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LES THROMBINE-LIKE, SERINE-PROTEASES PRESENTES
DANS LES VENINS DU GENRE CERASTES
(CERASTES CERASTES ET CERASTES VIPERA)
N.MARRAKCHI1,2 et M.EL AYEB1
1
2
Laboratoire des Venins et Toxines Institut Pasteur de Tunis. 13, Place Pasteur, 1002 Tunis.
Faculté de Médecine de Tunis. 9 Rue Professeur Zouheir Essafi Tunis.
RESUME
ABSTRACT
Les venins des vipères Cerastes cerastes et Cerastes vipera sont riches en protéines de type thrombine (protéases à sérine). Plusieurs protéines ont été isolées,
purifiées et caractérisées à partir de ces venins. Ces
protéines agissent sur la cascade de la coagulation
sanguine et sur le fonctionnement plaquettaire.
Mots clé: protéases à sérine, coagulation, agrégation plaquettaire, venin.
Cerastes cerastes and Cerastes vipera snake venoms
are rich of thrombin-like, serine-protease polypeptides.
Many proteins have been isolated, purified and characterized from these vipers. These proteins act in various way on blood coagulation pathway and platelet
function.
Key words: serine-protease, coagulation, platelet
aggregation, venom
INTRODUCTION
La thrombine, protéase à sérine glycosylée, joue un
rôle central dans l'hémostase. Elle transforme le fibrinogène en fibrine 1, interagit avec les plaquettes sanguines en entraînant leur agrégation, la libération des
constituants de leurs granules et la rétraction du clou
plaquettaire 2, 3. Elle active le facteur XIII ainsi que les
facteurs V, VII, VIII et XI .
Elle est capable de moduler sa propre production en
activant un système physiologique d'inhibition de la
coagulation en se liant au système protéine C/protéine S et à la thrombomoduline (Figure 1)4.
La plurifonctionnalité de la thrombine est portée par
des domaines structuraux individualisés, lui permettant
d'interagir avec des protéines plasmatiques ou membranaires et de se positionner de façon idéale pour une
protéolyse efficace et sélective de la protéine considérée5.
Les venins de serpents en particulier ceux des Crotalidae et des Viperidae sont riches en enzymes capables
de reproduire certaines fonctions de la thrombine.
Plusieurs articles de synthèse décrivent les protéines de
venins de serpents qui interfèrent avec les mécanismes
de la coagulation sanguine6, 7, 8, 9, 10. Certains venins
contiennent des pro et/ou des anticoagulants et des pro
et/ou des anti-agrégants6, 7, 8, 9, 10.
L'activité procoagulante des venins est due à la
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présence d'enzymes capables de coaguler le fibrinogène: et "les thrombines-like", telles que l'ancrod 11, 12, et la batroxobine 13, 14, 15.Ces différentes
protéines présentent des masses moléculaires de
l'ordre de 30 kDa et leurs séquences ont des homologies avec celle de la Thrombine. Ce sont des
estérases, qui peuvent être bloquées sélectivement
par des inhibiteurs spécifiques des sérines protéases. Ces protéases peuvent avoir des fonctions
variées. Certaines activent l'agrégation des plaquettes sanguines c'est le cas de la thrombocytine16,17.
D'autres jouent un rôle d'anticoagulant c'est le cas de
l'ancrod (l'arvin). Elle hydrolyse très rapidement et
très spécifiquement le fibrinogène sans provoquer de
thrombose et de ce fait, elle est très largement employée comme anticoagulant 15.
Dans cette revue nous nous intéressons particulièrement aux protéines du type thrombine, protéases
à sérine, isolées à partir des venins de serpents du
genre Cerastes.
Ce genre est représenté en Tunisie par deux espèces
Cerastes cerastes (vipère à cornes) et Cerastes vipera (vipère de désert). Elles colonisent les régions sahariennes
et subsahariennes de la Tunisie. Ces deux vipères sont
aussi présentes en Afrique du Nord et au Moyen Orient.
3
LES THROMBINE-LIKE, SERINE-PROTEASES PRESENTES DANS LES VENINS DU GENRE CERASTES
Figure 1 : Autorégulation de la production de la thrombine (T), produite au terme d’une série de réactions enzymatiques, qui se déroulent à la surface du vaisseau puis à la surface des plaquettees activées, est libérée dans
la circulation ou elle va amplifier sa formation. Elle se fixe sur son récepteur plaquettaire, stimulant les plaquettes
circulantes, qui vont fournir une nouvelle surface catalytique pour l’activation des protéines de la coagulation .
