(MUSST, DPRA et Génétoxicité) des extraits de

Partage d'expérience technique
sur l'évaluation in vitro (MUSST,
DPRA et Genotoxicité) des
extraits de plantes
Toulouse – 29 et 30 Novembre 2012 - Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
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Evaluation in vitro des extraits de plantes
 La Caractérisation du produit à tester
 La formulation pour les tests in vitro
 Solubilité et Sélection du véhicule
 La dose maximum requise
 Stratégie d'évaluation en génotoxicité
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Obtention d'un extrait de plante
Parties de la plante
Bulbe
Feuilles
Rameaux feuillés
Parties aériennes ou souterraines
Tiges
Méthodes
Infusion
Décoction
Extraction
Conditions d'extraction
Véhicule d'extraction (Aqueux, alcoolique, hydro-alcoolique,
CO2 hypercritique)
Ratio plante/véhicule
Température
Durée
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Mélange complexe
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Caractérisation du produit à tester
(Requis réglementaire)
Dénomination de l'extrait pour l'étude (Processus mis en
place à Ricerca Biosciences, SAS afin de distinguer les études entre-elles)
Extrait sec aqueux: ESA Plante 999
Extrait sec hydro-alcoolique: ESHA Plante 999
Extrait fluide: EF Plante 999
Huile Essentielle: HE Plante 999
Teinture mère: TM Plante 999
Certificat/Bulletin d'Analyse (Documentation
Analytique)
Dénomination du produit (cohérence documentaire)
Pureté et/ou concentration
Date de péremption et/ou de re-test
Conditions de stockage de l'échantillons à tester
Environnement Qualité du contrôle (GLP, GMP, ISO, Procédures, …)
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Contaminations (bactériologique ou fongique)
Impacts
Compromettre la réalisation du test (arrêt croissance ou mort cellulaire)
Interférer avec la réponse du Test System (Ames) et compromettre la
fiabilité des résultats
Alternatives
Irradiation gamma
Véhicule DMSO (bactériostatique)
Méthode d'extraction (supercritical carbon dioxide)
Modification des procédés de fabrication, nouveau lot……
Stérilisation à la chaleur (humide ou sèche): stabilité des composés ?
Filtration: nécessité de valider que le système utilisé ne modifie pas la
composition du produit à évaluer (adsorption sur le membrane de
filtration) ? Quel(s) marqueur(s) ?
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Formulations
Véhicule / Limite de solubilité
Genotoxicité: Eau, DMSO,
(éthanol max.: 25 µL/boite en Ames, 0.5% (v/v) en MLA)
MUSST: Eau, DMSO et RPMI (strict)
DPRA: Acétonitrile, Eau
Meilleure solubilité possible permettant d'atteindre
la dose maximum requise:
Genotoxicité:
- Ames: 50 mg/mL dans le DMSO (ou 10 mg/mL dans Eau)
- MLA: 500 mg/mL dans le DMSO (ou 200 mg/mL dans Eau)
MUSST: 20 mg/mL (Eau), 50 mg/ml (DMSO) et 0.4 mg/mL (RPMI)
DPRA: 0.1 mM
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Formulations
Stabilité/compatibilité de l'extrait dans le véhicule
Étude de stabilité dans les conditions du test (véhicule,
température, durée): généralement 24h à température
ambiante dans le véhicule
Analyse des formulations
Non requise par les BPL OCDE pour les études courtes
avec formulations extemporanées.
Demandée par les BPL Française et FDA.
 Quel est le(s) traceur(s) répondant le mieux à ces requis ?
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Toulouse 29 et 30 Novembre 2012 – Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
Solubilité et Sélection du véhicule: exemple dans le MUSST
Compound
120264
RPMI
0.4 mg/mL
No soluble
(cloudy pink
solution)
Water
20 mg/mL
DMSO
50 mg/mL
No soluble
(Droplets)
Soluble
Viabilité et Induction CD86
Induction CD86
Viabilité
300
250
%
200
150
Fortement positif en LLNA
100
50
0
0
50
100
150
200
250
Dose (µg/mL)
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Toulouse 29 et 30 Novembre 2012 – Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
Solubilité et Sélection du véhicule: exemple dans le MUSST
Induction CD86 (MUSST)
DMSO
RPMI
Eau
Eau
300
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
250
200
%
%
Viabilité (MUSST)
DMSO
RPMI
150
100
50
0
0
50
100
150
200
250
0
Dose (µg/mL)
50
100
150
200
Dose (µg/mL)
10
Toulouse 29 et 30 Novembre 2012 – Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
250
Dose maximum requise: exemple dans le DPRA
Ratio Cysteine/Produit: 0.5 mM/5 mM
Ratio Lysine/Produit: 0.5 mM/25 mM
PM (par défaut) = 400 g/mol
 Quel est le Poids Moléculaire de cet extrait ?
