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CODEX ŒNOLOGIQUE INTERNATIONAL
Tanins œnologiques
TANINS OENOLOGIQUES
N° SIN : 181
(Oeno 12/2002 modifiée par
Oeno 5/2008 et 6/2008, OIV-Oeno 352-2009)
OIV-OENO 554-2015
1. OBJET, ORIGINE ET DOMAINE D'APPLICATION
Les tanins oenologiques sont extraits soit de la noix de galle, soit d'un bois riche en
tanin : châtaignier, chêne, bois exotiques, etc.... soit des pépins et de pellicules de
raisins. Les tanins sont composés d'un mélange de glucosides soit de l'acide
gallique (gallotanins), soit de sa dilactone, l'acide ellagique (ellagitanins), (tanins
hydrolysables) ou bien d'un mélange de proanthocyanidines (tanins condensés).
Les tanins sont utilisés pour faciliter la clarification des moûts et des vins. Ils ne
doivent pas modifier les propriétés olfactives et la couleur des vins.
2. ETIQUETAGE
La nature du solvant d'extraction (eau ou alcool), l’origine botanique ainsi que
l’estimation des phénols totaux doivent figurer sur l'étiquette.
3. CARACTERES
Le tanin oenologique est d'une couleur allant du blanc jaunâtre au marron
rougeâtre, de saveur astringente, partiellement soluble dans l'acétate d'éthyle et
soluble dans l'eau, l'éthanol et le méthanol pour les tanins condensés et insoluble
dans la plupart des solvants organiques à l'exception de l'éthanol et du méthanol
pour les tanins hydrolysables.
4. CARACTÈRES D'IDENTITÉ
4.1 - La solution aqueuse de tanin donne, avec les sels de fer(III), un
précipité bleu noir entre pH 3 et 5. Ce précipité disparaît par addition d'une petite
quantité d'acide fort.
4.2 - La solution aqueuse de tanin condensé précipite la gélatine,
l'albumine du blanc d'oeuf, du sérum sanguin, etc. à pH compris entre 3 et 6. Les
tanins précipitent les alcaloïdes (quinine, strychnine, etc.) entre pH 4 et 6.
5. CARACTERISATION
Il est possible de caractériser l'origine botanique à l'aide de plusieurs critères :
spectre d'absorption en ultraviolet, teneur en flavanols, proanthocyanidines, acide
digallique, scopolétine (voir l’annexe).
F-COEI-1-TANINS
1
Tanins œnologiques
6. ESSAIS
6.1 Matières étrangères
Le tanin doit être presque entièrement soluble dans l'eau et la teneur en
substances insolubles inférieure à 2 p. 100, après agitation pendant 15
minutes de 10 g de tanin dans un litre d'eau.
6.2 Perte à la dessiccation
Déterminée jusqu'à poids constant, sur une prise d'essai de 2 g, la perte de
poids à l'étuve à 100- 105 °C, pendant 2 heures, doit être inférieure à 10
p. 100.
Toutes les limites fixées ci-dessous sont rapportées au produit sec.
6.3 Cendres
Incinérer progressivement, sans dépasser 550 °C, le résidu laissé dans la
détermination de la perte à la dessiccation.
Le poids de cendres doit être inférieur à 4 p. 100
6.4 Préparation de la solution pour essais
Reprendre les cendres de 2 g de tanin par 1 ml d'acide chlorhydrique dilué
(R) et une goutte d’acide nitrique concentré (R). Chauffer sur un bain d'eau
à 100 °C quelques instants pour préciser la dissolution. Transvaser dans
une fiole jaugée de 50 ml en rinçant la capsule avec de l'eau distillée, et
compléter au trait de jauge.
6.5 Arsenic
Sur 0,25 g de tanin, rechercher l'arsenic par la méthode décrite au Chapitre
II par spectrophotométrie d'absorption atomique, après destruction de la
matière organique par la méthode par voie humide.
La teneur en arsenic doit être inférieure à 3 mg/kg.
6.6 Fer
A 10 ml de solution pour les essais préparée selon 6.4, ajouter 2 ml de
solution de thiocyanate de potassium à 5 p. 100 (R) et 1 ml d'acide
chlorhydrique concentré (R). La coloration obtenue ne doit pas être plus
intense que celle d'un témoin préparé avec 2 ml d'une solution de sel de
fer(III) à 0,010 g de fer par litre (R), 8 ml d'eau et les mêmes volumes des
mêmes réactifs. En cas contraire une dilution de la solution pour essais
sera réalisée.
La teneur en fer doit être inférieure à 50 mg/kg, à l’exception de la teneur
en fer des tanins issus du châtaignier qui doit être inférieure ou égale à
F-COEI-1-TANINS
2
Tanins œnologiques
200 mg/kg, dans ce cas, la solution pour les essais préparée selon 6.4
devra faire l’objet d’une dilution adéquate. Il est également possible de
doser le fer par spectrométrie d'absorption atomique.
6.7 Plomb
Sur la solution pour les essais préparée selon 6.4 doser le plomb selon la
méthode figurant dans le Recueil des méthodes internationales d’analyse
des vins et des moûts par spectrophotométrie d’absorption atomique.
