CODE GENETIQUE ET TRADUCTION 1) Décryptage

CODE GENETIQUE ET TRADUCTION 1) Décryptage

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CODE GENETIQUE ET TRADUCTION
1) Décryptage du code génétique
Le code génétique a été établi dans les années 60. Plusieurs expériences ont été nécessaires pour
déterminer que la suite des acides aminés correspondait à l'ordre des nucléotides, que les codons
étaient composés de triplets et quelle était la correspondance entre un triplet et un acide aminé.
- Yanowski en étudiant les mutations de la tryptophane synthétase chez E. coli a montré que les
mutations sur la protéine sont colinéaires avec les mutations sur l'ADN le long de la carte
génétique.
- S'il fallait faire correspondre les 4 nucléotides aux 20 acides aminés, il fallait obligatoirement les
combiner au moins par 3 (42 = 16, 43 = 64). On arrive donc à la notion de codon
- Il n'y avait pas d'association particulière entre les acides aminés, donc pas de recouvrement des
codons. Il n'y a pas de chevauchement.
- En 1961 Sydney Brenner et Francis Crick étudient une grande quantité de mutations sur le
phage T4. Lorsqu'il y a addition ou délétion de 1 ou 2 bases, la protéine est non fonctionnelle. Par
contre lorsqu'il y a addition ou délétion de 3 bases, la protéine est souvent fonctionnelle. Cette
expérience permet de vérifier la notion de codon, et ajoute la notion de phase de lecture. (les
codons se suivent)
- En 1966 le code génétique est totalement décrypté grâce aux expériences de Nirenberg et
khorama
- En ajoutant un ARN poly U à un extrait cellulaire (sans ARNm), ils obtiennent un poly
Phenylalanine: donc UUU code pour la phénylalanine. De même, l’ARN poly A donne une
polylysine.
Poly ACACACACACACA donne thr-His-Thr-His-Thr donc ACA ou CAC code pour la
thréonine.
Poly AACAACAAC donne en mélange poly Asn , polythr et poly Gln (AAC, ACA et CAA)
donc ACA code pour la thréonine etc....
Nomenclature : le codon 5' ACG 3' sera reconnu par un anticodon 3' UGC 5' qui sera écrit CGU
Il n'y a pas un ARN de transfert par codon, plusieurs codons sont reconnus par le même ARNt.
Exemple GCU, GCC et GCA sont reconnus par le même ARNt. Ces trois codons codent pour
l'alanine.Il existe donc une certaine liberté stérique dans la reconnaissance de la troisième base du
codon. Cette liberté est appelée le wobble
1ère base de l'anticodon
U
3ème base du codon
A ou G
Ainsi dans le cas de l'Arg, un seul tRNA ayant pour anticodon UCU suffit pour reconnaître deux
codons AGA et AGG
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La première base est de plus souvent modifiée, par exemple, l'inosine peut former des liaisons
avec UC ou A elle est toujours utilisée pour lsoleucine
AUG donne met
AU(ACU) donne Ile
Dans d'autres cas la modification restreint le wobble, par exemple la thiouridine ne s'apparie
qu'avec A
Il existe donc de multiple combinaisons permettant de construire des tRNAs capables de
reconnaître les 61 codons représentant les acides aminés.
Intérêt du wobble: economie de tRNA, dissociation plus rapide de tRNAs fixés sur l'ARNm.
Variations du code génétique
L'universalité du code génétique est forte mais quelques exceptions ont été trouvées chez des
procaryotes et chez des ciliés. Par exemple chez le mycoplasme Mycoplasma capricolum, UGA
n'est pas utilisé pour la terminaison, mais code pour un Tryptophane. Chez les cilié, comme par
exemple Tetrahymena thermophila les codons UAA et UAG sont traduit en glutamine à la place
d'un codon de terminaison
Les ciliés sont sont séparés très tôt des eucaryotes et deux explications sont avancées pour
expliquer cette entorse au code universel. La première est qu’au début le code n'était pas encore
bien fixé avec une terminaison variable, de nombreuses protéines n'ayant pas d'extrémité COOH
bien définie. Lors de l'évolution, trois codons ont été utilisés chez la majorité des êtres vivants
mais seulement un dans quelques cas comme certains ciliés.
La deuxième hypothèse est que des codons stop utilisés très rarement, ont pu être mutés et être
utilisé pour coder un acide aminé (rappel des ARN suppresseurs)
D'autres variations ont été trouvées dans le génome mitochondrial. Par exemple AUA sert de
codon d'initiation dans le génome mitochondrial de la drosophile alors qu'il code pour une
isoleucine dans le génome nucléaire. De même UGA des mamifères code pour le tryptophane
dans le génome mitochondrial des mammifères. Ces variations sont dues au fait que les
mitochondries synthétisent qu'un très petit nombre de protéines (un dizaine). Une mutation a
donc très peu d'effet.
