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THÈSE
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS
UFR des sciences fondamentales et appliquées
Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers)
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)
Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie
Présentée par :
Camille Dejos
Caractérisation des propriétés antiprolifératives
d'une substance naturelle et rôle de la signalisation calcique
dans la différenciation des photorécepteurs
Directeur(s) de Thèse :
Thierry Bergès, Pierre Voisin
Soutenue le 14 octobre 2014 devant le jury
Jury :
Président
Patrick Bois
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Rapporteur
Frédéric Devaux
Professeur des Universités, Université Pierre et Marie Curie,
Paris 6
Rapporteur
Marie-Paule Felder-Schmittbuhl Chargé de recherche CNRS, Université de Strasbourg
Membre
Thierry Bergès
Professeur des Universités, Université de Poitiers
Membre
Pierre Voisin
Directeur de recherche CNRS, Université de Poitiers
Membre
Jean-Paul Javerzat
Directeur de recherche CNRS, Université de Bordeaux
Pour citer cette thèse :
Camille Dejos. Caractérisation des propriétés antiprolifératives d'une substance naturelle et rôle de la signalisation
calcique dans la différenciation des photorécepteurs [En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la
biologie. Poitiers : Université de Poitiers, 2014. Disponible sur Internet <http://theses.univ-poitiers.fr>
THESE
pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
Ecole Doctorale : Biologie-Santé, Bio-Santé
Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Camille Dejos
************************
d’une substance naturelle
et
Rôle de la signalisation calcique
************************
Directeurs de Thèse : Pr. Thierry Bergès, Dr. Marianne Bernard et Dr. Pierre Voisin
************************
Soutenance le 14 octobre 2014 devant la Commission d’Examen
************************
JURY
Président :
Patrick Bois, Professeur, Université de Poitiers
Rapporteurs :
Frédéric Devaux, Professeur, Université Pierre et Marie Curie Paris
Marie-Paule Felder-Schmittbuhl, Chargé de recherche CNRS, Université de Strasbourg
Examinateurs :
Jean-Paul Javerzat, Directeur de recherche CNRS, Université de Bordeaux
Pierre Voisin, Directeur de recherche CNRS, Université de Poitiers
Thierry Bergès, Professeur, Université de Poitiers
THESE
pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
Ecole Doctorale : Biologie-Santé, Bio-Santé
Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Camille Dejos
************************
d’une substance naturelle
et
Rôle de la signalisation calcique
************************
Directeurs de Thèse : Pr. Thierry Bergès, Dr. Marianne Bernard et Dr. Pierre Voisin
************************
Soutenance le 14 octobre 2014 devant la Commission d’Examen
************************
JURY
Président :
Patrick Bois, Professeur, Université de Poitiers
Rapporteurs :
Frédéric Devaux, Professeur, Université Pierre et Marie Curie Paris
Marie-Paule Felder-Schmittbuhl, Chargé de recherche CNRS, Université de Strasbourg
Examinateurs :
Jean-Paul Javerzat, Directeur de recherche CNRS, Université de Bordeaux
Pierre Voisin, Directeur de recherche CNRS, Université de Poitiers
Thierry Bergès, Professeur, Université de Poitiers
1
Résumé
Caractérisation des propriétés antiprolifératives d’une substance naturelle et
Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation des photorécepteurs
Partie 1. Evaluation de l’activité antiproliférative de la canthin-6-one
La recherche d’agents anticancéreux exploite les propriétés anti-prolifératives de
molécules d’origine naturelle. La canthin-6-one est un alcaloïde d’origine végétale dont les
propriétés antipyrétique et antiparasitaire sont utilisées en médecine traditionnelle. Une
utilisation thérapeutique de cette molécule, fondée sur des bases scientifiques, nécessite une
meilleure connaissance de ses propriétés anti-prolifératives et de son mode d’action. Nous
avons observé une inhibition complète de la prolifération de lignées humaines cancéreuses
(PC-3, HT-29, Jurkat, HeLa) en présence de canthin-6-one (10 à 40 µM). La canthin-6-one
entraine une diminution de l’incorporation de BrdU dans l’ADN néo-synthétisé des cellules
cancéreuses et une baisse de la proportion de cellules en mitose. L’origine de ces effets antiprolifératifs est une accumulation des cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire. La
conservation phylogénétique des mécanismes du cycle cellulaire nous a permis d’utiliser la
levure Saccharomyces cerevisiae pour rechercher des gènes cibles de la canthin-6-one. Par
criblage d’une banque d’ADN génomique de levure, nous avons identifié deux gènes de
résistance correspondants respectivement à une pompe d’efflux (Flr1) et à une enzyme
impliquée dans le contrôle qualité de la réplication à la transition G2-M (Siz2).
Mots-clés: canthin-6-one, cancer, cycle cellulaire, levure, résistance
Partie 2. Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation des photorécepteurs
Une meilleure connaissance des mécanismes de différenciation des photorécepteurs de
type bâtonnet devrait permettre la mise au point de méthodes thérapeutiques ou
prophylactiques contre les dégénérescences rétiniennes. Chez l’embryon de poule, un délai
d’une semaine entre la détermination des précurseurs de photorécepteurs et l’activation
transcriptionnelle du gène de la rhodopsine, suggère l’attente d’un signal important pour cette
étape de la différenciation. Par une approche pharmacologique in vitro, nous avons pu
montrer que l’activation du promoteur du gène de la rhodopsine et l’accumulation de l’ARNm
correspondant, dépendent d’une voie de signalisation impliquant un canal activé en
hyperpolarisation (HCN), des canaux calciques de type T ou R et de l’activité de la kinase
calmoduline-dépendante. Le profil d’expression du canal HCN1 dans la rétine embryonnaire
suggère qu’il pourrait jouer un rôle limitant dans ce mécanisme. Cette hypothèse a été testée
par une expression forcée du canal HCN1 dans des précurseurs rétiniens.
Mots-clés: différenciation, photorécepteur, opsine, calcium, HCN
2
Abstract
Characterization of the anti-proliferative properties of a natural substance and
Role of calcium signaling in photoreceptor differentiation
1. Evaluation of canthin-6-one anti-proliferative properties
A number of natural products have been isolated as anticancer agents because of their
anti-proliferative properties. Canthin-6-one is an alkaloid molecule produced by tropical
plants used in traditional medicine for its antipyretic and antiparasitic properties. Evidencebased medicine requires better knowledge of canthin-6-one’s anti-proliferative effects and
mode of action. In the presence of canthin-6-one (10 to 40 µM), we demonstrated a complete
growth inhibition of human cancer cells (PC-3, HT-29, Jurkat, HeLa). Canthin-6-one induced
a decrease in BrdU labeling of newly synthesized DNA and reduced the proportion of mitotic
cells. These anti-proliferative effects were due to the accumulation of cells in the G2/M
phases of the cell cycle. Cell cycle pathways being evolutionarily conserved in eukaryotes, we
used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system to further analyze the mode of
action of canthin-6-one. A yeast genomic library was screened for suppressors of canthin-6one toxicity and two resistance genes were identified. One encodes a major-facilitatorsuperfamily transporter (Flr1), probably involved in canthin-6-one efflux. The other one
encodes an enzyme involved in DNA quality control at the G2/M transition checkpoint (Siz2).
Key words: canthin-6-one, cancer, cell cycle, yeast, résistance
2. Role of calcium signaling in photoreceptor differentiation
The design of new treatments for retinal degenerations should benefit from better
knowledge of photoreceptor differentiation. During retinal differentiation in chicken embryos
there is a long time lag (one week) between commitment to the photoreceptor fate and
transcriptional activation of rhodopsin gene, suggesting committed precursors are in a standby
state waiting for a signal to activate opsin gene expression. We demonstrate by a
pharmacological approach in vitro that rhodopsin promoter activation and mRNA
accumulation depends on a signaling pathway involving hyperpolarisation-activated channels
(HCN), T- or R-type calcium channels and calmodulin-dependent protein kinase. The
expression profile of HCN1 in the embryonic retina suggests it may be a limiting factor for
rhodopsin gene activation. We tested this hypothesis by forcing the expression of HCN1 in
retinal precursors.
Key words: differentiation, photoreceptor, opsin, calcium, HCN
3
Remerciements
Je souhaite adresser mes remerciements à la Région Poitou-Charentes pour le
financement de ma bourse de thèse, ainsi que l’université de Poitiers au sein de laquelle j’ai
pu occuper le poste de doctorant contractuel à charge d’enseignement. Je remercie également
l’école doctorale Bio-Santé de Poitiers pour la qualité des enseignements proposés et leur
accompagnement.
Ces travaux de thèse ont été réalisés au sein du laboratoire Signalisation et Transports
Ioniques Membranaires « STIM », ERL 7368 du CNRS, dirigé par le professeur Frédéric
Becq, que je remercie pour son accueil. Je remercie chaleureusement le personnel employé
sur les plateformes du laboratoire pour leur disponibilité et leur compétence : Anne Canterau
du service de microscopie, Adriana Delwail du service de cytométrie en flux et Daniel
Guyonnet du service de séquençage. Je remercie également Carole Desfontaines et Christelle
Morillon du service administratif pour leur gentillesse.
Je tiens à remercier très chaleureusement toute l’équipe « Calcium et Différenciation »
qui a subi quelques bouleversements au cours de ces trois dernières années et à qui je souhaite
beaucoup de succès à l’avenir. En premier lieu, merci à mes directeurs de thèse, Thierry
Bergès, Marianne Bernard et Pierre Voisin, pour leur confiance. Je remercie le Pr. Thierry
Bergès qui m’a initiée à la génétique de la levure dès la licence, pour sa pédagogie, sa
patience et son soutien aussi bien au cours de ces travaux de thèse, qu’au cours des
enseignements que j’ai pu encadrer grâce à lui. Je remercie le Dr. Marianne Bernard qui m’a
donné envie de m’intéresser à la différenciation cellulaire et à la rétine lors de mon stage de
M1, pour sa pédagogie, sa rigueur scientifique et le temps qu’elle a consacré à ma formation.
Je remercie le Dr. Pierre Voisin qui m’a sans cesse aidé à développer ma curiosité, pour sa
pédagogie, ses connaissances et l’énergie consacrée à ces travaux aussi bien en pratique que
lors de sa rédaction. Je tiens à remercier le Dr. Matthieu Régnacq qui a fait avancer ces
travaux par la perspicacité de ses remarques, pour son esprit critique, son aide sur le plan
technique et scientifique et sa bienveillance. Je remercie Laetitia Cousin pour son aide
technique et sa grande gentillesse. Je remercie Jenny Colas pour son aide technique, sa
gentillesse et sa bonne humeur.
Je souhaite remercier tous ceux avec qui j’ai collaboré au cours de cette thèse, les
membres des autres équipes de STIM, les membres de l’équipe pédagogique du département
65, ou encore les autres doctorants rencontrés lors des formations ou lors du journal club.
4
Je tiens à remercier les membres du jury de thèse, Frédéric Devaux, Marie-Paule
Felder-Schmittbuhl, Jean-Paul Javerzat et Patrick Bois, d’avoir accepté d’être rapporteurs et
examinateurs de ce travail.
J’adresse mes remerciements au Dr. Frédéric Gaillard qui m’a permis de prendre
contact avec son collaborateur canadien Yves Sauvé afin de monter un projet post-doctoral
qui me permet de poursuivre mon projet professionnel.
Enfin, un grand merci à mes amis et à ma famille pour leur soutien inconditionnel.
Merci à Elodie et Sylvain, Julie, Laure, aux limougeaux et aux vendéens qui se reconnaitront.
Merci à ma grand-mère, mon oncle, ma tante et mes cousins du pays basque. Merci à mes
parents et ma sœur. Merci à Antoine qui a choisi de poursuivre cette aventure à mes cotés.
5
Table des matières
Liste des abréviations ...............................................................................................................10
Partie 1. Evaluation de l’activité antiproliférative de la canthin-6-one........................14
Index des figures.......................................................................................................................15
Index des tableaux.....................................................................................................................16
Introduction générale................................................................................................................17
1. Les canthinones : découverte, extraction et synthèse chimique...............................17
2. Propriétés biologiques et mode d’action des canthinones.........................................19
2.1. Propriétés antiulcéreuses............................................................................19
2.2. Propriétés antivirales..................................................................................19
2.3. Propriétés antiparasitaires...........................................................................19
2.4. Propriétés antibactériennes.........................................................................19
2.5. Propriétés antifongiques.............................................................................20
2.6. Propriétés anticancéreuses..........................................................................20
3. Les molécules d’origine naturelle dans le développement d’anticancéreux.............21
4. Objectifs de l’étude : caractérisation des propriétés antiprolifératifs de la canthin-6one sur des lignées cancéreuses et de son mode d’action chez la levure Saccharomyces
cerevisiae.......................................................................................................................28
Chapitre 1. Caractérisation des propriétés antiprolifératives de la canthin-6-one sur des lignées
cancéreuses in vitro...................................................................................................................29
Introduction...................................................................................................................29
Résumé de l’article soumis. Canthin-6-one displays antiproliferative activity and
causes accumulation of cancer cells in the G2/M phase..............................................30
Article soumis. Canthin-6-one displays antiproliferative activity and causes
accumulation of cancer cells in the G2/M phase..........................................................31
Matériels et méthodes....................................................................................................32
- Réactifs............................................................................................................32
- Culture des lignées cellulaires.........................................................................32
- Détermination du taux de prolifération des lignées par comptage cellulaire..32
- Analyse par western blot du clivage de la procaspase-3.................................33
- Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux.........................................33
6
- Analyse de l’incorporation de BrdU dans l’ADN néosynthétisé par southern
blot.....................................................................................................................34
- Immunofluorescence BrdU sur les cellules en culture....................................34
- Immunofluorescence de la β-tubuline sur les cellules en culture...................35
Conclusion.....................................................................................................................36
Chapitre 2. Caractérisation du mode d’action de la canthin-6-one chez la levure
Saccharomyces cerevisiae.........................................................................................................38
Introduction...................................................................................................................38
Résumé de l’article. The MSF-type efflux pump Flr1 induced by Yap1 promotes
canthin-6-one resistance in yeast..................................................................................42
Article. The MSF-type efflux pump Flr1 induced by Yap1 promotes canthin-6-one
resistance in yeast.........................................................................................................43
Matériels et méthodes....................................................................................................44
- Réactifs............................................................................................................44
- Souches de bactéries et de levures..................................................................44
- Culture des bactéries et des levures.................................................................45
- Plasmides.........................................................................................................46
- Transformation de levures avec une banque d’ADN génomique...................47
- Extraction d’ADN chromosomique et plasmidique de levure........................48
- Transformation par électroporation de bactéries
électro-compétentes DH5α................................................................................48
- Minipréparation d’ADN plasmidique à partir de bactéries E. coli.................48
- Transformation de levures par choc thermique...............................................49
- Estimation de la viabilité cellulaire par la méthode du test en goutte.............49
- Mesure du taux de croissance de levures en milieu liquide............................50
- Séquençage......................................................................................................50
- Extraction d’ARN de levure............................................................................50
- Réaction de rétrotranscription (RT) et PCR quantitative (qPCR)...................51
Résultats complémentaires............................................................................................53
1. Identification des gènes portés par le plasmide isolé de la souche CR11.....54
2. Identification du gène suppresseur RPO31...................................................55
7
3. Identification du gène suppresseur SIZ2........................................................56
Perspectives...................................................................................................................58
Références bibliographiques.........................................................................................69
Partie 2. Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation
des photorécepteurs.......................................................................................................75
Index des figures.......................................................................................................................76
Index des tableaux.....................................................................................................................77
Introduction générale................................................................................................................78
1. Situation anatomique de la rétine dans l’œil.............................................................78
2. Histologie fonctionnelle de la rétine neurale.............................................................80
3. Les photorécepteurs : cônes et bâtonnets..................................................................86
4. La phototransduction.................................................................................................90
5. Evolution des gènes d’opsines visuelles...................................................................93
6. Les grandes étapes de la rétinogenèse.......................................................................96
6.1. Formation des cupules optiques et détermination de la rétine neurale.......96
6.2. Prolifération des progéniteurs multipotents et sortie du cycle cellulaire...98
6.3. Réduction des potentialités de différenciation des précurseurs
rétiniens...........................................................................................................110
6.4. Engagement des précurseurs dans une voie de différenciation :
« commitment »................................................................................................112
7. Différenciation des photorécepteurs........................................................................114
7.1. Chronologie de la différenciation des photorécepteurs............................114
7.2. Rôle des facteurs diffusibles ....................................................................115
7.3. Rôle des facteurs de transcription.............................................................115
7.4. Différenciation des photorécepteurs in vitro............................................118
8. Objectifs de l’étude : recherche des signaux impliqués dans la différenciation des
photorécepteurs in vitro...............................................................................................119
Chapitre 1. Activation de la transcription du gène de la rhodopsine in vitro dans des
précurseurs rétiniens : rôle de la signalisation calcique et des canaux HCN..........................120
Article. Activation of rhodopsin gene transcription in cultured retinal precursors of
chicken embryo : rôle of Ca2+ signaling and hyperpolarization activated cation
channels.......................................................................................................................121
Conclusion et perspectives..........................................................................................122
8
Chapitre 2. Expression forcée du canal HCN1 dans des précurseurs rétiniens in vitro..........124
Introduction.................................................................................................................124
Matériels et méthodes..................................................................................................126
- Stratégie de clonage de la séquence codante du gène HCN1 de poule Gallus
domesticus.......................................................................................................126
- Réaction de rétrotranscription (RT)..............................................................126
- Amplification de la séquence codante du canal HCN1 de poule par PCR...127
- Séquençage....................................................................................................129
- Ligation des séquences HCN1 amplifiées par PCR dans pGEMT-easy.......129
- Transformation de bactéries par choc thermique..........................................130
- Sélection des bactéries transformées avec la ligation des produits de PCR
HCN1 dans pGEMT-easy................................................................................130
- Minipréparation d’ADN plasmidique...........................................................130
- Digestion enzymatique des séquences HCN1 clonées dans pGEMT-easy...130
- Ligation de la séquence codante du canal HCN1 dans pGEMT-easy...........131
- Sélection des bactéries transformées avec la ligation HCN1 dans pGEMTeasy..................................................................................................................131
- Ligation de la séquence HCN1 dans le vecteur d’expression pcDNA3........131
- Sélection des bactéries transformées avec la ligation HCN1 dans
pcDNA3...........................................................................................................132
- Animaux........................................................................................................132
- Dissection de la rétine neurale......................................................................132
- Culture primaire de précurseurs rétiniens embryonnaires.............................133
- Transfection transitoire des précurseurs rétiniens par un précipité d’ADN
plasmidique phosphate de calcium..................................................................133
- Immunofluorescence HCN1..........................................................................134
Résultats......................................................................................................................136
1. Clonage de la séquence codant du canal HCN1 de poule dans un vecteur
d’expression.....................................................................................................136
2. Immunofluorescence HCN1 sur les précurseurs rétiniens transfectés........136
3. Effet de l’expression forcée du canal HCN1 sur l’activité du promoteur
rhodopsine.......................................................................................................138
Conclusion et perspectives..........................................................................................141
Références bibliographiques.......................................................................................143
9
Liste des abréviations
A
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
Amp : ampicilline
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
ARN : acide ribonucléique
ARNm : ARN messager
ARNt : ARN de tranfert
ASCL1/Mash1 : Mammalian Achaete Scute Homolog 1
B
BEt : bromure d’éthidium
bHLH : basic Helix-Loop-Helix
BMP : Bone Morphogenic Protein
BrdU : 5-Bromo-2’-deoxyUridine
BSA : Bovine Serum Albumine
C
CaMkII : Calcium-calmoduline protein Kinase II
CNG : Cyclic Nucleotide-Gated ion channels
CDK : Cyclin-Dependent Kinase
CDKI : Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor protein
CNTF : Ciliary NeuroTrophic Factor
CRF : Corticotropin-Release Factor
CREB : cAMP Response Element Binding Protein
Crx : Cone-Rod Homeobox Protein
D
DEPC : DiEthylPyroCarbonate
DHA : DocosaHexaenoic Acid
DO : densité optique
DMSO : diméthylsulfoxide
dNTPs : désoxyribonucléotides triphosphates
E
EDTA : Acide éthylène-diamine-tétra-acétique
EGF : Epidermal Growth Factor
10
F
FGF : Fibroblast Growth Factor
Foxn4 : Forkhead Box n4
G
GABA : Gamma-Aminobutyric Acid
GAP : GTPase activating protein
GAPDH : GlycerAldehyde 3-Phosphate DeHydrogenase
GC : Guanylate Cyclase
GCAP : Guanylate Cyclase-Activating Proteins
GDNF : Glial-cell-Derived Neurotrophic Factor
GDP : guanosine diphosphate
GFAP : Glial Fibrillary Acidic Protein
GFP : Green Fluorescente Protein
GMPc : guanosine monophosphate cyclique
GTP : guanosine triphosphate
H
HES : Hairy and Enhancer of Split
HCN : Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated channel
HIOMT : HydroxyIndole-O-Methyl Transferase
HIP : Drug-induced HaploInsufficency Profiling
HIV : Human Immunodeficiency Virus
HOP : Homozygous Profiling
I
IBMX : 3-IsoButyl-1-MethylXanthine
IGF : Insulin-like Growth Factor
IHH : Indian Hedgehog
IPTG : Isopropyl β-D-1-ThioGalactopyranoside
J
JNK : c-Jun NH2-terminal kinase
K
KO : KnockOut
L
LB : milieu de culture Luria Bertani
L-Mf/Maf-A : Lens-specific Maf
LWS : Long Wavelenght-Sensitive
11
M
MA : millions d’années
Math 3 : Mouse Athonal Homolog 3
Math 5 : Mouse Athonal Homolog 5
MSP : Multi-copy Suppression Profiling
MMLV : Moloney Murine Leukemia Virus
N
NeuroD1 : Neurogenic Differenciation 1
NCX : Sodium-Calcium Exchanger antiporter
Nr2e3 : Nuclear Receptor Subfamily 2, group E, member 3
Nrl : Neural Retina Leucine zipper
O
Otx2 : Orthodenticle homeobox 2
Otx5 : Orthodenticle homeobox 5
P
Pax6 : Paired box protein 6
PBS : Phosphate Buffered Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PDE6 : phosphodiestérase spécifique du GMP cyclique
PEG : PolyEthylene Glycol
PKA : protéine kinase A
Prox1 : Prospero Homeobox 1
R
RA : Retinoic Acid
Rarβ : Retinoic Acid Receptor beta
Rarγ : Retinoic Acid Receptor gamma
Rax/Rx : Retinal Homeobox Protein
RFP : Red Fluorescente Protein
RGS9 : Regulator of G-protein Signaling 9
RNAse : RiboNucléAse
Ror β2 : Retinoid-related Orphan Receptor beta 2
RT : réaction de rétrotranscription
RTK : récepteurs à activité tyrosine kinase
Rxr : Retinoid X Receptor
12
S
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SEM : Standard Error of the Mean, erreur standard de la moyenne
SGD : Saccharomyces GENOME DATABASE
SHH : Sonic Hegehog
Six3 : Sine oculis Homeobox Homolog 3
SUMO : Small Ubiquitin-like Modifier.
SVF : sérum de veau fœtal
SWS : Short Wavelenght-Sensitive
T
T3 : tri-iodothyronine
TGFα : Transforming Growth Factor alpha
TGFβ : Transforming Growth Factor beta
TRAPP : Transport Protein Particle
Trβ2 : Thyroid Hormon Receptor beta 2
V
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
VIP : Vasoactive Intestinal Peptide
Vsx2/Chx10 : Visual System Homeobox 2
Y
YEp13 : Yeast Episomal vector 13
YNB : milieu de culture standard Yeast Nitrogen Base + Glucose
YPG : milieu de culture standard Yeast Peptone + Glucose
13
Partie 1. Evaluation de l’activité antiproliférative de la canthin-6-one
14
Index des figures
Figure 1 : Structure chimique de la canthin-6-one....................................................................18
Figure 2 : Activation des points de contrôle du cycle cellulaire en réponse à des dommages à
l’ADN........................................................................................................................................23
Figure 3 : Sites de liaison de la vinblastine et du paclitaxel sur les microtubules....................24
Figure 4 : Approches génétiques pour l’identification des cibles d’une molécule toxique chez
la levure.....................................................................................................................................40
Figure 5 : Phénotype des souches résistantes à la canthin-6-one..............................................53
Figure 6 : Carte de la région chromosomique portée par le plasmide responsable de la
résistance du clone CR11 vis-à-vis de la canthin-6-one...........................................................54
résistance des clones CR4, CR5 et CR15 vis-à-vis de la canthin-6-one...................................55
résistance du clone CR8 vis-à-vis de la canthin-6-one.............................................................56
Figure 9 : La surexpression du gène SIZ2 dans la souche flr1∆ lui confère un phénotype
résistant vis-à-vis de la canthin-6-one.......................................................................................57
Figure 10 : Combinaison des approches HIP, HOP et MSP.....................................................59
Figure 11 : Inhibition de la croissance de la souche flr1∆ jusqu’à de fortes concentrations de
canthin-6-one............................................................................................................................63
Figure 12 : Distribution des levures dans les différentes phases du cycle cellulaire en présence
de canthin-6-one........................................................................................................................64
Figure 13 : Aspect des fuseaux mitotiques en présence de canthin-6-one................................66
15
Index des tableaux
Tableau 1 : Les plantes utilisées pour l’extraction de la canthin-6-one....................................18
Tableau 2 : Les molécules d’origine naturelle dans le développement de traitements
anticancéreux............................................................................................................................22
Tableau 3 : Molécules anticancéreuses extraites de plantes, testées en phase préclinique ou
clinique......................................................................................................................................26
Tableau 4 : Lignées cellulaires utilisées dans cette étude.........................................................32
Tableau 5 : Identification de protéines cibles de molécules toxiques par approche génétique
chez la levure...........................................................................................................................41
Tableau 6 : Liste des souches de levures S. cerevisiae utilisées dans cette étude.....................44
Tableau 7 : Liste des plasmides utilisés dans cette étude.........................................................46
Tableau 8 : Liste des couples d’amorces de qPCR utilisés dans cette étude............................52
16
Introduction générale
Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde, à l’origine de 8,2
millions de décès en 2012 (source : Organisation mondiale de la Santé). Dans les années 90,
l’industrie pharmaceutique s’est concentrée sur le développement de thérapies ciblées utilisant
des molécules synthétiques ou des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques
responsables de la croissance tumorale (Basmadjian et al. 2014). Si cette stratégie a permis
d’améliorer le traitement de certains cancers, la problématique du traitement de nombreuses
tumeurs solides a relancé l’intérêt pour les molécules d’origine naturelle. En effet, depuis
2007 et l’agrément de dérivés de la rapamycine, les composés naturels se sont imposés dans
les thérapies anticancéreuses (Basmadjian et al. 2014). La recherche de molécules d’origine
naturelle possédant une activité anticancéreuse est donc à nouveau envisagée comme une voie
de développement pour de nouvelles thérapies. C’est dans cette optique que nous nous
sommes intéressés aux propriétés antiprolifératives de la canthin-6-one.
1. Les canthinones : découverte, extraction et synthèse chimique
Les canthinones sont un ensemble de plus de 150 molécules décrites actuellement,
dont une quarantaine est d’origine naturelle. L’élément de base de la structure chimique des
canthinones est la canthin-6-one (Showalter 2013). Décrite pour la première fois en 1952 par
Haynes et ses collaborateurs, la canthine-6-one est un alcaloïde historiquement isolé à partir
de Pentaceras australis, un arbre de la forêt tropicale australienne (Haynes et al. 1952,
Showalter 2013). La canthin-6-one est également produite par d’autres plantes des familles
Rutacées, Simarubacées et Amaryllidacées (tableau 1).
Pour isoler cette molécule, des protocoles de purification à partir de différents tissus
végétaux existent, mais plusieurs équipes travaillent à l’amélioration de la synthèse de cette
molécule afin de disposer d’une alternative intéressante à l’extraction (Showalter 2013). La
première synthèse totale, réalisée à partir de tryptophane, a été décrite en 1966 mais présentait
un rendement très faible (Showalter 2013). Actuellement, une synthèse chimique de la
canthin-6-one en deux étapes et avec un meilleur rendement est décrite (Gollner et Koutentis
2010). Dans cette étude nous utiliserons de la canthin-6-one synthétique disponible dans le
commerce (Soriano-Agaton et al. 2005).
17
Figure 1 : Structure chimique de la canthin-6-one (illustration de Showalter 2013)
La canthin-6-one, de formule chimique C14H8N2O, aussi dénommée 6H-Indolo[3,2,1de][1,5]naphthyridin-6-one, est composée d’un squelette β-carboline avec un cycle D
additionnel. Sur cette structure, l’ajout d’un groupement O-CH3 permet de former les dérivés
méthoxycanthinones (ex. : 1-méthoxycanthin-6-one). Il existe également des dérivés
hydroxylés (ex. : 8-hydroxycanthin-6-one, groupement OH sur le carbone 8). Cette structure
peut être tronquée pour former des dérivés possédant les cycles « ABD », « BCD » ou
« ABC ».
Tableau 1 : Les plantes utilisées pour l’extraction de la canthin-6-one
Famille
Genre
Espèce
Références Bibliographiques
Rutacée
Pentaceras
australis
Haynes et al. 1952
Fagara
mayu
Assem et al. 1983
Zanthoxylum
elephantiasis
Mitscher et al. 1972
usambarense
He et al. 2002
chiloperone
Thouvenel et al. 2003
Soriano-Agaton et al. 2005
Simarubacée
ovalifolium
Halstead et al. 2006
Alianthus
altissima
Anderson et al. 1983
Eurycoma
longifolia
Kuo et al. 2003
Bhat et Karim 2010
Amaryllidacée
Simaba
ferruginea
De Souza Almeida et al. 2011
Allium
neapolitanum
O’Donnel et Gibbons 2007
18
2. Propriétés biologiques et mode d’action des canthinones
Des décoctions de plantes contenant des canthinones, sont utilisées en Amérique du
sud dans le traitement de la malaria et de la leishmaniose. En médecine traditionnelle ces
produits naturels sont également utilisés comme agents antipyrétiques et pour le traitement
des ulcères gastriques ou de diarrhées (De Souza Almeida et al. 2011). Ces observations ont
conduit à s’intéresser plus précisément aux activités biologiques des canthinones et à leurs
modes d’action afin de rechercher de potentielles applications thérapeutiques.
2.1. Propriétés antiulcéreuses
Les propriétés antiulcéreuses de la canthin-6-one ont été évaluées dans des modèles
murins (De Souza Almeida et al. 2011). Cette étude décrit des effets gastro-protecteurs qui
reposeraient sur une activité antioxydante de la canthin-6-one, mais ses cibles moléculaires
n’ont pas été identifiées (De Souza Almeida et al. 2011).
2.2. Propriétés antivirales
Deux études, réalisées in vitro, décrivent les propriétés antivirales de la 1méthoxycanthin-6-one (Xu et al. 2000) et de dérivés synthétiques de canthinones (Brahmbhatt
et al. 2010) contre le HIV Human Immunodeficiency Virus. Cependant, ces études ne se sont
pas penchées sur la question du mode d’action des canthinones.
2.3. Propriétés antiparasitaires
Kuo et ses collaborateurs ont testé l’activité antimalariale d’extraits de racines
d’Eurycoma longifolia contenant des canthinones (Kuo et al. 2003). Mais ce sont des études
plus approfondies, sur des extraits de Zanthoxylum chiloperone, qui ont mis en évidence les
activités antiparasitaires de la canthin-6-one et de la 5-méthoxycanthin-6-one contre
différentes souches du pathogènes Leishmania, in vitro et in vivo (Ferreira et al. 2002,
Ferreira et al. 2007, Ferreira et al. 2011). Ces études ont conduit au dépôt d’une demande de
brevet pour l’utilisation de la canthin-6-one dans le traitement de la leishmaniose. Cependant,
les mécanismes responsables cette activité antiparasitaire n’ont pas été identifiés.
2.4. Propriétés antibactériennes
Les canthinones possèdent des propriétés antibactériennes qui pourraient s’avérer
intéressantes pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens, secteur confronté à
l’émergence de souches bactériennes multi-résistantes. La canthin-6-one et la 8hydroxycanthin-6-one,
extraites
d’Allium
19
neapolitanum,
présentent
des
activités
antibactériennes contre différentes souches de Mycobacterium et de Staphylococcus aureus
multi-résistantes (O’Donnel et Gibbons 2007). Là encore, cette étude ne s’est pas intéressée
au mécanisme d’action des canthinones dans le cadre de leurs activités antibactériennes.
2.5. Propriétés antifongiques
Plusieurs études décrivent le large spectre d’activités antifongiques de la canthin-6-one
(He et al. 2002, Thouvenel et al. 2003). Des dérivés synthétiques ont d’ailleurs été testés in
vitro sur différentes souches de champignons, mais sans amélioration significative de
l’efficacité des effets antifongiques (Soriano-Agaton et al. 2005). Une étude réalisée chez la
levure Saccharomyces cerevisiae, a porté sur le mode d’action de la canthin-6-one et suggère
que ses propriétés antifongiques reposent sur une modification du métabolisme lipidique
(Lagoutte et al. 2008). L’accumulation d’un analogue fluorescent de la canthin-6-one dans les
gouttelettes lipidiques et l’augmentation d’acides gras insaturés de type C16:1 (Lagoutte et al.
2008) ont conduit ces auteurs à proposer que la canthin-6-one stimule l’enzyme désaturase
des acides gras. Cependant, cette hypothèse n’a pas été testée et aucune autre étude à ce jour
ne met en évidence un effet sur le métabolisme lipidique.
2.6. Propriétés anticancéreuses
Quelques études décrivent les propriétés anticancéreuses des canthinones. Ainsi, la 1méthoxycanthin-6-one et la 5-méthoxycanthin-6-one ont des effets antiprolifératifs contre des
lignées cancéreuses humaines d’origine variée : adénocarcinome du col de l’utérus KB,
carcinome du poumon A-549, adénocarcinome du côlon HCT-8, carcinome du rein CAKI-1,
adénocarcinome du sein MCF-7 et mélanome SK-MEL-2 (Xu et al. 2000). La 9méthoxycanthin-6-one et la canthin-6-one extraites d’Eurycoma longifolia ont une activité
cytotoxique contre les lignées cancéreuses humaines A549 (carcinome du poumon) et MCF-7
(Kuo et al. 2003). La cytotoxicité de la 1-méthoxycanthin-6-one entraine d’ailleurs l’apoptose
sur les lignées cancéreuses humaines d’adénocarcinome du col de l’utérus HeLa et
d’ostéosarcome SAOS-2 (De Feo et al. 2005). L’activité proapoptotique de la 1méthoxycanthin-6-one a été confirmée dans une étude plus approfondie (Ammirante et al.
2006) réalisée sur différentes lignées cancéreuses humaines : Jurkat (lymphome), ARO et
NPA (carcinomes de la thyroïde) et HuH7 (carcinome du foie). Cette étude s’est intéressée à
l’activation de la kinase JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) en présence de 1-méthoxycanthin6-one et suggère que cette molécule pourrait être utilisée dans des thérapies anticancéreuses
(Ammirante et al. 2006). Plus récemment, une étude s’est penchée sur l’amélioration des
effets cytotoxiques de la 1-méthoxycanthin-6-one par la synthèse de molécules dérivées
20
(Peduto et al. 2011). Cependant, les mécanismes à l’origine de cet effet proapoptotique n’ont
pas été précisés.