La teneur en plomb doit être inférieure à 5 mg/kg.
6.8 Mercure
Doser le mercure selon la méthode décrite au Chapitre II par spectrométrie
d'absorption atomique.
La teneur en mercure doit être inférieure à 1 mg/kg.
6.9 Estimation des phénols totaux
Sur une solution aqueuse de tanins à 1 g/l diluée au 1/100ème, mesurer
l'absorbance à 280 nm sur un parcours optique de 1 mm. La teneur en
phénols totaux est donnée en équivalents acide gallique/g et transformée
en p. 100 de poudre de tanin.
Pour les phénols totaux, les résultats doivent être supérieurs à 65 %.
6.10 Nature des tanins
6.10.1 - Les tanins proanthocyanidiques sont estimés par la méthode aux
DMACH
:
mélanger
5
ml
de
réactif
(100
mg
de
diméthylaminocinnamaldéhyde + 10 ml d'HCl 12 M; après solubilisation
compléter avec du méthanol à 100 ml) à 1 ml de solution aqueuse de
tanins (1g/l). Après 10 minutes, lire l'absorbance à 640 nm sur 1 mm de
parcours optique. Les résultats sont donnés en équivalents catéchine.
Pour les tanins condensés, le résultat doit être supérieur à 10 mg/g.
6.10.2 - Pour estimer les ellagitanins il faut utiliser la méthode à l'acide
nitreux. Mélanger à 1 ml de solution aqueuse de tanins (1 g/l), 1 ml de
méthanol et 160 µl d'acide acétique à 6 p. 100 (m/v), chasser l'oxygène
par barbotage d'azote durant 10 minutes, ajouter enfin 160 µl de nitrite de
sodium à 6 p. 100 (m/v) suivi d'un bref barbotage d'azote (1 mn), le tube
est bouché hermétiquement et la réaction se développe en 60 mn dans un
bain d'eau à 30°C. L'intensité de la couleur développée est mesurée par
l'absorbance à 600 nm. Les résultats sont estimés en mg/g d'équivalents
castalagine (600nm: 983 g-1).
Pour les tanins hydrolysables de type ellagique, le résultat doit être
supérieur à 20 mg/g.
F-COEI-1-TANINS
3
Tanins œnologiques
6.10.3 - Les tanins hydrolysables de nature gallique correspondent aux
autres catégories de produits répondant négativement aux tests 6.10.1 et
6.10.2.
F-COEI-1-TANINS
4
Tanins œnologiques
6.11 Mode d'extraction
6.11.1 - Indice de solubilité IS
Il exprime le pourcentage de solubilité de 5 g de tanin dans 100 ml du
mélange éther diéthylique/éthanol (9/1, v/v).
Pour des tanins extraits à l'eau exclusivement, le résultat doit être inférieur
à5
6.11.2 - Indice d'extractibilité IEx :
lEx = (D.0.370 nm X 2) - (D.O.350 nm + D.0.420 nm).
Lorsque lEx est supérieur à 0,05, les produits sont issus d'une extraction
exclusivement à l'eau.
6.12. Pouvoir Colorant
Sans préjudice aux dispositions du paragraphe 1, l’emploi de tanins
œnologiques modifie plus ou moins la coloration des vins, fonction de leur
pouvoir colorant propre. On doit donc définir d’une part le pouvoir colorant
jaune (A420 1‰) correspondant à la coloration jaune mesurée par
l’absorbance à 420 nm d’une solution d’essai de tanin œnologique à 1‰
de matières sèches (1g/l). Plus l’indice est élevé et plus sa couleur jaune
influencera la couleur du vin.
Et d’autre part, le pouvoir colorant rouge (A520-A4201‰). Ce dernier
correspond à la différence de coloration entre le jaune mesuré à 420 nm et
le rouge mesuré à 520 nm d’une solution de tanins oenologiques à 1‰; le
tanin est colorant lorsque l’indice devient positif (A520 > A420).
Les tanins œnologiques sont solubilisés dans un mélange éthanol/eau
(50/50, v/v). Les absorbances sont mesurées sous 1 cm de trajet optique.
Les mesures se font immédiatement après la mise en solution. Dans ces
conditions, un tanin œnologique récent doit donner une solution limpide.
Les limites, pour qu’un tanin oenologique ne soit pas considéré comme
colorant, pour ces deux indices sont de :
 + 1,5 pour le pouvoir colorant jaune (A4201‰) et
 + 0,05 pour le pouvoir colorant rouge (A520-A4201‰)
7. CONSERVATION
Les tanins oenologiques
hermétiquement clos.
F-COEI-1-TANINS
doivent
être
conservés
dans
des
emballages
5
Tanins œnologiques
ANNEXE 1
MISE EN EVIDENCE DE L’ORIGINE BOTANIQUE DES TANINS OENOLOGIQUES
MATERIELS ET METHODES
Principe
La reconnaissance de l’origine botanique des tanins oenologiques nécessite
des observations à réaliser dans l’ordre suivant :
- 1°) Présence de tanins condensés tirés des raisins,
- 2°) Présence de tanins issus de noix de galles,
- 3°) Présence de tanins issus de bois exotiques,
- 4°) Différenciation du tanin de chêne du tanin de châtaignier.