C) Les évenements de la traduction
1) Couplage de l'acide aminé sur l'ARNt
L'acide aminé se fixe à l'extrémité 3' OH ou en 2'OH, Tous les ARN de transfert se terminent par
CCA, c'est sur cette extrémité que sera fixée l'acide aminé à transporter par une liaison ester sur le
OH.
Il y a tout d’abord accrochage de l'acide aminé sur l'ATP: aa + ATP ----> aa-AMP + 2 Pi. Le
pyrophosphate est hydrolysé, la réaction est irréversible. Il y ensuite transfert de l'acide aminé sur
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le tRNA : aa - AMP + tRNA ---> aa - tRNA + AMP. Sur l'enzyme il y a donc trois sites (tRNA,
acide aminé et ATP) et toutes les réactions se passent sur l'enzyme sans que les constituants
intermédiaires quittent l'enzyme.
La liaison ester est riche en énergie (provenant de l'energie de la liaison anhydride aa-AMP)
Cette énergie sera utilisée pour l'acrochage des acides aminés les uns aux autres.
Spécificité de la réaction : Le code génétique est due à la
spécificité de l'aminoacyl-tRNA synthétase. En effet, si
une cystéine liée à son ARNt est chimiquement
transformée en alanine. Dans la protéine, les cystéines
sont remplacées par des alanines.
Site
ATP
Site acide
aminé
O
site
tRNA
H C
0
-
-O P O
R
NH
2
0
O
-O P O
-
O
L'aminoacyl tRNA synthétase reconnaît soit l'anticodon
soit une paire de base en 3-70 comme par exemple, pour le
tRNA ala d’E. coli. Pour que la réaction soit spécifique, il
faut que le tRNA et l'acide aminé se lient au site de
l'enzyme avec très bonne affinité.
Mais la reconnaissance de l'ARN de transfert et de l'acide
aminé n'est pas parfaite. La réaction se fait quelquefois
avec un mauvais partenaire, et il y a dans ce cas des
possibilités de correction. On en connait deux selon les
synthétases : soit le mauvais acide aminé adénylé est
hydrolysé quand le bon tRNA se lie, soit le mauvais
aminoacyl tRNA est hydrolysé. Dans les deux cas, le
tRNA est important pour effectuer la correction.
-O P O
O
Ad nosine
R
H C
NH
2
OH
0
O
O
P
O
O
Adénosine
R
H C NH2
C
O O
2) L'initiation
Il y a 3 phases de lecture possibles: l'initiation permet de déterminer l'endroit exact où commence
la traduction. Il faut aussi que le bon AUG soit reconnu comme codon de départ. En effet, ily a
plusieurs méthionines dans la séquence.
Chez les procaryotes:
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Dans la bactérie il y a équilibre entre les formes 70S et 30
S + 50 S
+
Au 30S se lie le facteur d'initiation IF3 ce qui déplace
l'équilibre précédent.
70 S
50 S
30 S
+
30 S
IF3
+
Il y a ensuite liaison de l'ARN m. La liaison s'effectue à
une séquence particulière sur l'ARN (Shine Dalgarno, site
de liaison du ribosome) juste en amont, en 5' de l'ATG
initiateur. Cette liaison s'effectue par hybridation avec une
séquence complémentaire en 3' de l'ARN 16S. l’initiation
est donc interne à l’ARN, il peut y avoir plusieurs sites
d’initiation sur l’ARN.
IF3
30 S
mRNA
met
met
+
IF2
methionyl tRNA
met
met
+
IF3 a deux fonctions : une fonction d'antiassociation des
deux sous unités 30S et 50S contrôlant ainsi le nombre de
30S disponible pour la traduction et une fonction de
liaison de l'ARNm sur le 30S.
met
met
+
met
met
Un autre facteur d'initiation (IF1) se lie sur le complexe, il
aide à la dissociation entre les deux sous unités du
ribosome en stabilisant le complexe IF3-30S.
+
+
Un autre complexe se forme entre IF2 et l'ARN de
transfert d'initiation portant une formylmethionine.
Les deux complexes se reconnaissent au niveau d'un site appelé P. Ce nouveau complexe est
capable de se lier au 50S, il y a hydrolyse du GTP en GDP + pi (probablement par une protéine du
ribosome activée par IF2 et relargage des facteurs d'initiation (IF1, IF2 et IF3).
