
le groupe PSc comparé au groupe CASc. Les rapports d’athérogénicités C-VLDL-LDL-HDL1/C-HDL,
l’apolipoprotéines (apo) B/A-I, et le rapport CL/PL, marqueur de la fluidité membranaire sont
significativement diminués de -32%, -48% et -19% chez le groupe PSc comparé au groupe CASc. De
plus, la teneur sérique en albumine, marqueur de l’inflammation est élevée (+47%) chez le groupe PSc
comparé à CASc.
En conclusion, il apparait que la protéine de sardine comparée à la caséine n’a aucun effet sur la
cholestérolémie et la triglycéridémie chez le rat rendu hypercholestérolémique. En revanche, la
protéine de sardine réduit l’accumulation des EC au niveau de l’aorte et induit une amélioration du
transport inverse du cholestérol des tissus périphériques vers le foie en augmentant l’activité de la
LCAT, ce qui pourrait être en faveur d’un effet protecteur vis-à-vis du risque cardiovasculaire.
Mots clés : Rat – Hypercholestérolémie – Protéine de sardine – Caséine – Lipides – Lipoprotéines –
Lécithine : cholestérol acyltransférase.

Thèse sabrine - Université d`Oran

Transcription

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