- Les tanins de raisins se caractérisent par une forte teneur en flavanols
exprimée en (+) catéchine.
- Les tanins de noix de galle possèdent des teneurs en acide digallique
importantes.
- Le spectre dans l’ultraviolet des tanins issus de bois exotiques présente
un pic spécifique.
- Les tanins de chêne sont plus riches en coumarines et plus
particulièrement en scopolétine que les tanins de châtaignier.
Appareillages et conditions analytiques
- Verrerie de laboratoire.
- Agitateur magnétique.
- Spectrophotomètre d’absorption UV / visible double faisceau.
- Cuve de 1 cm de parcours optique en verre
- Cuve de 1 cm de parcours optique en quartz,
- Bain d'eau à 100°C (facultatif)
- Evaporateur rotatif chauffant
- Système chromatographique composé (à titre d'exemple):
d’une pompe à gradient pour mélanges binaires
d’un injecteur muni d’une boucle de 20 µl
d’un détecteur spectrophotométrique à longueur d’onde fixe 280
nm
d’un détecteur fluorimétrique
Colonne de type phase inverse (C18)
diamètre des
particules 5µm, dimensions de la colonne : 20 cm X 4.6 mm pour
doser l’acide digallique et la scopolétine.
- pH mètre.
F-COEI-1-TANINS
6
Tanins œnologiques
Réactifs et solutions étalons
- para-[diméthylamino]cinnamaldéhyde
-acide chlorhydrique en solution concentrée (R)
- (+) catéchine
- acide digallique
- éthanol absolu
- acétate d’éthyle
- hydroxyde de sodium en solution concentrée (R)
- méthanol
- éther éthylique
- acétonitrile
- acide acétique
- scopolétine
- ombelliférone
- eau distillée ou déminéralisée et ultrafiltrée.
Préparation des réactifs
Solution de p-[diméthylamino]cinnamaldéhyde (p-DACA)
100 mg de p-DACA sont mis en solution dans 10 ml d’acide
chlorhydrique 12 M et 90 ml de méthanol.
Solvants d’élution de l’acide digallique
solvant A: méthanol pur
solvant B: solution d’acide perchlorique dans l’eau
à pH 2,5
Solvants d’élution de la scopolétine
solvant A: eau distillée contenant 3 % d’acide
acétique
solvant B: acétonitrile contenant 3 % d’acide
acétique
Préparation des solutions étalons
Solution de (+) catéchine
Mettre en solution 10 mg de (+) catéchine dans 1 l d’eau distillée
Solution d’acide digallique à 100 mg / litre d’eau distillée
Solution de scopolétine à 20 µg / litre d’eau distillée.
F-COEI-1-TANINS
7
Tanins œnologiques
Modes opératoires
Mise en évidence de la présence de tanins de raisins, 2 méthodes
possibles:
Dosages des flavanols totaux.
5 ml de réactif à la p-DACA sont additionnés de 1 ml de solution
aqueuse à 200mg / l de tanin.
Après 10 mn, l’absorption du mélange placé dans une cuve en
verre dont le trajet optique est de 10 mm est mesurée à 640 nm.
Les valeurs de l'absorbance sont ensuite rapportées à une courbe
étalon obtenue à partir d’une gamme de concentrations croissantes
en (+) catéchine analysée dans les mêmes conditions.
Dosage des tanins proanthocyaniques
4 ml de solution à 200 mg/l de tanin sont additionnés de 2 ml
d’eau distillée et de 6 ml d’acide chlorhydrique 12 M dans un tube
à hydrolyse. Ce tube est porté à 100 °C pendant 30 mn puis
refroidi dans un bain d’eau glacée.
Un second tube contenant le même mélange reste à température
ambiante pendant le même temps.
Ensuite, les deux tubes reçoivent 1 ml d’éthanol puis les valeurs
des deux absorbances sont mesurées à 550 nm.
La différence des 2 absorbances est multipliée par 380 pour
donner la teneur en tanins proanthocyaniques.
Mise en evidence des tanins de noix de galle
20 ml de solution aqueuse de tanin à 50 mg/l sont amenés à pH 7
à l’aide d’une solution d'hydroxyde de sodium concentrée (R).
Une première série d’extractions effectuées avec 3 fois 20 ml
d’acétate d’éthyle permet d’éliminer les substances neutres.
Dans un second temps, la phase aqueuse est amenée à pH 2 par
addition de solution concentrée d’acide chlorhydrique (R) puis
extraite par une nouvelle série de 3 extractions à l’acétate d’éthyle.
Après évaporation de l’acétate d’éthyle, le résidu est repris par
20 ml de méthanol puis analysé par chromatographie dans les
conditions suivantes (à titre d'exemple) :
volume injecté: 20 µl d’extrait ou de solution standard
d’acide digallique
Détection à 280 nm
Composition du gradient d’élution:
de 10 à 20 % de solvant A en 35 mn
Débit de la phase mobile: 0,8 ml / mn.
F-COEI-1-TANINS
8
Tanins œnologiques
Mise en évidence de tanins issus de bois exotiques
Préparer une solution aqueuse de tanin telle que, placée dans une
cuve en quartz de 1 cm de parcours optique, cette solution
possède une absorbance mesurée à 280 nm comprise entre 1 et
1,5.