Chez les eucaryotes l'initiation est différente
met
met
Le ribosome reconnaît le cap à l’extrémité 5’ de
l’ARNm. De ce fait l'ARN ne peut pas être
polycistonique. Il n’y a pas comme chez les
procaryotes de reconnaissance d'une séquence
particulière en amont de l'ATG.
+
eIF2
methionyl tRNA
met
met
+
40 S
La reconnaissance du mRNA par le ribosome est
presque identique. Un complexe contenant une
protéine eIF2, du GTP et le tRNA se lie au 40S
libre, c'est ce nouveau complexe qui reconnaît
mRNA: la différence par rapport aux bactéries est
que le tRNA doit etre présent. Comme pour les
procaryotes la traduction nécessite des facteurs
d'initiation et d'élongation.
met
met
+
met
met
+
5
3) L’élongation
Il y a ensuite reconnaissance d'un aminoacyl tRNA sur le site A
a.a 2
met
Il y a transfert de la formylmethionine de l'aminoacyl tRNA
d'initiation sur l'aminoacyl tRNA du site A. Il y a alors dans le site
A, un peptidyl tRNA et sur le site A un tRNA deacétylé
AUG N 1N1N1
Le tRNA désacetylé va dans un autre site, le site E, le peptidyl
tRNA va dans le site P (avec l'ARN messager). Le tRNA
désacetylé part du site E ce qui permet l'accessibilité du site A à
un autre aminoacyl tRNA
site P
site A
met - a.a 2
Cette élongation nécessite la présence de plusieurs facteurs appelé
EF (facteurs d’élongation)
Bilan énergétique de l'élongation :
l'addition d'un acide aminé à la chaine nécessite l'hydrolyse d'une
molécule d'ATP et de deux molécule de GTP. L'ATP permet
l'accrochage de de l'acide aminé sur le t-RNA, une molécule de
GTP permet le positionnement de l'aminoacyl-tRNA sur le site A,
une deuxième molécule de GTP permet la translocation du
peptidyl tRNA du site A vers le site P.
Si on regarde le nombre de liaison riche en énergie, il en a fallu 4
(1ATP en AMP et 2 GTP en GDP) ce qui est important pour faire
juste une liaison amide. Mais ici l'énergie est surtout employée
pour assurer la fidélité de la traduction.
AUG N1N1N1
site P
met - a.a 2
site A
a.a 3
AUG N1N1N1 N2N2N2
site P
site A
4) La terminaison
Il y a trois codons STOP = UAA, UAG et UGA. Des protéines de libération se lient aux codons
STOP au niveau du site A. On les apelle RF (Releasing Factor). Ces protéines modifient l'activité
de la peptidyl transférase: il y a addition d'une molécule d'eau à la place d'un acide aminé.
Il y en a trois releasing factors chez les procaryotes (RF1 reconnaît UAA et UAG; RF2 reconnaît
UAA et UGA, RF3 permet la dissociation de RF1 ou de RF2 du site A en hydrolysant une
molécule de GTP) et une seule chez les eucaryotes
Il y a ensuite libération de la chaîne polypeptidique en croissance du ribosome et dissociation des
deux sous-unités ribosomales et libération de l'ARNm.
.4) Simultanéité et blocage
Chez les procaryotes: Il ya un couplage entre transcription et traduction. En effet, il n'y a pas
d'enveloppe nucléaire séparant l'ADN des ribosomes. Les ribosomes peuvent donc se fixer,
pendant la transcription, sur l'ARNm en cours de synthèse et ainsi commencer la traduction. C'est
impossible chez les eucaryotes, le ribosome n'est pas mature dans le noyau. Le couplage
transcription/traduction existe toutefois dans les mitochondries et les chloroplastes (origines
procaryotiques).
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Sur un même ARN messager (procaryote ou eucaryote), plusieurs ribosomes se déplacent
simultanément. Un ribosome peut se fixer sur l'ARNm quand le précédent est distant d'environ 80
nucléotides. Cette succession de ribosome forme des polysomes.
Blocage de la traduction par des antibiotiques. Plusieurs antibiotiques bloquent la traduction en se
fixant sur le ribosome. Par exemple, la tétracycline se fixe sur une protéine de la sous unité 30S et
inhibe la translocation du ribosome et le chloramphenicol se lie à la sous unité 50S et inhibe la
synthèse peptidique. Les ribosomes bactériens et eucaryotes étant différents ces drogues
n’affectent pas la traduction des ribosomes eucaryotes aux doses où elles sont efficaces pour
inhiber la traduction chez les eucaryotes. Les bactéries sont devenues résistantes à ces
antibiotiques soit en empêchant leur entrée dans la cellule comme dans le cas de la résistance à la
tétracycline, soit en métabolisant l’antibiotique comme dans le cas de la résistance au
chloramphénicol (tous les antibiotiques n’affectent pas la traduction, par exemple, certains
comme l’ampicilline, inhibent des enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi bactérienne).