A l’inverse elle limite sa propre formation, en se fixant sur une protéine de la membrane endotbélialen la
tbrombomoduline (IM) . LaTM modifie la spécificité de la tbrombine lui faisant perdre ses propriétés procoagulantes et la transformant en activateur de la protéine C (PC). La protéine C activée (PCa), en présence de son
cofacteur de la protéine S(PS) va alors dégrader le facteur Va et VIIIa, ralentissant ainsi la production de la tbrombine. FT : Facteur tissulaire.
1- LA PROTEINASE RP 34
2 - L'AFAACYTINE
Cette protéine a été isolée et purifiée à partir du
venin de Cerastes cerastes par Laraba-Djebari et al.
199218. La protéinase RP 34 appartient à la famille des
sérines protéases et elle présente des activités du
type thrombine. C'est une protéine acide {point isoélectrique (pHi) est de 3,75}, constituée par deux
sous unités identiques ayant une masse moléculaire,
déterminée par élèctrophorèse sur gel de polyacrymide dans des conditions dénaturantes, de l'ordre de
48,5 kilodaltons (kDa).
Les 33 premiers résidus du côté de l'extrémité N-terminale (Figure 2) montre une forte similitude avec les
séquences d'autres sérines protéases des venins de
serpents. La protéinase RP 34 est fortement inhibée
par le diisoflurophosphate (DFP). Elle est douée d 'activité estérasique et amidasique car elle catalyse l'hydrolyse des substrats synthétiques chromogéniques
comme le Nαtosyl-L-Arginine méthyl ester (TAME), la
Nαbenzoyl-L-Arginine-p-nitroanilide (BAEE).
La valeur de la constante de Michaelis (Km), déterminée avec la BAEE comme substrat est de l'ordre de
3 x 10-4 M. La protéine RP 34 n'est pas agrégante.
C'est une glycoprotéine qui a été isolée et purifiée à
partir du venin de Cerastes cerastes par Fatima-Laraba et al.19. L'afaâcytine a un point isoélectrique de
6,25 et elle est constituée de deux sous unités α et
ß. Les deux chaines α et ß ont la même masse moléculaire (40 kDa). L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate
(SDS) et en présence de ß-mercaptoéthanol a montré que les masses moléculaires apparentes respectives de chaque chaîne est de 43 kDa pour la chaîne
α alors que la chaîne ß est séparée en ß (35,5 kDa)
et ß' (10,2 kD)19,20. Les deux chaine α et ß sont N-glycosylées. Les vingt premiers acides aminés de l'extrémité N-terminale de la chaine et α et ß sont identiques. Ils présentent une similitude avec la
thrombine et d'autres sérines protéases présentes
dans différents venins.
L'afaâcytine convertit le fibrinogène en fibrine en
hydrolysant la chaîne Aα et Bß du fibrinogène. Elle
est également douée d'une activité amidasique et
estérasique. Cette dernière est inhibée par le DFP indiquant qu'il s'agit d'une sérine protéase. L'afaâcytine
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N.MARRAKCHI et M. EL AYEB
diffère de la thrombine car elle est insensible à l'action de l'héparine et l'hirudine en présence d'antithrombine III. L'afaâcytine fait raccourcir le temps de
formation d'un caillot de plasma normal et de plasmas déficients en facteur XII, XI, IX ou VIII et active
aussi le facteur X humain purifié. Cette sérine protéase n'induit que l'agrégation des plaquettes humaines. Cette agrégation est accompagnée par la libération de la sérotonine. Il semble que la voie de
la cyclooxygénase n'est pas impliquée car l'agrégation induite par l'afaâcytine n'est pas inhibée par
l'aspirine. En revanche, l'apyrase qui inhibe la
conversion de l'adénosine diphosphate (ADP) en
l'adénosine monophosphate (AMP), bloque l'activité proagrégante de l'afaâcytine. Elle pourrait donc
agir par la voie de l'ADP.
3 - LA PROTEINE PROAGREGANTE DE
CERASTES CERASTES
Cette protéine proagrégante a été isolée et purifiée à
partir du venin de Cerastes cerastes par Basheer et
al.21,22. Elle a une masse moléculaire apparente de
l'ordre de 62 kDa. Sa structure est formée par un dimère de 29 et 30,5 Kda de masse moléculaire. Les 15
premiers amino-acides séquencés sont identiques
pour les deux sous unités. C'est une protéine basique
ayant un point isoélectrique de l'ordre de 9 à 9,5.
Elle présente une puissante activité proagrégante. En
effet, 0,1 µg/ml de la protéine entraine une agrégation de 80 %. Cette agrégation est inhibée par le
phényl méthyl sulfonyl fluoride (PMSF), la leupeptine, l'iodoacétamide, l'inhibiteur de la protéine C,
l'inhibiteur de la phosphatase, l'ATP et la prostaglandine E2 (PGE2). En revanche, elle n'est pas inhibée par l'acide salicylique, les inhibiteurs de la
voie de l'ADP, l'inhibiteur de la protéine kinase A et
l'hirudine. L'agrégation induite par cette protéine
est partiellement inhibée par des anticorps monoclonaux anti- GlycoprotéineIb (GPIb) et anti-récepteur de la thrombine.