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Toulouse 29 et 30 Novembre 2012 – Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
Dose maximum requise: exemple dans le DPRA
Conditions tested
Cysteine peptide
Test A (Standard)
2 mg/mL in 0.5 mM Cysteine (10:1)
10 mg/mL in 0.5 mM Lysine (50:1)
16.2% (± 3.29%)
Minimal
reactivity
Moderate
reactivity
0%
Low
reactivity
25%
Lysine peptide
1.4%
(± 0.31%)
MEAN
(Cys. pep.&Lys. Pep)
> 8.8%
Category
Minimal reactivity
Hight
reactivity
50%
75%
100%
Fortement positif en LLNA
Inducteur de CD86 in vitro
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Toulouse 29 et 30 Novembre 2012 – Michel Aujoulat – Laboratory of Biological Evaluation
Dose maximum requise: exemple dans le DPRA
Conditions tested
Cysteine peptide
Test A (Standard)
2 mg/mL in 0.5 mM Cysteine (10:1)
16.2% (± 3.29%)
10 mg/mL in 0.5 mM Lysine (50:1)
Test B
20 mg/mL in 0.5 mM Cysteine (100:1) 70.4% (± 3.74%)
100 mg/mL in 0.5 mM Lysine (500:1)
Test C
50 mg/mL in 0.5 mM Cysteine (250:1) 82.0% (± 0.27%)
250 mg/mL in 0.5 mM Lysine (1250:1)
Lysine peptide
MEAN
(Cys. pep.&Lys. Pep)
Category
1.4%
(± 0.31%)
> 8.8%
Minimal reactivity
16.9%
(± 29.28%)
> 43.6%
High reactivity
41.2%
(± 12.88%)
> 61.6%
High reactivity
Déplétion en fonction de la concentration du milieu réactif
Cysteine
Lysine
90%
80%
% Déplétion
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
50
100
150
200
Concentration Extrait (mg/mL)
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250
300
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Génotoxicité: stratégie d'évaluation
Domaine d'utilisation des extraits de plante
Phytothérapie
Cosmétique
Alimentaire
Guidelines
EMA: Ames → MLA → Micronoyau in vivo
EFSA: Ames → Micronoyau in vitro → Micronoyau in vivo
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Génotoxicité: stratégie d'évaluation
5 produits soumis à Ames + MLA
Ames (-) Ames (+)
Test d'Ames
% Negatifs
65.0%
MLA (-)
2
0
% Positifs ou Equivoques
35.0%
MLA (+)
1
2
Clastogène/Aneugène ?
Evaluer les 3 end-points de génotoxicité: mutagène, clastogène et aneugène:
- Ames: mutagène (bactéries)
- Micronoyau vitro: Clasto/Aneu-gène (cellules de mammifère)
- MLA: mutagène, Clasto/Aneu-gène (cellules de mammifère)
Propriété antiseptique de certains extraits de plantes
Le MLA ne serait-il pas le test de première intention plus pertinent pour les
extraits de plante ?
- Mutagène sur cellules de mammifères
- Clastogène/Aneugène
- Effet antiseptique limité
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Conclusion
Caractérisation
Dénomination de l'extrait en lien avec la méthode d'obtention: définir une
nomenclature ?
Certificat/bulletin d'analyse (descriptif méthode d'extraction ?)
Contenu en extrait "pur" (présence de support)
Stabilité dans le véhicule sélectionné
Pertinence des analyses de formulations ?
Choix du véhicule et dose maximum testée
Maximaliser la dose à la limite de la cytotoxicité ou à la limite technique du test
(utilisation de "suspensions" ?) afin de garantir une évaluation de l'ensemble
des composés connus et inconnus d'un extrait ?
Pertinence de commencer l'évaluation de la génotoxicité par un test MLA
plutôt qu'un Ames afin d'avoir une évaluation des 3 end-points de danger
(mutagène, clastogène et aneugène) sur cellules de mammifère ?
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