Effectuer en continu sur cette solution des mesures d'absorbance
comprises entre 250 et 300 nm.
Relever la présence ou l’absence d’un pic maximum d’absorption.
Mise en évidence de tanins de chêne ou de châtaignier.
La scopolétine contenue dans 20 ml de solution aqueuse de tanin à
5 g/l est extraite par 3 fois 20 ml d’éther éthylique.
Après récupération complète et évaporation de la phase éthérée,
l’extrait est repris par 50 ml d’eau puis analysé par
chromatographie dans les conditions suivantes (à titre d'exemple):
volume injecté: 20 µl d’extrait ou de solution étalon de
scopolétine.
détection fluorimétrique:
longueur d’onde d’excitation: 340 nm,
longueur d’onde d’émision: 425 nm
Composition du gradient d’élution:
94 % de solvant A pendant 10 mn
de 94 à 85 % en 20 mn
de 82 à 67 % en 5 mn
de 37 à 42 % en 5 mn.
Débit de la phase mobile : 1 ml/mn
CONCLUSION
Un tanin est reconnu issu de raisin lorsque sa teneur en flavanols totaux, exprimée
en (+) catéchine est supérieure à 50 mg/g ou sa teneur en tanins
proanthocyaniques est supérieure à 0,5 mg/g.
Un tanin est reconnu issu de noix de galle lorsque sa teneur en acide digallique est
comprise entre 4 et 8 mg/g.
Un tanin est reconnu issu de bois exotiques lorsque son spectre met en évidence
un pic d’absorption entre 270 et 280 nm.
Un tanin est reconnu issu de chêne lorsque sa teneur en scoplolétine est
supérieure à 4 µg/g .
Un tanin est reconnu issu de châtaignier lorsque sa teneur en scopolétine est égale
ou inférieure à 4 µg/g et qu’il n’est pas identifié comme issu d’autre origine.
F-COEI-1-TANINS
9
Tanins œnologiques
ORIGINE BOTANIQUE
CONCLUSION
Mise en évidence de l’origine botanique des tanins par le dosage de
la teneur en flavanols totaux
L'absorbance doit être > 0,418 (D.O. du D.A.C.A.)
Si le test est négatif
Effectuer le dosage de l'acide digallique
Si la concentration en acide digallique
n'est pas comprise entre 4 et 8 mg/g
Mise en évidence des tanins de bois exotiques
par le spectre UV 250-300 nm
Si le test U.V. est négatif, différenciation du
tanin de chêne ou de chataîgnier
par le dosage de la scopolétine
Si la teneur en scopolétine
Si la teneur en scopolétine
< 4 µg/g
> 4 µg/g
C'est un tanin de châtaignier C'est un tanin de chêne
F-COEI-1-TANINS
Si le test est positif
Il s'agit d'un tanin de raisin
(voir Remarque 1)
Si la concentration en acide digallique
est comprise entre 4 et 8 mg/g
Il s'agit d'un tanin de noix de galle
Si le test U.V. est positif
on obtient deux types de profils
Si la teneur en acide
digallique  8 mg/g
C'est un tanin de tara
Si la teneur en acide
digallique < 8 mg/g
C'est un tanin de quebracho
(voir Remarque 2)
10
Tanins œnologiques
Remarque 1
Les tanins de raisin sont formés d'unités flavan-3-ol qui peuvent être libérées par le
clivage thiolytique des liaisons intermonomériques flavanoliques des
proanthocyanidols en milieu acide et à chaud. Les monomères libérés sont alors
séparés et dosés par HPLC. On peut ainsi quantifier séparément les procyanidols
des prodelphinidols. Cette méthode est utilisée pour la différentiation des tanins de
pellicules, de rafles et de pépins de raisin. Dans ces conditions, les tanins de
quebracho ne donnent aucun pic. (Voir méthode et figure ci-dessous).
Méthode de différenciations des tanins proanthocyanidiques par HPLC
Définition
Mise en évidence de tanins de quebracho, de pellicules et de pépins
Matériels et méthodes
Appareillage et conditions analytiques
- Pipette droite de 1 ml graduée en 0,05 ml
- Fiole jaugée de 10 ml
- Système HPLC
Il est équipé d’une pompe permettant un débit constant ou programmé avec une
grande précision, d’une boucle de 20 l.
Une colonne en phase inverse de type C18 dont le diamètre des particules peut
être par exemple de 10 μm de diamètre : Longueur : 250 mm ; Diamètre interne:
4,6 mm.
- Détecteur UV-Visible.
- Etuve
- Tubes à hydrolyse de 10 ml, fermeture avec bouchons téflonnés
- Filtres en esters de cellulose de 0,45 μm de diamètre de pores
- Système de filtration sous vide
- Pipette automatique de 1000 μl
- Balance au mg
Réactifs et solutions étalons
-
Méthanol pour HPLC
Eau distillée
Toluène-α-thiol (CAS 100-53-8) à 99%
Acide chlorhydrique (12M) à 37%
Acide orthophosphorique à 84
F-COEI-1-TANINS
11
Tanins œnologiques
Préparation des réactifs
-Préparation des solvants pour HPLC :
Solvant A : dans une fiole jaugée de 1 l, introduire 1 ml d’acide orthophosphorique
et compléter la fiole avec de l’eau distillée qui sera au préalable filtrée par un
système de filtration sous vide.