Cette protéine appartient à la famille des protéases
à sérine car ses activités proagrégante et estérasique
sont complètement inhibées par le PMSF. Cette sérine protéase est faiblement coagulante et elle possède une activité fibrinogénase.
4 - LA CERASTOCYTINE
C'est une protéine basique qui a un point isoélectrique supérieur à 9. Sa masse moléculaire est de
l'ordre de 38 kDa. Elle a une structure monomérique. Les cinquantes premiers résidus de l'extrémité
N-terminale (Figure 2) ont une forte similitude avec
ceux des thrombines-like isolées des venins des serpents ainsi que ceux de la thrombine.
La cérastocytine est capable d'induire une agrégation
plaquettaire avec une dose de demi effet de l'ordre
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de 3 nM23. Elle est également capable d'entraîner une
sécrétion d'ATP et de phospholipase A2 à partir des
granules denses plaquettaires. Elle est également
douée d'activité amidolytique, estérasique et fibrinogénolytique.
Les activités amidolytique et agrégante de la cérastocytine sont inhibées par le PMSF, le N-α-p-tosyl-LPhénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK), le Nαptosyl-L-Lysine chlorométhyl cétone (TLCK) et les
inhibiteurs de la trypsine suggérant ainsi qu'il s'agit
d'une protéase à sérine.
L'agrégation induite par la cérastocytine est bloquée
par les inhibiteurs de la thrombine (Chlorpromazine,
mépacrine théophylline...) ou de l'ADP (AMP, créatine-phosphate/créatine phosphokinase). Elle agirait
donc comme la thrombine tout en induisant la libération de l'ADP, ou bien elle agirait directement
comme l'ADP. L'utilisation des plaquettes lavées de
lapin, stimulées à la thrombine, puis désagrégées
par la prostacycline I2 montre que l'effet proagrégant de la cérastocytine est inhibé. Ce résultat est en
faveur de la première hypothèse. Les anticorps monoclonaux anti-glycoprotéine IIbIIIa (GPIIb-IIIa)
(bloquant spécifiquement le récepteur du fibrinogène) et anti GPIb (bloquant spécifiquement le récepteur de la thrombine) empêchent l'agrégation induite par la cérastocytine23.
5 - LA CERASTOTINE
C'est une glycoprotéine qui a été isolée à partir du venin de Cerastes cerastes24. Elle a une masse moléculaire de 40 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de
6,6. Son extrémité N-terminale est similaire à la cérastocytine (cinq acides aminés différents sur les cinquante premiers résidus séquencés) (Figure 2). Il
s'agit d'une protéase à sérine douée d'activités coagulante, estérasique, amidolytique et fibrinogénolytique. La cérastotine n'est capable d'induire une agrégation plaquettaire qu'en présence du fibrinogène.
Elle agit donc par un mécanisme différent de celui de
la cérastocytine et de celui de la thrombine. En effet
des anticorps monoclonaux anti-GPIIbIIIa (LJCP8 et
P2) et des anticorps monoclonaux anti-GPIb (LJIb10)
qui inhibent spécifiquement l'action proagrégante de
la thrombine, n'ont aucun effet sur l'activité proagrégante fibrinogène dépendante de la cérastotine. En revanche des anticorps monoclonaux (SZ2) spécifique
de la liaison facteur Von Willebrand/GPIb en présence de ristocétine, inhibent l'effet proagrégant de la
cérastotine mais n'ont pas d'effet sur l'activité proagrégante de la cérastocytine. Ce résultat suggère que
la cérastotine pourrait agir par le biais de la GPIb
mais au niveau d'un ou plusieurs site(s) différent(s) de
celui de la thrombine. L'utilisation des plaquettes traitées au paraformaldhéyde montre que la cérastotine
est agglutinante en présence du fibrinogène et du
5
LES THROMBINE-LIKE, SERINE-PROTEASES PRESENTES DANS LES VENINS DU GENRE CERASTES
facteur Von Willebrand. Des plaquettes stimulées à la
thrombine puis désagrégées par la prostacycline I2
agrègent en présence de la cérastotine. Ce résultat est
en accord avec ceux obtenus avec les anticorps. En
effet la cérastotine pourrait donc se fixer sur des sites
différents de ceux de la thrombine24.
Etant donné que la cérastotine est agrégante et agglutinante, elle peut donc avoir des propriétés pharmacologiques intéressantes. En effet elle pourrait être
utiliser dans les traitements de thrombopénie (maladie de Glanzmann caractérisée par un déficit en récepteurs de l'agrégation plaquettaire: la GPIIbIIIa).