3. Les molécules d’origine naturelle dans le développement d’anticancéreux
Plus de 500 composés issus de plantes (terrestre ou marine) et de microorganismes ont
des propriétés antioxydantes, antiprolifératives ou antiangiogéniques susceptibles d’inhiber la
croissance tumorale (Orlikova et al. 2014). Depuis 2007, plusieurs molécules dérivées de
produits naturels se sont imposées dans le développement de thérapies anticancéreuses
(tableau 2, d’après Basmadjian et al. 2014).
Plusieurs molécules issues de plantes sont actuellement utilisées comme traitement
anticancéreux, notamment l’irinotécan (analogue de la camptothécine), l’étoposide, la
vincristine (famille des alcaloïdes vinca) et le paclitaxel ou taxol (Orlikova et al. 2014). Les
propriétés antiprolifératives de ces molécules anticancéreuses reposent sur des modes d’action
ciblant différentes phases du cycle cellulaire :
- l’irinotécan et l’étoposide perturbent la réplication de l’ADN. L’irinotécan se lie au
complexe formé par l’ADN et la topoisomérase I, ce qui empêche le double brin d’ADN de se
refermer et conduit à des cassures simple brin (Marsh et Hoskins 2010). Les mêmes
conséquences sont observées avec l’étoposide interagissant avec la topoisomérase II
(Tammaro et al. 2013). Les dommages à l’ADN sont à l’origine de l’activation de protéines
régulant la progression dans le cycle cellulaire (figure 2, Curtin 2012).
- les alcaloïdes vinca et les taxanes perturbent la division cellulaire lors de la mitose.
La cytotoxicité des alcaloïdes vinca (vinblastine, vinorelbine, vincristine, vindesine et
vinflunine) repose principalement sur leur capacité à interagir avec les dimères de tubuline
(Moudi et al. 2013), ce qui perturbe la polymérisation des microtubules et induit un arrêt en
métaphase (figure 3, voir aussi Himes 1991). Les taxanes (paclitaxel) au contraire, stabilisent
les microtubules en empêchant leur dépolarisation (figure 3, voir aussi Sudo et al. 2004). Ces
molécules perturbent donc la dynamique des microtubules, au niveau du fuseau mitotique,
bloquant ainsi le bon déroulement de la mitose.
21
Tableau 2 : Les molécules d’origine naturelle dans le développement de traitements
anticancéreux (d’après Basmadjian et al. 2014).
- Mode d’action
Molécule
Origine
- Indication thérapeutiques
Temsirolimus
(Toricel®)
- analogues de la rapamycine
- inhibition voie mTor
- bactérie
- cancers rénaux
Streptomyces hygroscopicus
Everolimus
(Afinator®)
Ixabepilone
(Ixempra®)
- bactérie
Sorangium cellulosum
- stabilisation microtubules
- cancer du sein
Vinflunine
(Javlor®)
- dérivé de la vinblastine
- plante
(pervenche de Madagascar)
Catharanthus roseus
- inhibition assemblage des
microtubules
- cancers de la vessie
Romidepsin
(Istodax®)
- bactérie
Chromobacterium violaceum
- inhibition histones
désacétylases
- lymphomes T
Trabectedin
(Yondelis®)
- animal marin (ascidie)
Ecteinascidia turbinate
- dommages à l’ADN
- cancers ovariens
Cabazitaxel
(Jevtana®)
- dérivé de taxanes
- plante (if de l’ouest)
Taxus brevifolia
- stabilisation des microtubules
- cancers prostatiques
Mésylate
d’éribuline
(Halaven®)
- animal marin (éponge)
Halichondria okadai
- inhibition de la dynamique des
microtubules
- cancers du sein métastatiques
- plante (conifère)
Cephalotaxus harringtonia
- inhibition synthèse des
protéines
- leucémies myéloïdes
chroniques
Homoharringtonine
(Synribo®)
Carfilzomib
(Kyprolis®)
- peptide microbien
- inhibition spécifique du le
protéasome- myélome
Mébutate d’ingénol
(Picato®)
- plante (euphorbe)
Euphorbia peplus
- activation de la PKC
- kératoses actiniques
22
Figure 2 : Activation dess p
points de contrôle du cycle cellulaire en
e réponse à des
dommages à l’ADN (illustrati
ation de Curtin 2012).
La protéine ATM (Ataxia-Tela
elangiectasia Mutated) est activée par des cassu
ssures double brin de
l’ADN et déclenche le pointt de
d contrôle de la phase G1 du cycle cellula
ulaire en activant par
phosphorylation les protéines
es Chk2 et p53. La protéine ATR (Ataxia-T
Telangiectasia and
Rad3-related) est activée enn pprésence d’ADN simple brin (ex. : au nivea
veau des fourches de
réplication). Elle active les ppoints de contrôle de la phase S ou de laa phase
p
G2 du cycle
cellulaire par la phosphorylati
lation de la protéine Chk1. La kinase Chk1 activée
ac
phosphoryle
alors Wee1 et sa phosphatase
se Cdc25 afin d’arrêter le cycle cellulaire. Enn effet, ces dernières
régulent l’activité des complex
lexes CDK/cyclines responsable de la progres
ression dans le cycle
cellulaire.
23
Figure 3 : Sites de liaison de la vinblastine et du paclitaxel sur les microtubules (d’après
Jordan et Wilson 2004).
La vinblastine se lie sur des sites de haute affinité du coté end (+) des microtubules ce qui
empêche leur polymérisation. Le paclitaxel interagit avec la surface interne des microtubules
et empêche leur dépolymérisation.
24
D’autres molécules issues de plantes et présentant des activités anticancéreuses sont
actuellement testées en phase préclinique et clinique (tableau 3, Mishra et Tiwari 2011). Par
ailleurs, la recherche de nouveaux agents anticancéreux s’oriente à présent vers des molécules
naturelles possédant une activité antimalariale (Duffy et al. 2012). Ces recherches ont été
initiées par la découverte des propriétés antitumorales de l’artémisinine (Willoughby et al.
2009) qui a fait l’objet d’études précliniques (Efferth 2006, Efferth 2007). L’artémisinine
extraite d’Artemisia annua, interagit avec le facteur de transcription Sp-1, qui régule
l’expression de CDK (cyclin-dependent kinase) intervenant pendant la phase G1 du cycle
cellulaire (Willoughby et al. 2009). Depuis, les propriétés anticancéreuses de nombreuses
autres molécules antimalariales ont été décrites et plusieurs modes d’action ont été mis en
évidence (Duffy et al. 2012) :
- effets cytotoxiques, ex. : dérivés de l’artémisinine ;
- effets antiangiogéniques, ex. : dihydroartémisinine, tétracycline et doxycycline ;
- effets sur l’autophagie, ex : chloroquine ;
- effets proapoptotiques, ex. : atovaquone.
La canthin-6-one est une molécule dont l’activité antimalariale est démontrée et
l’étude de ses propriétés anticancéreuses pourrait conduire au développement de nouvelles
thérapies (Kaur et al. 2009).
25
Tableau 3 : Molécules anticancéreuses extraites de plantes, testées en phase préclinique
ou clinique (d’après Mishra et Tiwari 2011).
Molécules (molécules dérivées)
Et leur mode d’action
Structure chimique
Camptothécine
(Karenitecin, diflomotecan, ST1481, elomotecan,
DRF1042, SN2310)
- interaction avec le complexe
ADN/topoisomérase I
Combrestatine
(Combrestatine A-4 phosphate/A-1, diphosphate,
noscapine)
- dépolymérisation réversible de la tubuline
Paclitaxel
(cabazitaxel, larotaxel, DHA-paclitaxel, ortataxel,
Milataxel, Tesetaxel, TPI-287, BMS-188797)
- stabilisation des microtubules
Acronycine
(S23906-1)
- inhibition irréversible de la synthèse d’ADN,
blocage en phase S, apoptose
3’-O-methyl-nordihydroguaiaretic acid (NDGA)
(Terameprocol)
- inhibition des récepteurs membranaires de type
RTK (Receptor Tyrosine-protein Kinase)
26
Suite du tableau 3.
Epipodophyllotoxin
(Tafluposide)
- inhibition des topoisomérases I et II
Daidzéine
(Phenoxodiol, Genistein)
- inhibition de la topoisomérase II, apoptose
Gossypol
- inhibition d’enzymes déshydrogénases
Curcumine
- cassures double brin de l’ADN
Acide bétulinique
- apoptose
Silybine
- antioxydant
27
4. Objectifs de l’étude : caractérisation des propriétés antiprolifératives de la canthin-6one sur des lignées cancéreuses et de son mode d’action chez la levure Saccharomyces
cerevisiae
La recherche d’agents anticancéreux exploite les propriétés de molécules d’origine
naturelle (Basmadjian et al. 2014). Les canthinones présentent des potentialités intéressantes.
Toutefois, l’utilisation thérapeutique des canthinones, fondée sur des bases scientifiques,
nécessite une meilleure connaissance de leurs propriétés et de leurs cibles moléculaires.
L’objectif de cette étude était de mieux caractériser les effets antiprolifératifs et le mode
d’action de la canthin-6-one. Les effets antiprolifératifs de la canthin-6-one ont été réévalués
sur plusieurs lignées cancéreuses grâce à différentes techniques : comptage cellulaire,
incorporation de BrdU lors de la réplication, observation des figures de mitose et analyse du
cycle cellulaire en cytométrie de flux. L’identification des cibles moléculaires de la canthin-6one dans ces lignées cellulaires pose des problèmes techniques en raison du grand nombre de
possibilités offertes et de l’incapacité à intervenir sur l’expression du génome. L’originalité de
ce projet a donc été d’utiliser une approche expérimentale basée sur la levure S. cerevisiae,
pour étudier le mode d’action de la canthin-6-one. En effet, de nombreux gènes et
mécanismes moléculaires sont conservés chez les eucaryotes, ce qui fait de la levure un
modèle d’étude pertinent dans lequel ont été développés de nombreux outils génétiques
permettant d’identifier les cibles de molécules chimiques (Lopez et al. 2008). Le criblage
d’une banque d’ADN génomique de levure a été réalisé afin de rechercher de façon
systématique tous les gènes dont la surexpression est susceptible de diminuer les effets
antiprolifératifs de la canthin-6-one.
28
Chapitre 1. Caractérisation des propriétés antiprolifératives de la canthin-6-one sur des lignées
cancéreuses in vitro
Introduction
Peu d’études ont été réalisées sur les effets anticancéreux des canthinones (Xu et al.
2000, Kuo et al. 2003, De Feo et al. 2005, Ammirante et al. 2008, Peduto et al. 2011) et
aucune ne décrit précisément les propriétés anticancéreuses de la canthin-6-one ou son mode
d’action. Nous avons réexaminé les effets antiprolifératifs et cytotoxiques de la canthin-6-one
sur plusieurs lignées cellulaires et tenté de mieux comprendre son mode d’action. Ces travaux
sont présentés dans ce chapitre sous la forme d’une publication, soumise dans la revue
Journal of Natural Products.
29
Résumé de l’article soumis
Canthin-6-one displays antiproliferative activity and causes accumulation of cancer cells in
the G2/M phase
Les effets antiprolifératifs de la canthin-6-one ont été déterminés sur différentes
lignées cellulaires d’origines variées : des lignées cancéreuses humaines : PC-3 (prostate),
HT-29 (côlon), Jurkat (lymphocytes T) et HeLa (col de l’utérus), ainsi qu’une lignée
cancéreuse murine : C6 (cellules gliales) et une lignée murine immortalisée : NIH-3T3
(fibroblastes embryonnaires). La prolifération de ces lignées, évaluée par comptage des
cellules en culture, est complètement inhibée en présence de canthin-6-one à 40 µM (dès 10
µM pour la lignée HeLa). La concentration inhibitrice médiane (CI50) de la canthin-6-one sur
ces lignées est en moyenne de 20 µM (5 µM pour la lignée HeLa). En corrélation avec
l’inhibition de la prolifération, des effets cytotoxiques de différentes amplitudes ont pu être
mis en évidence sur certaines lignées (PC-3, HT-29 et HeLa) par quantification du clivage de
la procaspase-3. Les effets antiprolifératifs de la canthin-6-one sont donc visibles sur toutes
ces lignées tandis que la cytotoxicité de cette drogue semble très dépendante du type
cellulaire. Concernant des cellules non cancéreuses, la viabilité de fibroblastes humains (test
MTT) n’est pas drastiquement affectée pour une concentration de 40 µM de canthin-6-one
(80% de viabilité). Ces résultats montrent que la canthin-6-one inhibe en premier lieu la
prolifération cellulaire, ce qui peut déclencher de l’apoptose en fonction des types cellulaires.
Ces effets antiprolifératifs sont confirmés par la chute du taux d’incorporation de BrdU lors
de la réplication (diminution entre 60 et 80%) en présence de canthin-6-one. Enfin, l’analyse
du cycle cellulaire par cytométrie en flux montre que les cellules traitées avec de la canthin-6one s’accumulent dans les phases G2 ou M. En accord avec l’inhibition de la prolifération, le
nombre de cellules présentant un fuseau mitotique diminue d’environ 70% en présence de
canthin-6-one. D’autre part, elle n’affecte pas la polymérisation de la tubuline in vitro, ce qui
suggère que ce n’est pas un poison du cytosquelette. Les effets antiprolifératifs de la canthin6-one semblent donc reposer sur l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN de
la transition G2/M.
30
Article soumis
Canthin-6-one displays antiproliferative activity and causes accumulation of cancer cells in
the G2/M phase
31
Canthin-6-one Displays Antiproliferative Activity and Causes Accumulation of Cancer
Cells in the G2/M Phase
Camille Dejos, Pierre Voisin, Marianne Bernard, Matthieu Régnacq and Thierry Bergès*
Signalisation & Transports Ioniques Membranaires, CNRS ERL 7368, University of Poitiers,
Poitiers, France
* E-mail: [email protected]. Phone: +33 5 4945 3735. Fax: +33 5 4945 4014.
1
ABSTRACT
Canthinones are natural substances with a wide range of biological activities, including
antipyretic, antiparasitic and antimicrobial. Antiproliferative and/or cytotoxic effects of
canthinones on cancer cells have also been described, although their mechanism of action
remains ill-defined. To gain better insight into this mechanism, the antiproliferative effect of a
commercially available canthin-6-one (1) was examined dose-dependently on six cancer cell
lines (human prostate: PC-3, human colon: HT-29, human lymphocyte: Jurkat, human cervix:
HeLa, rat glioma: C6 and mouse embryonic fibroblasts: NIH-3T3). Cytotoxic effects of 1
were investigated on the same cancer cell lines by procaspase-3 cleavage and on normal
human skin fibroblasts. Strong antiproliferative effects of the compound were observed in all
cell lines whereas cytotoxic effects were very dependent on cell type. A better definition of
the mechanism of action of 1 was obtained on PC-3 cells, by showing that it decreases BrdU
incorporation into DNA by 60- to 80%, mitotic spindle formation by 70% and that it causes a
2-fold accumulation of cells in the G2/M phase of the cell cycle. Together, the data suggest
that the primary effect of canthin-6-one (1) is antiproliferative, possibly by interfering with
the G2/M transition. Proapoptotic effects might result from this disturbance of the cell cycle.
2
Natural products have long been a source of anticancer substances until the emergence of
targeted therapies and rational drug designs in the 90’s, but regained interest in the last
decade.1 Among these compounds, antimalarials represent an ill-explored source of novel
anticancer drugs.2 First described in 1952 by Haynes et al.,3 canthinones, isolated from the
Australian rainforest tree Pentaceras australis (Rutaceae family) belong to the class of βcarbolin molecules.4 Canthinones are also produced by plants belonging to the Simaroubaceae
and Zygophyllaceae families.5, 6 Traditional medicine makes use of plants producing
canthinones for their antipyretic and antiparasitic properties (against malaria and
leishmaniasis), and for the treatment of gastric ulcers and diarrhea.7 During the past decade,
the biological activities of canthinones have been evaluated and several studies described
antimicrobial,8 antifungal,9-11 as well as antiproliferative and/or cytotoxic activities on various
human cancer cell lines.12-17 Among the first studies undertaken, Xu et al. reported that 1methoxy-canthinone and 5-methoxy-canthinone extracted from Leitneria floridana
suppressed the growth of a panel of human cell lines: HeLa (cervix adenocarcinoma), A-549
(lung carcinoma), HCT-8 (colon adenocarcinoma), CAKI-1 (kidney carcinoma), MCF-7
(breast carcinoma) and SK-MEL-2 (melanoma).12 No attempt was made at defining the
mechanism of action of canthinones on cancer cell proliferation and further studies were
mostly focused on their cytotoxic activities. Uncharacterized cell death was reported in A-549
(lung) and MCF-7 human cancer cell lines treated with 9-methoxy-canthin-6-one and canthin6-one (1) isolated from the roots of Eurycoma longifolia.13 The proapoptotic activity of
canthinones was first reported on HeLa, SAOS-2, U87MG and U-937 (osteosarcoma) cancer
cell lines treated with extract of Ailanthus altissima.15 It was confirmed in a detailed study of
the apoptotic symptoms evoked by 1-methoxy-canthin-6-one in Jurkat (leukemia), ARO,
NPA (thyroid) and HuH7 (liver) cancer cell lines.16 Considering the wide range of biological
activities of canthinones, their apparently safe use in traditional medicine as well as the
3
relative easiness of their high-yielding synthesis in vitro,18 these molecules may represent a
valuable complement to current chemotherapies. As a first step towards a possible use of
canthinones in evidence-based therapies, a better understanding of the mechanisms of action
of these molecules would be required. Specifically, the mechanism of action of canthinones
on cancer cell proliferation remains ill-defined as compared to well-documented effects on
apoptosis.16 However because apoptosis may be the consequence of cell cycle arrest in
established cancer cell lines,19-22 previous studies have not ruled out the possibility that the
primary effect of canthinones may be to interfere with cell cycle progression. Therefore, this
study sought to re-examine the antiproliferative effects of a commercially available canthin-6one (1) in order to obtain a better definition of its impact on the cell cycle and possibly to
identify its mode of action.
RESULTS AND DISCUSSION
Differential Effects of Canthin-6-one (1) on Cancer Cell Proliferation and Apoptosis.
The in vitro antiproliferative effects of canthin-6-one (1) were studied on six cell lines: human
prostate adenocarcinoma PC-3, human colon adenocarcinoma HT-29, human cervix
epitheloid carcinoma cells HeLa , human leukemic T cell lymphoblast Jurkat, rat glioma C6
and mouse embryonic fibroblasts NIH-3T3. Growth curves were established by cell counts
over 4 days of culture, in the absence or presence of 40 µM canthin-6-one (1), a concentration
previously shown to affect yeast growth.11 For most cell lines, this treatment completely
arrested cell growth, while causing only minor decreases in cell populations relative to the
initial plating density (Figure 1A, D, G, M and P). In contrast, 1 was highly toxic to HeLa
4
cells at this concentration, with more than 90% decrease in cell counts after two days of
culture (Figure 1J). In HeLa cells, 10 µM canthin-6-one (1) was sufficient for complete
inhibition of cell growth without reducing the initial cell density (Figure 1J). The dosedependent effect of 1 was further examined on all cell lines. For most cell lines, half-maximal
inhibition of cell growth was observed at 15-20 µM, maximal inhibition at 30 µM and up to
30% cell death at 40-60 µM (Figure 1B, E, H, K, N, and Q). The dose-response curve of
HeLa cells confirmed their higher sensitivity, with half-maximal inhibition of cell growth at 5
µM, complete inhibition at 10 µM and cell death above 15 µM (Fig 1K). Altogether these
results suggest that 1 primary effect was to block the growth of cancer cell lines. Given that
proapoptotic effects of 1-methoxy-canthin-6-one have been reported,15, 16 procaspase-3
cleavage was monitored by western blot analysis at different treatment times with 1. PC-3
cells cultured in the presence of 40 µM of 1 showed a 2-fold increase in caspase-3 fragments
at 48 h and a 7-fold increase at 96 h (Figure 1C), in agreement with the 20-30% decrease in
cell viability observed on the time-course and dose-response curves (Figure 1A and B).
Weaker signs of procaspase-3 cleavage (maximum 2-fold increase at 48 h) could be observed
in HT-29 cells (Figure 1F), in agreement with a less reproducible decrease in cell counts
(Figure 1D and E). HeLa cells which appeared most sensitive to the cytotoxic effect of the
drug (Figure 1J and K), showed 1.5- and 3.5-fold increase in procaspase-3 cleavage after 48 h
treatment with 10 µM or 30 µM of 1, respectively (Figure 1L). HeLa cells could not be
analyzed at 96 h treatment, due to severe cell death and inability to harvest sufficient protein
material. Jurkat, C6 and NIH-3T3 cells showed no increase in procaspase-3 cleavage at 40
µM of 1 (Figure 1I, O and R), in agreement with the absence of cell counts reduction by the
drug (Figure 1G, H, M, N, P and Q). These data indicate that the proapoptotic effect of 1 is
cell line-dependent, whereas a strong antiproliferative effect of this compound was
consistently observed in all cell lines. Canthin-6-one (1) cytostatic feature is thus not
5
automatically associated with
th ccytotoxic effects. Cell death could be induced
ced by several
mechanisms including cytotox
oxicity but also cell cycle arrest.23 The rest off the
th study was
focused on the prostate cancer
er PC-3 cell line,24 with the aim of better charac
racterizing the effect
of 1 on cell proliferation.
6
Figure 1. Antiproliferative and proapoptotic effects of canthin-6-one (1) on several cell lines.
Growth curves, dose-response curves and western blots of procaspase-3 cleavage were
obtained for a series of cancer cell lines: (A, B and C) PC-3, (D, E and F) HT-29, (G, H and I)
Jurkat, (J, K and L) HeLa, (M, N and O) C6 and (P, Q and R) NIH-3T3. Time-course and
dose response curves were obtained by counting dissociated cells in a Malassez chamber.
Results are expressed as mean ± s.e.m. (standard error of the mean), n = 4. Procaspase-3
7
cleavage was detected by immunofluorescence on western blots after 2-4 days treatment with
the indicated dose of 1. Immunofluorescence of β-actin was used as loading control.
Effect of Canthin-6-one (1) on DNA Synthesis. Because cell counts reflect a balance
between proliferation and cell death, we sought to obtain a more direct assessment of the
effects of canthin-6-one (1) on cell proliferation by measuring BrdU incorporation into DNA.
PC-3 cells were pre-cultured for 30 h in the presence or absence of 1 and then labeled with
BrdU for 18 h. BrdU incorporation into genomic DNA was quantified by immunoblotting
(Figure 2A) and the proportion of post-mitotic nuclei, characterized by a strong, uniform
labeling of the chromatin was estimated by immunofluorescence microscopy (Figure 2B).
Southern blot analysis revealed an 80% drop in BrdU incorporation into DNA after treatment
with 1 (Figure 2A). Further information was obtained with immunofluorescence microscopy,
as it indicated that 85% of the cells were post-mitotic in control cultures, after 18 h BrdU
labeling (Figure 2C). This high-efficiency labeling is in agreement with a doubling time of
PC-3 cells around 24 h, as observed above (Figure 1A). In contrast, only 35% of the cells
treated with the drug had a post-mitotic nucleus (Figure 2C). This represents a 60% drop in
the frequency of post-mitotic nuclei (Figure 2C). Decrease of DNA synthesis in the presence
of 1 brings additional evidence that its primary action consists of antiproliferative activity
rather than cytotoxic effect. Altogether, the data clearly show that canthin-6-one (1) lowers
the occurrence of cells replicating their DNA and raise the question of which phase of the cell
cycle is affected.
8
Figure 2. Canthin-6-one (1) reduces the proportion of post-mitotic cells. PC-3 cells were
treated for 30 h with either 40 µM of 1 or 0.2% DMSO (control), before adding BrdU for 18
h. (A) BrdU incorporation into DNA was measured by immunofluorescence on a Southern
blot of genomic DNA and normalized to ethidium bromide (EtBr) fluorescence. (B) Example
of post-mitotic nuclei labeling. (C) Percentage of post-mitotic nuclei observed in 28 (control)
or 46 (1) random microscopic fields, representing a total of 1,500 and 1,800 cells,
respectively. Results are expressed as mean ± s.e.m. and similar results were obtained in a
second experiment (control: 70% post-mitotic nuclei, 1: 31% post-mitotic nuclei).
Canthin-6-one (1) Causes Cell Accumulation in G2/M. To gain deeper insight into the
mechanism of action of canthin-6-one (1), its effect on cell cycle distribution of PC-3 cells
was assessed by flow cytometry with detection of PI-stained DNA. In controls, distribution of
PC-3 cells in the cell cycle was consistent with previous studies: 58% of cells were in G1
phase, 22% in S phase and 20% in G2 or mitosis.25 After 48 h incubation with 1 (40 µM) PC3 cells showed a clear accumulation in G2/M, characterized by 4N DNA content (Figure 3).
As the proportion of G2/M cells increased from 20% to 48% in response to 1, cells in G1
phase correlatively decreased from 58% to 38% and those in S phase from 22% to 13%
(Figure 3). These observations suggest that this drug interferes with processes occurring in
the late S phase and/or in G2, leading to G2/M checkpoint induction. Since this checkpoint
9
prevents cells from entering mitosis
m
when DNA is damaged, leaving the cells
cel enough time
and giving them the opportunit
nity to repair their DNA, these results raise the
he possibility that
canthin-6-one (1) treatment ma
may result in DNA lesions, directly or indirectl
ctly. The putative
genotoxicity of this drug or its derivatives has not been examined so far, and thus will deserve
further investigations. Howeve
ver, given that this drug is only poorly proapop
optotic, its effect on
the cell cycle could be heighten
tened with the use of molecules that abrogatee the
th G2/M
checkpoint (ex: caffeine), an at
attractive therapeutic strategy that has emerged
ged in the last
decade.26 Alternatively, canthin
thin-6-one (1) may also interfere with the mitoti
totic spindle, thereby
leading to G2/M arrest. The pu
putative effects of this drug on mitosis were thus
thu investigated.
Figure 3. Canthin-6-one (1) induces
in
accumulation of PC-3 cells in G2/M.. P
PC-3 cells were
treated for 2 days with either 1 (40 µM) or 0.2% DMSO (control). Cells were
we fixed and
stained with propidium iodide
de before analyzing cell cycle distribution by flow
flo cytometry.
Single cells (at least 20,000 pe
per condition) were sorted according to the inte
ntensity of PIlabeling: 2N DNA content (PI
PI = 100) was interpreted as cells in G1, 4N DNA
DN content (PI =
200) was interpreted as cellss in G2 and mitosis (M), cells in the intermediat
iate state (100 < PI <
200) were interpreted as replic
licating their DNA (S). Percentage of cells in G1,
G S and G2/M
phases were reported in tables.
es. Results are expressed as mean ± s.e.m. of 3 independent
cultures superimposed on thee ggraph.
10
Effect of Canthin-6-one (1)
(1 on Mitosis. To analyze the effect of canthin
thin-6-one (1) on the
M phase of the cell cycle, mito
itotic spindles were visualized by tubulin immu
munolabeling (Figure
4A). The proportion of mitotic
tic cells in a control culture was 2.5% (Figure 4B),
4
in agreement
with previous reports on PC-33 cells and consonant with the notion that mito
itosis contributes 3060 min of the 24 h cell cycle.277, 28 After 48 h treatment with 1, mitotic spind
indles were observed
in 0.4% of the cells, correspond
onding to an 80% decrease in frequency (Figure
ure 4B). No evident
distortion of the mitotic spindle
dles could be observed in the presence of 1 (Fig
Figure 4A). In
addition, 1 had no effect on tubulin
tub
polymerization, in vitro (Figure 4C). Th
The data suggest that
canthin-6-one (1) delayed thee entry
e
into mitosis, thereby causing the G2/M
M cell accumulation
described above.
Figure 4. Mitotic spindles are
re less frequent in the presence of canthin-6-one
one (1). PC-3 cells
were treated for 2 days with eit
either 1 (40 µM) or 0.2% DMSO (control). (A)
A) β-Tubulin
β
immunofluorescence revealed
ed normal-looking mitotic spindles in both contr
ntrol and 1-treated
cells (scale bar: 20 µm). (B) Pe
Percentage of mitotic cells in random microsco
scope fields of
control and 1-treated culturess (at
( least 6,000 cells were counted in each grou
roup). (C) Tubulin
polymerization in vitro was me
measured by absorbance at 350 nm in the prese
esence of 1 (25 µM)
or DMSO.
11
Evaluation of Canthin-6-one (1) Cytotoxicity on Normal Human Dermal Fibroblasts.
If canthin-6-one (1) is to become of therapeutical value, its antiproliferative effect on cancer
cells should not be sullied by cytotoxic effects on normal cells. To examine this point, the
effect of increasing doses of 1 on normal human dermal fibroblasts (NHDF) was monitored
by MTT assay and morphological observations. Up to 20 µM canthin-6-one (1), NHDF were
not drastically affected by the treatment, with more than 80% viability according to MTT
assay and normal morphology of the cell population (Figure 5). When treated with 40 µM of
1, a concentration that completely blocked cell growth of most proliferative cancer cell lines,
NHDF viability remained at 80% (Figure 5). At 80 µM of 1, NHDF viability was significantly
decreased (64%, Figure 5). The highest concentration tested (160 µM) induced a sharp drop
of cell viability (33%) accompanied by morphological evidence of toxicity (Figure 5). Halfmaximal inhibition of NHDF viability by 1 was estimated at 115 µM, whereas it was 5-20 µM
on cancer cell lines. Previous study pointed that proapoptotic and toxic activity of 1-methoxycanthin-6-one on Jurkat leukemia cell line was not detected on peripheral blood mononuclear
cells from normal donors.16 The very low cytotoxicity of canthin-6-one (1) on NHDF at
concentrations that efficiently inhibit cancer cell proliferation is an encouragement for further
examination of its potential as an anticancer drug.
12
Figure 5. Canthin-6-one (1) cytotoxic effects on normal human dermal fibroblasts cells
(NHDF). Viability of NHDF was investigated after 3 days in the presence of 1 at indicated
concentrations, or DMSO in controls. MTT test results are expressed as percentage of
viability (mean ± s.e.m., n = 3). Morphologic observations were reported as (+) for normal
cell population, (+/-) for growth inhibition, (-) for toxicity and (0) for mortality.
Canthin-6-one (1) is a natural substance produced by plants used in traditional medicine.29
Indeed, this compound already proved its therapeutic potential in antimalarial treatments and
its low toxicity in murine model suggests it may be considered for long term therapies.30, 31, 20
The recently formulated hope to discover new anticancer agents among antimalarial
substances,1, 2 receives further support from the present study, as it describes a strong
antiproliferative effect of this drug on cancer cells and narrows down its mechanism of action
on a delayed transition from G2 to mitosis. This warrants further studies aimed at elucidating
the origin of this modification of the cell cycle, whether it is due to DNA damage or to an
inhibition of G2 to M transition enzymes. The effect of 1 on yeast growth may help solve this
issue because of the genetic amenability of the yeast model system.11 Previous studies have
argued for a strong pharmacological potential of drugs that stop cells in the G2/M phase of the
cell cycle.32 However the damages caused by aristolochic acid, another natural substance that
stops cancer cells in G2/M, call for caution.33, 34 Further studies on the mechanism of action of
13
canthin-6-one (1) should be paralleled by thorough studies of its tissue toxicity, before it can
be considered useful for clinical purpose.
EXPERIMENTAL SECTION
Chemicals and Reagents. Canthin-6-one (1) was purchased at Alpha Chimica (ChâtenayMalabry, France).35 The purity of 1 (99%) was determined by GC (supplier’s product
specification). 1 was dissolved in DMSO to a concentration of 80 mM and stored at -20°C. 1
was added to the cell cultures from a 50-fold concentrated solution extemporaneously
prepared in 10% DMSO. Culture media were from Life Sciences Technologies (Cergy
Pontoise, France). All laboratory chemicals were from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin
Fallavier, France).
Cell Proliferation Assay. A panel of six cell lines: human prostate adenocarcinoma PC-3,
human colon adenocarcinoma HT-29, human cervix epitheloid carcinoma cells HeLa, human
leukemic T cell lymphoblast Jurkat, rat glioma C6 and mouse embryonic fibroblasts NIH-3T3
(all from ECACC-Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) were used to study
antiproliferative activity. Cells were cultured at 37°C, 5% CO2, in appropriate medium
supplemented with 100 U/mL penicillin-streptomycin, 2 mM glutamine and 10% fetal calf
serum (FCS) (all from Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France): Ham’s F12 for PC-3
cells, RPMI for Jurkat cells, DMEM for HT-29, HeLa, C6 and NIH-3T3 cells. Growth curves
and dose-response curves were established by cell counts in 24-wells plates. Cells were
seeded at 40,000 per well and cultured for the indicated time, with the indicated concentration
of 1 or with 0.2% DMSO in controls. At each experimental point, quadruplicate wells were
trypsinized (except for Jurkat cells) and cells were counted in a Malassez chamber. Results
are expressed as mean ± s.e.m., n = 4.
14
Western Blot Analysis of Procaspase-3 Cleavage. The influence of canthin-6-one (1) on
procaspase-3 cleavage was investigated by western blot. Cells were seeded in 24-wells plates
(40,000 cells per well) and treated with 40 µM of 1 (10 µM and 30 µM for HeLa cells) or
with 0.2% DMSO in control conditions for 2-4 days. After rinsing in phosphate-buffered
saline (PBS), cells were scratched in 1 mL PBS and recovered by centrifugation (6,000 g for
30 s). Cell pellets were resuspended in Laemmli buffer 36 and then proteins were fractionated
by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (12.5% gels) and
electrotransferred on nitrocellulose membrane. Non-specific sites were blocked in PBS
containing 0.05% Tween-20 and 5% bovine serum albumin (PBS-Tween-BSA). Membranes
were incubated overnight at 4°C with a rabbit monoclonal antibody anti-caspase-3 (# 9665
from Cell Signaling Technology, Ozyme Saint-Quentin Yvelines France) diluted 1/1000 in
PBS-Tween-BSA. After rinsing in PBS-Tween-BSA, antigen-antibody complexes were
detected by Alexa-488-labeled goat anti-rabbit antibody (#A-11029 from Molecular Probes,
Life Technologies, Saint-Aubin, France) diluted 1/500 in PBS-Tween-BSA (2 h, room
temperature). β-Actin was used as loading control in western blot analysis. Nitrocellulose
membranes were blocked in PBS-Tween-BSA and then in normal goat serum 1/50 in PBSTween-BSA before incubation overnight at 4°C with a mouse monoclonal antibody anti-βActin (clone AC-15, #A5441, Sigma-Aldrich) diluted 1/1000 in PBS-Tween-BSA. Antigenantibody complexes were detected by Alexa-555-labeled goat anti-mouse antibody (#A-21422
Molecular Probes) diluted 1/500 in PBS-Tween-BSA. Fluorescence were measured on a laser
scanner (Typhoon Trio, GE Healthcare, Europe, Velizy-Villacoublay, France) coupled to the
ImageQuant software (GE Healthcare).