Solvant B : dans une fiole jaugée de 1 l, introduire 1 ml d’acide orthophosphorique
et compléter la fiole avec du méthanol qui sera au préalable filtré par un système
de filtration sous vide.
- Méthanol contenant 1,7% HCl : on introduit 140 μl d’acide chlorhydrique à l’aide
d’une pipette automatique de 1000 μl dans 10 ml de méthanol.
- Réactif de thioacidolyse = Solution de toluène-α-thiol à 5% : on introduit 470 μl
de toluène-α-thiol à l’aide d’une pipette automatique de 1000 μl dans 10 ml de la
solution.
- Tanins œnologiques (préparations commerciales)
- Solution de tanins à 1 g/l : on introduit 10 mg de tanins dans 10 ml de méthanol.
Mode opératoire
On introduit 0,5 ml d’une solution de tanins dans un tube à hydrolyse et 0,5 ml du
réactif de thioacidolyse (solution de toluène-α-thiol à 5%). Le mélange est agité et
chauffé à 60°C pendant 10 mn. Le tube est refroidi et on ajoute 0,5 ml d’eau
distillée.
L’échantillon est analysé par HPLC sur une colonne C18, phase inverse. Les éluants
utilisés sont les solvants A et B. Le programme d’élution est le suivant : de 70%
(pendant 5 mn) du solvant B à 10% en 40 mn, puis de 10 à 70% (pendant 5 mn)
en 10 mn (retour aux conditions initiales). Le débit de 1ml/mn est constant durant
toute la programmation et la longueur d’onde choisie est 280 nm.
L’identification des pics et leur quantification respective sont réalisées en accord
avec les données fournies par Vivas et al. (2004)*.
Tanins de pépins, pellicules et quebracho ont des profils différents. Les pépins sont
exclusivement composés de procyanidols, sont caractérisés par un fort degré de
galloylation, une grande quantité d’épicatéchine et un faible degré de
polymérisation moyen : mDP. Les pellicules sont caractérisées par un mélange de
procyanidols et prodelphinidols, avec une prédominance de procyanidols, un faible
degré de galloylation, une quantité importante d’épicatéchine et un mDP variable.
Le quebracho ne donne aucun flavan-3-ols. On peut ainsi déterminer la composition
en tanins proanthocyanidoliques.
* N. VIVAS, M.F. NONIER, N. VIVAS de GAULEJAC, C. ABSALON, A. BERTRAND, M. MIRABEL,
Differentiation of proanthocyanidin tannins from seeds, skins and stems of grapes (Vitis Vinifera) and
F-COEI-1-TANINS
12
Tanins œnologiques
heartwood of Quebracho (Schinopsis balansae) by MALDI-TOF/MS and thioacidolysis/LC/methods »,
Analytica Chimica Acta, 2004, 513, Issue 1, 247-256.
Remarque 2
L'origine botanique du tanin identifiée comme provenant du québracho est déduite
par éliminations successives. La caractérisation formelle de la présence de tanin de
québracho peut être effectuée par HPLC couplée à la spectrométrie de masse
(MALDI-TOF) qui montre que les constituants monomériques de ce tanin sont issus
du fisetinidol et du robinetinidol qui ne possèdent pas d'hydroxyle en position 5 sur
le noyau A (en d'autres termes les tanins de raisins sont formés à partir de
monomères qui possèdent un noyau A trihydroxylé ( phloroglucinol) alors que les
tanins de québracho sont formés à partir de monomères dont le noyau A est
dihydroxylé (résorcinol).
F-COEI-1-TANINS
13
Tanins œnologiques
R
*
8
Pellicules de raisin
2
3
9
7
1
5 6
4
9
8
Pépins de raisins
1 - Epigallocatechin
2 - Catechin
4
2
7
3
3 - Epicatechin
5
n
4 - Epicatéchine -3-O-gallate
5 - Catechin benzylthioether
R
I
*
6 - Epigallocatechin benzylthioether
Quebracho
7 - Catechin benzylthioether
II
8 - Epicatechin benzylthioether
Pas de réaction avec les procyanidols
9 - Epicatechin
- 3 - O - gallate benzylthioether
n
R
*-
Reagent residue
Fig 1 chromatogrammes obtenu par HPLC de proanthocyanidols de pellicules,
pépins de raisins et Quebracho, après thiolyse.
F-COEI-1-TANINS
14
Tanins œnologiques
ANNEXE 2
DIFFÉRENCIATION DES TANINS OENOLOGIQUES COMMERCIAUX
PAR
ANALYSE CG/SM DES MONOSACCHARIDES ET DES POLYOLS
1.
Introduction
Selon le codex oenologique international de l'O.I.V., les tanins
oenologiques devraient être extraits de noix de galle (de Quercus, tels
que galles d'Alep), de Tara, également appelé Caesalpina Spinosa, du
bois de chêne (quercus sp.), de pépins et pellicules de raisin (Vitis
vinifera) et du bois de certains arbres tels que le quebracho (Schinopsis
balansae) et le châtaignier (Castanea sp.).