6 - LA CERASTOBINE
C'est une enzyme du type thrombine. Elle a été isolée et purifiée jusqu'à l'homogénéité à partir du venin de Cerastes vipera par Farid et al. 25. Sa structure
est monomérique et elle est composée de 348 acides
aminés. Elle a un poids moléculaire de 38 kDa et son
point isoélectrique est de 7,7. La cérastobine hydrolyse des substrats contenant l'arginine comme le
TAME, le BAME et la BAEE mais elle n'a pas d'effet
sur le Nαbenzoyl-D-Arginine-p-nitroanilide
(BAPNA). La cérastobine induit l'agrégation des plaquettes sanguines. Cette enzyme permet la for-
24
23
25
18
27
28
15
29
12
30
Figure 2: Comparaison de séquences des fragments N-terminaux de quelques protéases à sérine isolées à partir de différents
venins avec celles de la thrombine humaine.La lettre X indique que le résidu aminoacide est indéfini
6
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N.MARRAKCHI et M. EL AYEB
mation de la fibrine à partir du fibrinogène et hydrolyse également les substrats chromogéniques de
la thrombine tel que le H-D-phe-Pip-Arg-p-nitroanilide (S2238). La cérastobine possède également
une activité de type kallikréine. Elle libère le bradykinine à partir du bradykininogène.
7 - LA VIPERABINE
Elle est purifiéé à partir du venin de Cerastes vipera par
El Asmar et al.26. C'est une protéine acide (pHi = 4,9),
ayant un poids moléculaire de 32 kDa. Elle n'est pas
douée d'activité esterasique et n'hydrolyse pas l'albumine ou la caséine. Elle transforme le fibrinogène en fibrine. Elle possède une activité amidolytique. En effet
elle hydrolyse le substrat CBS 34-47. Elle raccourcit le
temps de coagulation du plasma normal et déficient en
facteurs II, V, VII, VIII,XI, XI, XII ou XIII. Son activité du
type thrombine est inhibée par le DFP. Il s'agit donc
d'une sérine-protéiase. Elle active faiblement les plaquettes sanguines.
CONCLUSION ET PERSPECTIVE
La toxicité du venin des Viperides est difficile à corréler
avec les diverses activités enzymatiques de leurs composés. Certains de ces composés peuvent agir en synergie ou
au contraire ont des effets opposés. Plusieurs protéines ont
été isolées à partir des venins de Cerastes cerastes et de Cerastes vipera. Certaines d'entre elles sont capables d'interagir avec des étapes de la cascade de la coagulation sanguine et avec le fonctionnement plaquettaire. Ces protéases
à sérine, du type thrombine peuvent être des outils dans
le traitement des maladies thrombotiques et contribuer à
la compréhension et au contrôle des événements de l'hémostase.
Plusieurs auteurs ont montré que le venin de Cerastes cerastes est riche en protéines ayant des activités semblables.
On peut citer la cérastocytine, la cérastotine, la protéine RP
34, l'afaâcytine...Ces différentes sérine-protéases peuvent
être coagulante, anticoagulante ou agrégante.
On peut se poser la question concernant le rôle de toutes
ces thrombines-like dans un même venin (Cette richesse
en thrombine-like pourrait contribuer à une grande efficacité du venin. Notons que toutes les équipes qui ont participé à ces études, ont travaillé avec des mélanges de venins de différentes vipères d'une même espèce. Des études
préliminaires au laboratoire venins et toxines à l'Institut Pasteur de Tunis sur des venins individuels de Cerastes cerastes
ont montré l'existence d'un polymorphisme entre les différents serpents prélevés. En effet nous avons noté l'absence de la cérastocytine et/ou de la cérastotine chez certains d'entre eux. D'autre spécimens ont dans leur venin les
deux protéines.
La construction d'une banque à ADNc (acide désoxyribonucléique complémentaire) à partir des glandes à venin de
Cerastes cerastes ainsi que le clonage de la cérastocytine
Tome 7 5 (1/2)
et de la cérastotine sont en cours au laboratoire . Cette
étude ainsi que des études de relation structure-fonction et
d'ingénierie des thrombines-like pourraient contribuer à
une meilleure connaissance du mode d'action de ces protéines et de la variabilité de leur effet procoagulant et
proagrégant. De l'ensemble de ces approches, il en résulterait probablement la conception de nouvelles molécules
d'intérêt pharmacologique ou de diagnostique. On peut
également réaliser des mutagenèses dirigées essentiellement au niveau du site actif de la cérastocytine transformant
ainsi son activité proagrégante en anti-agrégant plaquettaire.
Ce type d'approche a été déjà commencée pour la thrombine.
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