Flow Cytometric Analysis of Cell Cycle Arrest. Cell-cycle distribution after treatment
with 1 was determined by flow cytometry DNA analysis after cells stained with propidium
iodide (PI). PC-3 cells were seeded in 6-wells plates (100,000 cells in control groups and
15
200,000 cells in 1-treated groups) and cultured for 2 days with either 40 µM of 1 or control
0.2% DMSO. Cells were collected after incubation with 0.25% trypsin, 1 mM EDTA for 5
min at 37°C and resuspended in 150 µL PBS. Cells were immediately fixed by the addition of
850 µL cold 70% ethanol. After standing for 30 min at 4°C, cells were centrifuged,
resuspended in 1 mL of DNA-staining solution (5 µg/mL PI, 0.1% Triton X 100, 200 µg/mL
RNase A in PBS) and incubated for 2 h at room temperature in the dark. Cells were analyzed
using a BD FACSVerseTM flow cytometer (Becton Dickinson, BD Biosciences, Le Pont-deClaix, France). Fluorescence emitted from the PI-DNA complex was captured at 488 nm
using 20,000 single cells per sample and analyzed using a BD FACSuiteTM software (BD
Biosciences).
BrdU Incorporation. BrdU incorporation into DNA was monitored in PC-3 cells using a
commercially available immunodetection kit (#11 296 736 001 from Roche Applied
Bioscience, Mannheim, Germany) according to the manufacturer’s instructions. For
immunofluorescence microscopy, PC-3 cells were seeded in 4-wells chamber slides (10,000
cells per well) and cultured for 30 h with 1 (40 µM) or 0.2% DMSO in controls, before
addition of BrdU and further incubation for 18 h. Cells were briefly rinsed in PBS and fixed
in 500 µL 70% ethanol, 15 mM glycine (pH 2) for 20 min at -20°C. DNA denaturation was
achieved for 1 h at 37°C in 500 µL 2 N HCl, followed by neutralization with three rinses in
0.1 M borate (pH 9.5). After washing in PBS, non-specific sites were blocked for 2 h in PBSTween-BSA. Mouse monoclonal anti-BrdU antibody diluted 1/20 in PBS-Tween-BSA was
added for 1 h at 37°C and after rinsing in PBS-tween-BSA, Alexa 488-labeled goat antimouse antibody (#A-11029 from Molecular Probes, 1/400 in PBS-Tween-BSA) was added
and incubated for 1 h at room temperature. After a final rinse in PBS, preparations were
mounted in Mowiol 4.88 (Calbiochem, St-Quentin-en-Yvelines, France) and examined on a
fluorescence microscope (Olympus BX41, Olympus France, Rungis, France). For Southern
16
blot analysis of BrdU incorporation into DNA, 106 PC-3 cells were seeded in 25 cm2 flasks,
treated for 30 h and labeled for 18 h as described above. Cells were then washed with 10 mL
PBS and incubated for 3 h at 50°C in 600 µL of proteinase K Buffer (10 mM Tris pH 7, 150
mM NaCl, 0.5% SDS) and proteinase K (60 µg). The lysate was transferred into an Eppendorf
tube, 30 µL RNAse A (1 mg/mL) were added for incubation 1 h at 37°C. After 2 washes in 1
volume of phenol/chloroform (1:1) and 1 volume of chloroform, DNA was precipitated in
0.15 M sodium acetate (pH 6), 50% isopropanol (overnight, -20°C). DNA pellet was
recovered by centrifugation (13,000 g, 20 min), washed in 1 mL 70% ethanol and
resuspended in TE buffer (10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA). A 400 ng aliquot of DNA was
electrophoresed on a 1% agarose gel containing ethidium bromide, denatured and transferred
by capillarity on a nitrocellulose membrane. After crosslinking at 72° C for 2 h, ethidium
bromide DNA fluorescence was photographed on a UV light station coupled to Biocapt
software (Vilber Lourmat, Marne La Vallée, France). Nitrocellulose-immobilized DNA was
denatured with 2 N HCl for 1 hour at 37°C and washed twice with 0.1 M borate (pH 9.5).
Non-specific sites were blocked in PBS-Tween-BSA and the membrane was probed with
mouse monoclonal anti-BrdU antibody and Alexa 647-labeled donkey anti-mouse antibody
(#A31571 from Molecular Probes) as described above. Immunofluorescence was recorded on
a Typhoon scanner, quantified with ImageQuant TL and normalized to BrEt-induced DNA
fluorescence.
Tubulin Immunofluorescence. Mitotic spindles were labeled with anti-β-tubulin antibody
(#T4026 from Sigma-Aldrich). PC-3 cells were seeded in 4-wells chamber slides (10,000
cells per well) and cultured for 2 days with either 40 µM of 1 or 0.2% DMSO in controls.
Cells were fixed in 500 µL of 70% ethanol, 15 mM glycine pH 2 (20 min, -20°C) washed in
PBS, and non-specific sites were blocked in PBS-Tween-BSA. Incubation with a mouse antiβ-tubulin antibody 1/200 was performed for 2 h at 37°C and antigen-antibody complexes
17
were detected with Alexa 488-labeled goat anti-mouse antibody (#A-11029 from Molecular
Probes, 1/400 in PBS-Tween-BSA, 1 h at 20°C). After a final wash with PBS, preparations
were mounted in Mowiol 4.88 (Calbiochem) and examined on a fluorescence microscope
(Olympus BX41). At least 10,000 cells in each group were counted to determine the
percentage of cells in mitosis.
Viability Assay on Normal Human Skin Fibroblasts. Viability assay was performed by
BIOalternatives (Gencay, France). Normal Human dermal fibroblasts (NHDF) were cultured
for 3 days in DMEM medium supplemented with 10% FCS in the presence of increasing
concentrations of 1 (up to 160 µM) or equivalent concentrations of DMSO in controls. Methyl
thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction was measured by absorbance at 540 nm (results
expressed as mean ± s.e.m., n = 3) and microscopic observation of cell morphology was
performed.
Tubulin Polymerization in vitro. Tubulin polymerization assay in vitro was performed
by Ecrins Therapeutics (La Tronche, France). The assay was achieved in the presence of 50
µM tubulin and 1 mM GTP in polymerization buffer at 37°C. Tubulin polymerization was
measured (every 30 s for 40 min) by absorbance at 350 nm with a spectrometer (FLUOstar
Omega, BMG LABTECH, Champigny-sur-Marne, France) coupled to the OMEGA software,
in the presence of 1 (25 µM) or DMSO. Results are expressed as mean ± s.e.m., n = 3.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank Dr. T. Janet for providing us BrdU incorporation kit and anti-caspase3
antibody. The authors acknowledge Dr. A. C. Balandre, Dr. S. Bensalma and Dr. V. Coronas
for their valuable expertise in culture of primary cell lines and cancer cell lines. The authors
wish to thank Ms. L. Cousin and Ms. J. Colas for their technical assistance. O. Haïda and M.
Gestin are acknowledged for their participation during their undergraduate internship. This
18
work has benefited from the facilities and expertise of A. Delwail of ImageUP platform
(University of Poitiers). The authors are grateful to F. X. Bernard (BIOalternatives, Gençay)
for the cytotoxicity assays. C. Dejos was supported by a grant from the Région PoitouCharentes. This work was supported by an Action Concertée Incitative (Chimie-Biologie) of
the University of Poitiers.
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21
TABLE OF CONTENTS
22
Matériels et méthodes
Réactifs
La canthin-6-one, obtenue selon Soriano-Agaton et al. (2005), est commercialisée sous forme
de poudre (Alpha Chimica, Châtenay-Malabry, France). Son degré de pureté estimée en GC
par le fournisseur est de 99%. Une solution concentrée à 80 mM est préparée dans du DMSO
et stockée à -20°C. Pour traiter les cellules en culture, une solution à 20 mM est préparée
extemporanément à partir de la solution mère dans du DMSO 10%.
Culture des lignées cellulaires
Les lignées cellulaires (ECACC-Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) sont cultivées à
37°C sous atmosphère 95% d’air et CO2 5%, dans le milieu approprié (Life Sciences
Technologies, Cergy Pontoise, France), supplémenté en sérum de veau fœtal SVF 10%,
glutamine 2 mM et en antibiotiques pénicilline 100 U/mL et streptomycine 100 µg/mL
(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France).
Tableau 4 : Lignées cellulaires utilisées dans cette étude
Nom de la lignée
Type cellulaire et origine
Milieu de culture
PC-3
adénocarcinome humain de la prostate
Ham’s F12
HT-29
adénocarcinome humain du côlon
DMEM
HeLa
cancer du col de l’utérus humain
DMEM
cellules leucémiques lymphoblastiques
RPMI 1640 GlutaMax™
de type T humaines
(en suspension)
C6
gliome de rat
DMEM
NIH-3T3
fibroblastes embryonnaires murins
DMEM
Jurkat
Détermination du taux de prolifération des lignées par comptage cellulaire
Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits (40 000 cellules par puits), et traitées
avec de la canthin-6-one ou du DMSO 0,2% en condition contrôle. Les cellules sont
dissociées (150 µL de trypsine 0,25%, EDTA 1 mM, 10 min à 37°C, CO2
5% ; ou
simplement agitées par pipetage pour la lignée Jurkat), puis 150 µL de bleu Trypan 0.02%
sont ajoutés. Les cellules sont comptées sur une lame de Malassez. Quatre puits de culture
sont analysés par condition expérimentale.
32
Analyse par western blot du clivage de la procaspase-3
Les cellules sont cultivées dans des plaques 24 puits (40 000 cellules par puits), pendant 2 à 4
jours, en présence de canthin-6-one 40 µM (10 µM et 30 µM pour la lignée HeLa) ou de
DMSO 0,2%. Après un rinçage avec 1 mL de PBS (Phosphate Buffered Saline), les cellules
sont détachées du support par raclage dans 1 mL de PBS et récupérées par centrifugation
(6 000 g, 30 sec). Les culots cellulaires sont resuspendus dans du tampon Laemmli (Laemmli
1970) et les protéines sont séparées sur un gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 12,5% et électro-transférées sur une membrane de
nitrocellulose. Les membranes sont bloquées dans du PBS-Tween 20 0,05%-BSA 5% (PBSTween-BSA, 2 h, à température ambiante) puis incubées toute la nuit à 4°C, avec un anticorps
monoclonal, dirigé contre la procaspase-3, produit chez le lapin (#9665, Cell Signaling
Technology, Ozyme Saint-Quentin Yvelines France), dilué 1/1000 dans du PBS-Tween-BSA.
Après un rinçage PBS-Tween 20 0,05% (PBS-Tween), les complexes antigène-anticorps sont
détectés avec un anticorps secondaire goat-anti-rabbit couplé à un fluorophore Alexa-488
(#A-11029 Molecular Probes, Life Technologies, Saint-Aubin, France) dilué 1/500 dans du
PBS-Tween-BSA (2 h, à température ambiante). La protéine β-actine est utilisée pour
déterminer la quantité de protéine chargée par puits. Les membranes sont à nouveau bloquées
dans du PBS-Tween-BSA puis dans du sérum de chèvre dilué 1/50 dans du PBS-Tween-BSA.
Les membranes sont incubées toute la nuit 4°C, avec un anticorps monoclonal, dirigé contre
la β-actine, produit chez la souris (clone AC-15, #A5441, Sigma-Aldrich), dilué 1/1000 dans
du PBS-Tween-BSA. Les complexes antigène-anticorps sont détectés avec un anticorps
secondaire goat-anti-mouse couplé au fluorophore Alexa-555 (#A-21422Molecular Probes)
dilué 1/500 dans du PBS-Tween-BSA. La fluorescence des anticorps secondaires est mesurée
sur un scanner laser (Typhoon Trio, GE Healthcare, Europe, Velizy-Villacoublay, France)
couplé au logiciel ImageQuant (GE Healthcare).
Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux
Les cellules PC-3 sont ensemencées dans des plaques 6 puits : 200 000 cellules par puits en
présence de canthin-6-one 40 µM ou 100 000 cellules par puits en présence de DMSO 0,2%.
Après 2 jours de culture, les cellules sont dissociées avec de la trypsine 0,25%, EDTA 1 mM
(5 min à 37°C, CO2 5%). Les cellules sont resuspendues dans 150 µL de PBS et
immédiatement fixées par ajout de 850 µL d’éthanol 70% froid. Après 30 min à 4°C, les
cellules sont collectées par centrifugation (6 000 g, 30 sec) et resuspendues dans 1 mL de
solution pour le marquage de l’ADN (iodure de propidium 5 µg/mL, Triton X100 0,1%,
RNase A 200 µg/mL, dans du PBS). Le marquage est réalisé pendant 2 h à température
33
ambiante à l’obscurité. Les cellules sont analysées sur un cytomètre de flux BD
FACSVerseTM (Becton Dickinson, BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, France) couplé au
logiciel BD FACSuiteTM (BD Biosciences). La fluorescence émise par l’ADN marquée par
l’iodure de propidium est mesurée à 488 nm en analysant 20 000 évènements par échantillon.
Analyse de l’incorporation de BrdU (5-bromo-2’-deoxyuridine) dans l’ADN néosynthétisé
par southern blot
L’incorporation de BrdU dans l’ADN des cellules PC-3 a été réalisée suivant les instructions
du kit BrdU Labeling and Detection kit (11 296 736 001, Roche). Les cellules PC-3 sont
ensemencées dans des flacons de 25 cm2 : 1 million de cellules en présence de canthin-6-one
40 µM ou 500 000 cellules en présence de DMSO 0,2%. Les cellules sont cultivées pendant
30 h, avant d’ajouter la BrdU et de prolonger la culture pendant 18 h. Les cellules sont lavées
avec 10 mL de PBS puis incubées 3 h à 50°C sous agitation dans 600 µL de tampon de lyse
(Tris 10 mM pH 7, NaCl 150 mM, SDS 0,5%, protéinase K 60 µg). Les lysats sont incubés en
présence de 30 µL de RNAse A (1 mg/L) pendant 1 h à 37°C. La phase aqueuse est extraite
deux fois avec un volume de phénol/chloroforme (1:1) puis une fois avec un volume de
chloroforme. L’ADN génomique est précipité dans de l’acétate de sodium 0,15 M pH 6,
isopropanol 50% (toute une nuit, à -20°C). Le culot ADN est récupéré par centrifugation
(15 000 g, 20 min), lavé avec 1 mL d’éthanol 70%, séché (10 min, à température ambiante) et
repris dans 30 µL de TE (Tris 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM). L’ADN (400 ng) migre sur un
gel d’agarose 1% contenant du BEt (bromure d’éthidium), avant d’être dénaturé et transféré
par capillarité sur une membrane de nitrocellulose. L’ADN est ponté sur la membrane (2 h, à
72°C) puis la fluorescence du BEt est révélée sous lumière UV dans une station couplée au
logiciel Biocapt (Villber Lourmat, Marne La Vallée, France). L’ADN est dénaturé dans du
HCl 2 N (1 h, à 37°C) et lavé deux fois dans du borate 0,1 M pH 9,5. La membrane est
bloquée dans du PBS-Tween-BSA puis incubée avec un anticorps monoclonal, dirigé contre
la BrdU, produit chez la souris (1 h, à 37°C, kit Roche), dilué 1/20 dans du PBS-Tween-BSA.
Les complexes anticorps-antigène sont révélés avec un anticorps donkey-anti-mouse couplé
au fluorophore Alexa-647 (A31571, Molecular Probes) dilué 1/300 dans le PBS-Tween-BSA
(2 h, à température ambiante). La fluorescence est détectée sur un scanner laser Typhoon™
couplé au logiciel ImageQuant TL et normalisée par la fluorescence BEt.
Immunofluorescence BrdU sur les cellules en culture
Les cellules PC-3 sont ensemencées dans des lames 4 puits (10 000 cellules par puits) et
cultivées en présence de canthin-6-one 40 µM ou de DMSO 0,2%, pendant 30 h avant
34
d’ajouter la BrdU et de prolonger la culture pendant 18 h. Après un rinçage PBS, les cellules
sont fixées dans 500 µL d’éthanol 70%, glycine 15 mM pH 2,5 (20 minutes, à -20°C).
L’ADN est dénaturé dans 500 µL de HCl 2 N (1 h, à 37°C) puis l’acide est neutralisé par trois
rinçage avec du borate 0,1 M pH 9,5. Après un rinçage PBS, les sites non spécifiques sont
bloqués dans du PBS-Tween-BSA puis les cellules sont incubées 1 h à 37°C avec un
anticorps monoclonal, dirigé contre la BrdU, produit chez la souris (kit Roche), dilué 1/20
dans le PBS-Tween-BSA. Les complexes antigène-anticorps sont détectés avec un anticorps
goat-anti-mouse couplé au fluorophore Alexa-488 (#A-11029, Molecular probes) dilué 1/400
dans du PBS-Tween-BSA. Après un rinçage PBS-Tween, les préparations sont montées dans
du Mowiol® (Mowiol 4.88, Calbiochem) et observées sous microscope à fluorescence
(Olympus BX41, Olympus France, Rungis, France).
Immunofluorescence β-tubuline sur les cellules en culture
Les cellules PC-3 sont ensemencées dans des lames 4 puits (10 000 cellules par puits) et
cultivées en présence de canthin-6-one 40 µM ou de DMSO 0,2% pendant 48 h. Après un
rinçage PBS, les cellules sont fixées dans 500 µL d’éthanol 70%, glycine 15 mM pH 2,5 (20
minutes, à -20°C). Les sites non spécifiques sont bloqués dans du PBS-Tween-BSA et les
cellules sont incubées 2 h à 37°C avec un anticorps monoclonal, dirigé contre la β-tubuline,
produit chez la souris (T4026, Sigma-Aldrich), dilué 1/200 dans le PBS-Tween-BSA. Les
complexes antigène-anticorps sont détectés avec un anticorps goat-anti-mouse couplé au
fluorophore Alexa-488 dilué 1/400 dans du PBS-Tween-BSA. Après un rinçage PBS-Tween,
les préparations sont montées dans du Mowiol® et observées sous microscope à fluorescence.
35
Conclusions
Cette étude montre que les effets antiprolifératifs de la canthin-6-one reposent sur une
accumulation des cellules dans les phases G2 ou M du cycle cellulaire. Plusieurs mécanismes
d’action peuvent alors être envisagés :
- la canthin-6-one perturbe la division cellulaire ;
C’est le cas des alcaloïdes vinca et des taxanes qui empêchent la mitose en interférant avec la
dynamique des microtubules du fuseau mitotique (Himes 1991, Sudo et al. 2004). Cette
hypothèse n’est pas privilégiée, car la canthin-6-one n’interfère pas avec la polymérisation de
la tubuline in vitro.
- la canthin-6-one freine la progression des cellules cancéreuses dans le cycle
cellulaire en modifiant leur métabolisme ;
C’est le cas de certains taxanes (paclitaxel et docetaxel) qui agissent notamment sur la
glycolyse, le cycle de Krebs ou le métabolisme lipidique (Zhao et al. 2013). Les travaux de
Lagoutte et al. (2008) concernant les effets antifongiques de la canthin-6-one suggéraient
qu’elle modifie le métabolisme lipidique chez la levure S. cerevisiae. Afin de reproduire ces
résultats, nous avons analysé en présence de canthin-6-one les proportions des acides gras les
plus abondants chez la levure (acide palmitique C16:0, acide palmitoléique C16:1, acide
stéarique C18:0 et acide oléique C18:1) par chromatographie en phase gazeuse. Cependant,
aucune modification de la proportion de ces acides gras n’a été observée (résultats non
illustrés). Ces auteurs suggéraient également que la canthin-6-one-N-oxide (analogue
fluorescent dans le vert de la canthin-6-one) s’accumule dans les gouttelettes lipidiques
(Lagoutte et al. 2008). Dans des conditions de traitement identiques, nous avons observé par
microscopie de fluorescence que la canthin-6-one-N-oxide est présente dans des vacuoles,
mises en évidence par l’expression de la protéine vacuolaire Vph1 tagguée avec la protéine
fluorescente rouge RFP (résultats non illustrés). Ainsi, ces résultats n’indiquent pas que la
canthin-6-one modifie le métabolisme lipidique ou s’accumule dans les gouttelettes lipidiques
chez la levure. Même si ces résultats n’excluent pas un effet sur le métabolisme lipidique des
cellules cancéreuses, cette hypothèse n’est pas privilégiée.
- la canthin-6-one active le point de contrôle des dommages à l’ADN entre la
phase G2 et la mitose.
Les dommages à l’ADN, causés par des molécules naturelles, peuvent être provoqués par une
interaction directe avec l’ADN ou avec des protéines se liant à l’ADN. Par exemple, l’acide
aristolochique, présent dans des plantes de la pharmacopée chinoise, introduit des mutations
par formation d’adduits avec l’ADN (Hoang et al. 2013). Des cassures simple brin peuvent se
produire pendant la réplication, comme c’est le cas avec l’irinotécan et l’étoposide (Marsh et
36
Hoskins 2010, Tammaro et al. 2013). Enfin, les effets anticancéreux de la curcumine, extraite
du rhizome Curcuma longa, sont notamment dus à des cassures double brin de l’ADN (Jiang
et al. 2010). Les résultats présentés ci-après, obtenus avec comme modèle cellulaire la levure
S. cerevisiae, tendent à nous orienter vers l’hypothèse d’un effet de la canthin-6-one, direct ou
indirect, sur l’ADN avec pour conséquence une activation du point de contrôle G2/M dans les
cellules animales.
La levure S. cerevisiae a en effet été choisie comme modèle de cellules eucaryotes
pour essayer d’obtenir des précisions sur le mode d’action de la canthin-6-one. En effet, les
mécanismes moléculaires impliqués dans la division cellulaire sont conservés chez les
eucaryotes, ce qui fait de la levure S. cerevisiae un modèle pertinent pour l’étude du mode
d’action des effets antiprolifératifs de la canthin-6-one. Dans un premier temps, une approche
génétique a été privilégiée. Les résultats présentés dans le chapitre suivant sont consacrés à la
recherche de gènes suppresseurs de l’effet de la canthin-6-one chez la levure.
37
Chapitre 2. Caractérisation du mode d’action de la canthin-6-one chez la levure
Saccharomyces cerevisiae
Introduction
La levure est un modèle d’étude possédant de nombreux avantages : facilitée de
manipulation et de culture, croissance à l’état haploïde ou diploïde, possibilité de réaliser de
nombreuses manipulations génétiques, génome entièrement séquencé, banques de souches
mutantes disponibles etc. L’existence de collections de souches de levures mutantes et leur
criblage de façon automatisé, fait de ce modèle cellulaire un outil puissant pour l’analyse des
cibles de molécules biologiquement actives (Hoon et al. 2008). Chez la levure, plusieurs
approches génétiques permettent d’étudier le mécanisme d’action de xénobiotiques à
différents niveaux : description du phénotype induit par une drogue, identification du
processus cellulaire altéré par cette drogue et finalement identification de sa cible in vivo.
Chez la levure, la modification du taux de croissance et la viabilité en présence d’une drogue
sont des paramètres simples à mesurer. Plusieurs approches par criblage consistent donc à
analyser en présence d’une drogue la sensibilité de souches mutantes, possédant un dosage
modifié pour un gène spécifique (figure 4 d’après Hoon et al. 2008) :
- identification de gènes responsables d’une haplo-insuffisance (Drug-induced
HaploInsufficency Profiling) : dosage du gène d’intérêt = 50% (figure 4 A et tableau 4).
L’haplo-insuffisance consiste en l’apparition d’un phénotype différent de celui de la souche
de référence lorsqu’une copie d’un gène est absente. Le criblage est réalisé sur une banque de
levure diploïdes, possédant chacune une hétérozygotie pour un gène spécifique (Hoon et al.
2008). Le taux de croissance de chacune de ces souches est comparé dans des cultures en
milieu liquide en présence de la drogue. Cette analyse peut être couplée à la technologie des
puces à ADN, pour analyser la proportion des souches, étiquetés et mélangés dans une culture
liquide (Smith et al. 2010). L’avantage de cette approche est de pouvoir identifier des gènes
cibles de la drogue, même s’il s’agit de gènes essentiels pour la survie puisqu’une seule copie
du gène cible est inactivée (Hoon et al. 2008). La recherche de profils haplo-insuffisants est
une méthode dont l’efficacité et la fiabilité a été démontrée dans de nombreuses études (réf.
dans Smith et al. 2010, voir aussi tableau 4).
- identification de gènes dont la délétion confère un phénotype résistant vis-à-vis
d’une drogue (Homozygous Profiling) : dosage du gène d’intérêt = 0% (figure 4 B et tableau
4). Le criblage est réalisé sur une banque de levures diploïdes, chacune possédant la délétion
des deux copies d’un gène spécifique, ou sur une banque de souches haploïdes (Hoon et al.
2008). Comme dans la recherche de gènes responsables d’une haplo-insuffisance, le taux de
38
croissance des souches est comparé en culture liquide et l’analyse peut être réalisée sur une
puce à ADN pour déterminer la proportion des souches étiquetées et mélangées en culture
liquide (Smith et al. 2010). Elle exclue l’identification du gène cible s’il est nécessaire pour la
survie (mutant non viable). Néanmoins, l’avantage est de pouvoir identifier un phénotype
résistant dans le cadre d’une abolition complète de l’expression de la protéine cible (Hoon et
al. 2008).
- identification de gènes dont la surexpression confère un phénotype résistant visà-vis d’une drogue (Multi-copy Suppression Profiling) : dosage du gène d’intérêt > 100%
(figure 4 C et tableau 5). Le criblage est réalisé sur des levures transformées avec une banque
de plasmides multicopies (portant par exemple des séquences génomiques) ou de plasmides
permettant la surexpression d’un gène particulier (Hoon et al. 2008). La croissance des
souches est comparée sur milieu solide ou en milieu liquide, contenant une concentration de la
drogue inhibant fortement la souche de référence (Smith et al. 2010). Cette approche exclue
l’identification de gènes dont la surexpression serait toxique, ou de protéines dont l’activité
nécessite la présence de partenaires qui ne seraient pas eux aussi surexprimés (Hoon et al.
2008). Les gènes paralogues, codant pour des protéines dont la fonction est redondante, sont
tous identifiés si cette fonction est nécessaire pour obtenir un phénotype résistant (Hoon et al.
2008).
Ces différentes approches génétiques ont permis de rechercher ou de confirmer
l’identité de protéines cibles de différentes drogues (tableau 5, d’après Smith et al. 2010).
Nous avons choisi de rechercher des gènes dont la surexpression confère un phénotype
résistant vis-à-vis de la canthin-6-one. Pour cela, nous avons testé, sur milieu solide, la
sensibilité à la canthin-6-one de levures transformées avec une banque d’ADN génomique,
construite dans un plasmide multicopies. Cette approche génétique a mené à l’identification
de plusieurs gènes suppresseurs dont l’étude est présentée dans ce chapitre de thèse. Le
facteur de transcription Yap1, activé en réponse à un stress cellulaire, fait partie des gènes
suppresseurs identifiés. Le mécanisme de résistance dépendant de YAP1 est décrit dans la
publication présentée ci-dessous (Dejos et al. 2013). Une seconde partie de ce chapitre est
consacrée à la présentation des régions chromosomiques portées par les autres plasmides
identifiés lors de ce criblage.
39
Figure 4 : Approches génétiques pour l’identification des cibles d’une molécule toxique
chez la levure (d’après Hoon et al. 2008)
40
Tableau 5 : Identification de protéines cibles de molécules toxiques par approche
génétique chez la levure (d’après Smith et al. 2010)
HIP : Drug-induced HaploInsufficency Profiling ; HOP : Homozygous Profiling ; MSP :
Multi-copy Suppression Profiling.
Molécule
Tunicamycine
(antibiotique)
Protéine cible
Méthode
de criblage
Alg7 : enzyme de glycosylation
MSP/HIP
Dfr1 : dihydrofolate réductase
HIP
Méthotrexate
(cancer, maladies autoimmunes)
Fluconazole
(antifongique)
Erg1 : enzyme de la voie de synthèse l’ergostérol HIP
Rapamycine
(immunosupresseur,
Tor1 : protéine kinase
HIP/MSP
Glc7 : sérine/thréonine phosphatase
HIP/MSP
transplantation rénale)
Calyculine A
(cancer)
Fenpropimorph
(fongicide)
Alverine citrate
(relaxant des muscles lisses)
Lovastatine
(dyslipidémie)
Molécules provoquant des
dommages à l’ADN
Hmg1 : HMG-CoA réductase
HIP
Protéines Rad
HOP
41
Résumé de l’article
The MSF-type efflux pump Flr1 induced by Yap1 promotes canthin-6-one resistance in yeast
L’objectif de cette étude était de préciser le mode d’action de la canthin-6-one. Le
criblage d’une banque d’ADN génomique de levure S. cerevisiae, construite dans des
plasmides multicopies, a été réalisé dans le but d’identifier des gènes dont la surexpression
confère une résistance à la canthin-6-one. En effet, les effets toxiques d’une molécule peuvent
diminuer si l’augmentation du dosage d’un gène modifie la stœchiométrie entre cette drogue
et une protéine cible. Ainsi, il est possible d’identifier une voie de signalisation affectée par
une molécule toxique ou la cible d’une drogue in vivo. Cette approche génétique a permis
d’isoler le gène YAP1, codant pour un facteur de transcription activé en réponse à de
nombreux stress cellulaires, dont le stress oxydant ou une génotoxicité (Zhang et al. 2011).
Dans une souche sauvage de référence, lors d’un fort stress oxydant (en présence d’H2O2)
l’accumulation de la protéine Yap1 étiquetée GFP est nettement visible dans le noyau. Tandis
qu’en présence de canthin-6-one, la protéine Yap1-GFP reste majoritairement localisée dans
le cytoplasme. Ce résultat suggère que la canthin-6-one ne déclenche pas un fort stress
oxydant. Toutefois, la transcription du gène TRX2 (enzyme thiorédoxine activée en réponse à
un stress oxydant) est augmentée de 2,6 fois en présence de canthin-6-one et l’addition de
molécules antioxydantes (N-acétyl-cystéine ou glutathion) en culture sur milieu solide,
diminue la sensibilité de souches de références vis-à-vis de la canthin-6-one. L’équilibre
oxydo-réducteur de la cellule semble donc être affecté en présence de cette drogue, mais ce
déséquilibre ne semble pas à lui seul responsable de l’effet antifongique de la canthin-6-one.
La surexpression de certains gènes peut aussi atténuer les effets d’une drogue par l’activation
d’un processus de dégradation ou d’expulsion, faisant chuter sa concentration intracellulaire.
La surexpression du gène YAP1 induit une forte activation transcriptionnelle du gène FLR1,
codant pour une pompe d’efflux membranaire. De plus, la surexpression de YAP1 ne confère
pas de phénotype résistant si le gène FLR1 est délété. Inversement, la surexpression de FLR1
n’induit pas de phénotype résistant en absence de YAP1. Ainsi, un processus d’expulsion de la
canthin-6-one via la pompe Flr1 semble se mettre en place dès lors que le facteur de
transcription Yap1 est surexprimé. L’identification du gène suppresseur YAP1 n’a pas permis
de comprendre le mode d’action de la canthin-6-one. Cependant, il est important de savoir,
dans le cadre du développement thérapeutique d’une molécule, qu’un mécanisme de
résistance peut se mettre en place via son expulsion par une pompe d’efflux.
42
Article
The MSF-type efflux pump Flr1 induced by Yap1 promotes canthin-6-one resistance in yeast
43
FEBS Letters 587 (2013) 3045–3051
journal homepage: www.FEBSLetters.org
The MFS-type efflux pump Flr1 induced by Yap1 promotes
canthin-6-one resistance in yeast
Camille Dejos, Matthieu Régnacq, Marianne Bernard, Pierre Voisin, Thierry Bergès ⇑
Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires, CNRS FRE 3511, Université de Poitiers, Poitiers, France
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 6 May 2013
Revised 17 July 2013
Accepted 18 July 2013
Available online 31 July 2013
Edited by Judit Ovádi
a b s t r a c t
Screening for suppressors of canthin-6-one toxicity in yeast identified Yap1, a transcription factor
involved in cell response to a broad range of injuries. Although canthin-6-one did not promote a significant oxidative stress, overexpression of YAP1 gene clearly increased resistance to this drug. We
demonstrated that Yap1-mediated resistance involves the plasma membrane major-facilitatorsuperfamily efflux pump Flr1 but not the vacuolar ATP-binding-cassette transporter Ycf1. FLR1 overexpression was sufficient to reduce sensitivity to the drug, but strictly dependent on a functional
YAP1 gene.
Ó 2013 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords:
Saccharomyces cerevisiae
Canthin-6-one resistance
Transcription factor
Membrane efflux pump
1. Introduction
Canthin-6-one alkaloids are naturally produced by plants
belonging to the Simaroubaceae, Zygophyllaceae and Rutaceae
families [1–3]. They exhibit a broad spectrum of antimicrobial [4]
and antifungal activities [3]. Antiparasitic properties have also
been reported [5–7] and decoctions of canthin-6-one producing
plants are used in the treatment of malaria and leishmaniasis in
South America. Traditional medicine also uses these natural products as antipyretic agents and for the treatment of gastric ulcers
and diarrhea [8]. One of these compounds, 1-methoxy-canthin-6one, displayed cytotoxic and antiproliferative effects in human cell
cultures [9] and induced apoptosis via a JNK-dependent mechanism [10]. Considering this wide range of biological activities as
well as their very low toxicity on normal cells, these molecules
may represent a potent alternative to current chemotherapies that
display numerous drawbacks. Yet very little is known about the
mechanism of action of these molecules, their cellular targets,
nor the way cells may cope with them to reduce or suppress their
efficacy. A link between the antifungal activity of canthin-6-one
and fatty acid metabolism has been reported [11] in the yeast Saccharomyces cerevisiae: upon treatment with a sub-inhibitory concentration of the drug, the proportion of unsaturated fatty acids
⇑ Corresponding author. Address: Institute of Cellular Physiology and Biology,
CNRS FRE3511, University of Poitiers, 1 rue Georges Bonnet, 86022 Poitiers Cedex,
France. Fax: +33 549 45 40 14.
E-mail address: [email protected] (T. Bergès).
tended to increase, more particularly 9-hexadecenoate (C16 :1),
suggesting that canthin-6-one stimulated desaturase enzyme systems. This hypothesis was not addressed, however, nor was the
status of the sole alkyl chain fatty acid desaturase of yeast (Ole1)
examined after drug treatment. Consistent with a putative effect
on lipid metabolism, a fluorescent derivative of canthin-6-one
co-localized with cytoplasmic lipid droplets after rapid uptake by
yeast cells [11]. This subcellular localization, if confirmed in human
cells, may be in relation with the analgesic, antipyretic and antiinflammatory effects of these drugs. Indeed cyclooxygenase-2
(COX-2) and prostaglandin-E2 (PGE2) synthesis involved in the
inflammatory response and responsible for the elevated body temperature and fever was shown to reside in lipid bodies of colon
cancer cells [12]. Thus one can speculate that these molecules
when accumulated in lipid droplets may interfere with PGE2 production. This hypothesis is not in contradiction with a recent study
showing that anti-ulcer activity of canthin-6-one does not involve
PGE2 synthesis in animal models whereas treatment with this drug
rather resulted in a mild decrease of PGE2 production [8]. Considering that inhibition of PGE2 synthesis with aspirin significantly reduced cell proliferation of the CACO-2 colon cancer cell line [12],
this putative effect of canthin-6-one derivatives on PGE2 production would certainly deserve to be addressed.
In order to get a better insight into the mechanism of action of
these drugs, we screened a yeast genomic library in S. cerevisiae to
isolate high-copy-number suppressors of canthin-6-one sensitivity. Among the genes selected with this strategy we isolated the
0014-5793/$36.00 Ó 2013 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2013.07.040
3046
C. Dejos et al. / FEBS Letters 587 (2013) 3045–3051
yeast AP1 homologue (YAP1), a gene involved in cell response to
various stress, more particularly oxidative stress [13,14], and pleiotropic drug resistance in high-copy number [15,16]. More recently,
the involvement of Yap1 in response to genotoxic insults has also
been reported [17]. In this study we showed that plasmid-borne
overexpression of YAP1 leads to canthin-6-one resistance via the
major-facilitator-superfamily (MFS) transporter Flr1 involved in
the efflux of a broad range of cytotoxic molecules [15,18,19].
or 80 lM and DMSO 0.2% in control conditions. Growth rate was
monitored by recording absorbance over time (OD600 nm).