2.
Domaine d'application
La méthode décrite permet de différencier des tanins oenologiques
commerciaux de différentes origines (galles végétales, pépins et
pellicules de raisin, bois de chêne, de châtaignier et de quebracho).
3.
Principe
La concentration de monosaccharides (arabinose, xylose, fructose et
glucose) et de polyols (arabitol, quercitol, pinitol, chiroinositol,
mucoinositol, scylloinositol et mesoinositol) dans des échantillons de
tanin a été déterminée par couplage chromatographie en phase
gazeuse/ spectrométrie de masse (CGSM) après leur dérivatisation
préalable en triméthylsilyléthers.
4.
Réactif et produits
Réactifs
Triméthylsilylimidazole (TMSI) pur à 97 %
Triméthylchlorosilane (TMCS)
Pyridine anhydre, pure à 99,5 %
Eau de grande pureté issue d'un système Milli-Q A10
Étalons
Phényle--glucoside (étalon interne) : 1 mg.mL-1 préparé dans du
méthanol à 70 %
Préparation des solutions étalons (de monosaccharides et de polyols)
F-COEI-1-TANINS
14
Tanins œnologiques
Les solutions étalons de glucose, fructose, arabinose, xylose, arabitol,
pinitol, myoinositol, scylloinositol, mucoinositol et chiroinositol ont été
dissoutes dans un mélange méthanol :eau (30:70) à des concentrations
variant entre 0,05 et 0,5 mg/mL de chaque étalon. Étant donné que le
quercitol et le bornesitol ne sont pas disponibles dans le commerce, des
extraits aqueux ont été préparés à partir de glands de chêne Quercus sp.
et de feuilles d'Echium vulgare. Les extraits ont été concentrés par
évaporation sous vide à basse température, silylés, puis injectés comme
indiqué ci-dessous. La teneur en hydrates de carbone (triple
détermination, RSD 5 %) est de 68 % de quercitol, 20 % de glucose et
18 % de fructose pour l'extrait de chêne, et 20 % de fructose, 33 % de
glucose, 27 % de bornesitol, 2 % de mesoinositol et 19 % de saccharose
pour l'extrait d'Echium.
Remarque : Les solutions étalons doivent de préférence être préparées
chaque jour et conservées dans un réfrigérateur avant injection. Les
échantillons doivent être dérivatisés et analysés dans la même journée.
5.
Échantillons
Vingt-huit échantillons de différents tanins commerciaux, parmi lesquels
des tanins de bois de chêne (O ; n=4), pépin de raisin (S ; n=6),
pellicule de raisin (H ; n=2), galles végétales (G ; n=6), châtaignier
(ch ; n=3), quebracho (Q ; n=3), gambier (GMB ; n=1) et mélanges de
raisin+quebracho (GQ ; n=1), quebracho+châtaignier+galle végétale
(QChG ; n=1) et châtaignier+quebracho (ChQ ; n=1), ont été achetés
directement sur le marché ou fournis par des fabricants.
6.
Appareillage
- Hotte de laboratoire
- Verrerie de laboratoire : béchers, récipients, etc.
- Micropipettes
- Évaporateur rotatif
- Vortex
- Broyeur
- Centrifugeuse
- Chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation
de flamme (DIF) - Chromatographe en phase gazeuse couplé àun
détecteur à spectrométrie de masse opérant en mode impact
électronique à 70 eV. Les données MS sont enregistrées de 40 à 700
m/z.
- colonne en silice fondue de 25 m X 0,25 mm de diamètre intérieur X
0,25 d'épaisseur de film, enduite de méthylsilicone réticulé.
F-COEI-1-TANINS
15
Tanins œnologiques
7.
Mode opératoire
Procédure de dérivatisation
50 mg de tanins sont dissous dans 5 mL d'eau désionisée et filtrée à
l'aide d'un papier filtre Whatman n° 1 ou équivalent. L'étalon interne est
obtenu en mélangeant 1 mL d'échantillon et 1 mL de phényle-glucoside. Le mélange est concentré par évaporation sous vide et des
dérivés triméthylsilylés sont obtenus par ajout de 100 L de pyridine
anhydre, 100 L de TMSI et de 100µL de TMCS, en agitant après chaque
ajout. L'extraction des dérivés triméthylsilylés (TMS) est effectuée avec
100 µL d'hexane et 200 µL d'eau..
Analyse par chromatographie gazeuse
1µL de la couche supérieure d'hexane est injecté sur le chromatographe
en phase gazeuse. L'identité de chaque composé est confirmée par
comparaison de leurs temps de rétention et spectres de masse, obtenus
par CGSM, avec ceux des étalons. Le profil chromatographique type de
chaque origine de tanin est illustré en Figure 1.