D) Régulation de la traduction
Exemple de l'opéron tryptophane chez E. coli.
La synthése du trp nécessite plusieurs étapes qui sont catalysées par 5 enzymes codées par les
gènes TrpA, TrpB, TrpC, TrpD, et TrpE. Cet opéron conteint en outre un promoteur, un
opérateur. En l'absence de Trp, les 5 gènes sont transcrits et traduits et le Trp est synthétisé. En
présence de Trp, un répresseur se fixe sur l'opérateur et l'opéron n'est plus transcrit. Il s'agit ici
d'un régulation de la transcription, le répresseur fixé empèche la transcrpition
Il existe de plus une régulation au niveau de la traduction, appelé attenuation
rappel:
- chez les procaryotes la transcription et la traduction sont simultanées
- les ARNs sont polycistroniques
- l'arrêt de la trancription : la RNA polymérase s'arrête quand elle synthétise une série de résidus U
dans la mesure où elle a d'abord synthétisé une séquence autocomplémentaire capable de se
replier.
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l'ARN dans la région du leader-attenuateur peut prendre deux structures secondaires distinctes:
1) Dans le cas ou la partie codante ne
forme pas de structure secondaire, les
partie 2 et 3 suivantes forment une
structure secondaire. Il y a continuation
de la transcription.
tryptophane
répresseur
transcription
leader TrpE
TrpD
TrpC
Trp B
TrpA
ARN
promoteur
opérateur
2) Dans le cas ou la partie codante forme
une structure secondaire avec la partie
suivante (2), il se forme une deuxième
boucle
présentant
une
structure
secondaire d'arrêt de la transcription.
1
2
UUUUU
3
transcription
4
1
arrêt de la transcription
2
3
4
ribosome bloqué
sur la séquence leader
Ainsi selon les structures secondaires au
niveau le la séquence d’atténuation, il y a
soit transcription des 5 phases de lecture soit arrêt prématuré de la trnscription et donc pas de
traduction des 5 protéines nécessaires à la synthèse du tryptophane.
La séquence leader est traduite en un peptide de 14 acides aminés comportant du tryptophane
dans sa séquence, losqu'il y a du trp dans le milieu le ribosome passe à travers et on a la structure
1 et donc arrêt de la transcription.
En absence de Trp, le ribosome reste bloqué, la transcription continu, la partie 1 ne peut pas
s'hybrider avec la partie 2 du fait de la présence du ribosome, la transcription continue.
Exemple: contrôle de la traduction du gène ompF.
La régulation est due à la synthèse d'un petit ARN contrôlant directement la traduction du gène
ompF.
Lorsque la pression osmotique augmente,
il y a activation de la protéine ompR qui
OmpR
active la transcription de micF. Il y a
synthèse d’un petit ARN de 174 bases
gene micF
appelé micRNA (mRNA interfering
ARN de ompF
transcription
complementary RNA). Cet ARN est
3’
5’
5’
3’
ARN micF
antisens complémentaire d'une région de
traduction
ompF qui inclue le site de liaison au
ribosome: il empêche la traduction de
hybridation
ompFil devient sensible à des RNases qui
OmpF
digèrent le RNA double brin.
inhibition de la traduction
ompF code pour une protéine de la
membrane externe de E. Coli qui ne doit
plus être traduite lorsque la pression osmotique augmente
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Utilisation de ce système : cet exemple a servi de modèle pour étudier l'expression de certain
gènes. On peut soit transcrire un ARN complémentaire à celui du gène à éteindre soit utiliser des
oligonucléotides qui s'hybrident au niveau de l'AUG. Le problème est qu'il faut une grande
quantité d'antisens.
Rappel des interactions ARN/ARN dèjà vus
dans les régulations : exemple de la régulation du nombre de plasmide
au niveau de l'initiation de la traduction des ARNm procaryotes (il y a une hybridation entre
l'ARNm et l'ARN 16S au niveau du site de liaison du ribosome, séquence de Shine Dalgarno)
au niveau de la traduction hybridation entre l'ARN de transfert et l'ARN messager au niveau des
codons et anticodons.
au niveau de la maturation des ARNs impliquant les snRNP, par exemple les petits ARNs U1..Un
s'hybrident aux sites d'épisssage.