2.4. Spotting assays
2. Materials and methods
For spotting assays, single colonies of S. cerevisiae from plate
cultures were suspended in sterile water, serially diluted (10 2,
10 3, 10 4, 10 5) and spotted on YPG pH6 containing 10, 20, 30
and 40 lM canthin-6-one or 0.2% DMSO for control conditions
and grown for 5–7 days at 28 °C.
2.1. Yeast strains, culture conditions and plasmids
2.5. RNA extraction
All S. cerevisiae strains used in this study are listed in Table 1.
Cells were plated on YPD complete medium and strains containing
plasmids were plated on YNB minimal medium supplemented
with appropriate nutrients for maintenance of plasmids and grown
routinely at 28 °C. Culture media containing canthin-6-one were
buffered at pH 6 with sodium phosphate. The yeast genomic
DNA library constructed in YEp13 was a kind gift from Dr. Roger
Schneiter (Fribourg University). Plasmids pRS426-Yap1-Myc for
overexpression of YAP1, pRS314-GFP-Yap1 allowing production of
a GFP-tagged Yap1 and pFLR1-K2 for overexpression of FLR1 were
generously provided by Dr. Michel Toledano (Commissariat à
l’Energie Atomique et aux Energies Alternatives, France), Dr. Yoshiharu Inoue (Kyoto University) and Dr. Helmut Jungwirth (Graz University) respectively.
Three independent cultures of wild-type strain with and without the plasmid for YAP1 overexpression were pre-grown overnight and then inoculated in fresh medium to an initial OD600 nm
of 0.1. When cultures reached 0.5 OD/ml they were treated for
1 h with 40 lM canthin-6-one or 0.2% DMSO for control conditions. Total RNA extraction was performed as previously described
by Li et al. [20]. Briefly, cells (equivalent to 2.5 OD600 nm units) were
collected by centrifugation and washed in water before suspension
in isolation buffer (10 mM EDTA; 50 mM Tris–HCl; SDS pH 6).
Then, cells were lysed by incubation for 5 min at 65 °C. The cell lysate was immediately placed on ice before adding 200 ll 0.3 M KCl.
Supernatant was recovered by centrifugation (12 000 rpm for
10 min at 4 °C) and total RNA was extracted with phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). RNA precipitation was performed
overnight at 80 °C in 3 M sodium acetate pH 5.2 (0.1 vol) and isopropanol (2.5 vol). RNA pellet was recovered by centrifugation
(13 000 rpm for 20 min at 4 °C), washed with 70% cold ethanol,
dried at room temperature and resuspended in DEPC-treated
water. RNA quantification was performed by absorbance analysis
at 260 nm and adjusted to 0.25 lg/ll. For cDNA synthesis, 1 lg
of total RNA was used for RT with 50 ng random hexamers (GE
Healthcare Europe, Saclay, France) and Moloney Murine Leukemia
Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT; Promega) for 2 h at 37 °C.
The RT reaction was terminated on ice by 1/5 dilution in doubledistilled water.
2.2. Chemicals
Canthin-6-one was provided by Alpha Chimica (Châtenay-Malabry, France). It was prepared in DMSO at 80 mM and stored at
20 °C.
2.3. Measurement of growth inhibition by canthin-6-one
To study the effects of canthin-6-one on growth rate, strains
were pre-grown overnight and then inoculated in fresh medium
to an OD600 nm of 0.2 with canthin-6-one concentration of 20, 40
Table 1
Yeast strains and plasmids used in this study.
Strain
Genotype
Characteristics
Origin
WTBY4742
ybp1D
MATa his3D1 leu2D0 lys2D0 ura3D
WT strain derived from S288c
EUROSCARF (Y10000)
MATa his31 leu2D0 lys20 ura3D0
YBR216C::kanMX4
MATa his3D1 leu2D0 lys2D0
ura3D0 YIR037W::kanMX4
ura3D0 YDR135C::kanMX4
ura3D0 YBR008C::kanMX4
MATa leu2-3,112 his3-11,15 trp1-1
ura3-1 can1-100
MATa ade2-101 his3-D200 leu2-D1
lys2-801 trp1-D1 ura3-52
yap1::HIS3 in YPH250
Deleted in the Yap1-Binding Protein. S288c
background
Deleted in Gpx3 thiol peroxidase. S288c background
EUROSCARF (Y13356)
Deleted in the vacuolar Yeast Cadmium Factor 1.
S288c background
Deleted in the plasma membrane transporter
FLuconazole Resistance 1. S288c background
WT strain
EUROSCARF (Y14069)
gpx3D
ycf1D
flr1D
G175W303
YPH250
yap1D
Plasmid
pRS426Yap1Myc
pRS314GFPYap1
pFLR1-K2
pHDELRFP
WT strain
Deleted in the yeast AP-1 like transcription factor
Yap1 in the YPH250 background
EUROSCARF (Y15972)
EUROSCARF (Y13143)
Gift from Sten Stymne (Swedish University of Agricultural
Sciences)
Gift from Yoshiharu Inoue (Graduate School of Agriculture
Kyoto University)
Gift from Yoshiharu Inoue
Characteristics
Overexpression of myc-tagged YAP1. Derived from pRS426 (2 l origin, multicopy, URA3
marker)
Origin
Gift from Michel Toledano (Commissariat à l’Energie
Atomique et aux Energies Alternatives, France)
Expression of GFP-tagged YAP1. Derived from pRS314 (CEN6/ARS4, monocopy, TRP1 marker)
Gift from Yoshiharu Inoue (Kyoto University)
Overexpression of FLR1. Derived from YEp351 (2l origin, multicopy, LEU2 marker)
Expression of HDEL-RFP, marker of the nuclear envelop/ER membrane (URA3 marker)
Gift from Helmut Jungwirth (Graz University)
Gift from Roger Schneiter (Fribourg University)
3047
Table 2
Primers used for real time qPCR.
Gene
Primers
qPCR product (bp)
GSH1 (YJL101C)
F: TTTGACGCTGACTGTCTTCC
R: AGCGGCATTTTTATGATTCC
F: TCCGCTTCTGAATACGACAG
R: TCATTTTACATGGCCCACAC
F: CGCTGTTGCTTATGGTTGTT
R: CCATATAGGCCAAGCCAACT
F: CACAGACCACCCAAAGAATG
R: CGGCCTATAACGAGTGGAAT
F: CATATCCGAGTCACCGTTTG
R: GATTGGTGTTAGAGGCAGCA
F: CACGGATAGTGGCTTTGGTGAACAATTAC
R: TATGATTATCTGGCAGCAGGAAAGAACTTGGG
82
TRX2 (YGR209C)
FLR1 (YBR008C)
YCF1 (YDR135C)
YAP1 (YML007W)
ALG9 (YNL219C)
2.6. Real-time qPCR
The coding regions of the target genes were recovered from
Yeast Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). The primer design was undertaken by the on-line Genscript Primer Design
in advanced mode (http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/
primer_genscript.cgi) using the following parameters: size of the
primers between 20 and 25 bases, Tm values of 59 °C and amplicon
size between 80 and 110 bp. The primer pairs were verified with
91
104
72
95
110
BLAST (http://www.blast.org) and by in silico PCR (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) using the genome of S. cerevisiae as a
template. Primers pairs used in this study (listed in Table 2) were
validated as follows: they gave a single PCR product as verified
by melting curve analysis and agarose gel electrophoresis; the distribution of PCR sigmoids was linear (r P0.99) over 5 logs of template concentration with an efficiency of 1.85–1.98. The primers
were provided by Invitrogen™ (Life Technologies, France). Realtime qPCR was performed on a LightCyclerÒ (Roche Applied Sci-
Fig. 1. Selection of YAP1 as a suppressor of canthin-6-one inhibition. (A) Sensitivity of G175, transformed with empty plasmid [YEp13], was compared to canthin-6-one
resistant (CR) transformants selected from the library. G175 and CR clones were spotted on a medium containing 20 lM canthin-6-one. (B) G175 overexpressing YAP1 was
compared to the reference strain G175 with or without control plasmid [YEp13] by spotting cell suspensions on a medium containing 10–30 lM canthin-6-one. (C) Growth of
YAP1-deleted strain yap1D was compared to the isogenic strain YPH250 in liquid medium with 40 lM canthin-6-one and their sensitivity were tested by spotting them on a
medium with 10–30 lM canthin-6-one. In all cases, the control condition refers to a medium containing 0.2% DMSO.
3048
ence, Meylan, France) detection system using SYBRÒ Green mix
(Takara-Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, France). The amplification conditions were: enzyme activation step at 95 °C for 30 s followed by 45 cycles comprising 10 s at 95 °C, 10 s at 60 °C, and 10 s
at 72 °C. PCR reactions on non-reverse-transcribed RNA samples
from each condition produced no detectable amplification, thus
verifying the absence of genomic DNA contamination. ALG9 was
used as reference gene as described by Teste et al. [21]. Reverse
transcripts copy numbers were calculated from standard curves
established with known quantities of each template. Results are
expressed as the ratio of number of copies of the target template
per 105 copies of ALG9 template following 40 lM canthin-6-one
treatments versus 0.2% DMSO (fold increase).
Quantitative data are expressed as mean ± standard error of the
mean (±S.E.M.) of 3 independent experiments. The difference between groups was analyzed by a paired Student’s t-test and was
considered significant when P < 0.05.
3. Results and discussion
3.1. High-copy-number suppression of canthin-6-one sensitivity
A strategy in yeast to isolate cellular targets of a given toxic
molecule consists in overproduction of the target itself or of genes
involved in its production. Indeed the use of a library of wild-type
yeast genomic DNA in a high-copy-number plasmid allows increased gene dosage in order to modify the stoiechiometry between the target and the toxic molecule thereby reducing its
effect(s). This approach may also lead to the identification of an
alternative route(s) to the pathway inhibited by the molecule. A
decrease in drug efficiency may also result from an enhanced degradative process, or from the activation of efflux pumps, both
mechanisms leading to lower intracellular concentration of the
toxic molecule. Although these two latter processes do not provide
information on the mechanism of action of the drug, their identification may be important for future therapeutic development of
this drug. The screening of the library was performed with the
G175 reference strain on a medium containing 20 lM canthin-6one. We noticed that growth was more severely affected on solid
medium than in liquid medium (not shown) and that less sensitive
clones appeared at a relatively high frequency (illustrated in
Fig. 1A and B, see G175[Yep13]). G175 was transformed to Leu+
with the library DNA (LEU2 marker, 2 l origin, mean insert size
5–6 kbp) and the transformants (about 25 000) growing on
20 lM canthin-6-one were selected. Among a total of nine clones
still significantly positive after replica plating (Fig. 1A), partial
sequencing of the inserts allowed us to reduce the number to four
groups. One of them (CR1 for canthin-resistant 1) harbored a
Fig. 2. Evaluation of Yap1 dependent oxidative stress response induced by canthin-6-one. (A) Yap1-GFP was expressed in a yap1D strain and its cellular localization was
observed by confocal microscopy after incubation for 1 h with 200 lM canthin-6-one, 1.5 mM H2O2 or 0.2% DMSO. Nuclear envelop/ER membrane were labeled with HDELRFP. (B) mRNA level of YAP1 and of Yap1 target genes in the presence of canthin-6-one was evaluated by RT-qPCR in the reference strain Y10000. Error bars represent ± S.E.M.
Stars (H) above bars indicate statistical significance of a P-value <0.05. (C) The sensitivity of reference strains G175, Y10000 and YPH250 to canthin-6-one was evaluated in
the presence of 10 mM reduced glutathione (GSH) or 10 mM N-acetyl-cysteine (NAC). (D) Y10000 and mutant strains ybp1D and gpx3D with or without the plasmid for YAP1
overexpression were spotted on a medium with 10–40 lM canthin-6-one.
Fig. 3. Overexpression of YAP1 induced FLR1 and YCF1 expression. Expression of
efflux pumps genes FLR1 and YCF1 was studied by RT-qPCR in wild type Y10000
with or without plasmid-borne overexpression of YAP1. Error bars represent± S.E.M.
Stars (H) above bars indicate statistical significance of a P-value <0.05.
4580 kbp genomic DNA insert with two complete coding sequences (YAP1 and YML007C-A) and two truncated ones (ERG6,
GIS4). YML007C-A refers to an uncharacterized ORF encoding a
short putative peptide of 36 amino acids with unknown function.
On the other hand, YAP1 encodes the well-characterized yeast
AP1 homologue, a bZIP transcription factor [13] and we estimated
that this gene would be the best candidate to focus on. G175 was
transformed with a high-copy-number plasmid harboring YAP1
and the transformants were plated on canthin-6-one containing
medium. Colonies grew in the presence of canthin-6-one up to
30 lM concentration (Fig. 1B), leading to the conclusion that overexpression of this transcription factor renders yeast resistant to
this drug.
In order to determine whether YAP1-mediated pathway might
be naturally involved in the cell response to canthin-6-one, we assessed sensitivity to this drug in a YAP1 deleted background. YAP1
inactivation impaired growth under normal conditions (Fig. 1C),
thus we could not firmly discriminate whether the slight increase
of sensitivity was due to the lack of YAP1 or to growth reduction.
3049
to 0.3 mM H2O2 in response to the oxidative stress [25]. Realtime qPCR was performed with RNA extracted from cells exposed to canthin-6-one (1 h after exposure to 40 lM canthin-6one). As shown in Fig. 2B, the transcription level of YAP1 was
not modified. We also measured by real-time qPCR whether
some of the known Yap1 targets were induced upon canthin-6one treatment. GSH1 and TRX2 are known to be induced by
Yap1 in response to oxidative stress [26,27], whereas FLR1 and
YCF1 encode plasma membrane and vacuolar efflux pumps
respectively that are involved in the detoxification of a wide
variety of xenobiotics [15,18,28–30]. We observed that canthin6-one exposure did not induce significantly (P > 0.05) GSH1 nor
YCF1. By contrast, FLR1 and TRX2 were significantly induced,
but only by a factor of 2.2 and 2.6, respectively, (Fig. 2B). Altogether this data indicate that canthin-6-one does not promote
an oxidative stress comparable to that obtained by H2O2. Despite
this low level of transcriptional activation of FLR1 and TRX2, we
checked the effect of addition of N-acetyl-cysteine or reduced
glutathione (10 mM each) to the culture medium. We observed
a reduction of the sensitivity of the three control strains used
throughout this study (Fig. 2C), suggesting that the redox state
of the cells exposed to canthin-6-one might be affected by the
drug.
Finally we examined whether YAP1 mediated resistance requires Ybp1 and/or Gpx3. As depicted on Fig. 2D, deletion of
any of these genes failed to abolish the effect of YAP1 overexpression. Thus plasmid-borne overproduced Yap1 might be sufficient to ensure nuclear accumulation of the transcription
factor thereby rendering the assistance of these factors
unessential.
3.2. Canthin-6-one and oxidative stress
The involvement of Yap1 in oxidative stress response has
been extensively studied and documented [13,14]. Yap1 shuttles
between the cytoplasm and the nucleus, and its nuclear localization is determined by its cysteine-rich domain (CRD) whose
oxidized/reduced status influences the conformation of the protein [22]. Ybp1 (Yap1-binding protein) is required for oxidation
of the cysteine residues of Yap1 CRD, and thus is involved in
the nuclear localization of the transcription factor in response
to stress [23]. In this process, Hyr1/Gpx3, a glutathione peroxidase (GPx)-like enzyme, acts as the sensor of intracellular
hydroperoxide levels. In response to peroxide stress, Hyr1/
Gpx3 forms a disulfide bond in the CRD of Yap1 with the help
of Ybp1 [24].
The cellular localization of a GFP-tagged version of Yap1 was
assessed after exposure of the yap1D strain to canthin-6-one (1 h
after treatment with 200 lM canthin-6-one). Although a treatment of the cells with H2O2 used as an oxidative stress control
led to a strong and unambiguous nuclear localization, Yap1GFP did not accumulate in the nuclear compartment following
canthin-6-one treatment (Fig. 2A). Moreover, it has been reported that YAP1 expression is induced 20 min after exposure
Fig. 4. Canthin-6-one resistance mediated by YAP1 overexpression is exerted
mainly by Flr1 and not by Ycf1. (A) Sensitivity of strains deleted for FLR1 or YCF1
and overexpressing YAP1 was tested on medium with 30 lM or 40 lM canthin-6one. (B) Sensitivity of flr1D was compared to the isogenic strain Y10000 by
recording their growth in liquid medium in the presence of 40 lM canthin-6-one or
in control conditions (0.2% DMSO).
3050
Fig. 5. Multiple copies of FLR1 induced resistance to canthin-6-one but only in the presence of YAP1. Sensitivity of the reference strains Y10000 and YPH250 and yap1D
overexpressing FLR1 or transformed with the empty plasmid YEp351 was tested by spotting them on a medium containing 10–30 lM canthin-6-one.
3.3. Role of efflux pumps (target of Yap1) in canthin-6-one resistance
By comparison to the 20-fold increase in FLR1 transcription in
the presence of benomyl [18], this transcript was only moderately
induced upon canthin-6-one exposure (albeit significantly). We
thus examined whether this efflux pump could play an active role
in Yap1-mediated resistance. Ycf1 is a vacuolar efflux pump whose
gene is positively regulated by Yap1 [30]. The transcription level of
FLR1 and YCF1 was examined by real-time qPCR in a strain overproducing the plasmid-borne Yap1 (Fig. 3). They were both significantly induced, 11-fold and 1.6-fold, respectively. Although
deletion of YCF1 did not modify the resistance to canthin-6-one
mediated by Yap1, FLR1 inactivation completely abolished this effect, demonstrating that this drug: H+ antiporter of the plasma
membrane was indeed acting downstream of YAP1 to mediate
resistance to the drug (Fig. 4A). However, we observed that sensitivity to canthin-6-one was not increased in the FLR1-deleted
strain as compared to the control Y10000 (Fig. 4B) showing that
the basal production of this protein is not sufficient to counteract
the effects of canthin-6-one. This observation indicates that this efflux pump is not naturally involved in adaptation of wild-type
yeast to reduce the toxicity of this drug or alternatively that additional efflux pump(s) could be involved in the extrusion of canthin6-one.
We then checked the effect of FLR1 overexpression both in a
wild-type background and in a YAP1-deleted background. As depicted in Fig. 5, plasmid-borne overproduction of Flr1 led to canthin-6-one tolerance, up to 30 lM. This effect was fully
dependent on Yap1 since it was totally abolished in the YAP1-deleted strain (Fig. 5). A similar observation was reported by Jungwirth et al. [31] in the case of diazaborine resistance mediated
by the Flr1 efflux pump, showing that the transcription factor
Yap1 is essential for full activation of FLR1 transcription [19].
3.4. Summary
This study did not provide novel clues about the mechanism of
action of the alkaloid canthin-6-one. Although FLR1 and TRX2, two
well characterized Yap1 target genes, were moderately but significantly induced upon treatment, our data show that this drug does
not generate a significant oxidative stress. However, considering
that addition of N-acetyl-cysteine or reduced glutathione decreased sensitivity, the effect of this drug on the redox state of
the cells would deserve further investigation. Given that deletion
of YAP1 resulted in a slight increase of sensitivity, a role of this
transcription factor in the intrinsic resistance to canthin-6-one is
not totally excluded. Additionally we demonstrated that the
MFS-type transporter Flr1 is able to reduce the sensitivity to this
drug when overproduced via a higher gene dosage, and that Flr1mediated tolerance to the drug is strictly dependent on the transcription factor Yap1. Thus although the Yap1-Flr1 pair is not naturally involved in yeast tolerance to canthin-6-one, this study
demonstrates that their overexpression can lead to resistance to
the chemical stress generated by this drug.
Acknowledgments
We thank Dr. Roger Schneiter (Fribourg University), Dr. Michel
Toledano (Commissariat à l’Energie Atomique et aux Energies
Alternatives, France), Dr. Yoshiharu Inoue (Kyoto University) and
Dr. Helmut Jungwirth (Graz University) for providing library, plasmids and strains, Dr. Panayiotis A. Koutentis (Cyprus University)
and Dr. Philippe Bertrand (University of Poitiers) for discussions
at the beginning of this project. We acknowledge Jenny Colas for
her invaluable technical assistance and Anne Cantereau for her
expertise with confocal microscopy. Marion Planchon and Chloé
Michaudel are acknowledged for their participation during their
undergraduate internship. CD was supported by a grant from the
Région Poitou-Charentes. This work was supported by an Action
Concertée Incitative (Chimie-Biologie) of the University of Poitiers.
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Réactifs
La canthin-6-one, obtenue selon Soriano-Agaton et al. (2005), est commercialisée sous forme
de poudre (Alpha Chimica, Châtenay-Malabry, France). Son degré de pureté estimé en GC
par le fournisseur est de 99%. Une solution concentrée à 80 mM est préparée dans du DMSO
et stockée à -20°C. Une solution à 16 mM dans du DMSO est diluée directement dans les
milieux de cultures.
Souches de bactéries et de levures
- La souche de bactéries Escherichia coli DH5α (Φ80lacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi1, hsdR17, (rk-, mk+), Sup44, relA1, deoR, ∆(lacZYA-argF)U169) est utilisée pour
l’amplification des plasmides.
- Les souches de levures S. cerevisiae utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le
tableau 6.
Tableau 6 : Listes des souches de levures S. cerevisiae utilisées dans cette étude
Souche
G175-W303
Génotype
MATα leu2-3,112 his311,15 trp1-1 ura3-1
can1-100
Caractéristiques
Souche sauvage de
référence
WT-BY4742
(Y1000)
MATα his3∆1 leu2∆0
lys2∆0 ura3∆0
YPH250
MATa ade2-101 his3∆200 leu2-∆1 lys2-801
trp1-∆1 ura3-52
Souche sauvage de
référence, dérivée de
S288c
Souche sauvage de
référence
yap1∆
yap1::HIS3 in YPH250
Souche YPH250,
délétion du gène codant
pour le facteur de
transcription Yap1
44
Origine
Sten Stymne
(Swedish University of
Agricultural Sciences)
EUROSCARF
(Y10000)
Yoshiharu Inoue
(Graduate School of
Agriculture Kyoto
University)
Y. Inoue
Suite du tableau 6.
Souches dérivées de la souche WT-BY4742
Souche
Génotype
Caractéristiques
ybp1∆
MATα his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 Souche S288c, délétion du
gène codant pour la protéine
ura3∆0 YBR216C::kanMX4
Ybp1 (Yap1-binding
protein)
gpx3∆
MATα his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 Souche S288c, délétion du
gène codant pour la
ura3∆0 YIR037W::kanMX4
péroxidase Gpx3
(glutathione peroxidase 3)
Souche S288c, délétion du
ycf1∆
gène codant pour la pompe
lys2∆0 ura3∆0
vacuolaire Ycf1 (yeast
YDR135C::kanMX4
cadmium factor)
Souche S288c, délétion du
flr1∆
gène codant pour la pompe
lys2∆0 ura3∆0
d’efflux membranaire Flr1
YBR008C::kanMX4
(fluconazole resistance 1)
Origine
EUROSCARF
(Y13356)
EUROSCARF
(Y15972)
EUROSCARF
(Y14069)
EUROSCARF
(Y13143)
Culture des bactéries et des levures
- Les bactéries DH5α sont cultivées à 37°C en milieu liquide LB (Luria Bertani : extrait
autolytique de levure 5 g/L ; tryptone 10 g/L ; NaCl 10 g/L) ou sur milieu solide LB de même
composition, additionné d’agar 2%. Les bactéries contenant des plasmides portant le gène de
résistance à l’antibiotique ampicilline sont cultivées en milieu LB additionné d’ampicilline
(0,1 mg/mL) : LB-Amp.
- Les levures sont cultivées à 28°C. Les milieux de culture des levures contenant de la
canthin-6-one sont tamponnés à pH 6 à l’aide de phosphate de sodium (Na2HPO4 1,7 g/L,
NaH2PO4 10,56 g/L), en raison de la sensibilité de cette molécule aux variations de pH. Les
milieux de culture utilisés sont les suivants :
- milieu complet standard YPG Yeast Peptone + Glucose : extrait autolytique de
levure 10 g/L, peptone de viande 10 g/L, glucose 20 g/L (stérilisé par autoclave 20
min, à 120°C)
- milieu minimum standard YNB Yeast Nitrogen Base + Glucose : Yeast Nitrogen
Base w/o aminoacids and amonium sulfate 1,7 g/L, sulfate d’ammonium 5 g/L,
glucose 10 g/L, complété en acides aminés ou bases azotées nécessaires à 50 µg/mL
(stérilisé par autoclave 15 min, à 110°C)
- Pour les cultures en milieu liquide, la densité cellulaire d’une suspension de levures est
mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 600 nm (DO600nm). A cette
45
longueur d’onde, on estime qu’une unité d’absorbance correspond approximativement à une
concentration cellulaire de 2.107 cellules/mL.
Plasmides
Les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 7.
Tableau 7 : Liste des plasmides utilisés dans cette étude
Nom du plasmide
Banque d’ADN génomique de levure
construite dans vecteur navette
E. coli / S. cerevisiae, YEp13 (Yeast
Episomal vector 13)
pRS426-Yap1-Myc
Caractéristiques
- gène de sélection : LEU2
- inserts de 5-6 kb
Origine
Dr. Roger Schneiter
(Université Fribourg)
- gène de sélection : URA3
- surexpression du facteur
de transcription Yap1
pRS314-GFP-Yap1
- gène de sélection : TRP1
- production de la protéine
de fusion Yap1 étiquetée
GFP
- surexpression de la pompe
d’efflux Flr1
- surexpression de l’enzyme
SUMO Siz2
- gène ISN1 sous contrôle
d’un opérateur tetOFF et
d’un promoteur CYC1
Dr. Michel Toledano
(Commissariat à
l'Energie Atomique et
aux Energies
Alternatives, France)
Dr. Yoshiharu Inoue
(Graduate School of
Agriculture Kyoto
University)
Dr. Helmut Jungwirth
(Université de Graz)
pFLR1-K2
yEPLac181 (CKM6)- SIZ2
pCM189-ISN1
46
Dr. Krishnaveni
Mishra (Université de
Genève)
Dr. Bertrand
Daignant-Fornier
(Université de
Bordeaux)
Transformation de levures avec une banque d’ADN génomique
Pour cribler une banque d’ADN génomique de levure à saturation et de façon significative, le
nombre théorique de transformants à obtenir est estimé par la formule suivante :
N = ln (1-p) / ln (1-f)
N : le nombre de clones nécessaires pour le criblage significatif
p : la probabilité souhaitée
f : la taille des inserts portés par les plasmides, divisée par la taille du génome de levure
Pour cribler significativement à p = 0,01 une banque d’ADN génomique représentant le
génome de levure, d’une taille de 13 000 kb, et construite dans des plasmides portant des
inserts d’environ 5 kb (2 à 3 gènes), au moins 12 000 transformants doivent être obtenus.
Lorsqu’une grande quantité de transformants est requise, la méthode de transformation décrite
par Gietz et Woods est utilisée (Gietz et Woods 2002). A partir d’une culture liquide de levure
de souche G175 cultivée à saturation, une culture de 50 mL de milieu YPG est inoculée à
DO600nm=0,05 et amenée jusqu’en début de phase exponentielle de croissance à DO600nm= 0,5.
Les cellules sont collectées par centrifugation (3 000 g, 5 min) et lavées avec 25 mL d’eau
distillée. Le culot cellulaire est repris dans 1 mL d’eau distillée et des aliquotes de 200 µL
(soit environ 1.108 cellules) sont réparties dans des tubes 1,5 mL. Les cellules sont collectées
par centrifugation (3 000 g, 5 min) et reprises dans 360 µL d’une solution de transformation
préparée extemporanément (PEG3500 33%, acétate de lithium 0,1 M, 100 µg d’ADN de
sperme de saumon préalablement bouilli et 5 µg de plasmide). Les cellules sont incubées
pendant 40 min à 42°C puis collectées par centrifugation (3 000 g, 5 min) et reprises dans 100
µL d’eau distillée. Toutes les cellules transformées sont rassemblées en une seule suspension
cellulaire. Cinq boîtes de milieu sélectif (YNB sans leucine) contenant de la canthin-6-one 20
µM sont ensemencées avec cette suspension cellulaire (100 µL par boite). Afin de déterminer
le nombre de transformants obtenus, deux boites de milieu sélectif (YNB sans leucine) ne
contenant pas de canthin-6-one sont ensemencées avec une dilution au 10ème et une dilution au
100ème de cette suspension cellulaire. Les colonies de transformants résistants obtenus au bout
de 5 jours de croissance à 28°C sont repiquées sur milieu sélectif en absence de canthin-6one.
47
Extraction d’ADN chromosomique et plasmidique de levure
Les transformants résistants à la canthin-6-one, repiqués sur milieu solide sélectif (YNB sans
leucine), sont inoculés dans 5 mL de milieu liquide (YNB sans leucine) et la culture est
amenée à saturation (une nuit, à 28°C, sous agitation). Les cellules sont collectées par
centrifugation (3000 g, 5 min). Après un lavage avec 1 mL d’eau distillée, les culots sont
repris dans 500 µL de solution de lyse (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM, Tris HCl
10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 6) et 500 µL de phénol/chloroforme/alcool isoamylique
(25:24:1). Les cellules sont cassées en présence de microbilles de verre par forte agitation (3
cycles : 30 sec d’agitation au Mini-Beadbeater™, 30 sec sur glace). La phase aqueuse est
récupérée et incubée en présence de RNAse A (125 µg/mL) pendant 15 minutes à 37°C. La
phase aqueuse est nettoyée avec un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique
(25:24:1), puis un volume de chloroforme/alcool isoamylique (1:1). Sur la phase aqueuse, 1
mL d’éthanol 100% froid est ajouté pour faire précipiter l’ADN. Le culot d’ADN est récupéré
par centrifugation (15 000 g, 15 min), lavé avec 1 mL d’éthanol 70%, séché (10 min, à
température ambiante) et repris dans 50 µL d’eau distillée. Les vecteurs navettes E. coli / S.
cerevisiae, YEp13 conférant une résistance à la canthin-6-one sont introduits dans les
bactéries DH5α pour être amplifiés.
Transformation par électroporation de bactéries électro-compétentes DH5α
Une aliquote de bactéries E. coli DH5α est incubée en présence de 2 µL d’ADN total extrait
de levure (sur glace, pendant 20 min). Les bactéries sont soumises à un choc électrique
(voltage 2,5 kV, résistance 200 Ω, capacité 25 µFD) puis incubées dans 750 µL de milieu LB
liquide pendant 1 h à 37°C. Les bactéries sont étalées sur une boite de milieu solide LB-Amp
et incubées une nuit à 37°C. Les clones sélectionnés en présence d’antibiotique sont utilisés
pour amplifier le plasmide d’intérêt en culture liquide (minipréparation d’ADN plasmidique).
Minipréparation d’ADN plasmidique à partir des bactéries E. coli
Les clones de bactéries sélectionnés sur boîte LB-Amp sont inoculés dans 4 mL de milieu
liquide LB-Amp et cultivés une nuit à 37°C sous agitation. Les bactéries sont récupérées par
centrifugation (10 000 g, 2 min) et reprises dans 100 µL de solution de resuspension (glucose
0,9% (w/v), EDTA 10 mM, Tris HCl 25 mM). Les bactéries sont lysées par ajout de 200 µL
de solution de lyse (NaOH 0,2 M, SDS 1%, 10 min, à température ambiante). Les débris
cellulaires et l’ADN génomique sont précipités par addition de 150 µL d’acétate de sodium 3
M pH 5,2 (sur glace, 10 min). Le lysat est centrifugé (10 000 g, 5 min, à 4°C) et 400 µL de
surnageant sont récupérés dans un tube 1,5 mL propre.
48
- Si l’ADN plasmidique est utilisé pour une transformation : L’ADN plasmidique est précipité
par addition de 800 µL d’éthanol 100%. Après centrifugation (15 000 g, 10 min, à 4°C), le
culot d’ADN plasmidique est lavé avec 200 µL d’éthanol 100%, séché (10 min, à température
ambiante) et finalement repris dans 30 µL d’eau distillée.
- Si l’ADN plasmidique est séquencé : Le surnageant est traité à la RNAse A (125 µg/mL,
50°C, 10 min) et débarrassé des protéines avec un volume de phénol/chloroforme/alcool
isoamylique (25:24:1) et un volume de chloroforme/alcool isoamylique (1:1). L’ADN
plasmidique est précipité par ajout d’un volume d’isopropanol. Le culot d’ADN plasmidique
est récupéré par centrifugation (15 000 g, 10 min, à 4°C), lavé avec 500 µL d’éthanol 70%,
séché (10 min, à température ambiante) et repris dans 20 µL d’eau distillée.
Transformations de levures par choc thermique
Un clone de levure, isolé sur boîte est repris dans 100 µL de solution A (Tris HCl 10 mM pH
7,5, EDTA 1 mM pH 8, acétate de lithium 0,1 M, sorbitol 1 M) et incubé 1 h à 28°C. Les
cellules sont récupérées par centrifugation (3 000 g, 1 min) et incubées en présence de 5 µL
d’ADN plasmidique (2-5 µg) pendant 10 min à température ambiante. Un volume de 100 µ L
de solution B (Tris HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8, acétate de lithium 0,1 M, PEG4000
40%) est ajouté et les cellules sont incubées pendant 30 min à 28°C. Un choc thermique est
réalisé pendant 5 min à 42°C. Les cellules sont récupérées par centrifugation (3 000 g, 5 min)
et reprises dans 100 µL de solution C (Tris HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8, sorbitol
0,6 M). La suspension cellulaire est étalée sur une boite de milieu sélectif YBN. Les
transformants obtenus après 5 jours de croissance à 28°C sont repiquées sur milieu sélectif
YNB.
- La souche de référence G175 est transformée avec chaque plasmide isolé à partir des
transformants résistants à la canthin-6-one et amplifié dans les bactéries DH5α. La résistance
vis-à-vis de la canthin-6-one, de la souche G175 transformée avec chaque plasmide isolé est
par la suite vérifiée par la méthode de test en gouttes.
Estimation de la viabilité cellulaire par la méthode de test en gouttes
Un clone est prélevé sur milieu solide et resuspendu dans 1 mL d’eau distillée stérile. Des
suspensions cellulaires sont réalisées par dilution en série afin d’obtenir des DO600nm de 10-2,
10-3, 10-4 et 10-5. Une goutte équivalente à un volume de 5 µL de chaque dilution et de
suspension est déposée sur une boite de milieu YPG pH 6 contenant 10, 20, 30 et 40 µM
49
canthin-6-one ou du DMSO 0,2%. Les levures sont cultivées dans une étuve à 28°C pendant 5
à 7 jours.
Mesure du taux de croissance de levures en milieu liquide
Une culture à saturation est inoculée dans du milieu liquide YPG pH 6 pour obtenir une
DO600nm = 0,2. Les cultures sont incubées à 28°C sous agitation en présence de canthin-6-one
40 µM ou de DMSO 0,2%. La croissance est suivie par mesure de la densité optique de la
culture au cours du temps.