Analyse par CG-DIF.- conditions chromatographiques
Les injections sont faites en mode "splitless" Température de
l'injecteur et du détecteur : 300 ºC. La température du four est
maintenue à 100 ºC pendant 1 minute, programmée à 200 ºC
moyennant une vitesse de chauffage de 30 ºC.min-1 et maintenue
pendant 15 minutes, et finalement programmée à 270 ºC à 15 ºC
min-1 et maintenue pendant 20 minutes. Le gaz vecteur est
l’azote..
Analyse CGSM. conditions chromatographiques - Chromatographe
en phase gazeuse couplé à un détecteur de masse quadripolaire
(HP 6890 ou similaire) fonctionnant en mode impact électronique (IE) à
70 eV. Les données SM ont été enregistrées de 40 à 700 m/z.
- Conditions chromatographiques :
Les injections sont faites en mode splitless. L'injecteur est à
300 ºC et la température du four est maintenue à 100 ºC
pendant 1 minute, puis programmée à 200 ºC moyennant une
vitesse de chauffage de 30 ºC min-1 et maintenue pendant 15
minutes, et finalement programmée à 270 ºC à 15 ºC min-1 et
F-COEI-1-TANINS
16
Tanins œnologiques
maintenue pendant 20 minutes. Le gaz vecteur est de l'hélium à
1 mL min-1.
8.
Calcul (Résultats)
L'analyse quantitative est effectuée à l'aide du facteur de réponse (FR)
de chaque étalon par rapport au phényle-β-D-glucoside (étalon interne)
sur la plage attendue. La reproductibilité de la méthode est évaluée par
analyse d'un échantillon sur cinq jours différents. Néanmoins, cette
méthode ne permet pas de distinguer les tanins de quebracho des tanins
de pellicule de raisins. Les limites de détection (LD) et de quantification
(LQ) (Tableaux 1 et 2) sont calculées pour chaque composé selon la
méthode de Foley et Dorsey (1984). Des valeurs moyennes de 0,42 ng
et 1,41 ng injectés ont été respectivement obtenues pour la LD et la LQ.
Les concentrations des polyols et des monosaccharides dans les tanins
analysés sont présentées respectivement dans les tableaux 3 et 4.
Cette méthode permet de classifier les tanins selon le schéma proposé
en Figure 2. Le quercitol révèle la présence de tanins de bois de chêne,
tandis que le pinitol est principalement un indicateur de tanins issus de
galles de tara et le bornesitol de tanins du gambier. L'absence
d'arabinose et de xylose dans les tanins de galles peut également aider
à la caractérisation de ces échantillons. Par conséquent, le bornesitol, le
quercitol, le pinitol, l'arabinose et le xylose pourraient être utilisés pour
différencier ces produits avec certitude, et pour distinguer en outre ces
tanins du reste des produits analysés. Les tanins de galles et de raisin
peuvent être facilement différenciés de ceux d'autres origines en raison
de l'absence d'arabinose et de xylose dans leur composition en
monosaccharide. En ce qui concerne les échantillons de tanin de raisin,
du fructose a pu être observé dans les tanins de pépins de raisin, mais
pas les tanins de pellicule de raisin. La présence de mucoinositol et de
chiroinositol pourrait être utile pour distinguer les tanins de châtaignier
de ceux du quebracho ou de pellicule de raisin.
9. Bibliographie
Carlavilla, C., Villamiel, M., Martínez-Castro, I., Moreno-Arribas, M.V.
Occurrence and significance of quercitol and other inositols in wines
during oak wood aging. Am. J. Enol. Vitic. 2006, 57, 468-473
F-COEI-1-TANINS
17
Tanins œnologiques
Foley, J.P.; Dorsey, J.G. Clarification of the limit of detection in
chromatography. Chromatographia, 1984, 18, 503-511
Sanz L., Martínez-Castro I., Moreno–Arribas, M.V. Identification of the
origin of commercial enological tannins by the analysis of
monosaccharides and polyalcohols. Food Chem., 2008, 111, 778-783
F-COEI-1-TANINS
18
Tanins œnologiques
Tableau 1. Répétabilité de la méthode de chromatographie gazeuse
pour la détermination des hydrates de carbone dans les tanins
(échantillon Q3).