Séquençage
La réaction de séquençage (Sanger et al. 1977) est réalisée sur 2 µg d’ADN plasmidique en
suivant les indications du kit de séquençage Big-DyeTM Terminator cycle sequencing (Applied
Biosystems). Le programme de la réaction de PCR comporte 30 cycles de dénaturation (97°C,
45 sec), hybridation (50°C, 45 sec) et élongation (60°C, 4 min). Les produits de la réaction,
repris dans un volume final de 20 µL complété avec de l’eau distillé, sont précipités par ajout
de 80 µL d’éthanol 76%. Le culot est récupéré par centrifugation (15 000 g, 15 min) et lavé
avec 250 µL d’éthanol 70%. Le culot séché est repris dans 15 µL de formamide désionisée.
Enfin, l’ADN est dénaturé à 95°C pendant 5 min et refroidi brutalement sur glace avant d’être
analysé par le service commun de séquençage du Pole Biologie-Santé de Poitiers.
Extraction d’ARN de levure
Une culture à saturation est inoculée dans 15 mL de milieu liquide YPG pH 6 pour obtenir
une DO600nm = 0,1. La culture est amenée en début de phase exponentielle de croissance
(autour de DO600nm = 0,5 : 4 h, à 28°C, sous agitation). Les cellules sont réparties en deux
cultures (environ 5 mL pour avoir 5.107 cellules par groupe) pour être traitées pendant 1 h
avec de la canthin-6-one 40 µM ou du DMSO 0,2%. L’extraction ARN est réalisée suivant le
protocole décrit par Li et al. 2009. Les cellules sont récupérées par centrifugation (3 000 g, 5
min) et lavées dans 1 mL d’eau distillée. Les culots cellulaires sont resuspendus dans 400 µL
de tampon de lyse (EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, SDS 5% pH 6) et incubées 5 min à
65°C. Le lysat est immédiatement placé sur glace avant d’ajouter 200 µL de KCl 0,3 M. La
phase aqueuse est récupérée après centrifugation (10 000 g, 5 min à 4°C) et débarrassée des
protéines avec un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1). L’ARN est
précipité par ajout de 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M pH 5.2 et de 2,5 volumes
d’isopropanol (15 min, à -80°C). L’ARN est récupéré par centrifugation (15 000 g, 20 min, à
4°C), lavé avec 1 mL d’éthanol 70%, séché (10 min, à température ambiante) et repris dans
50
30 µL d’eau traitée DEPC. La concentration ARN est déterminée par mesure de l’absorbance
à 260 nm (1 DO260nm = 40 µg/mL d’ARN) et la contamination protéique est évaluée par le
ratio DO260/280nm (proche de 2 pour s’assurer de la pureté de l’échantillon). La concentration
des ARN est ajustée à 0,25 µg/µL et les échantillons sont conservés à -20°C.
Réaction de rétrotranscription (RT) et PCR quantitative (qPCR)
Pour chaque réaction de RT (10 µL), l’hybridation des amorces héxamériques aléatoires (1
µL d’une solution stock à 15 DO260nm/mL) sur 1 µg d’ARN total (4 µL des échantillons ARN
concentrés à 0,25 µg/µL) est réalisée à 65°C pendant 5 min, suivi d’un arrêt brutal sur glace.
La réaction de RT a lieu en présence de 2 µL de Tampon MMLV 5X (Moloney Murine
Leukemia Virus, Promega, Charbonnières, France), de 2,5 µL d’un mélange de dNTP 2 mM
(dATP, dTTP, dCTP et dGTP, Promega), de 0,5 µL d’enzyme reverse-transcriptase RTMMLV (Promega). La réaction de RT est réalisée pendant 2 h à 37°C puis arrêtée sur glace et
par dilution au 1/5 avec de l’eau bidistillée. Les séquences codantes des gènes d’intérêt sont
tirées de Yeast Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Les amorces de qPCR sont
dessinées grâce au site on-line Genscript Primer Design (http://www.genscript.com/cgibin/tools/primer_genscript.cgi) en utilisant les paramètres suivants : taille des amorces entre
20 et 25 pb, Tm de 59°C et taille de la région à amplifier entre 80 et 110 pb (tableau 8). La
spécificité des couples d’amorces est vérifiée in silico avec les outils BLAST
(http://www.blast.org) et USCS In-silico PCR (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr). La
réaction de qPCR est réalisée sur un appareil LightCycler® (Roche Applied Science, Meylan,
France) avec le kit de PCR SYBR® Green mix (Takara-Ozyme, Montigny-le-Bretonneux,
France). Après une étape d’activation de l’enzyme à 95°C pendant 30 sec, 45 cycles de PCR
sont réalisés (dénaturation : 95°C, 10 sec, hybridation des amorces : 60°C, 10 sec, élongation :
72°C 10 sec). Après la PCR il est vérifié que : un unique produit PCR est obtenu (analyse des
courbes de fusion, électrophorèse), la distribution des sigmoïdes de PCR est linéaire (r≥0.99)
sur 5 logs de concentration de la matrice avec une efficacité de 1.85-1.98, les échantillons
ARN non rétrotranscrits ne donnent pas de produit de PCR (absence de contamination par de
l’ADN génomique). Le nombre de copies d’ADNc est calculé par étalonnage de courbes
standards établies à partir de quantités connues de produit PCR. Le gène ALG9 est utilisé
comme gène de référence comme conseillé par Teste et al. 2009. Les résultats sont exprimés
par le ratio du nombre de copies de la matrice cible pour 105 copies de matrice ALG9.
51
Tableau 8 : Liste des couples d’amorces de qPCR utilisés dans cette étude
Gène
GSH1
(YJL101C)
TRX2
(YGR209C)
FLR1
(YBR008C)
YCF1
(YDR135C)
YAP1
(YML007W)
ALG9
(YNL219C)
Produit de
Couple d’amorces
qPCR (pb)
Sens 5’-TTTGACGCTGACTGTCTTCC -3’
Antisens 5’- AGCGGCATTTTTATGATTCC -3’
82
Sens 5’- TCCGCTTCTGAATACGACAG -3’
Antisens 5’-TCATTTTACATGGCCCACAC -3’
91
Sens 5’- CGCTGTTGCTTATGGTTGTT -3’
Antisens 5’- CCATATAGGCCAAGCCAACT -3’
104
Sens 5’- CACAGACCACCCAAAGAATG -3’
Antisens 5’- CGGCCTATAACGAGTGGAAT -3’
72
Sens 5’- CATATCCGAGTCACCGTTTG -3’
Antisens 5’- GATTGGTGTTAGAGGCAGCA -3’
95
Sens 5’-CGGATAGTGGCTTTGGTGAACAATTAC -3’
Antisens 5’-TATGATTATCTGGCAGCAGGAAAGAA
CTTGGG -3’
110
52
Résultats complémentaires
Plusieurs plasmides multicopies confèrent un phénotype résistant, plus ou moins
marqué, vis-à-vis de la canthin-6-one (figure 5). La région chromosomique portée par chaque
plasmide, isolé des souches CR (canthin resistant), a été identifiée par séquençage à l’aide
d’amorces complémentaires des régions localisées aux bornes de l’insert génomique. Un
plasmide est parfois présent de façon redondante dans plusieurs clones. Ainsi le plasmide
porteur du gène suppresseur YAP1, est présent dans les souches CR1, CR2, CR7 et CR17
(figure 5). Ce plasmide induit le phénotype résistant le plus marqué (figure 4). Cependant,
l’identification du gène suppresseur YAP1 ne nous a pas permis de comprendre le mode
d’action de la canthin-6-one. En effet, la résistance des souches surexprimant YAP1 repose sur
un mécanisme trivial d’expulsion de la drogue par la pompe d’efflux Flr1 (Dejos et al. 2013).
L’étude des autres plasmides isolés lors de ce criblage a donc été poursuivie dans le but
d’identifier d’autres gènes suppresseurs susceptibles de nous renseigner sur le mode d’action
de la canthin-6-one.
Figure 5 : Phénotype des souches résistantes à la canthin-6-one (illustration de Dejos et al.
2013)
53
1. Identification des gènes portés par le plasmide isolé de la souche CR11
Le plasmide présent dans la souche CR11 confère le phénotype résistant le moins
marqué (figure 5). Ce plasmide contient un insert de 5 789 pb, correspondant aux
coordonnées 519 240 à 525 029 pb du chromosome XV (figure 6). Cet insert porte la
séquence complète des gènes VAM3, RGS2 et LEU9 (figure 6).
résistance du clone CR11 vis-à-vis de la canthin-6-one
Le gène LEU9 code pour une enzyme catalysant la première étape de la voie de
biosynthèse de la leucine. Le gène RGS2 code pour une GAP GTPAse-activating protein. Il
est peu probable que ces gènes soient responsables du phénotype résistant de la souche CR11.
Le gène VAM3 code pour une protéine impliquée dans le trafic vacuolaire. Les mutants
délétés pour ce gène possèdent des vacuoles anormales et sont plus sensibles à des stress
chimiques (source : Saccharomyces GENOME DATABASE, http://www.yeastgenome.org).
Cette protéine pourrait donc être impliquée dans un mécanisme de résistance à la canthin-6one faisant intervenir un processus de stockage ou de dégradation de la drogue dans la
vacuole.
L’analyse du mécanisme à l’origine de la résistance de la souche CR11 n’est pas
achevée. Du fait de la taille des régions chromosomiques introduites dans le plasmide YEp13,
deux à trois gènes sont surexprimés. L’identification du gène suppresseur porté par un
plasmide peut-être effectuée selon deux approches non exclusives :
- (1) procéder à la délétion de chacun de ces gènes individuellement pour identifier le
gène dont l’absence rétablit le phénotype de la souche sauvage ;
- (2) surexprimer individuellement chacun des gènes présents sur le fragment
chromosomique associé à la résistance, grâce à un plasmide multicopies ou un
plasmide de surexpression, pour confirmer qu’il confère une résistance vis-à-vis de la
canthin-6-one.
Aucune de ces approches n’a pour le moment été entreprise concernant ce fragment
chromosomique.
54
2. Identification du gène suppresseur RPO31
Un second plasmide a été identifié de façon redondante lors de ce criblage. Il s’agit du
plasmide présent dans les souches CR4, CR5 et CR15. Ce plasmide confère un phénotype
résistant intermédiaire entre la souche CR11 (faible résistance) et les souches surexprimant
YAP1 (forte résistance) (figure 5). Ce plasmide contient un insert de 6 385 pb, correspondant
aux coordonnées 538 643 à 545 028 pb du chromosome XV (figure 7). Cet insert porte les
gènes RPO31 et TRS33 (figure 7). La protéine Rpo31 est la sous unité catalytique de l’ARN
polymérase III. La protéine Trs33 est une sous unité du complexe TRAPP Transport Protein
Particle.
résistance des clones CR4, CR5 et CR15 vis-à-vis de la canthin-6-one
Dans ce plasmide, une délétion a été réalisée afin de retirer la séquence codant pour les
287 premiers acides aminés de la partie N-terminale de la protéine Rpo31 composée de 1 460
acides aminés. Cette délétion entraine la perte du phénotype résistant vis-à-vis de la canthin6-one (communication personnelle Marion Planchon, stage de master). Pour s’assurer que la
surexpression du gène RPO31 confère une résistance vis-à-vis de la canthin-6-one, une
souche de référence sera transformée avec un plasmide multicopies ou un plasmide de
surexpression portant la séquence codante du gène RPO31. La modification de la
stœchiométrie canthin-6-one/ARN polymérase III, pourrait être responsable d’une diminution
des effets antifongiques de la canthin-6-one.
Ainsi, cette sous-unité de l’ARN polymérase III pourrait être une cible de la canthin-6one in vivo. Précédemment, une étude portant sur la levure S. cerevisiae a montré que l’ARN
polymérase III est la cible de la molécule nommée UK-118005 (Wu et al. 2003). Une
mutation ponctuelle de l’ARN polymérase III avait alors été identifiée comme étant suffisante
pour induire une résistance vis-à-vis de cette drogue (Wu et al. 2003). Cette hypothèse mérite
d’être approfondie, mais même si d’autres éléments viennent confirmer ces résultats, le
mécanisme par lequel la surexpression de cette seule sous-unité conduit à une résistance vis-àvis de la canthin-6-one reste à déterminer.
55
3. Identification du gène suppresseur SIZ2
Enfin, le plasmide présent dans la souche CR8, lui confère un phénotype résistant
intermédiaire, comparable à celui obtenu avec la surexpression du gène RPO31 (figure 5). Ce
dernier plasmide contient un insert de 4 987 pb, correspondant aux coordonnées 626 218 à
631 205 pb du chromosome XV (figure 8). Cet insert porte les gènes ISN1 et NFI1/SIZ2
(figure 8). Le gène ISN1 code pour une nucléotidase spécifique de l’IMP (inosine 5'monophosphate). Le gène NFI1/SIZ2 code pour une protéine SUMO E3 ligase de la famille
des protéines SUMO Small Ubiquitin-like Modifier.
résistance du clone CR8 vis-à-vis de la canthin-6-one
La sensibilité d’une souche de référence, transformée avec un plasmide permettant la
surexpression du gène ISN1, a été évaluée par un test en gouttes sur milieu complet contenant
des concentrations croissantes de canthin-6-one. Le plasmide pCM189 contenant le gène ISN1
sous contrôle d’un opérateur tetO et d’un promoteur CYC1, permettant l’expression du gène
ISN1 en absence de l’antibiotique tétracycline, nous a été gracieusement offert par le Dr.
Bertrand Daignant-Fornier (Université de Bordeaux). La surexpression du gène ISN1 ne
diminue pas la sensibilité à la canthin-6-one d’une souche de référence, ce qui suggère que ce
gène n’est pas responsable de la résistance du clone CR8 (résultat non illustré).
Par la suite, la souche flr1∆, ne possédant pas la pompe d’efflux Flr1 susceptible
d’expulser la canthin-6-one, a été transformée avec un plasmide multicopies portant le gène
SIZ2 (construction gracieusement offerte par le Dr. Krishnaveni Mishra, Université de
Genève, décrite dans Pasupala et al. 2012). La sensibilité de cette souche à la canthin-6-one a
été évaluée par test en goutte sur milieu complet en présence de concentrations croissante de
canthin-6-one (figure 9). La surexpression du gène SIZ2 confère une résistance, nettement
visible après 7 jours de croissance, en présence de 30 µM de canthin-6-one (figure 9).
L’identification du gène suppresseur SIZ2 suggère que la canthin-6-one induit des
dommages à l’ADN. En effet, le système des protéines SUMO est responsable de
modifications post-traductionnelles qui jouent notamment un rôle important dans la réparation
des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue (Psakhye et Jentsch 2012).
L’identification de ce gène suppresseur conforte une des hypothèses avancées concernant le
56
mode d’action de la canthin-6-one sur les cellules animales. Les effets antiprolifératifs et
antifongiques de la canthin-6-one pourraient avoir pour origine l’activation du point de
contrôle des dommages à l’ADN entre les phases G2 et M.
Figure 9 : La surexpression du gène SIZ2 dans la souche flr1∆ lui confère un phénotype
résistant vis-à-vis de la canthin-6-one
La souche flr1∆ a été transformée avec un plasmide multicopies CKM6-SIZ2 permettant la
surexpression de SIZ2 : souche flr1∆[SIZ2] ou avec le plasmide CKM6 sans insert : souche
flr1∆[ckm6]. La viabilité de ces souches en présence de canthin-6-one a été comparée par un
test en gouttes. Une suspension cellulaire de chaque souche est diluée en série et déposée sur
milieu solide complet YPG pH6 en présence de concentrations croissante de canthin-6-one 10
µM, 20 µM et 30 µM, ou de DMSO 0,2%.
57
Perspectives
L’approche génétique mise en place chez la levure S. cerevisiae, organisme modèle
des cellules eucaryotes, avait pour objectif d’identifier les cibles moléculaires de la canthin-6one pour essayer de mieux comprendre son mécanisme d’action. Une précédente étude des
effets antifongiques de la canthin-6-one suggérait qu’elle interfère avec le métabolisme
lipidique (Lagoutte et al. 2008). Cependant, les analyses lipidiques que nous avons réalisées
au laboratoire n’ont pas confirmé ces résultats, ce qui nous a poussés à envisager d’autres
mécanismes d’action.
Nous avons recherché des gènes dont la surexpression confère un phénotype résistant
à la canthin-6-one par une approche de Multi-copy Suppression Profiling. Une autre stratégie
aurait pu être utilisée pour isoler les souches de levure résistantes, comme l’identification de
souches hyper-résistantes sélectionnées par augmentation croissante de la concentration de
composant toxique (Cakar et al. 2009). Si plusieurs souches résistantes ont pu être identifiées
par MSP, il serait intéressant de bénéficier des approches complémentaires de criblage, haploinsuffisance et délétion homozygote, évoquées précédemment (figure 10). Le principe de ces
criblages est de considérer qu’une modification du dosage d’un gène en lien avec le
mécanisme d’action d’une drogue influence la sensibilité vis-à-vis de cette drogue. Par
combinaison de ces approches, un gène conférant à la fois une résistance s’il est surexprimé et
une sensibilité s’il est délété, a une grande probabilité d’être en lien avec le mécanisme
d’action de cette drogue.
Plusieurs gènes suppresseurs ont été isolés lors du criblage d’une banque d’ADN
génomique de levure, construite dans le plasmide multicopies YEp13 :
- (1) le gène YAP1 ;
Tout d’abord, nous nous sommes intéressés au mécanisme de résistance dépendant du
facteur de transcription Yap1, surexprimé par plusieurs transformants résistants obtenus lors
du criblage. Ce facteur de transcription est impliqué dans la réponse transcriptionnelle à
différents stress cellulaires tels qu’un stress oxydant ou une génotoxicité (Zhang et al. 2011).
En effet, en plus de son implication bien décrite dans la réponse au stress oxydant, Yap1
s’accumule dans le noyau en réponse à des molécules génotoxiques, par exemple en réponse à
des dommages à l’ADN induit par le méthyl-méthansulfonate (Rowe et al. 2012), ou en
réponse aux propriétés antimitotiques du bénomyle (Lucau-Danila et al. 2005). La
transcription de YAP1 et l’accumulation de Yap1 ne sont pas induites en présence de canthin6-one, ce qui suggère que ni le stress oxydant, ni un éventuel effet génotoxique, ne sont à
l’origine des effets antifongiques de la canthin-6-one (Dejos et al. 2013).
58
Figure 10 : Combinaison des approches HIP, HOP et MSP (illustration de Roemer et al.
2011) Trois banques de souches possédant des délétions homozygotes (n = 4 990, HOP), des
délétions hétérozygotes (n = 1 145, HIP) et des souches transformées avec une banque
d’ADN génomique (n = 4 700, MSP) sont traitées avec une molécule d’intérêt. Les
« séquences étiquettes » des délétants et les inserts d’ADN génomique des transformants sont
isolés et amplifiés. Ces séquences sont hybridées séquentiellement sur la même puce ADN de
type TAG4.
59
Finalement, la résistance dépendante d’une surexpression de Yap1, repose sur un
mécanisme trivial d’expulsion de cette molécule grâce à la pompe d’efflux Flr1 (Dejos et al.
2013). Si ce résultat ne permet pas de se prononcer sur le caractère génotoxique de la canthin6-one, il reste néanmoins important de savoir que cette molécule peut être prise en charge par
des pompes d’efflux. La pompe d’efflux Flr1 de la famille des MFS (Major Facilitator
Superfmily) a été initialement identifiée comme responsable d’une résistance au fluconazole
(Flr1 : Fluocanazole Resistance 1, source SGD) et prend en charge de nombreuses autres
drogues dont le bénomyle ou le méthotrexate précédemment évoqués (réf. dans Dos Santos et
al. 2014). Dans les cellules cancéreuses, les principales pompes responsables de l’expulsion
de drogues sont les protéines MDR (MultiDrug Resistante protein) de la famille des
transporteurs ABC (Amaral et al. 2007). Pour savoir si des transporteurs de types ABC
peuvent expulser la canthin-6-one, la résistance de souche de levure surexprimant ces
transporteurs pourra être évaluée par test en gouttes. Chez la levure, ces transporteurs (Yor1,
Pdr5, Pdr15, Pdr10, Snq2, Pdr11 et Pdr18) sont surexpimés dans des souches possédant des
allèles gain de fonction pour les facteurs de transcription Pdr1 et Pdr3.
Pour l’étude du mécanisme de résistance dépendant de Yap1 nous avons mesuré les
taux d’expression d’une partie de ses gènes cibles par RT-PCR après 1 h de traitement (Dejos
et al. 2013). Une étude transcriptomique à plus grande échelle, réalisée grâce à des puces à
ADN, décrirait plus précisément les réponses transcriptionnelles mises en place suite à une
exposition à la canthin-6-one. Une approche cinétique, permettrait d’observer des
modifications précoces de l’expression de certains gènes, au lieu de rechercher des gènes dont
l’effet n’est visible qu’à long terme grâce à l’évaluation de la viabilité par test en gouttes.
Ainsi, une étude cinétique comparable à celle réalisée sur le bénomyle pourrait être réalisée
sur une souche de référence immédiatement après une exposition à la canthin-6-one (entre 30
sec à 40 min, voir dans Lucau-Danila et al. 2005).
- (2) le gène VAM3 ;
Le fait que le gène VAM3 induise une résistance vis-à-vis de la canthin-6-one reste à
confirmer. Ceci pourra être vérifié simplement en observant la sensibilité par test en gouttes
de la souche flr1∆ transformée avec un plasmide permettant la surexpression de VAM3 (par
exemple le plasmide utilisé dans Darsow et al. 1997). Le mécanisme de résistance dépendant
de Vam3 pourrait faire intervenir un stockage ou une dégradation de la canthin-6-one dans les
vacuoles. Si c’est le cas, une souche délétée pour VAM3 et présentant des vacuoles anormales
devrait être plus sensible à la canthin-6-one que les souches de références. Cette hypothèse
serait en accord avec l’observation de l’accumulation de la canthin-6-one-N-oxide dans les
60
vacuoles, visualisée en microscopie de fluorescence au cours de cette étude (résultat non
illustré). Le mécanisme de résistance dépendant de VAM3 pourrait donc une nouvelle fois être
trivial et ne pas nous renseigner sur le mode d’action de la canthin-6-one.
- (3) le gène RPO31 ;
Par la suite, l’identification des gènes suppresseurs s’est portée sur les plasmides
responsables d’un phénotype résistant intermédiaire. Si la surexpression de la sous-unité
Rpo31 grâce à un plasmide multicopies, confirme son effet suppresseur, l’ARN polymérase
III pourrait être une protéine cible de la canthin-6-one à la fois chez la levure et dans les
cellules animales. Il est envisageable de réaliser in vitro des mesures de l’activité de l’ARN
polymérase III en présence de canthin-6-one pour appuyer cette hypothèse (voir protocole
dans Wu et al. 2003). Cet essai consiste à mesurer l’incorporation de GTP radiomarqué dans
des ARNt suite à l’incubation d’extrait nucléaire de levure en présence de plasmides portant
des gènes d’ARNt (voir protocole dans Wu et al. 2003). L’effet de la canthin-6-one sur la
transcription des ARNt pourrait également être observé par détection des ARNt radiomarqués
sur northern blot (voir protocole dans Wu et al. 2003).
- (4) le gène SIZ2.
Enfin, le gène suppresseur SIZ2, codant pour une enzyme E3-ligase, a été identifié.
Comme le facteur de transcription Yap1, l’enzyme Siz2 possède de nombreuses cibles
cellulaires dont des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN ou dans la maintenance
de la longueur des télomères (source : SGD). Ce n’est que récemment que l’importance des
protéines de la famille SUMO a été décrite dans les mécanismes de réparation des dommages
à l’ADN (Psakhye et Jentsch 2012). La SUMOylation peut concerner des protéines de la
recombinaison homologue impliquée dans la réparation de cassures double brin (Psakhye et
Jentsch 2012). L’identification du gène suppresseur SIZ2 suggère que la canthin-6-one
provoque des dommages à l’ADN, à l’origine de ses effets antifongiques. Différents
mécanismes d’action peuvent être envisagés, comme la formation d’adduits par une
interaction directe de la canthin-6-one avec l’ADN (ex. : mutations provoquées par l’acide
aristolochique, Hoang et al. 2013). La canthin-6-one pourrait provoquer des cassures de
l’ADN pendant la réplication par interaction avec l’ADN ou des protéines de la réplication
(ex. : mode d’action de l’irinotécan et de l’étoposide, Marsh et Hoskins 2010, Tammaro et al.
2013 ; mode d’action de la curcumine, Jiang et al. 2010). La canthin-6-one pourrait inhiber
des systèmes de reconnaissance ou de réparation de l’ADN (ex. : la caféine inhibe les kinases
ATM et ATR activées par des cassures double brin de l’ADN, Sarkaria et al. 1999).
61
La canthin-6-one possède un spectre d’action très large : effets antiviraux,
antiulcéreux, antiparasitaires, antimicrobiens, antifongiques et anticancéreux. Le caractère
génotoxique de la canthin-6-one pourrait expliquer l’étendue de ses propriétés biologiques.
Ainsi, l’inhibition de la prolifération des levures et des lignées cancéreuses provoquée par la
canthin-6-one, pourrait avoir pour origine un arrêt du cycle cellulaire au niveau du point de
contrôle G2/M, impliqué dans la vérification de l’intégrité du génome après la réplication.
Cependant à première vue, ces effets antiprolifératifs sont quelque peu différents sur les
levures et les lignées cancéreuses.
Contrairement à ce qui est observé sur les lignées cancéreuses, un traitement avec une
concentration de 40 µM de canthin-6-one ne provoque pas un arrêt complet de croissance
chez la levure (Dejos et al. 2013). Suite à l’identification du mécanisme de résistance
dépendant de la pompe Flr1, des courbes de suivi de croissance ont été réalisées sur la souche
flr1∆ pour s’affranchir de l’éventuelle activité de celle-ci (figure 10). Il a pu être observé que
la croissance de cette souche est simplement ralentie en présence de canthin-6-one et ce
jusqu’à la concentration de 120 µM (figure 11, communication personnelle Kenza Taoud,
stage de licence).
D’autre part, les cellules cancéreuses traitées pendant 2 jours avec 40 µM de canthin6-one s’accumulent dans les phases G2 ou M du cycle cellulaire (voir publication soumise
Dejos et al. 2014). En revanche, une expérience préliminaire de cytométrie en flux montre
que pour les levures flr1∆ exposées pendant 3 h avec 120 µM de canthin-6-one, c’est la
proportion de cellules en phase S qui tend à augmenter (figure 12, communication personnelle
Thierry Bergès).
Ces différences trouvent une explication dans le fait que le passage du point de
contrôle G2/M chez la levure n’est pas aussi strict que dans les cellules animales (Stark et
Taylor 2004). En effet, les cellules dont l’ADN est endommagé peuvent achever leur mitose
et continuent à progresser dans le cycle cellulaire (Stark et Taylor 2004). Cette relative
tolérance est en revanche abolie chez certains mutants (Lee et al. 2001) dont la sensibilité
pourra être comparée à celle de souches de référence. Les effets observés précocement chez la
levure après 3 h de traitement, soit environ 2 générations, n’excluent pas que la canthin-6-one
interfère avec le bon déroulement de la réplication et que les lésions générées entrainent une
activation du point de restriction G2/M. Finalement, les effets antiprolifératifs observés sur les
levures et les lignées cancéreuses peuvent être le reflet d’une génotoxicité de la canthin-6-one,
conduisant à l’activation du point de contrôle des dommages à l’ADN G2/M.
62
Figure 11 : Inhibition de la croissance de la souche flr1∆ jusqu’à de fortes
concentrations de canthin-6-one (communication personnelle Kenza Taoud)
La croissance de la souche flr1∆ en milieu liquide complet YPG pH 6 a été suivie par mesure
de la densité optique DO600nm pendant 10 h (une mesure toutes les 2 h) à partir d’une culture
ensemencée à DO600nm = 0,1. Les levures sont traitées dès l’ensemencement de la culture avec
différentes concentrations de canthin-6-one : 30 µM, 40 µM, 80 µM et 120 µM, ou du DMSO
0,2%.
63
Figure 12 : Distribution des
es levures dans les différentes phases du
u cycle
c
cellulaire en
présence de canthin-6-one (communication
(co
personnelle Thierry Bergès)
La souche flr1∆ est cultivée en milieu liquide YPG pH 6 pendant 3 h en présence
pr
de canthin6-one 120 µM ou de DMSO 0,2
0 %. Toutes les 30 min, un échantillon estt prélevé
p
afin de fixer
les cellules et de marquer l’AD
ADN au SYBR Green pour l’analyse par cytom
métrie en flux.
64
Chez la levure, un arrêt en G2/M se traduit par une diminution du nombre de cellules
présentant un fuseau mitotique normal. Dans une expérience préliminaire, une souche de
levure exprimant une protéine tubuline étiquetée GFP (gracieusement offerte par le Pr. David
G. Drubin, University of California, Berkeley) a été traitée dans les même conditions que
l’expérience de cytométrie en flux (120 µM de canthin-6-one ou DMSO 0,2% pendant 3 h)
afin d’observer l’aspect des fuseaux mitotiques en présence de canthin-6-one par microscopie
confocale de fluorescence (figure 13). En présence de canthin-6-one, la proportion de cellules
en mitose, caractérisées par un fuseau mitotique traversant la cellule mère et la cellule fille,
semble diminuer au profit de cellules en G2, caractérisées par un fuseau mitotique localisé
dans la cellule mère (figure 13). Même si les conditions expérimentales étaient identiques, les
résultats de ces expériences préliminaires ne sont pas complètement corrélés. Il sera
nécessaire de répéter ces expériences afin de confirmer qu’une accumulation des levures en
phase S est suivie d’une activation du point de restriction G2/M.
Les analyses du cycle cellulaire par cytométrie en flux réalisée sur la lignée PC-3
montrent qu’en présence de canthin-6-one, les cellules s’accumulent dans les phases G2 ou M
du cycle cellulaire. L’observation, dans une expérience préliminaire, des fuseaux mitotiques
chez la levure indique une diminution de la proportion des cellules en mitose. Plusieurs
expériences peuvent être réalisées pour affiner les résultats de cytométrie concernant les
cellules PC-3 et distinguer clairement si les cellules sont arrêtées en G2 ou M. L’hypothèse
d’un effet sur la mitose n’est pas privilégiée car la canthin-6-one n’affecte pas la
polymérisation de la tubuline in vitro (voir publication soumise, Dejos et al. 2014). Cependant
d’autres mécanismes peuvent empêcher le bon déroulement de la mitose et ce résultat ne
suffit pas à écarter cette hypothèse. Par cytométrie en flux, il est possible de distinguer les
cellules en mitose par une immunodétection de l’histone H3 phosphorylée (Stark et Taylor
2004). Les cellules sont alors triées en fonction de la quantité de fluorescence ADN (iodure de
propidium) et de l’immunofluorescence de l’histone 3 phosphorylée (voir protocole dans Xu
et al. 2002). Pour compléter cette approche, l’état d’activation de protéines impliquées dans la
régulation du cycle cellulaire pourra être caractérisé par western blot (ex. : phosphatase
Cdc25c et protéine kinase Cdk1/Cdk2 responsable de l’entrée en phase M). La localisation de
la cycline B1, accumulée dans le noyau avant la mitose, pourra être observée en
immunofluorescence. Dans l’hypothèse où la canthin-6-one provoque des cassures de l’ADN,
l’état de phosphorylation des protéines Chk1 et Chk2 par les senseurs ATM et ATR pourra
être étudié par western blot.
65
Figure 13 : Aspect des fuseau
eaux mitotiques en présence de canthin-6-on
one (communication
personnelle Thierry Bergès)
Une souche exprimant la tub
ubuline étiquetée GFP a été cultivée en milie
ilieu complet liquide
jusqu’à une DO600nm = 0,4 pui
puis traitée pendant 3 h en présence de canthin
hin-6-one 120 µM ou
de DMSO 0,2%. La fluoresce
scence de la tubuline localisée au niveau du fu
fuseau mitotique est
observée en microscopie confo
nfocale.
66
Si l’activation du point de restriction G2/M en présence de canthin-6-one est
confirmée dans les lignées cancéreuses, cela vient encore appuyer l’hypothèse d’une
génotoxicité de cette molécule. Ces effets ne sont pas sans rappeler ceux de l’acide
aristolochique, présent dans les plantes de la famille des aristoloches utilisées dans la
pharmacopée chinoise et qui induit un arrêt des cellules en G2/M (Jenkins et al. 2014). Cette
molécule s’est révélée hautement cancérigène et son utilisation a été interdite au Japon, en
Europe et en Amérique du Nord (Clyne 2013). L’acide aristolochique introduit des mutations
par formation d’adduits avec l’ADN (Hoang et al. 2013) et son accumulation locale au niveau
du rein, par l’intermédiaire des transporteurs d’anions organiques de type 1 et 3, conduit à
une insuffisance rénale et à l’apparition de tumeurs des voies urinaires supérieurs (Xue et al.
2011). Aucun effet comparable n’a été jusqu’à présent décrit dans les populations sudaméricaines utilisant des plantes riches en canthinones, ce qui n’exclue pas des effets
délétères. De nombreuses méthodes permettent d’évaluer la génotoxicité et la carcinogénicité
d’une drogue (Abdelmigid 2013) et une batterie de tests in vitro et in vivo est recommandée
pour l’évaluation de la génotoxicité de molécules pharmaceutiques (Brambilla et al. 2011) :
- (1) la recherche de mutations génétiques chez la bactérie ;
Ce test consiste en la recherche de souches de bactéries mutantes révertantes pour une
auxotrophie. Le test d’Ames utilise des souches de Salmonella typhimurium auxotrophes pour
l’histidine mais un autre test propose d’utiliser des souches d’Escherichia coli auxotrophes
pour le tryptophane. Une pression de sélection est exercée sur les bactéries en les forçant à
pousser sur un milieu solide en absence de l’acide aminé essentiel à leur croissance et en
présence de la molécule à tester. Plus l’effet mutagène de cette molécule est fort, et plus le
nombre de souches mutantes devenues prototrophes (révertants) pour l’acide aminé essentiel
est important (Abdelmigid 2013).
Des tests similaires peuvent être effectués chez la levure. Il existe un essai basé sur
l’apparition de différences de couleur des colonies en fonction de modifications génétiques du
gène ADE2 : colonies normales blanches, colonies mutantes roses ade2-119/ade2-119 ou
colonies mutantes rouges ade2-40/ade2-40 (ex. avec la bléomycine, Poli et al. 1999). Il est
également possible de déterminer la fréquence de réversion d’une mutation ponctuelle (ex. :
mutation ilv1-92 du gène codant pour l’enzyme Iso1 impliquée dans la synthèse de
l’osileucine, Poli et al. 1999).
- (2) l’évaluation cytogénétique in vitro d’aberrations chromosomiques ou un test de
recherche de mutations génétiques sur des cellules de mammifères (Brambilla et al. 2011) ;
67
- (3) l’évaluation in vivo d’aberrations chromosomiques sur des cellules
hématopoïétiques de rongeurs (Brambilla et al. 2011).
En conclusion, la réévaluation des propriétés anticancéreuses de la canthin-6-one sur
différentes lignées a montré que cette drogue a en premier lieu un effet antiprolifératif. Dans
un second temps, l’effet cytotoxique mis en évidence sur certaines lignées cancéreuses
pourrait être la conséquence de l’activation du point de contrôle G2/M. Si cette hypothèse se
confirme, une attention particulière devra être portée à la vérification de l’innocuité de la
canthin-6-one sur les cellules saines. La poursuite de la caractérisation des effets
antiprolifératifs et des cibles moléculaires de la canthin-6-one reste un préalable à son
développement thérapeutique.