Valeur moyenne
Écart type
Xylose
0,17
0,01
Arabinose
0,43
0,03
Arabitol
0,04
0,00
Quercitol
0,00
0,00
Fructose
0,32
0,04
Glucose
0,60
0,02
Mucoinositol
0,02
0,00
Chiroinositol
0,00
0,00
Scylloinositol
0,00
0,00
Mesoinositol
0,05
0,00
Tableau 2. Limites de détection (LD) et de quantification (LQ) de la
méthode de détermination des hydrates de carbone et polyols dans les
échantillons de tanins œnologiques par chromatographie gazeuse
(exprimées en ng injectés)
LD (ng)
LQ (ng)
Xylose
0,50
1,66
Arabinose
0,66
2,21
Arabitol
0,21
0,70
Fructose
1,11
3,70
Glucose
0,51
1,70
Mucoinositol
0,16
0,52
Chiroinositol
0,22
0,74
Scylloinositol
0,20
0,68
Mesoinositol
0,24
0,80
F-COEI-1-TANINS
19
Tanins œnologiques
COEI-1-TANINS : 2009
Tableau 3. Concentration des polyols (mg/100g), tr=traces dans les tanins commerciaux
Bois de chêne
O1
O2
O3
O4
Galles végétales
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Pépin de raisin
S1
S2
S3
S4
S5
S6
Pellicule de raisin
H1
H2
Châtaignier
Ch1
Ch2
Ch3
Quebracho
Q1
Q2
Q3
Gambier
GMB
Raisin+quebracho
GQ
Quebracho+Châtaignier+galle QChG
Châtaignier+quebracho
ChQ
F-COEI-1-TANINS
Arabitol
0.06
0.06
0.05
0.09
0.64
0.08
0.04
0.07
tr
0.02
0.03
0.01
0.10
0.03
0.05
Quercitol
6.92
4.49
1.57
3.14
0.03
0.06
0.05
-
Pinitol
0.73
0.26
0.07
0.06
1.35
0.49
0.09
tr
0.19
0.19
-
Bornesitol Mucoinositol
0.10
0.11
0.04
0.14
0.14
0.03
0.19
0.02
0.02
0.02
0.03
0.13
Chiroinositol Scylloinositol Mesoinositol
0.10
0.52
0.49
0.11
0.57
0.55
0.02
0.13
0.12
0.17
0.17
0.30
tr*
0.03
tr
0.04
0.02
tr
0.16
tr
0.01
0.38
2.34
tr
0.01
0.01
tr
0.25
tr
0.55
0.62
0.33
0.05
0.52
0.49
0.01
tr
0.05
0.03
0.06
0.07
0.12
0.12
0.56
0.53
20
Tanins œnologiques
mg/100g
Xylose
Arabinose
Fructose
Glucose
Bois de chêne
O1
O2
O3
O4
0.29
0.57
0.37
0.41
1.18
2.53
0.85
1.84
0.12
1.82
0.22
0.07
0.58
2.69
Galles végétales
G1
G2
G3
G4
G5
G6
-
-
0.26
0.07
0.05
0.11
0.50
-
0.42
0.17
0.05
0.16
0.63
-
Pépin de raisin
S1
S2
S3
S4
S5
S6
0.13
-
-
10.01
0.64
45.23
0.61
1.22
9.59
0.50
32.46
0.46
0.03
tr
Pellicule de raisin
H1
H2
0.31
0.48
0.30
0.07
0.67
Châtaignier
Ch1
Ch2
Ch3
0.50
0.41
0.65
1.46
1.04
1.55
1.15
0.95
0.28
0.78
0.91
0.69
Quebracho
Q1
Q2
Q3
0.30
0.07
0.16
0.44
0.10
0.42
0.22
0.05
0.32
0.20
0.10
0.59
Gambier
Raisin+quebracho
GMB
GQ
QChG
0.02
0.07
0.04
0.11
0.07
0.42
0.25
0.17
0.12
0.28
0.30
ChQ
0.29
1.29
1.34
1.46
Quebracho+ Châtaignier
+galle
Châtaignier+quebracho
Tr=traces
F-COEI-1-TANINS
21
Tanins œnologiques
Abondance
Abundance
A
1
80000000
13
4
14
70000000
60000000
50000000
12
40000000
30000000
20000000
10000000
0
2
3 3
10
7 9 7
10
20
30
Abondance
Abundance
min
B
13
14
8000000
6
6000000
8
4000000
2000000
7
5
7
0
10
20
30
min
Figure 1. Profils chromatographiques en phase gazeuse des polyols et des hydrates
de carbone présents dans des tanins commerciaux de A) bois de chêne, B) galle
végétale, C) bois de châtaignier, D) pépin, de raisin, E) pellicule de raisin, F) bois de
quebracho, G) gambier. 1-arabinose, 2-arabitol, 3-xylose, 4-quercitol, 5-fructose, 6pinitol, 7-glucose, 8-acide gallique, 9 Mucoinositol, 10 Chiroinositol, 11-Bornesitol,
12- Scylloinositol, 13- Mesoinositol, 14-Phényle- -D-glucoside (étalon interne).
F-COEI-1-TANINS
22
Tanins œnologiques
Figure 1. suite
Abondance
Abundance
C
11
10
10
12000000
12000000
12
13
Chestnut
C
5
10000000
10000000
7
Abundance
8000000
8000000
13
14
8
8
7
2
6000000
6000000
4000000
4000000
2000000
2000000
9
3 3
0
10
20
min
30
min
Abondance
Abundance
D
12000000
14
Seed grape
D
10000000
7
8000000
5
6000000
7
4000000
2000000
13
0
10
F-COEI-1-TANINS
20
30
min
23
Tanins œnologiques
Figure 1. suite
Abondance
Abundanc
E
14
60000
50000
40000
30000
7
7
20000
10000
0
10
Abondance
Abundanc
20
30
mi
F
1
14
1100000
9000000
7000000
5000000
3000000
3
7
3
7
5
1000000
10
1
20
30
min
F-COEI-1-TANINS
24
Tanins œnologiques
Figure 1. suite
Abundance
Aoondance
G
13
2000000
1500000
5
7
1000000
50000
3
0
10
1
7
11
2
30
mi
F-COEI-1-TANINS
25
Tanins œnologiques
F-COEI-1-TANINS
26

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