68
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74
Partie 2. Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation des
photorécepteurs
75
Index des figures
Figure 1 : Anatomie de l’œil.....................................................................................................79
Figure 2 : Organisation de la rétine des vertébrés.....................................................................81
Figure 3 : Le champ récepteur « centre ON - périphérie OFF »...............................................83
Figure 4: Les deux voies de recyclage des rétinoïdes chez les vertébrés..................................85
Figure 5 : Morphologie d’un photorécepteur de type bâtonnet................................................88
Figure 6 : Le pédicule synaptique des photorécepteurs............................................................89
Figure 7 : La phototransduction................................................................................................92
Figure 8 : Les sept types de photorécepteurs des oiseaux.........................................................95
Figure 9 : Détermination des domaines présomptifs de la rétine au niveau des vésicules et des
cupules optiques........................................................................................................................97
Figure 10 : Migration nucléaire intercinétique et symétrie des divisions cellulaires................99
Figure 11 : Chronologie des sorties de mitose des précurseurs rétiniens................................111
Figure 12 : Inhibition latérale de la différenciation neuronale par le système Delta-Notch...111
Figure 13 : Les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes d’opsines..117
Figure 14 : Modèle de la cascade de signalisation responsable de la transcription du gène de la
rhodopsine in vitro..................................................................................................................122
Figure 15 : Annotation de la séquence codante de l’ARNm HCN1 de G. gallus
(XM_429145.4).......................................................................................................................128
Figure 16 : Carte du vecteur de clonage pGEMT-easy (Promega).........................................129
Figure 17 : Vecteur d’expression pcDNA3 (Invitrogen)........................................................132
Figure 18 : Immunofluorescence du canal HCN1..................................................................138
Figure 19 : Effet de l’expression forcée du canal HCN1 sur l’activité du promoteur
rhodopsine...............................................................................................................................140
76
Index des tableaux
Tableau 1 : Rôle des signaux extracellulaires dans la prolifération et la différenciation des
progéniteurs rétiniens..............................................................................................................100
Tableau 2 : Rôle des facteurs de transcription et des régulateurs du cycle cellulaire dans la
prolifération et la différenciation des cellules de la rétine neurale.........................................105
Tableau 3 : Régulation de l’engagement et de la différenciation des précurseurs rétiniens par
des combinaisons de facteurs de transcription........................................................................113
Tableau 4 : Amorces utilisées au cours du clonage de la séquence codante HCN1...............127
77
Introduction générale
1. Situation anatomique de la rétine dans l’œil
L’œil des vertébrés est constitué de trois couches tissulaires concentriques : la couche
externe (ou scléro-cornéenne), la couche intermédiaire (ou uvée) et la couche interne qui
correspond à l’ensemble rétine neurale et épithélium pigmentaire (figure 1). Le volume de
l’œil est rempli aux trois-quarts par l’humeur vitrée qui maintient la pression intraoculaire.
La couche externe de l’œil est constituée, dans sa partie postérieure, de la sclérotique et
dans sa partie antérieure, de la cornée. La sclérotique est en continuité avec la dura du
système nerveux central et elle assure l’intégrité physique de l’œil grâce à un empilement de
fibres de collagène. En avant de l’œil, la cornée est un disque transparent, car non vascularisé
et contenant peu de cellules.
La couche intermédiaire de l’œil est située entre le tissu de protection que constitue la
sclérotique et le tissu neurosensoriel qu’est la rétine. Elle présente trois régions
spécialisées qui sont, de l’avant vers l’arrière : l’iris, le corps ciliaire et la choroïde. Sur la
partie antérieure de l’œil, l’iris est un diaphragme qui contient des cellules pigmentées et des
cellules musculaires lisses dont la contraction règle la quantité de lumière qui pénètre dans
l’œil. Dans le prolongement de l’iris, le corps ciliaire adapte la forme du cristallin auquel il
est relié par des ligaments suspenseurs. Le cristallin avasculaire est principalement constitué
de cellules épithéliales dépourvues d’organites (fibres du cristallin) et joue le rôle d’une
lentille. Enfin, la choroïde est un réseau dense de capillaires fenêtrés, qui s’étend entre la
sclérotique et l’épithélium pigmentaire. Les choriocapillaires fenêtrés assurent l’arrivée de
nutriments et l’oxygénation de la rétine.
La rétine est la couche la plus interne de l’œil. Elle est composée de deux tissus
distincts : l’épithélium pigmentaire et la rétine neurale. Le compartiment qui les sépare,
espace sous-rétinien, est homologue aux ventricules cérébraux. L’épithélium pigmentaire est
une monocouche de cellules chargées de mélanine qui forme la barrière hémato-rétinienne
externe. L’étanchéité de l’épithélium pigmentaire est assurée par des jonctions serrées, des
jonctions adhérentes et des desmosomes. Il est responsable des échanges trophiques et
hormonaux entre les choriocapillaires et la rétine neurale et joue ainsi un rôle essentiel dans la
composition du liquide interstitiel sous rétinien. En plus de ses fonctions trophiques,
l’épithélium pigmentaire protège les photorécepteurs contre l’excès de photons et assure le
renouvellement du pôle apical des photorécepteurs par phagocytose (Rizzolo et al. 2011). La
78
rétine neurale est le tissu qui convertit les signaux lumineux en potentiels d’action transmis
au cerveau par le nerf optique pour permettre la vision (Nelson 2011). C’est un
neuroépithélium pluristratifié, constitué de plusieurs types de neurones et de cellules gliales.
Figure 1 : Anatomie de l’œil (illustration de Stevens et Lowe 1992)
La couche externe (ou scléro-cornéenne), illustrée en bleu, est constituée de la sclérotique et
de la cornée. La couche intermédiaire (ou uvée), illustrée en violet, comprend l’iris, le corps
ciliaire et la choroïde. La couche interne, illustrée en noir et jaune, correspond à l’ensemble
épithélium pigmentaire et rétine neurale, reliée au nerf optique. L’œil est rempli aux troisquarts par l’humeur vitrée qui maintient la pression intraoculaire.
79
2. Histologie fonctionnelle de la rétine neurale
Les différentes populations de neurones et de cellules gliales composant la rétine
neurale sont organisées en trois couches cellulaires (ou nucléaires), séparées par deux couches
synaptiques (ou plexiformes) (figure 2).
La couche nucléaire externe est composée des corps cellulaires des photorécepteurs
(cônes et bâtonnets) dont le pôle apical contacte les cellules de l’épithélium pigmentaire à
travers l’espace sous-rétinien. Du côté scléral de la couche nucléaire externe, des jonctions
adhérentes et des desmosomes associant photorécepteurs et cellules gliales de Müller
constituent la membrane limitante externe qui assure l’étanchéité de l’épithélium rétinien
(Omri et al. 2010). Selon les espèces, la couche nucléaire externe est plus ou moins
pluristratifiée : deux ou trois strates de noyaux chez de nombreux poissons, batraciens et
oiseaux, cinq strates chez l’Homme, douze chez le rat (figure 2).
La couche plexiforme externe est constituée par les synapses entre photorécepteurs,
cellules bipolaires (neurones de second ordre dans la transmission verticale du signal vers le
cerveau) et cellules horizontales (interneurones modulant la transmission verticale). Le signal
électrique produit par les photorécepteurs en réponse à la lumière est de type analogique :
dépolarisation graduelle à l’obscurité, hyperpolarisation graduelle à la lumière. Il est transmis
aux cellules bipolaires et aux cellules horizontales par l’intermédiaire de synapses
glutamatergiques.
La couche nucléaire interne contient les corps cellulaires des cellules bipolaires, des
cellules horizontales, des cellules amacrines et des cellules gliales de Müller.
Les cellules bipolaires sont des neurones de second ordre connectés aux
photorécepteurs. Elles intègrent les signaux de 5 à 15 photorécepteurs (Kolb et Nelson 1993).
La réponse électrique des cellules bipolaires est comme celle des photorécepteurs de type
analogique, mais elle peut être de même sens que celle du photorécepteur ou de sens inverse.
On distingue ainsi les cellules bipolaires ON qui se dépolarisent à la lumière et les cellules
bipolaires OFF qui se dépolarisent à l’obscurité. Les cellules bipolaires ON expriment des
récepteurs glutamatergiques métabotropiques mGluR6 (Nakajima et al. 1993) dont
l’activation est hyperpolarisante, alors que les cellules bipolaires OFF expriment des
récepteurs glutamatergiques ionotropiques de type quisquilate et kaïnate (Devries 2000) dont
l’activation est dépolarisante.
80
Figure 2 : Organisation de la rétine des vertébrés (d’après Swaroop et al. 2010)
a. La rétine neurale est en contact avec l’épithélium pigmentaire au niveau des segments
externes des photorécepteurs (cônes, C et bâtonnets, R). L’empilement de noyaux dans la
couche nucléaire externe (CNE) est variable selon les espèces : cinq strates dans la rétine
humaine (b., Wright et al. 2010), trois strates chez la poule (c., Fischer et al. 1999), douze
strates chez le rat (d., Tsubura et al. 2011). Dans la couche plexiforme externe, les
photorécepteurs font synapse avec les cellules horizontales (H) et bipolaires (B). Les noyaux
des cellules horizontales, bipolaires, gliales de Müller (M) et amacrines (A) constituent la
couche nucléaire interne. Les cellules bipolaires font synapse avec les cellules amacrines et
ganglionnaires (G) dans la couche plexiforme interne. Enfin, les axones des cellules
ganglionnaires forment le nerf optique conduisant les signaux visuels vers le cerveau.
81
Les cellules horizontales sont des interneurones connectés en triade avec les
photorécepteurs et les cellules bipolaires. Leur arborisation s’étend horizontalement dans la
couche plexiforme externe et contacte plusieurs synapses entre photorécepteurs et bipolaires.
Ainsi, les cellules horizontales permettent d’intégrer les réponses à la lumière d’un ensemble
de photorécepteurs pour aboutir au stimulus optimal des cellules bipolaires. Le champ
récepteur des cellules bipolaires est concentrique de type « centre ON -périphérie OFF », pour
les cellules bipolaires ON (figure 3), ou l’inverse pour les cellules bipolaires OFF. Il s’agit
donc d’une réponse au contraste, qui traduit une rétro-inhibition exercée par les cellules
horizontales depuis la périphérie vers le centre du champ récepteur. Cette rétro-inhibition
pourrait être de type GABAergique et/ou dépendante de l’excrétion de protons via une pompe
ATP-dépendante (Hirasawa et al. 2012).
Les cellules amacrines sont classées en fonction de leur grande diversité de taille et
de stratification. Elles produisent un ou deux neurotransmetteurs parmi le glutamate, la
glycine, le GABA, la dopamine, l’acétylcholine, la sérotonine et l’adénosine et un
neuropeptide parmi la substance P, la somatostatine, le CRF (corticotropin-release factor), le
VIP (vasoactive intestinal peptide) ou le neuropeptide Y (Kolb 1997). Elles régulent les
synapses entre cellules bipolaires et ganglionnaires, introduisant différents éléments de
complexité, en particulier une composante phasique et une composante directionnelle (Vaney
et al. 2012). De plus, des cellules amacrines particulières (AII) réalisent la connexion entre les
cellules bipolaires de bâtonnets et les cellules ganglionnaires (Kolb 1997).
Les cellules gliales de Müller sont les principales cellules gliales de la rétine, à côté
des astrocytes, qui ne sont présents que dans la couche des fibres nerveuses, et des cellules
microgliales, qui sont des éléments sanguins résidents. Les cellules de Müller s’étendent sur
toute la hauteur de la rétine : à la face ventriculaire, elles constituent la limitante externe en
formant des jonctions adhérentes entre elles et avec les photorécepteurs (Omri et al. 2010); à
la face vitréale, elles reposent sur la lame basale et elles enveloppent les capillaires sanguins,
dans le cas des rétines vascularisées (réf. dans Bringmann et al. 2009). Ces cellules
contiennent des filaments intermédiaires, tels que la vimentine et la GFAP (glial fibrillary
acidic protein) dont l’expression est induite suite à un traumatisme (ex. : décollement de la
rétine, Bringmann et al. 2009). Elles régulent l’équilibre osmotique de la rétine par des
canaux de type aquaporine-4 (Bringmann et al. 2009) ainsi que le pH par leur activité
anhydrase carbonique (Newman 1994) et limitent la présence d’espèces réactives de
l’oxygène dans la rétine grâce au glutathion (Bringmann et al. 2009). Leur stock de glycogène
leur confère un rôle important dans le métabolisme du glucose (Poitry-Yamate et
Tsacopoulos, 1992). Elles sont capables de recycler le glutamate, dont l’accumulation dans le
82
milieu extracellulaire a un effet neurotoxique (Bringmann et al. 2009). De plus, les cellules
gliales de Müller sont le siège d’une voie de régénération du chromophore visuel (le 11-cisrétinal), différente de celle décrite dans l’épithélium pigmentaire (Wang et Kefalov 2009). Ce
nouveau cycle du rétinal (figure 4) permettrait de fournir le chromophore aux cônes et aux
cellules ganglionnaires exprimant la mélanopsine (Mata et al. 2002).
Figure 3 : Le champ récepteur « centre ON - périphérie OFF »
Au centre du champ, les photorécepteurs sont hyperpolarisés en réponse à la lumière. Si de
plus, les photorécepteurs périphériques sont à l’obscurité, ils sont dépolarisés et libèrent du
glutamate (GLUT ). Cette libération excite la cellule horizontale qui libère du GABA (et/ou
des protons), renforçant ainsi l’hyperpolarisation des photorécepteurs situés au centre du
champ. Cette perception du « contraste » minimalise la libération du glutamate au centre du
champ (glut). Les cellules bipolaires ON, possédant des récepteurs glutamatergiques
métabotropiques, elles se trouvent « désinhibées » et libèrent du glutamate, qui augmente la
fréquence des potentiels d’action de la cellule ganglionnaire ON.
83
La couche plexiforme interne est constituée par les synapses entre cellules
bipolaires, amacrines et ganglionnaires. La couche plexiforme interne est divisée en deux
couches synaptiques : dans la couche haute, les cellules bipolaires OFF font des synapses
avec des cellules ganglionnaires OFF et dans la couche basse, de la même façon, se trouve le
circuit ON. Le flux vertical d’information transmis par les cellules bipolaires est
glutamatergique, alors que la modulation exercée par les cellules amacrines fait intervenir une
grande diversité de neurotransmetteurs et neuropeptides.
La couche des cellules ganglionnaires est située sur la face interne de la rétine. Chez
la souris, elle est en réalité composée pour moitié de cellules amacrines déplacées (Jeon et al.
1998), il existe aussi des « ganglionnaires déplacées » dont le corps cellulaire se trouve dans
la couche des amacrines. Les cellules ganglionnaires reçoivent le signal des cellules bipolaires
de cônes et des cellules amacrines AII, qui relaient les bipolaires de bâtonnet. Le circuit des
bâtonnets est très convergent : 75 000 bâtonnets, à travers 5 000 bipolaires, vers 250
amacrines AII et une cellule ganglionnaire (Sterling et al. 1988). Dans le circuit des cônes,
chaque cellule ganglionnaire reçoit les axones de 3 ou 4 cellules bipolaires qui reçoivent ellesmêmes 4 à 8 cônes (Wassle et al. 1981). C’est au niveau des dendrites des cellules
ganglionnaires que le signal, jusqu’ici analogique, devient digitalisé en trains de potentiels
d’action. La réponse électrique des cellules ganglionnaires est soit de type ON (trains de
potentiels pendant toute la durée du signal lumineux), soit de type OFF (l’inverse), soit de
type ON-OFF (trains de potentiels au moment du changement d’éclairage). Les axones des
cellules ganglionnaires constituent d’abord la couche des fibres nerveuses (non myélinisées)
puis se rassemblent dans le nerf optique où ils se myélinisent.
84
Figure 4: Les deux voies de recyclage des rétinoïdes chez les vertébrés
(illustration d’Arshavsky 2002)
(A) Le cycle visuel décrit dans l’épithélium pigmentaire permet de recycler le tout-transretinol en 11-cis-retinal pour les bâtonnets et les cônes. (C) Le cycle visuel récemment décrit
dans les cellules gliales de Müller recycle spécifiquement le 11-cis-retinal à destination des
cônes.
85
3. Les photorécepteurs: cônes et bâtonnets
Les photorécepteurs de la couche nucléaire externe sont des neurones spécialisés,
sensibles à la lumière, qui sont soit de type cône soit de type bâtonnet. Du point de vue
morphologique, les photorécepteurs sont de forme allongée, très polarisés et compartimentés
en quatre régions distinctes : le segment externe, le segment interne, un corps cellulaire
renfermant le noyau et un pédicule synaptique (figure 5).
Le segment externe, structure photosensible du photorécepteur, est constitué d’un
empilement de disques membranaires. Situé au pôle apical du photorécepteur, c’est un type de
cil cellulaire modifié, spécialisé dans la sensibilité à la lumière et dans lequel a lieu la
phototransduction. La structure des disques membranaires et la forme du segment externe sont
des caractéristiques morphologiques permettant de distinguer le type de photorécepteur: cône
ou bâtonnet. Le segment externe des bâtonnets est un compartiment cellulaire de forme
cylindrique dans lequel s’empilent des disques membranaires indépendants, perpendiculaires
à l’axe du segment externe. Ces disques membranaires sont indépendants de la membrane
plasmique mais il existe des structures filamentaires les reliant entre eux et à la membrane
plasmique qui les entoure. Le segment externe des cônes est quant à lui constitué par un
empilement de replis membranaires en continuité avec la membrane plasmique.
Le cil connectif relie le segment externe au segment interne du photorécepteur. Ce cil
connectif contient des microtubules axonémals (structure constituée de 9 doublets de
microtubules) qui s’étendent jusqu’à environ la moitié du segment externe et sont ancrés dans
le segment interne.
Le segment interne possède une région riche en mitochondries (l’ellipsoïde) et plus
près du noyau, une région où se concentrent l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique
(le myoïde). Entre l’ellipsoïde et le segment externe se trouve une gouttelette lipidique unique
et colorée, dans les photorécepteurs de type cône (chez la plupart des vertébrés, sauf les
mammifères placentaires). Cette gouttelette lipidique a une pigmentation caractéristique dans
chaque type de cône et contribue à la discrimination des longueurs d’ondes spécifiques et
donc à la vision des couleurs (Cserhati et al. 1989).
Le corps cellulaire des photorécepteurs est en grande partie occupé par le noyau. A
l’état différencié les noyaux des photorécepteurs s’alignent dans la couche nucléaire externe.
En raison de la densité des photorécepteurs et de l’encombrement des noyaux qui sont des
structures rigides, la couche nucléaire externe est généralement pluristratifiée. Pour une
86
espèce donnée, la position du noyau est assez constante pour chaque type de photorécepteur.
Ainsi, chez la poule, les noyaux des bâtonnets ont la position la plus vitréale puis les noyaux
des cônes se succèdent avec tuilage (Morris et Shorey 1976, Lopez-Lopez et al. 2008, Voisin
et al. 2012).
Le pédicule synaptique des cônes et le sphérule synaptique des bâtonnets
correspondent à un axone très court, connecté aux neurones de second ordre (cellules
horizontales et bipolaires) dans la couche plexiforme externe (figure 6A). En microscopie
électronique, apparaissent en coupe transversale de la synapse des structures planes dense aux
électrons nommée « rubans » (figure 6 B). Ces « synapses rubans », structure également
décrite dans le système auditif, sont de type glutamatergique. Des centaines de vésicules
synaptiques peuvent être reliées au ruban par une structure filamentaire. Ce stock important
de vésicules permet de déverser des centaines de vésicules par seconde pendant une période
relativement longue. Des canaux calciques disposés parallèlement au ruban synaptique
déclenchent l’exocytose des vésicules de glutamate. Les pédicules des cônes comportent
environ 30 rubans synaptiques chacun associé à une triade de dendrites composée d’une
dendrite centrale provenant d’une cellule bipolaire et deux dendrites latérales provenant de
cellules horizontales (Zanazzi et Matthews 2009). Tandis que dans les sphérules de bâtonnets
se trouvent deux rubans synaptiques chacun associé avec quatre neurones de second ordre,
deux dendrites de cellules bipolaires au centre et deux dendrites de cellules horizontales
disposées latéralement (figure 6C).
87
Figure 5 : Morphologie d’un photorécepteur de type bâtonnet
(d’après Kennedy et Malicki 2009)
Les photorécepteurs sont compartimentés en quatre grandes régions: le segment externe, le
segment interne, le corps cellulaire contenant le noyau, et le pédicule synaptique
88
Figure 6 : Le pédicule synaptique des photorécepteurs
(A) Les photorécepteurs établissent des connexions synaptiques avec des cellules horizontales
et bipolaires (modifiée d’après Hogan et al. 1971). (B) En microscopie électronique, le ruban
(r) est une structure dense aux électrons, localisée dans une invagination de la membrane
présynaptique (échelle 0,1µm, modifiée d’après Zanazzi et Matthews 2009). (C) Les rubans
synaptiques des cônes sont associés à une triade de dendrites: une dendrite centrale de cellule
bipolaire (illustrée en vert) et de deux dendrites latérales de cellules horizontales (illustrées en
bleu). Dans les sphérules de bâtonnets (rod) sont associées deux dendrites de cellules
bipolaires au centre et deux dendrites de cellules horizontales latéralement (modifiée d’après
Baden et al. 2013).
89
4. La phototransduction
La phototransduction est la voie de signalisation induite dans les photorécepteurs en
réponse à la lumière (figure 7). La cascade de la phototransduction a été particulièrement bien
décrite dans les segments externes des bâtonnets, qui peuvent être obtenus en grande quantité
à partir de la rétine de grenouille ou de bœuf (Baehr et al. 1979, Hurley et Stryer 1982,
Deterre et al. 1988). Le mécanisme de la phototransduction est le même dans les cônes, mais
avec une cinétique différente, car pour la plupart des protéines de la phototransduction, des
gènes différents sont exprimés sélectivement dans les cônes et dans les bâtonnets (Burns et
Arshavski 2005).
La première étape de la phototransduction est l’absorption d’un photon par le 11cis-rétinal, lié de façon covalente à un récepteur à sept domaines transmembranaires,
l’opsine. La photo-isomérisation du 11-cis-rétinal en tout-trans-rétinal a pour conséquence un
changement de conformation de l’opsine qui sous sa forme activée se couple
transitoirement à une protéine G hétéro-trimérique, la transducine (Tαβγ). La sous unité
catalytique Tα (une GTPase) libère du GDP et lie du GTP au niveau de son site actif, puis se
dissocie des sous unités Tβγ. L’activation de la transducine constitue la première étape
d’amplification du signal dans la phototransduction (20 Tα-GTP par rhodopsine active, Yau et
Hardie 2009).
Tα-GTP active ensuite une phosphodiestérase spécifique du GMPc, la PDE6, dont
l’activité catalytique contrebalance la synthèse de GMPc par une guanylase cyclase (GC). La
PDE6 est une protéine tétramérique composée de deux sous-unités catalytiques Pα et Pβ et de
deux sous-unités régulatrices identiques Pγ. Tα-GTP chélate les sous-unités régulatrices P-γ
afin de lever l’inhibition du dimère catalytique Pαβ. L’hydrolyse du GMPc qui en résulte,
constitue une seconde étape d’amplification du signal (100 000 molécules de GMPc
hydrolysées par rhodopsine activée, Fung et al. 1981).
Une chute de la concentration cytosolique de GMPc au niveau du segment externe du
photorécepteur induit la fermeture des canaux CNG (cyclic nucleotide-gated ion channels)
en moins d’une milliseconde (Karpen et al. 1988). Ces canaux CNG activés par le GMPc sont
présents en grande quantité à la membrane plasmique du segment externe des photorécepteurs
(Fesenko et al. 1985). Ouverts à l’obscurité, grâce à la concentration basale de GMPc, ils sont
à l’origine d’un courant cationique entrant ou dark current, qui maintient la membrane dans
un état dépolarisé et entraîne une libération continue du glutamate au niveau synaptique (Yau
1994). Une fois les canaux CNG fermés (à la lumière), la balance ionique du photorécepteur
90
est régulée par une pompe sodium/potassium ATPase et un échangeur sodium/calium
NCX (sodium-calcium exchanger antiporter). La réduction de l’influx de cations dans le
segment externe du photorécepteur conduit à l’hyperpolarisation de la cellule et par
conséquent à la diminution de la libération de glutamate au niveau synaptique.
Le retour à l’état initial correspond à l’inactivation de chacun des composants de la
cascade de phototransduction et à la restauration de la concentration basale de GMPc,
nécessaires pour que le système puisse à nouveau répondre à la lumière.
Les ions Ca2+ jouent un rôle majeur dans le retour à l’état initial : expulsé en continu
par l’échangeur NCX le taux de calcium diminue suite à la fermeture des canaux CNG par la
lumière. Cette chute du taux de calcium favorise la synthèse de GMPc par la GC, dont
l’activité est régulée par des GCAP (guanylate cyclase-activating proteins) sensibles au
calcium intracellulaire (Koch et al. 2010). De plus, la phosphorylation/inactivation de l’opsine
par la rhodopsine kinase et sa liaison à l’arrestine (Arr1), sont régulées par une calciprotéine,
la recoverine (Kuhn et Wilden 1987). Une autre calciprotéine, la calmoduline, régule l’affinité
du canal CNG pour son ligand GMPc : cette affinité augmente lorsque la concentration de
calcium diminue ce qui contribue à rétablir le dark current dès qu’une faible concentration de
GMPc est disponible.
Des mécanismes indépendants du calcium sont également mis en jeu. Ainsi, la
transducine est inactivée par l’hydrolyse du GTP, laquelle est accélérée par une GAP
(GTPase activating protein), nommée RGS9 (regulator of G-protein signaling 9, He et al.
1998). Les sous-unités Pγ régulatrices de la PDE6 se réassocient aux sous-unités Pαβ. Enfin,
le chromophore est reconverti en 11-cis-rétinal dans l’épithélium pigmentaire par une série
de réactions enzymatiques appelée « cycle visuel » (figure 4).
91
Figure 7 : La phototransduction (illustration de Yau et Hardie 2009)
L’absorption d’un photon (hν) conduit à l’activation de la rhodopsine (Rh*) qui active la
transducine Tαβγ. La sous unité GTPase, Tα, échange le GDP contre du GTP et se dissocie
des sous unités Tβγ. Tα-GTP active la PDE6 qui hydrolyse du GMPc. La chute de
concentration du GMPc induit la fermeture des canaux CNG. L’échangeur NCX fait chuter le
taux de Ca2+ ce qui favorise la synthèse de GMPc par la GC (régulée par la GCAP). La
rhodopsine, inactivée par phosphorylation via la rhodopsine kinase (régulée par la
recoverine), se lie à l’arrestine (Arr). Tα est inactivée par l’hydrolyse du GTP, accélérée par la
GAP RGS9. Les sous-unités Pγ régulatrices de la PDE6 se réassocient aux sous-unités Pαβ.
92
5. Diversité des gènes d’opsines visuelles
Les opsines « visuelles » sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires,
composés d’environ 350 acides aminés, couplées aux protéines G et dont la diversité reflète
celle des photorécepteurs. Les hélices alpha transmembranaires forment un compartiment
hydrophobe dans lequel se loge le chromophore (rétinal) lié de façon covalente par une base
de Schiff à un résidu lysine situé sur la septième hélice du récepteur (Bowmaker 2008).
Chaque type d’opsine confère une sensibilité spectrale particulière au photorécepteur
qui l’exprime (Yokoyama 1996, Bowmaker 2008). Chez les vertébrés, cinq classes d’opsines
sont décrites et chaque bâtonnet ou type de cône exprime une opsine spécifique :
- la rhodopsine (RH1), exprimée dans les bâtonnets, est sensible à des longueurs
d’ondes comprises entre 492 et 508, selon les espèces (Yokoyama 1996) ;
- l’opsine de cône LWS (ou L/MWS) long- to middle-wavelenght-sensitive est
sensible à des longueurs d’onde situées entre 490 et 570 nm (vert-rouge) ;
- l’opsine de cône RH2 rhodopsin-related (aussi nommée opsine MWS pour middle
wavelenght-sensitive) est sensible entre 480 et 535 nm (vert) ;
- l’opsine de cône SWS2 short wavelenght-sensitive 2 est sensible entre 410 et 490
nm (bleu-violet) ;
- l’opsine de cône SWS1 short wavelenght-sensitive 1 (aussi nommée opsine UVS
ultra-violet sensitive ou VS violet-sensitive) est sensible entre 355 et 440 nm.
L’étude des séquences des gènes d’opsines permet de comprendre leur évolution au
sein des différents groupes de vertébrés. Dès l’origine des vertébrés, les lamproies de
l’hémisphère sud (Geotria australis) possèdent cinq gènes d’opsines (Collin et al. 2003). Les
gènes LWS, SWS1 et SWS2 de lamproie semblent être les orthologues des gènes présents chez
les gnathostomes (Collin et al. 2003). Cependant, il n’est pas parfaitement établi si les gènes
RHA et RHB de lamproie et les gènes RH1 et RH2 des gnathostomes sont le résultat de deux
duplications indépendantes (Collin et al. 2003) ou s’ils sont orthologues (Bowmaker 2008).
Les gènes d’opsines ont subi de nombreuses duplications et réductions au cours de
l’évolution des vertébrés. Ainsi, chez les téléostéens, le groupe des acanthoptérygiens a subi
une duplication du gène RH2 (vers – 200 MA), qui a donné naissance aux gènes RH2A et
RH2B. Puis, à l’intérieur de ce groupe, le gène RH2A a subi deux duplications indépendantes
93
chez les cichlidés (poissons des grands lacs africains, vers – 10 MA) et chez les médakas (réf.
dans Bowmaker 2008). Le groupe des acanthoptérygiens a également subi une duplication du
gène SWS2, qui a donné naissance aux gènes SWS2A et SWS2B (réf. dans Bowmaker 2008).
Chez les cyprinidés, qui n’appartiennent pas au groupe des acanthoptérygiens, le gène RH2 a
subi plusieurs duplications indépendantes, produisant quatre gènes RH2 chez le poisson zèbre
et deux gènes RH2 chez le poisson rouge (réf. dans Bowmaker 2008). Au cours de
l’évolution, les gènes d’opsines ont également subi des réductions. Chez les mammifères
euthériens on observe la perte des gènes d’opsines RH2 et SWS2, pour ne conserver qu’une
vision dichromatique avec les opsines LWS et SWS1 (réf. dans Bowmaker 2008). Cependant,
la vision trichromatique est réapparue chez les singes de l’ancien monde, grâce à la
duplication du gène LWS (opsine LWS sensible dans le rouge et MWS sensible dans le vert)
en tandem direct sur le chromosome X (réf. dans Bowmaker 2008).
Au vue des différentes voies évolutives suivies par les gènes d’opsines chez les
vertébrés, il est remarquable que les oiseaux possèdent la même diversité de gènes d’opsines
que celle rencontrée à l’origine du phylum : une copie de RH1, RH2, LWS, SWS1 et SWS2
(Yokoyama 1996). Ainsi, la rétine de poule constitue un modèle favorable pour l’étude des
mécanismes de différenciation de tous les types de photorécepteurs. Dans la rétine de poule
les cinq gènes d’opsines sont exprimés dans sept types morphologiques de photorécepteurs :
un type de bâtonnet et six types de cônes, ces derniers étant caractérisés par la présence d’une
gouttelette lipidique colorée (figure 8, voir aussi Cserhati 1989). Les bâtonnets expriment
l’opsine RH1. L’opsine LWS est exprimée dans des cônes simples, sensibles dans le rouge et
possédant une gouttelette lipidique rouge-orangée, ainsi que dans les deux éléments des cônes
doubles (cône principal et cône accessoire). L’opsine RH2 est exprimée dans les cônes
simples sensibles dans le vert qui possèdent une gouttelette lipidique jaune. L’opsine SWS2
des cônes simples sensibles dans le bleu est associée à une gouttelette « claire ». Enfin, les
cônes simples exprimant l’opsine SWS1 sont sensibles dans le violet et ont une gouttelette
« transparente » (Bowmaker et al. 1997). Les spectres de sensibilité des opsines étant
chevauchants, les gouttelettes lipidiques ont un rôle de filtre chromatique qui améliore la
discrimination des couleurs en fonction de l’opsine associée (Bowmaker et al. 1997).
94
Figure 8 : Les sept types de photorécepteurs des oiseaux (illustration de Bowmaker 2008)
Bâtonnets : opsine RH1, pas de gouttelette lipidique ; Cône violets : opsine SWS1, gouttelette
transparente ; Cônes bleus : opsine SWS2, gouttelette claire ; Cônes verts : opsine RH2,
gouttelette jaune ; Cônes rouges : opsine LWS, gouttelette rouge ; Cônes doubles : opsine
LWS, gouttelette pâle dans le cône principal.
95
6. Les grandes étapes de la rétinogenèse
6.1. Formation des cupules optiques et détermination de la rétine neurale
Les domaines présomptifs des vésicules optiques ont pu être identifiés dans la partie
antérieure du primordium neural, chez l’embryon de poule en fin de gastrulation, entre la
26ème et la 29ème heure de développement (Couly et Le Douarin, 1987). Les vésicules optiques
s’accroissent latéralement jusqu’à entrer en contact avec l’ectoderme de surface, au niveau de
la placode optique (figure 9). Le FGF (Fibroblast Growth Factor) produit par la placode
optique joue un rôle essentiel dans la spécification du domaine de la rétine neurale, caractérisé
précocement par l’expression du facteur de transcription Vsx2/Chx10 (figure 9). Le facteur de
transcription Mitf, marqueur de l’épithélium pigmentaire est quant à lui exprimé uniquement
dans la partie proximale de la vésicule optique (figure 9). Le stade « vésicule optique »
correspond chez la souris au 9ème jour de vie embryonnaire (E9) (Colozza et al. 2012). Par la
suite, l’invagination de la partie centrale des vésicules optiques forme les cupules optiques,
composées de deux feuillets superposés de neuroectoderme entre lesquels se trouve l’espace
du ventricule optique. La couche externe de la cupule optique se différenciera en épithélium
pigmentaire tandis que la couche interne deviendra la rétine neurale (figure 9). Cette
spécification est renforcée par des signaux sécrétés par les tissus adjacents : FGF, activine et
BMP Bone Morphogenic Protein (figure 9, voir aussi Kim et Kim 2012). La partie ventrale de
la couche externe donnera le pédoncule optique sous l’influence du SHH (Sonic Hedgehog)
produit par le prosencéphale ventral.
96
Figure 9 : Détermination des domaines présomptifs de la rétine au niveau
niv
des vésicules
et des cupules optiques (d’apr
après Kim et Kim 2012)
La placode optique produit du FGF qui participe à la spécification de la rétine neurale. Les
cellules de la rétine neurale
le eexpriment le facteur de transcription Vsx2/
x2/Chx10 tandis que
celles de l’épithélium pigment
entaire expriment Mitf. Le SHH produit ventral
tralement influence la
spécification du pédoncule opt
ptique.
97
6.2. Prolifération des progéniteurs multipotents et sortie du cycle cellulaire
Tous les types cellulaires présents dans la rétine neurale sont produits par une
population commune de cellules progénitrices qui prolifèrent à un rythme progressivement
décroissant, jusqu’à E11 chez la poule (Prada et al. 1991) et jusqu’au 12ème jour postnatal
(P12) chez le rat (Rapaport et al. 2004). Chez la souris, un progéniteur produit en moyenne 40
à 50 cellules entre E13 et P12 (Turner et al. 1990). Au stade prolifératif, les progéniteurs
multipotents contactent les deux faces de l’épithélium rétinien pseudostratifié et ils sont le
siège d’une migration nucléaire intercinétique (figure 10). Au cours du cycle cellulaire, le
noyau migre vers la face vitréale entre les phases G1 et S, puis il rejoint pendant la phase G2
la face ventriculaire de la rétine où il accomplit la phase M (figure 10). Au début de leur
prolifération, la majorité des progéniteurs subit une division symétrique, selon un plan
vertical, produisant deux cellules filles identiques qui poursuivent le cycle cellulaire (figure
10). Par la suite, certains progéniteurs se divisent de façon asymétrique selon un plan
horizontal produisant des cellules filles qui héritent de déterminants moléculaires différents
(figure 10). Cette division asymétrique crée la possibilité pour l’une des deux cellules filles de
sortir de mitose pour se différencier.
Cette sortie de mitose concerne en premier lieu des progéniteurs situés au centre de la
rétine, puis elle s’étend progressivement vers sa périphérie (Prada et al. 1991). De nombreux
signaux diffusibles capables d’influencer la prolifération des progéniteurs rétiniens ont été
identifiés, sans que puisse être établi un modèle de régulation général ou une hiérarchie dans
l’importance du rôle de chacun (tableau 1). Les progéniteurs mitotiques sont caractérisés par
l’expression de plusieurs facteurs de transcription et de protéines du cycle cellulaire (tableau
2). Au moment de la sortie de mitose, un rôle prépondérant de la cycline D1 et des CDKI
(Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor protein) a pu être mis en évidence (Dyer et Cepko 2001,
Das et al. 2012). A un stade ultérieur, une partie des précurseurs rétiniens produits pendant la
phase de prolifération sera éliminée par une vague d’apoptose (Cepko et al. 1996).
98
Figure 10 : Migration nucléaire intercinétique et symétrie des divisions cellulaires
(d’après Lee et Norden 2013, Shitamukai et Matsuzaki 2012)
Au cours du cycle cellulaire, le noyau des précurseurs rétiniens migre vers le pôle basal entre
les phases G1 et S et vers le pôle apical entre les phases S et G2. La mitose a lieu à la face
apicale. La répartition de facteurs cytoplasmiques et des récepteurs de surface entre les deux
cellules filles sera différente, selon l’axe du plan de division : vertical dans le cas d’une
division symétrique, horizontal lors d’une division asymétrique.
99
Tableau 1 : Rôle des signaux extracellulaires dans la prolifération et la différenciation
des progéniteurs rétiniens (d’après Cailleau 2004, Agathocleous et Harris 2009)
Wnt
Voie de signalisation Frizzled-GSK3-β-caténine
Prolifération
Chez la poule : l’activité de la voie Wnt maintient un stock de progéniteurs
dans la marge ciliaire (Kubo et al. 2003) ; la surexpression de Wnt2b dans
des explants rétiniens favorise la prolifération (Kubo et al. 2003).
Différenciation
Chez la poule : la surexpression de Wnt2b dans des explants rétiniens inhibe
la différenciation neuronale (Kubo et al. 2003) ; l’expression de Wnt2b
permet la stratification de précurseurs en culture réagrégée (Nakagawa et al.
2003).
Chez la souris, la perte des β-caténines entraine un défaut de stratification de
la rétine (Fu et al. 2006).
Survie
Chez la souris et l’homme, la voie Wnt est impliquée dans la survie des
photorécepteurs (Jones et al. 2000, a et b).
Famille :
Hedgehog
Voie de signalisation Patched-Smoothened-Gli
SHH Sonic Hedgehog, IHH Indian Hedgehog
Développement
Le gradient dorso-ventral SHH participe à la formation du patron tissulaire
de la cupule optique (réf. dans Yang 2004).
Prolifération
Chez la souris :
- l’activation constitutive de la voie Hedgehog induit la prolifération des
progéniteurs (Moshiri et Reh 2004)
- l’activité de la voie Hedgehog favorise la sortie du cycle cellulaire
(Agathocleous et al. 2007)
- SHH sécrété par les cellules ganglionnaires favorise la prolifération des
progéniteurs (réf. dans Wallace 2008).
- la prolifération des progéniteurs est affectée en absence du récepteur Smo
(Sakagami et al. 2009).
Différenciation
Chez le poisson-zèbre, SHH produit par les cellules ganglionnaires produit
une vague de neurogenèse centre-périphérie (réf. dans Yang 2004).
Chez le rat, SHH favorise la différenciation des photorécepteurs (réf.
dans Levine et al. 2000).
Chez la poule, SHH inhibe la différenciation des cellules ganglionnaires (réf.
dans Yang 2004).
Chez la souris, les cellules ganglionnaires sont produites en excès en absence
du récepteur Smo (Sakagami et al. 2009).
100
Suite du tableau 1. (1/4)
Delta-Notch
Voie de signalisation Delta-Notch-Hes-Groucho
Prolifération et différenciation
L’inhibition latérale de la différenciation neuronale par les cellules
ganglionnaires maintien la prolifération des progéniteurs et favorise la
gliogenèse (Perron et Harris 2000, voir aussi figure 12).
FGF 1 et 2
Voies de signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK)
FGF Fibroblast Growth Factor
Développement
FGF produit par l’ectoderme de surface, intervient dans la spécialisation de la
rétine neurale par rapport à l’épithélium pigmentaire (réf. dans Yang 2004).
FGF favorise la neurogenèse, la prolifération et participe à la gliogenèse
(Lillien et Cepko 1992, Esteve et Bovolenta 2006).
FGF stimule la différenciation des photorécepteurs dans des cultures de
précurseurs rétiniens d’embryon de poule (Tcheng et al. 1994) ou de rat
nouveau-né (Hicks et Courtois 1992).
Survie
Chez le rat RCS présentant une dégénérescence rétinienne, FGF prévient la
dégénérescence des photorécepteurs in vivo (Faktorovich et al. 1990).
Chez le porc, FGF prévient la dégénérescence des photorécepteurs in vitro
(Traverso et al. 2003).
Chez le poisson-zèbre, l’expression d’une forme dominant négative du
récepteur FGF-1 entraine une dégénérescence des photorécepteurs
(Hochmann et al. 2012).
EGF
TGFα
Récepteurs de l’EGF, voies de signalisation RTK
EGF Epidermal Growth Factor
TGFα Transforming Growth Factor alpha
Prolifération
Chez la poule et chez l’homme, EGF stimule la prolifération des cellules
souches de la marge ciliaire (Fischer et Reh 2000).
Chez le rat, TGFα favorise la prolifération de progéniteurs rétiniens in vitro.
(Lillien et Cepko 1992)
Différenciation
Chez le rat, la surexpression du récepteur à l’EGF diminue la
différenciation des bâtonnets au profit des cellules de gliales in vivo et in
vitro (Lillien 1995).
Chez le rat, TGFα favorise la gliogenèse in vitro. (Lillien et Cepko 1992)
101
VEGF
GDNF
Famille :
Insulin
IGF1-2
Voies de signalisation des RTK
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGF produit par les cellules ganglionnaires différenciées augmente la
prolifération des progéniteurs et inhibe la différenciation des cellules
ganglionnaires (Hashimoto et al. 2006).
Voies de signalisation RTK, récepteur Ret et corécepteur GFRα1
GDNF Glial-cell-Derived Neurotrophic Factor
Expression
Dans la rétine de poule, l’expression du récepteur Ret suit un gradient centre
périphérie (Karlsson et al. 2002, Rothermel et al. 2004).
Différenciation
Chez la poule, GDNF favorise la différenciation des bâtonnets dans des
cultures de précurseurs rétiniens réagrégés (rétinosphéroides)
(Rothermel et Layer 2003).
Survie
Chez le rat transgénique (TgN S334ter-4 : modèle de Retinis pigmentosa) et
la souris rd (retinal degeneration) GDNF augmente la survie des bâtonnets
(Frasson et al. 1999, McGee Sanftner et al. 2001).
GDNF associé au DHA, favorise la survie des photorécepteurs de rat in vitro
(Politi et al. 2001).
Voies de signalisation des récepteurs insuline IR
IGF Insulin-like Growth Factor
Chez la poule :
- IGF1 exerce une action anti-apoptotique (Diaz et al. 2000) et stimule la
neurogenèse dans la rétine (Frade et al. 1996) ;
- IGF1 et IGF2 jouent un rôle stimulateur autocrine/paracrine dans la
neurogenèse (Hernandez-Sanchez et al. 1995) ;
-insuline et FGF2 stimulent la dédifférenciation des cellules gliales, leur
prolifération et la génération de nouveaux neurones (Fischer et al. 2002).
Chez les poissons, les IGF produits par les cônes favorisent la différenciation
des bâtonnets (Zygar et al. 2005).
102
TGFβ
BMP
Activine
Voie de signalisation Smad
TGFβ Transforming Growth Factor beta
BMP Bone Morphogenic Protein
Développement
Un gradient dorso-ventral de BMP participe à la morphogenèse de la cupule
optique (réf. dans Yang 2004).
Prolifération
Chez le rat, TGFβ inhibe la prolifération (Close et al. 2005).
Chez la souris, BMP favorise la prolifération (Murali et al. 2005).
Différenciation
Chez la souris, BMP favorise la neurogenèse (Murali et al. 2005).
Chez la poule, l’activine A inhibe la différenciation des photorécepteurs
et favorise la différenciation des cellules amacrines dans des cultures de
précurseurs rétiniens E7 (Belecky-Adams et al. 1999).
Chez le rat, l’activine A favorise la différenciation des bâtonnets dans
des cultures de précurseurs rétiniens E18 (réf. dans Yang 2004).
Apoptose
Chez la poule, TGFβ favorise l’apoptose (réf. dans Yang 2004).
Chez la souris, l’apoptose des cellules rétiniennes est freinée par BMP (réf.
dans Yang 2004).
CNTF
Voie de signalisation Jak-STAT
CNTF Ciliary NeuroTrophic Factor
Expression
Chez la poule, le récepteur du CNTF est exprimé par les précurseurs de
photorécepteurs entre les stades embryonnaires E8 et E12 (Fuhrmann et
al. 1998).
Différenciation
Chez la poule, CNTF stimule la production de cônes verts in vitro
(Fuhrmann et al. 1995, Xie et Adler 2000).
Chez le rat :
- CNTF inhibe la différenciation des bâtonnets in vitro (Ezzeddine et al.
1997, Kirsch et al. 1998, Schulz-Key et al. 2002)
- CNTF réoriente les précurseurs vers un phénotype bipolaire in vivo
(Morrow et al. 1998).
Survie
Chez la souris rd, CNTF associé à BDNF prévient la dégénérescence des
photorécepteurs in vitro (Ogilvie et al. 2000).
103
Acide
rétinoïque
Voie de signalisation : récepteurs nucléaires Rar et Rxr
RA Retinoic Acid
Différenciation
Chez l’homme, RA induit spécifiquement l’expression des gènes de
l’HIOMT et de l’arrestine dans des cultures de rétinoblastes (Bernard et
Klein 1996, Li et al. 2002).
Chez le rat, RA stimule la différenciation des bâtonnets in vitro et in vivo
(Kelley et al. 1994-1995-1999).
Chez la poule, RA pourrait jouer un rôle dans la stratification de la rétine
(Hoover et al. 2001).
Hormone T3
Voie de signalisation : récepteurs nucléaires Trβ2
T3 : tri-iodothyronine
Expression
Chez la poule et la souris, le récepteur Trβ2 est exprimé dans la couche des
photorécepteurs durant la rétinogenèse (réf. dans Harpavat et Cepko 2003).
Prolifération et Différenciation
Chez le rat, T3 favorise la prolifération des progéniteurs, différenciation
des cônes et la genèse des cellules ganglionnaires in vitro et in vivo (réf.
dans Harpavat et Cepko 2003).
Chez la souris, la différenciation in vivo des cônes LWS est médiée par
Trβ2 (réf. dans Harpavat et Cepko 2003).
NeuroPlusieurs neurotransmetteurs influencent la prolifération des progéniteurs.
transmetteurs (Martins et Pearson 2008)
104
Tableau 2 : Rôle des facteurs de transcription et des régulateurs du cycle cellulaire dans
la prolifération et la différenciation des cellules de la rétine neurale
Facteurs de transcription de type forkhead
Foxn4
Forkhead Box n4
Différenciation
Chez la souris, Foxn4 favorise la différenciation des cellules amacrines et
horizontales en activant l’expression des facteurs Math3, NeuroD1 et
Prox1 (Li et al. 2004).
Facteurs de transcription à motif hélice-boucle-hélice basique
bHLH (basic Helix-Loop-Helix)
Math5/Atoh7
Mouse Athonal Homolog 5
Différenciation
Math5 est impliqué dans la différenciation des cellules ganglionnaires (réf.
dans Ohsawa et Kageyama 2008).
Math3/NeuroD4
Mouse Athonal Homolog 3
Différenciation
Math3 est impliqué dans la différenciation des cellules bipolaires,
amacrines et horizontales (réf. dans Ohsawa et Kageyama 2008).
NeuroD1
Neurogenic Differenciation 1
Différenciation
NeuroD1 est nécessaire pour l’expression de Trβ2 dans les cônes. La
délétion de NeuroD1 chez la souris conduit à l’absence de cônes
exprimant l’opsine LWS (Liu et al. 2008).
Ascl1/Mash1
Mammalian Achaete Scute Homolog 1
Différenciation
Ascl1/Mash1 est impliqué dans la différenciation des cellules bipolaires
(réf. dans Ohsawa et Kageyama 2008).
Hes1et Hes5
Hairy and Enhancer of Split
Prolifération et Différenciation
L’activation de Notch induit l’expression des facteurs Hes1 et Hes5. Ils
répriment alors l’expression des facteurs de transcription Ascl1 et Math3
activateurs de gènes proneuraux. Ainsi la différenciation neuronale est
inhibée et le phénotype progéniteur est maintenu (réf. dans Ohsawa et
Kageyama 2008, Hatakeyama et Kageyama 2004).
105
Facteurs de transcription à homéodomaine
Six3
Sine oculis Homeobox Homolog 3
Développement
Chez le xénope et le poisson zèbre, Six3 favorise la prolifération lors de la
détermination des domaines présomptifs de la rétine (Gestri et al. 2005).
Prox1
Prospero Homeobox 1
Prolifération
Chez la souris, Prox1 régule la sortie de mitose des progéniteurs (Dyer et
al. 2003).
Différenciation
Les souris PROX1-/- ont une rétine dépourvue de cellules horizontales
(Dyer et al. 2003).
L’expression de Prox1 peut forcer la différenciation des progéniteurs
rétiniens en cellules horizontales (Dyer et al. 2003).
Rax/Rx
(mammifères)
Qrx/RaxL
(poule)
Retinal Homeobox Protein
Développement
Rax participe à la détermination des domaines présomptifs de la rétine
(Furukawa et al. 1997).
Chez la souris et l’homme l’absence de Rax entraine une anophtalmie
(Tuker et al. 2001, Abouzeid et al. 2012).
Chez la poule, RaxL est exprimé dans les progéniteurs rétiniens et dans la
couche des photorécepteurs (Chen et Cepko 2002).
Rax se lie sur le promoteur du gène de l’arrestine (Kimura et al. 2000)
et active la transcription d’Otx2 (Muranishi et al. 2011).
Facteurs de transcription de type paired box homeodomain
Pax6
Paired Box Protein 6
Développement
Pax6 participe à la détermination des domaines présomptifs de la rétine
(réf. dans Swaroop et al. 2010).
Prolifération
Chez la souris, la perte de Pax6 conduit au phénotype mutant Sey Small
eye car la prolifération est réduite (Marquardt et al. 2001).
Différenciation
En absence de Pax6, seules les cellules amacrines se différencient
(Marquardt et al. 2001).
106
Otx2
Orthodenticle Homeobox 2
Différenciation
Chez la souris, le KO conditionnel d’Otx2 dans les progéniteurs
rétiniens conduit à la perte des photorécepteurs, des cellules bipolaires
et horizontales (réf. dans Swaroop et al. 2010).
Vsx2/Chx10
Visual System Homeobox 2
Développement
Chez l’homme et la souris, l’absence de Vsx2 entraine une microphtalmie
par défaut de prolifération des progéniteurs (Bar-Yosef et al. 2004).
Prolifération
Vsx2 régule le cycle cellulaire en prévenant l’accumulation de l’inhibiteur
du cycle p27kip1 (Green et al. 2003).
Différenciation
Vsx2 inhibe la différenciation des bâtonnets et favorise celle des
cellules bipolaires (Dorval et al. 2006, Livne-Bar et al. 2006).
Crx
Otx5
Cone-Rod Homeobox Protein
Différenciation et survie
Chez les souris CRX -/-, les photorécepteurs dégénèrent par défaut
d’expression de plusieurs gènes de la phototransduction et l’absence
de développement du segment externe nécessaire à leur survie
(Furukawa et al. 1999).
Facteurs de transcription à domaine « leucine-zipper », bZIP (Basic Leucine Zipper)
Nrl
(famille Maf)
Neural Retina Leucine Zipper
Différenciation
Chez la souris, la perte de Nrl conduit au développement d’une rétine
dépourvue de bâtonnets mais avec un excès de cônes exprimant l’opsine
SWS (Mears et al. 2001, Swain et al. 2001)
Nrl se lie dans la région proximale du promoteur rhodopsine et
interagit avec Crx pour l’expression de gènes de fonction des
bâtonnets (réf. dans Swaroop et al. 2010).
L-Maf/Maf-A
(large maf
family)
Lens-specific Maf
Différenciation
Chez la poule, L-Maf/Maf-A est immunodétectée avec la rhodopsine
suggérant un rôle analogue à celui de Nrl (mammifères) dans la
différenciation des bâtonnets (Benkhelifa et al. 1998, Lecoin et al. 2004,
Ochi et al. 2004). A l’âge adulte, il est présent dans les cellules
ganglionnaires, amacrines, horizontales et les bâtonnets (Ochi et al. 2004).
107
Récepteurs nucléaires
Nr2e3
(récepteur
orphelin)
Nuclear Receptor Subfamily 2, group E, member 3
Différenciation
Chez la souris, Nr2e3 est une joue un rôle majeur dans le maintien du
phénotype bâtonnet, par potentialisation de l’activité des facteurs Nrl
et Crx sur le promoteur de la rhodopsine et la répression des gènes
d’opsines de cônes (réf. dans Swaroop et al. 2010).
Trβ2
(récepteur T3)
Thyroid Hormon Receptor beta 2
Différenciation
Trβ2 favorise la différenciation des cônes LWS chez la poule et la
souris.
Les souris TRβ2-/- ne possèdent que des cônes SWS. Sous forme
d’homodimère Trβ2 active la transcription de l’opsine LWS.
En absence de T3, sous forme d’hétérodimère avec Rxrγ, il réprime la
transcription de l’opsine SWS. (réf. dans Swarrop et al. 2010)
Rxrα
Rxrγ
(récepteur 9-cis
RA)
Retinoid X Receptor
Différenciation
Rxrγ est exprimé dans les cônes chez plusieurs espèces. Il peut
s’hétérodimériser avec Nr2e3 et Trβ2. Les souris Rxrγ -/-ne possèdent
que des cônes exprimant l’opsine SWS (Szanto et al. 2004, Roberts et
al. 2005).
Rarβ
Rarγ
(récepteur alltrans RA)
Retinoic Acid Receptor
Différenciation
Rarβ-γ contrôlent la différenciation de l’épithélium pigmentaire et
indirectement la formation de la couche des photorécepteurs (réf. dans
Forrest et Swaroop 2012).
Rorβ2
(récepteur
orphelin)
Retinoid-related Orphan Receptor beta 2
Prolifération
Rorβ2 entretient la prolifération des progéniteurs.
Différenciation
Rorβ2 est exprimé dans les photorécepteurs, cellules amacrines et
ganglionnaires. Dans les bâtonnets il est exprimé plus précocement
que Nrl (absence de NRL dans les KO Rorβ2). Les souris Rorβ2-/- ont
un phénotype proche de celui des Nrl-/- avec une absence de
bâtonnets et un excès de cônes SWS, cependant non fonctionnels. En
synergie avec Crx, Rorβ2 active la transcription de l’opsine SWS et
est nécessaire à la formation du segment externe (réf. dans Swaroop et
al. 2010).
108
Régulateurs du cycle cellulaire
Cycline D1
CDKI
Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor : p27kip1 et p57kip2
Prolifération et sortie de mitose
La prolifération des progéniteurs rétiniens dépend de l’activation du
complexe cyclineD1-Cdk4/6 (Das et al. 2012).
La sortie de mitose requiert l’inhibition de la cycline D1 et l’activation de
CDKI (Dyer et Cepko 2001).
109
6.3. Réduction des potentialités de différenciation des précurseurs rétiniens
Il existe une corrélation entre la date de sortie de mitose (birthdate) et le phénotype
que les précurseurs pourront adopter à l’issue de la différenciation cellulaire. Ainsi, les
premiers
précurseurs
post-mitotiques
se
différencient
principalement
en
cellules
ganglionnaires, tandis que les cohortes suivantes donnent progressivement des cellules
horizontales, des cellules amacrines, des photorécepteurs, des cellules bipolaires puis des
cellules gliales de Müller (Hatakeyama et Kageyama 2004). Cet ordre d’apparition est sujet à
d’importants chevauchements mais il semble respecté chez l’ensemble des vertébrés (figure
11).
Il a été montré que les précurseurs rétiniens conservent une certaine multipotence
jusqu’à leur sortie de mitose, puisque deux cellules filles peuvent adopter des phénotypes
différents (Belecky-Adams et al. 1996, Cepko et al. 1996). Cependant, un précurseur ne
pourra plus se différencier en cellule ganglionnaire s’il sort de mitose après un certain stade
de développement : E6 chez la poule et P1 chez la souris (Belecky-Adams et al. 1996, Cepko
et al. 1996). Inversement, les précurseurs qui sortent de mitose le plus tardivement perdent la
possibilité de se différencier en neurone. Ces précurseurs ne peuvent donner que des cellules
gliales de Müller car ils restent le plus longtemps sous l’influence de l’inhibition latérale du
système Delta-Notch, qui empêche l’expression des gènes proneuraux (figure 12).
Des signaux diffusibles, dont les concentrations dans le microenvironnement varient
au cours du développement, pourraient également participer aux réductions de potentialités de
différenciation des précurseurs (tableau 1). Ainsi, dans la rétine de poule, la sécrétion de SHH
par les cellules ganglionnaires néodifférenciées établit un gradient de concentration qui inhibe
le recrutement de nouvelles cellules ganglionnaires à la face vitréale de la rétine (Zhang et
Yang 2001). La restriction de compétence des précurseurs peut également reposer sur
l’activité transcriptionnelle inhibitrice de certains facteurs de transcription, tel que
Math5/Atoh7 qui réprime dans les précurseurs de cellules ganglionnaires l’expression des
gènes nécessaires à la différenciation vers un autre type neuronal (ex : Math3, NeuroD1, réf.
dans Zhang et al. 2011).
110
Figure 11 : Chronologie des sorties de mitose des précurseurs rétiniens de souris et de
poule (d’après Belecky-Adams et al. 1996 et Ohsawa et Kageyama 2008)
Les précurseurs rétiniens sortent de mitose et se différencient suivant un ordre conservé chez
les vertébrés : cellules ganglionnaires, horizontale, amacrines, photorécepteurs, bipolaires et
cellules gliales. Les périodes rallongées en pointillés se rapportent à la souris.
Figure 12 : Inhibition latérale de la différenciation neuronale par le système Delta-Notch
(illustration d’Ohsawa et Kageyama 2008)
Les cellules ganglionnaires expriment à leur membrane le ligand Delta activant le récepteur
Notch, exprimé par les progéniteurs adjacents. L’activation du récepteur Notch induit le
clivage et la translocation nucléaire de son domaine intracellulaire qui participe à l’activation
transcriptionnelle des gènes codant pour les facteurs de transcription Hes1 et Hes5. Leur
coopération avec le répresseur Groucho réprime l’expression des gènes proneuraux Mash1 et
Math3.
111
6.4. Engagement des précurseurs dans une voie de différenciation : commitment
Les précurseurs post-mitotiques s’engagent dans une voie de différenciation en
fonction de leur compétence et des signaux rencontrés dans le microenvironnement
(Livesey et Cepko 2001, Hatakeyama et Kageyama 2004). L’hétérogénéité de ce
microenvironnement est matérialisée par la stratification de la rétine. En effet, les précurseurs
post-mitotiques quittent la face ventriculaire pour migrer vers leur position finale et établir des
connexions synaptiques qui constituent les couches plexiformes. Chez la poule, la couche
plexiforme interne commence à se former à E6-E7 et la couche plexiforme externe apparait
autour de E9 (Grün 1982). Toutes les couches cellulaires sont identifiables à partir de E11 au
centre de la rétine, puis cette différenciation s’étend vers la périphérie. L’engagement des
précurseurs repose sur (ou se traduit par) l’expression d’une combinaison de facteurs de
transcription, principalement de type bHLH et homéodomaine (tableau 3, voir aussi
Hatakeyama et Kageyama 2004). L’expression de certains facteurs à homéodomaine est
corrélée à la position des précurseurs dans l’épaisseur de la rétine, tandis que l’expression des
facteurs bHLH pourrait spécifier le type neuronal des cellules de chaque strate (Hatakeyama
et Kageyama, 2004). Certains facteurs de transcription semblent jouer un rôle prépondérant
pour spécifier un type cellulaire particulier (ex : Nrl pour les bâtonnets, Math5/Atoh7 pour les
cellules ganglionnaires, Vsx2/Chx10 pour les cellules bipolaires, cf. tableau 2). Mais dans
tous les cas, la spécification du phénotype repose sur des interactions entre facteurs de
transcription de différentes familles, dont la complexité commence juste à être élucidée
(Zhang et al. 2011).
112
Tableau 3 : Régulation de l’engagement et de la différenciation des précurseurs rétiniens
par des combinaisons de facteurs de transcription (d’après Hatakeyama et Kageyama
2004, Ohsawa et Kageyama 2008, Zhang et al. 2011)
Facteurs à
homéodomaine
Facteurs
type bHLH
Pax6, Rax,
Prox1, Vsx2
Hes1,
NeuroD1
Cônes et
bâtonnets
Crx, Otx2
NeuroD1,
Mash1
Cellules
horizontales
Pax6, Prox1,
Six3
Math3
Cellules
bipolaires
Vsx2, Otx2
Math3,
Mash1
Cellules
amacrines
Pax6, Six3
NeuroD1,
Math3
Cellules
gliales
de Müller
Rax
Hes1, Hes5
Cellules
ganglionnaires
Pax6
Math5/Atoh7
Progéniteurs
Rétiniens
Facteurs
Facteurs à
type forkhead domaine bZIP
Nrl,
L-Maf/Maf-A
Récepteurs
nucléaires
Nr2e3,
Trβ2, Rxrα,
Rxrγ, Rarβ,
Rarγ, Rorβ2
Foxn4
113
Foxn4
Rorβ2
7. Différenciation des photorécepteurs
7.1. Chronologie de la différenciation des photorécepteurs
La différenciation des photorécepteurs correspond à l’activation transcriptionnelle des
gènes de fonction, tels que les gènes d’opsines et ceux codant pour les protéines de la
phototransduction. Suite à la présélection des précurseurs pendant la phase d’engagement,
l’expression plus ou moins précoce de gènes marqueurs de la différenciation témoigne du
déroulement de celle-ci.
Chez la souris, l’expression de l’opsine SWS1 commence autour de E18, alors que
l’expression de la rhodopsine et de l’opsine LWS ont lieu plus tardivement, autour de P4
(Swaroop et al. 2010). Les facteurs de transcription Nrl et Nr2e3, exprimés autour de E14, et
également considérés comme nécessaires pour l’étape d’engagement, permettent d’identifier
les précurseurs des bâtonnets, avant l’expression de la rhodopsine (Akimoto et al. 2006).
Dans la rétine de poule, les précurseurs de photorécepteurs expriment la protéine
visinine aussitôt après leur sortie de mitose, c'est-à-dire dès E6 au centre de la rétine (Bruhn et
Cepko 1996). La visinine est un marqueur de différenciation très précoce, puisqu’elle est
exprimée environ une semaine avant les gènes d’opsines. Un peu plus tard, autour de E10, les
précurseurs de photorécepteurs peuvent être identifiés dans la couche nucléaire externe, par
l’expression de facteurs de transcription, tels que Rax-L pour les cônes et L-Maf/Maf-A pour
les bâtonnets (Ochi et al. 2004, Lecoin et al. 2004). Ces précurseurs sont également
caractérisés par l’expression de l’α-transducine (à E10), impliquée dans la phototransduction
et de l’hydroxyindole-O-méthyltransférase (à E12), enzyme de synthèse de la mélatonine
(Cailleau et al. 2005, Voisin et al. 2012). Les gènes marqueurs les plus discriminants et
rendant compte d’une différenciation de plus en plus affinée, sont les gènes d’opsines. Chez la
poule, la transcription du gène SWS1 (cônes violets) commence à E13, suivie par LWS (cônes
rouges) et RH2 (cônes verts) à E14, RH1 (bâtonnets) à E16 et SWS2 (cônes bleus) à E17
(Cailleau et al. 2005, Voisin et al. 2012). Des critères morphologiques rendent compte de la
différenciation : les gouttelettes lipidiques apparaissent entre E10 et E15 selon les auteurs
(Lopez-Lopez et al. 2008), les segments externes entre E12 et E14 et les premiers disques
membranaires à E15 (Grün 1982).
L’ensemble de ces observations indique qu’il existe, chez la souris comme chez la
poule, un délai d’environ une semaine entre l’engagement vers le phénotype photorécepteur
(expression de Nrl ou de la visinine) et l’expression des gènes d’opsines, attestant la
différenciation fonctionnelle.
114
7.2. Rôle des facteurs diffusibles
De nombreuses études, in vitro et in vivo, se sont penchées sur le rôle des facteurs
diffusibles dans la différenciation des photorécepteurs. A défaut de pouvoir proposer un
modèle explicatif intégré, prenant en compte l’ensemble des données de la littérature, le rôle
des principaux signaux identifiés est résumé dans le tableau 1.
SHH et l’acide rétinoïque activent la différenciation des bâtonnets de mammifères in
vitro (Levine et al. 2000). De plus, les bâtonnets sont absents de la rétine des souris K.O.
Knockout pour les récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque (réf. dans Levine et al. 2000).
Le rôle du FGF2 dans la différenciation des bâtonnets de mammifères fait l’objet de résultats
divergents, qui pourraient indiquer une grande sensibilité aux conditions expérimentales
(Hicks et Courtois 1992, Levine et al. 2000).
In vitro, CNTF favorise la différenciation des cônes RH2 de poule (Xie et Adler 2000)
et inhibe la différenciation des bâtonnets de rat et de souris (réf. dans Levine et al. 2000).
L’activine inhibe la différenciation des photorécepteurs au profit des cellules amacrines chez
la poule et augmente le nombre de bâtonnets dans des cultures de précurseurs rétiniens de rat
(réf. dans Levine et al. 2000).
L’effet de certains signaux extracellulaires peut être mis en lien direct avec une
modification de l’activité transcriptionnelle dans les précurseurs, comme pour l’acide
rétinoïque et les hormones thyroïdiennes se liant sur des récepteurs nucléaires capables
d’orienter la différenciation des précurseurs de photorécepteurs vers le phénotype cône ou
bâtonnet (tableaux 1 et 2).
7.3. Rôle des facteurs de transcription
Les rôles des principaux facteurs de transcription impliqués dans la différenciation des
photorécepteurs ont été découverts chez la souris, grâce à la technique d’invalidation génique.
Ils sont résumés dans le tableau 2 et dans la figure 13.
Pour ce qui concerne les photorécepteurs, les facteurs de transcription qui reflètent
leur engagement vers ce phénotype (ex : Otx2, Crx, Nrl, Nr2e3) se montrent aussi capables
d’activer expérimentalement la transcription des gènes de fonction, tels que les opsines, la
transducine et d’autres gènes impliqués dans la phototransduction ou la synthèse de
mélatonine (Otx2 : Nishida et al. 2003, Whitaker et Knox 2004, Crx : Chen et al. 1997,
Furukawa et al. 2002, Peng et Chen 2007,Nrl : Mears et al. 2001, Nr2e3 : Kobayashi et al.
1999). En fonction de l’expression plus ou moins précoce de ces facteurs de transcription, leur
combinaison pourrait entrainer au cours de la différenciation in vivo, l’émergence du
phénotype photorécepteur ou son amplification.
115
Chez la souris, Otx2 est considéré comme un régulateur clé de la différenciation des
photorécepteurs (Beby et Lamonerie 2013). Il active expérimentalement le promoteur du gène
de la rhodopsine (Whitaker et Knox 2004) et il induit l’expression du facteur de transcription
à homéodomaine Crx dans les précurseurs de photorécepteurs (Nishida et al. 2003, Omori et
al. 2011, Muranishi et al. 2010). Crx, exprimé assez tardivement, intervient surtout pour
renforcer l’expression des gènes de la phototransduction (Hennig et al. 2008, Corbo et al.
2010). En effet, chez les souris CRX -/-, les photorécepteurs entament leur différenciation
mais dégénèrent rapidement car ils ne développent pas de segment externe, nécessaire à leur
survie (Furukawa et al. 1999).
La différenciation des bâtonnets dépend particulièrement du facteur de transcription
Nrl (Swaroop et al. 2010). Dans les souris NRL -/-, l’absence de bâtonnets est accompagnée
d’une production en excès de cônes exprimant l’opsine SWS1. Ceci suggère que Nrl est
nécessaire pour orienter la différenciation d’une population commune de précurseurs vers le
phénotype bâtonnet. Nrl et Nr2e3 répriment l’expression de SWS1 tandis que Crx et Nrl
activent en synergie le gène de la rhodopsine (figure 13). L’activation transcriptionnelle de
SWS1, exprimée par défaut en absence de Nrl, dépend de Crx et du récepteur nucléaire
orphelin Rorβ2 (Srinivas et al. 2006). Dans les cônes exprimant l’opsine LWS, la
transcription du gène SWS1 est réprimée par des hétérodimères de récepteurs nucléaires Rxrγ
et Trβ2 (Roberts et al. 2005, figure 13). L’expression de Trβ2 est elle-même dépendante du
facteur NeuroD1 en l’absence duquel l’opsine LWS n’est pas exprimée (Liu et al. 2008,
figure 13). Sous l’influence de l’hormone thyroïdienne T3, les homodimères de récepteurs
nucléaires Trβ2 favorisent l’expression de l’opsine LWS (Roberts et al. 2006).
Chez la poule, les connaissances sont plus limitées en raison de l’impossibilité
d’utiliser l’invalidation génique. Les résultats disponibles suggèrent une certaine similitude
d’action d’Otx2 (Dinet et al. 2006), tandis que les protéines Otx5 et L-Maf/Maf-A pourraient
avoir des fonctions respectivement comparables aux facteurs Crx et Nrl des mammifères, dont
ils sont proches du point de vue génétique (Plouhinec et al. 2005, Ochi et al. 2004, Lecoin et
al. 2004).
116
Figure 13 : Les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes
d’opsines (illustration de Zhang et al. 2011)
La transcription des gènes d’opsines des mammifères est dépendante des facteurs de
transcription Otx2, Nrl, Nr2e3, Crx, Rxrα, Rxrγ, NeuroD1 et Trβ2.
117
7.4. Différenciation des photorécepteurs in vitro
La différenciation des photorécepteurs de poule peut être observée in vitro dans des
cultures en monocouche de précurseurs rétiniens isolés à E7 (Adler et al. 1984). Après quatre
jours de culture, Adler et ses collaborateurs décrivent la différenciation de cellules
majoritairement de type cône (80%), car possédant une unique gouttelette lipidique (Adler et
al. 1984). Il s’agit principalement de cônes exprimant l’opsine LWS, avec environ 5% de
cônes exprimant l’opsine RH2 (Bradford et al. 2005). Il a été suggéré que la différenciation
des cônes rouges in vitro était une différenciation « par défaut », résultant de la levée d’une
inhibition en dehors du contexte rétinien (Adler et Hatlee 1989). L’addition de CNTF dans les
cultures permettait d’augmenter la proportion de cônes exprimant l’opsine RH2 (Xie et Adler
2000). Tandis que l’addition de staurosporine induisait la différenciation de bâtonnets,
détectée par l’expression du gène RH1 (Xie et Adler 2000). Certains signaux semblaient donc
pouvoir réorienter la différenciation des précurseurs (Xie et Adler 2000).
Cependant les conditions de culture, en présence de sérum, sont très éloignées du
contexte physiologique. En effet, in vivo, les photorécepteurs ne sont pas en contact direct
avec les composants du sérum, qui doivent traverser sélectivement la barrière hématorétinienne pour les atteindre. Plusieurs travaux ont par ailleurs mis en évidence l’influence de
la concentration en sérum sur l’expression des opsines (Jacob et al. 2005, Cailleau et al.
2005). Dans ces conditions, il parait difficile de déterminer si l’expression des gènes
d’opsines in vitro reflète l’exécution spontanée d’un programme de différenciation ou une
réponse à l’effet stimulateur de facteurs sériques. Par ailleurs, la staurosporine, inhibiteur de
nombreuses protéines kinases (Meggio et al. 1995), ne constitue pas un signal physiologique
susceptible de nous renseigner sur le mécanisme de différenciation des bâtonnets.
Plus récemment, notre équipe a réexaminé ces questions sur des précurseurs, prélevés
entre E6 et E13, et cultivés pendant quatre jours, en absence de sérum. Dans ces conditions,
l’activation transcriptionnelle de tous les gènes d’opsines peut être observée in vitro (Voisin et
al. 2012). Cependant, en raison des modifications de compétence des précurseurs au cours du
temps, les résultats dépendent fortement de l’âge des embryons donneurs. Ainsi, il a pu être
observé qu’à partir de E6, les précurseurs sont capables d’activer spontanément la
transcription des gènes SWS1, LWS et RH2. Après E10, les précurseurs acquièrent la
compétence d’activer spontanément la transcription du gène RH1. Et ce n’est qu’à E13 que les
précurseurs deviennent capables d’activer, in vitro, la transcription du gène SWS2 (Voisin et
al. 2012).
118
Ce dispositif de culture a également permis d’identifier un signal potentiellement
significatif dans l’activation transcriptionnelle du gène RH1. En effet, des précurseurs
rétiniens cultivés à E8 se montrent incapables d’activer spontanément la transcription de RH1,
mais ils peuvent être induits à le faire en réponse à des traitements qui augmentent le taux
d’AMPc ou provoquent la dépolarisation de la membrane plasmique (Voisin et Bernard
2009). Ce résultat suggère que peu de temps après leur sortie de mitose, les précurseurs
possèdent déjà la conformation chromatinienne et les facteurs de transcription rendant
possible l’activation du gène RH1. D’autre part, le caractère physiologique de l’AMPc et de la
dépolarisation membranaire permet d’envisager que ces signaux puissent être représentatifs
des mécanismes mis en œuvre in vivo dans la différenciation des bâtonnets.
8. Objectifs de l’étude : recherche des signaux impliqués dans l’activation
transcriptionnelle du gène de la rhodopsine in vitro
Un délai d’une semaine entre l’engagement des précurseurs de photorécepteurs et
l’activation transcriptionnelle des gènes d’opsines a été décrit chez les rongeurs et chez la
poule. Les mécanismes moléculaires responsables de ce temps de latence pourraient
correspondre à l’exécution d’un programme de différenciation intrinsèque, acquis par les
précurseurs à la sortie de mitose. Une autre hypothèse est que les précurseurs engagés vers le
phénotype photorécepteur à la sortie de mitose, attendent des signaux du microenvironnement
pour déclencher l’activation des gènes d’opsines.
Les précurseurs de bâtonnets semblent sensibles à des signaux du microenvironnement
puisque l’activation transcriptionnelle du gène de la rhodopsine est induite dans des cultures
de précurseurs isolés à E8, par une augmentation du taux d’AMPc ou par une dépolarisation
membranaire. Au contraire, les précurseurs isolés à E13 activent spontanément le gène de la
rhodopsine en culture. Cette activation transcriptionnelle spontanée a lieu en absence de
sérum et pourrait donc être représentative des mécanismes moléculaires mis en jeu in vivo. Il
est donc intéressant de déterminer si les mécanismes induisant l’activation spontanée du gène
rhodopsine sont dépendants de l’AMPc et/ou d’une dépolarisation membranaire.
119
Chapitre 1. Activation de la transcription du gène de la rhodopsine in vitro dans des
précurseurs rétiniens : rôle de la signalisation calcique et des canaux HCN
120
Article
Activation of rhodopsine gene transcription in cultured retinal precursors of chicken embryo :
rôle of Ca2+ signaling and hyperpolarization activated cation channels
121
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY
| 2014 | 129 | 85–98
doi: 10.1111/jnc.12624
1
1
Universite de Poitiers, CNRS, Poitiers, France
Abstract
This study reports that the spontaneous 50-fold activation of
rhodopsin gene transcription, observed in cultured retinal
precursors from 13-day chicken embryo, relies on a Ca2+dependent mechanism. Activation of a transiently transfected
rhodopsin promoter (luciferase reporter) in these cells was
inhibited (60%) by cotransfection of a dominant-negative form
of the cAMP-responsive element-binding protein. Both rhodopsin promoter activity and rhodopsin mRNA accumulation
were blocked by Ca2+/calmodulin-dependent kinase II inhibitors, but not by protein kinase A inhibitors, suggesting a role
of Ca2+ rather than cAMP. This was confirmed by the
inhibitory effect of general and T-type selective Ca2+ channel
blockers. Oscillations in Ca2+ fluorescence (Fluo8) could be
observed in 1/10 cells that activated the rhodopsin promoter
(DsRed reporter). A robust and reversible inhibition of
rhodopsin gene transcription by ZD7288 indicated a role of
hyperpolarization-activated channels (HCN). Cellular localization and developmental expression of HCN1 were compatible
with a role in the onset of rhodopsin gene transcription.
Together, the data suggest that the spontaneous activation of
rhodopsin gene transcription in cultured retinal precursors
results from a signaling cascade that involves the pacemaker
activity of HCN channels, the opening of voltage-gated Ca2+channels, activation of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II
and phosphorylation of cAMP-responsive element-binding
protein.
Keywords: calcium channels, hyperpolarization-activated
channels, photoreceptor, retina, rhodopsin, transcription.
J. Neurochem. (2014) 129, 85–98.
The mature retina displays a laminar organization consisting
of three cellular layers: outer nuclear layer (composed of rod
and cone photoreceptors), inner nuclear layer (composed of
uller glial
horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells and M€
cells), and ganglion cell layer (composed of the output
neurons whose axons give rise to the optic nerve). All these
cell types originate from a common pool of embryonic
progenitors and differentiate in a tiling sequence, conserved
among vertebrate species: ganglion cells first, followed by
horizontal cells, photoreceptors, amacrine cells, bipolar cells,
and finally M€uller glial cells (Belecky-Adams et al. 1996;
Cepko et al. 1996). As evidenced by lineage-tracing studies,
two daughter cells derived from the same progenitor often
differentiate into distinct cell types, a result indicating that
these cells retain a certain degree of plasticity until their last
mitosis (Belecky-Adams et al. 1996; Cepko et al. 1996).
Nevertheless, as far as photoreceptors are concerned, cell-fate
commitment appears to take place soon after proliferation has
ended, because some photoreceptor-specific markers, such as
the transcription factor ‘neural retina leucine zipper’ (Nrl) in
mouse rods, or the calcium-binding protein visinin in chicken
cones, are expressed within one day of exiting mitosis
Received October 2, 2013; revised manuscript received November 13,
2013; accepted November 22, 2013.
Address correspondence and reprint requests to Marianne Bernard,
Universite de Poitiers – CNRS, 1 rue Georges Bonnet - Bât. B36, Poitiers
Cedex 86022, France. E-mail: [email protected]
1
These authors contributed equally to this study.
Abbreviations used: BSA, bovine serum albumin; CaMKII, Ca2+/
calmodulin-dependent kinase II; CREB, cAMP-response element-binding protein; HCN, hyperpolarization-activated channels; PBS, phosphatebuffered saline.
© 2013 International Society for Neurochemistry, J. Neurochem. (2014) 129, 85--98
85
86
M. Bernard et al.
(Bruhn and Cepko 1996; Akimoto et al. 2006). One aspect
of photoreceptor differentiation that is conserved in mammals and birds is the existence of a long time lag between
commitment, revealed by Nrl or visinin expression, and overt
differentiation, reflected by opsin expression. For example in
mouse and chicken, significant rhodopsin expression is
detected about 8 days after photoreceptor commitment
(Treisman et al. 1988; Belecky-Adams et al. 1996; Bruhn
and Cepko 1996; Cailleau et al. 2005; Akimoto et al. 2006;
Voisin et al. 2012). The nature of this long time lag between
commitment to a photoreceptor fate and opsin gene expression has not been elucidated. It is not known whether it
reflects the time required for the implementation of a
differentiation program acquired post-mitotically, or if it
reflects a standby state of committed precursors, waiting for a
signal to activate opsin gene expression. Hypothetically, this
signal might correspond to spontaneous oscillations in Ca2+
and cAMP levels that have been described in developing
retinas (Catsicas et al. 1998; Wong et al. 1998; Firth et al.
2005; Dunn et al. 2006). In chicken retina, Ca2+ oscillations
are maximal when opsin gene expression begins (E14–E18,
Wong et al. 1998) and they have been shown to reach the
outer nuclear layer (Catsicas et al. 1998). In keeping with
this hypothesis, we previously reported that chicken retinal
precursors isolated in culture at E8 are not capable to
spontaneously activate rhodopsin gene transcription, but can
be induced to do so in response to cAMP or membrane
depolarization (Voisin and Bernard 2009). More recently, we
observed that chicken retinal precursors isolated in culture
after E10 spontaneously activate rhodopsin gene transcription (Voisin et al. 2012). Therefore, this study sought to
examine the possible role of cAMP- and Ca2+-dependent
signaling pathways in the spontaneous activation of rhodopsin gene transcription in chicken retinal precursors cultured
after E10.
Materials and methods
Animals
Fertilized chicken eggs were purchased from Anjou-Accouvage
(Le-Louroux-Beconnais, France) and incubated at 37°C, 70%
humidity. Embryos were killed by decapitation between embryonic
day 8 (E8) and E13. Retinas were immediately dissected in culture
medium, and processed for cell culture. Chickens (postnatal day 1
(P1) to P4) were killed by CO2 and decapitation. Animal care
followed the European Community and French Ministry guidelines
(decree 87848, license E 86-040). The experiments complied with
the ARRIVE guidelines.
Embryonic retinal cell cultures
Primary cultures of embryonic chicken retinal cells were prepared as
previously described (Adler 1990), with slight modifications (Voisin
et al. 2012). Neural retinas from E13 embryos, free of pigment
epithelium, were dissociated by trypsin-DNase digestion, seeded at
high density (1.25 9 106/cm2) in plastic plates pre-coated with
polyornithine (20 lg/cm2) and cultured 1 to 5 days (see figure
legends) at 37°C, 5% CO2, constant darkness, in medium 199
supplemented with 100 U/mL penicillin/streptomycin, 2 mmol/L
glutamine and with either 0.5% bovine serum albumin (BSA) (all
from Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France) or 10%
newborn calf serum (NCS; Life technologies, Saint-Aubin, France).
Pharmacological treatments
For real-time RT-PCR analysis, E13 retinal cells were cultured for
4 days and were treated with drugs for the last 2 days, before RNA
extraction. For rhodopsin promoter analysis, E13 retinal cells were
treated with pharmacological compounds immediately after seeding,
transfected with promoter-reporter plasmids 4 h later, and assayed
for luciferase activities 24 h later. The following compounds were
dissolved in double-distilled water: Rp-8Br-cAMPS (BioLog,
Bremen, Germany), H89, CdCl2, NiCl2, tubocurarine (SigmaAldrich), x-conotoxin GVIA, SNX 482, kynurenic acid (R & D
Systems, Lille, France). The following compounds were dissolved
in dimethyl sulfoxide (DMSO): ML218 (Sigma-Aldrich), KN-62,
KN-93, bepridil, cilnidipine, x-agatoxin IVA, mibefradil, ryanodine, 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB), ZD7288, 6-cyano-7nitroquinoxaline-2,3-dione, MK801 (R & D Systems), KN-92
(Calbiochem, St-Quentin-en-Yvelines, France). Controls received
an equal volume of solvent (water or DMSO).
RNA extraction and real-time RT-PCR
Cells cultured for 4 days in serum-free medium were sonicated in LiCl
3 M/urea 6 M and RNA was extracted as previously described
(Cailleau et al. 2005). Random hexamer-primed reverse transcription
and real-time PCR on LightCyclerâ (Roche Applied Science, Meylan,
France) were as previously described (Cailleau et al. 2005). The
primer pairs for chicken rhodopsin (RH1) and chicken glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase were as previously described
(Voisin et al. 2012). Sequences of the primers for chicken HCN1
were: sense = 5′-TTACGCTTATTACGCCTTTCAAG-3′; antisense = 5′-GGTGGGAAATCCTGGAGTAAC-3′ (GenBank XM_
429145). Primer pairs were validated as follows: single PCR product
(melting curve, gel electrophoresis, DNA sequencing), linear distribution of the PCR sigmoids (r ≥ 0.99) with an efficiency of 1.85–
1.98. We verified that 2- to 10-fold dilutions of the RNA introduced
into an RT-PCR reaction caused the expected critical cycle (Ct)
increments. Reverse transcripts copy numbers were calculated from
standard curves established with known quantities of each template.
Transfections with luciferase reporter plasmids
Cells cultured in NCS-supplemented medium were transfected by
the CaPO4 method, as previously described (Voisin and Bernard
2009). Cells (2.5 9 106 in 600 lL medium) were transfected with
0.6 lg of plasmid containing 1.6 kb of the chicken rhodopsin
promoter, upstream of the firefly luciferase reporter (pRho1.6 kb,
previously described in Voisin and Bernard 2009) or with 0.6 lg of
promoterless pGL3-Basic plasmid (Promega, Charbonnieres,
France) as negative control. Variations in transfection efficiency
were normalized by cotransfection with 0.2 lg of pRL-TK plasmid
(Promega), containing herpes simplex virus thymidine kinase
promoter upstream of Renilla luciferase. In cells treated with H89
(Fig. 2b), normalization was performed with 0.15 lg of pRL-SV40
plasmid (Promega), containing the enhancer and early promoter of
Ca2+-dependent regulation of rhodopsin transcription
SV40 upstream of the Renilla luciferase, because we observed that
co-transfection with pRL-TK introduced a correction bias. Expression of a dominant-negative form of the transcription factor cAMPresponse element-binding protein (CREB), with a mutation in the
phosphorylation site, was performed by co-transfection with 0.6 lg
of pCMV-CREB133 (Clontech, Saint-Quentin-en-Yvelines,
France). When different pharmacological agents were tested in the
same experiment, the different experimental groups were always
transfected with the same CaPO4/DNA precipitate, to minimize
variations because of qualities of precipitates. Firefly and Renilla
luciferase activities were assayed with the Dual-GloTM luciferase
assay system (Promega) on a GloMaxTM20/20 luminometer (Promega).
Transfection with a DsRed reporter plasmid and co-labeling of lipid
droplets
The 1.6 kb chicken rhodopsin promoter was subcloned into the
promoterless vector pDsRed2-1 (Clontech), to generate the ‘pDsRedpRhodo1.6 kb’ plasmid. Sequence and orientation were verified by
sequencing (BigDye and ABI 3130, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France). E13 retinal cells, seeded in chamber slides (Lab-Tek
Permanoxâ, NUNC) pre-coated with polyornithine, were transfected
with 2 lg of ‘pDsRed-pRhodo1.6 kb’. Two-day post-transfection,
cells were fixed (4% paraformaldehyde, 20 min, 4°C), washed twice
with phosphate-buffered saline (PBS), and oil droplets were labeled
with Bodipyâ 493/503 (Molecular probes, Montlucßon, France)
0.5 lg/mL in PBS 1% DMSO (20 min, 20°C). After a final wash in
PBS, slides were mounted in Mowiolâ 4-88 (Sigma-Aldrich) and
examined on a fluorescence microscope (Leica DMI6000, Leica,
Nanterre, France) equipped with a digital camera (Leica DFC350FX
with LAS AF software, Leica).
Viability assays
Cell viability in the presence of the different pharmacological agents
was evaluated by measuring the yield of RNA extraction per 106
cells, and with a classical cytotoxicity assay (Figure S1). To
determine more specifically whether the pharmacological treatments
may have selectively affected the viability of the rod precursors, we
verified that the effects of the drugs on rhodopsin promoter activity
were reversible upon rinsing. This test could not be applied to RNA
analysis, because 4 days of culture were required for accumulating
enough rhodopsin mRNA, and cell survival spontaneously declined
beyond 4 days of culture. The reversibility protocol was as follows:
E13 cells received pharmacological treatments immediately after
seeding and were transfected 4 h later. Luciferase assay was
performed 24 h post-transfection/treatment on a first experimental
group, while a second group was transferred to control culture
medium and assayed for luciferase 3 days later.
Immunodetection of HCN1 on western blots
Embryonic chicken retinas (40 mg) were sonicated in 700 lL of
buffer (50 mM Tris pH 7.4; 0.5 M NaCl; 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride; 1 mM EGTA) cleared from cell debris at 1000 g (20 min,
20°C) and membranes were recovered by centrifugation at 100 000 g
(1 h, 4°C). Pellets were washed with 1 mL of TE buffer (10 mM Tris
pH 7.5; 1 mM EDTA), resuspended in Laemmli buffer (Laemmli
1970) and heated at 37°C for 20 min. Proteins were fractionated by
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and
electrotransferred on nitrocellulose membrane. Non-specific sites
87
were blocked in PBS containing 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) and
5% BSA. The membranes were incubated (overnight, 4°C) with
mouse monoclonal anti-HCN1 primary antibody (clone S70-28, Acris
Antibodies, Herford, Germany) diluted 1 : 1000 in PBS-Tween, 1%
BSA. The secondary antibody (CyTM3-conjugated goat-anti-mouse
IgG antibody, Jackson, Newmarket, UK), diluted 1 : 400 in PBSTween, 1% BSA, was incubated 1 h at 20°C. As negative control, a
membrane was incubated with the secondary antibody alone.
Fluorescence was detected on a laser scanner (Typhoon Trio, GE
Healthcare, Europe, Velizy-Villacoublay, France) coupled to the
ImageQuant software (GE Healthcare).
Detection of HCN1 by immunohistochemistry
Retinas fixed in Bouin’s solution were dehydrated in ethanol, then
butanol, and embedded in paraffin. Sections (6 lm) were blocked
in PBS–Tween, 5% BSA and incubated (overnight, 4°C) with the
anti-HCN1 antibody described above (1 : 1000 in PBS–Tween,
1% BSA). Immunocomplexes were detected with biotinylated
horse anti-mouse IgG (Vector laboratories, Paris, France) diluted
1 : 500 in PBS–Tween and with avidin–biotin-peroxidase complexes (Vectastain Kit; Vector Laboratories). Peroxidase activity
was revealed with 0.05% diaminobenzidine, 38 mmol/L ammonium nickel sulfate and 0.003% H2O2 in 0.15 mol/L sodium
acetate buffer. Sections were observed on a light microscope (Zeiss
Axioplan, Zeiss, Le-Pecq, France) equipped with a digital camera
(Olympus LC20 with LCmicro software, Olympus, Rungis,
France).
Calcium imaging
Embryonic chicken retinal cells (E13) were cultured on glass-slides
(3 cm diameter) precoated with polyornithine. Cells were washed
with medium 199 without phenol red (Sigma-Aldrich) and then
loaded with 1 mM Fluo-8 (Interchim, Montlucßon France) at 37°C
for 30 min. Images were obtained with a spinning disk confocal
system from Andor technology (Belfast, Ireland) equipped with
Andor Ixon+897 back illuminated EMCCD camera (16 lm2 pixel
size), Olympus inverted IX81S1F-ZDC microscope (Olympus,
France) and an incubation chamber (37°C and CO2 enrichment,
Solent Scientific, UK). For calcium imaging, cells were illuminated
at 488 nm and emitted fluorescence was collected through a
passband filter at 525 nm (30 nm width). IQ2 acquisition software
(Andor technology) was used to acquire images (one image every
2 s during 10–20 min) of 512 9 512 pixels (0.33 lm per pixel with
409 objective lens). Fluorescence was recorded in cells from 11
individual microscope fields (approximately 150 cells per field), in
three independent experiments.
Statistical analyses
For real-time RT-PCR analyses, statistics were performed on the
normalized Ct values (for each individual sample, the Ct value for
rhodopsin was normalized to the Ct value for glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase). For luciferase assays, statistics were
performed on the normalized luciferase activities (firefly/Renilla
ratios measured in each individual culture well). Statistical analyses
were performed with the two-tailed Student’s t-test. Data are
presented as mean SEM. Statistical significance is indicated in
each figure legend. For all experiments, differences were considered
significant at p < 0.05.
88
M. Bernard et al.
Results
In vitro activation of the rhodopsin gene promoter in
developing rods
Retinal precursor cells were isolated from chicken embryos
aged E8 to E13 and transiently transfected in vitro with a
luciferase reporter plasmid harboring a 1.6 kb rhodopsin
promoter. As illustrated in Fig. 1a, rhodopsin promoter
activity in cultured cells markedly increased with the age
of donor embryos. Cells obtained from E8 embryos did
not activate the rhodopsin promoter, a small (6-fold)
increase was observed in cells from E10 embryos and a
robust (30- to 100-fold) activation of the promoter was
observed in cells obtained at E12–E13 (Fig. 1a). Rhodopsin promoter activity faithfully reflected the accumulation
of rhodopsin mRNA measured in parallel cultures
(Fig. 1b), thus confirming our previous report on the
spontaneous activation of rhodopsin gene transcription in
vitro (Voisin et al. 2012). In addition, rhodopsin promoter
activation appeared to take place in rod precursors,
because transfection with a plasmid containing the same
promoter driving a Dsred fluorescent reporter, allowed us
to observe labeled cells with the characteristic shape of
photoreceptors (Fig. 1c–e) and lacking the cone-specific
lipid droplet (Fig. 1f–h). The labeled cell frequency was
about 1/1000, which is coherent with the following
proportions: 30% photoreceptors in the culture (Xie and
Adler 2000), 15% of the photoreceptors being rods in
(a)
chicken retina (Voisin et al. 2012), 1–2% transfection
efficiency (our observations with constitutive promoters).
Assuming the differentiation of cultured precursors replicates to some extent the in vivo situation, we sought to
characterize the regulation pathway involved in the
spontaneous activation of rhodopsin gene transcription.
Rhodopsin promoter activity is inhibited by a
dominant-negative form of CREB, but not by PKA inhibitors
On the basis of our previous work indicating that exogenous
cAMP stimulates rhodopsin gene transcription in retinal
cells isolated from E8 embryos (Voisin and Bernard 2009),
we examined whether an endogenous activation of the
cAMP-dependent pathway could be responsible for the
spontaneous activation of the rhodopsin gene, observed in
cells isolated at E13. A non-phosphorylatable form of
CREB lacking the critical serine 133 (CREB133), was
co-transfected with the promoter-reporter plasmid. This
resulted in a 60% inhibition of rhodopsin promoter activity
(Fig 2a), thus indicating that the phosphorylated form of
CREB is required for rhodopsin gene activation. Due to the
low transfection efficiency (around 1%), the effect of
CREB133 could not be detected on rhodopsin mRNA
levels (data not shown).
The protein kinase A (PKA) inhibitors Rp-8Br-cAMPS
and H89 did not prevent rhodopsin promoter activation in the
cultured cells (Fig 2b). Indeed, Rp-8Br-cAMPS could even
cause a slight stimulation of the rhodopsin gene promoter
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Fig. 1 Spontaneous activation of rhodopsin promoter and mRNA expression in cultured embryonic
chicken retinal cells. (a) Retinal precursors (from E8 to
E13) were cultured for 24 h in control conditions
before transfection with either pRho1.6 kb or pGL3Basic plasmids, and with the pRL-TK normalizingplasmid. Luciferase activities were measured 48 h
post-transfection and expressed as firefly/Renilla
ratios (mean SEM, n = 3). Similar results were
obtained in two to five independent experiments.
**p < 0.02; ***p < 0.01. (b) Retinal precursors were
cultured for 4 days in control conditions. Rhodopsin
mRNA levels were measured by real-time RT-PCR
and normalized to glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH) (mean SEM, n = 4).
(c–h) E13 retinal precursors were transfected with
pDsRed-pRhodo1.6 kb and were observed by
fluorescence microscopy, 2-day post-transfection. (f–
h) Transfected cells incubated with Bodipy to label oil
droplets. None of the 100 DsRed-fluorescent cells
observed contained a lipid droplet. (f) DsRed2-1 (red);
(g) Bodipy (green); (h) merged images of (f and g).
Magnification bars = 10 lm.
(a)
89
(b)
Fig. 2 Rhodopsin promoter activity is inhibited by a dominant-negative
form of cAMP-response element-binding protein (CREB), but not by
PKA inhibitors. (a) Retinal cells from E13 embryos were cotransfected
with either pRho1.6 kb or pGL3-Basic, and with a plasmid expressing
CREB133. Normalization was performed with pRL-TK. Results are
firefly/Renilla luciferase ratios measured 72 h post-transfection
(mean SEM, n = 6). ***p < 0.001. Similar results were obtained in
four independent experiments. (b) Cells cultured for 24 h with the
indicated compounds were transfected with pRho1.6 kb and with
either pRL-TK (Rp-8Br-cAMPS) or pRL-SV40 (H89). Results are firefly/
Renilla luciferase ratios measured 24 h post-transfection and
expressed as percent of control group (mean SEM, n = 3).
**p < 0.02; NS, non-significant.
(Fig 2b). A partial degradation of Rp-8Br-cAMPS may have
generated trace amounts of 8Br-cAMP (as mentioned by the
manufacturer), which is an activator of rhodopsin gene
transcription (Voisin and Bernard 2009. Rp-8Br-cAMPS and
H89 also failed to interfere with rhodopsin mRNA levels
(data not shown). Together, the data would suggest that
CREB, but not its phosphorylation by PKA, is required for
rhodopsin promoter activation.
Wiley 1997). The effects of KN-62 and KN-93 and the lack
of effect of KN-92 could be confirmed at rhodopsin promoter
level (Fig. 3b). The faster response of the promoter-reporter
system over endogenous mRNA accumulation, allowed us to
observe that the effect of KN-62 was reversible upon rinsing
(Fig. 3c). In addition, general cell viability was not affected
by the presence of KN compounds, thus confirming that the
observed effects were not due to toxicity (Figure S1). We
also verified that KN62 inhibited CREB phosphorylation in
cultures of chicken retinal precursors (Figure S2).
In vitro activation of rhodopsin gene transcription is
dependent on CaMKII
A possible role of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II
(CaMKII) was investigated, because this enzyme is known to
phosphorylate and activate CREB in different tissues (Dash
et al. 1991; Sheng et al. 1991). The CaMKII inhibitors
KN-62 and KN-93 prevented the spontaneous rise in
rhodopsin mRNA levels (Fig. 3a). The selectivity of
KN-62 for CaMKII has been established more thoroughly
than that of KN-93, but the latter was reported to be more
potent (Tokumitsu et al. 1990; Sumi et al. 1991; Davies
et al. 2000) and this was reflected on the inhibition of
rhodopsin mRNA accumulation (Fig. 3a). KN-92, a KN-93
analog that lacks activity on CaMKII (Tombes et al. 1995)
did not significantly inhibit rhodopsin mRNA expression
(Fig. 3a), indicating that the effect of KN-93 was mostly due
to CaMKII inhibition. Coomassie blue G at 2 lM had no
effect (data not shown), thus ruling out a possible action of
KN-62 through the P2X7 purinergic receptor (Gargett and
In vitro activation of rhodopsin gene transcription depends
on voltage-gated Ca2+ channels
On the basis of our previous work indicating that membrane
depolarization stimulates rhodopsin gene transcription in
retinal cells isolated at E8 (Voisin and Bernard 2009), we
examined a possible contribution of voltage-gated calcium
channels to the spontaneous activation of the rhodopsin gene
in E13 cells. General inhibitors of voltage-activated Ca2+
channels (Cd2+, bepridil) prevented the rise in rhodopsin
mRNA levels (Fig. 4a). Inhibition was also observed with
Ni2+ and mibefradil that preferentially target T-type and
R-type Ca2+ channels (Mehrke et al. 1994; Randall and
Tsien 1997; Lee et al. 1999; Catterall et al. 2005) and with
ML218 that selectively targets T-type Ca2+ channels (Xiang
et al. 2011). In contrast, the L-type Ca2+ channel blocker
nifedipine (Catterall et al. 2005) had no significant effect
(Fig. 4a). The prominent role of T-type Ca2+ channels was
90
M. Bernard et al.
(a)
(b)
(c)
Fig. 3 Rhodopsin mRNA levels and promoter activity are inhibited by
Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) inhibitors. (a) E13
retinal cells were cultured for 4 days and treated with the indicated
compounds for the last 2 days. ‘E13 t0’ corresponds to cells before
culture. Rhodopsin mRNA levels (real-time RT-PCR) are normalized to
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and expressed
as percent of control (mean SEM, n = 4). ***p < 0.00005; NS, nonsignificant. (b) Cultured cells were treated with the indicated compounds and transfected with either pRho1.6 kb or pGL3-Basic, and
with pRL-TK (for normalization). Results are firefly/Renilla luciferase
ratios measured 24 h post-transfection/treatment and expressed as
percent of control (mean SEM, n = 3). ***p < 0.005; NS, nonsignificant. (c) Transfected cells treated with KN-62 [or dimethyl
sulfoxide (DMSO)] were assayed for luciferase activities at 24 h posttransfection/treatment or transferred to fresh control medium and
assayed 3 days later (‘wash’: note the different scale). Results are
mean SEM (n = 3). ***p < 0.05. Similar results were obtained with
KN-93.
confirmed by the observation that rhodopsin promoter
activity was not affected by different blockers with selectivity for L-type, N-type, R-type, P/Q-type channels (Catterall
et al. 2005), whereas it was dose-dependently inhibited by
bepridil, mibefradil, and ML218 (Fig. 4b, c). As illustrated
for mibefradil in Fig. 4d, the effects of these three compounds were reversible upon rinsing. In addition, we verified
that bepridil, mibefradil and ML218 had only minor effects
on general cell viability (Figure S1).
rod precursors, we monitored Fluo-8 fluorescence in cells
expressing the DsRed reporter protein under control of the
rhodopsin promoter. As illustrated in Fig. 5d–f, one of 10
DsRed-positive cells exhibited spike-like oscillations.
Our attempts to pharmacologically interfere with Ca2+
oscillations were inconclusive, due to disturbance of the
CO2 flow.
Ca2+ oscillations in cultured retinal precursors
Because Ca2+ waves can be observed in the developing
chicken retina (Catsicas et al. 1998; Wong et al. 1998), we
sought to observe Ca2+ oscillations in cultured chicken
retinal precursors loaded with Fluo-8. Strictly dependent on
the presence of 5% CO2 in the incubation chamber, 6% of the
cells displayed spontaneous oscillations of Ca2+ fluorescence, with amplitudes ranging from 150% to 650% of
baseline intensity (average 210 10%, n = 84 cells) and a
duration of 0.5–2 min (Fig. 5). These oscillations (Fig. 5a–c)
were very similar to the Ca2+ transients described in cultured
rat retinal cells (Firth and Feller 2006), and resembled the
‘spikes’ and ‘waves’ previously described in cultured
embryonic spinal cord neurons (Gu et al. 1994). Ca2+
oscillations in individual cells were not evenly distributed
throughout the 20 min recording period and there was no
evidence of synchronization between cells within the same
field. To determine whether Ca2+ oscillations could occur in
In vitro activation of rhodopsin gene transcription depends
on HCN channels
We investigated whether the Ca2+ influx required for
rhodopsin gene activation was due to depolarizing neurotransmitters or to hyperpolarization-activated cation channels
(HCN). Based on previous studies indicating that waves of
depolarization in the developing retina are generated by
acetylcholine nicotinic and glutamate ionotropic neurotransmissions (Catsicas et al. 1998; Wong et al. 1998; Firth et al.
2005), we tested the corresponding antagonists: tubocurarine
1 lM (nicotinic antagonist), kynurenic acid 1 mM (excitatory aminoacid antagonist), 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3dione 10 lM (AMPA/kainate antagonist) and MK801
10 lM (NMDA antagonist). None of them caused any
reduction in rhodopsin promoter activity (data not shown). In
contrast, ZD7288, a potent inhibitor of hyperpolarizationactivated cation channels (Harris and Constanti 1995)
inhibited rhodopsin mRNA accumulation in a dose-dependent manner (Fig. 6a) and also dose-dependently and
reversibly blocked rhodopsin promoter activation (Fig. 6b, c).
(a)
91
(b)
(c)
(d)
Fig. 4 Rhodopsin mRNA levels and promoter activity are inhibited by
blockers of voltage-gated Ca2+ channels. (a) E13 cells were cultured
for 4 days and treated for the last 2 days with: 5 lM bepridil (Bepr.),
200 lM CdCl2, 200 lM NiCl2, 10 lM mibefradil (Mibef.), 15 lM ML218
or 20 lM nifedipine (Nifed.), water or dimethyl sulfoxide (DMSO). ‘E13
t0’ corresponds to cells before culture. Rhodopsin mRNA levels (realtime RT-PCR) were normalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and expressed as percent of control
(mean SEM, n = 4). **p < 0.002; ***p < 0.0001; NS, non-significant. (b, c) Cells were treated with either 20 lM bepridil (Bepr), 20 lM
nifedipine (Nifed), 5 lM cilnidipine (Cilnid), 1 lM x-conotoxin GVIA
(x-Cono), 300 nM SNX482 (SNX) or 30 nM x-agatoxin IVA (x-Aga)
(b) or with increasing concentrations of bepridil, ML218 or mibefradil (c)
and transfected with pRho1.6 kb and with pRL-TK (for normalization).
Results are firefly/Renilla luciferase ratios measured 24 h posttransfection and expressed as percent of control (mean SEM,
n = 3). ***p < 0.00005; NS, non-significant. In (a–c) drug selectivities
for Ca2+ channel are in parentheses. (d) Transfected cells treated with
mibefradil (or DMSO) were assayed for luciferase activities at 24 h
post-transfection/treatment or transferred to fresh control medium and
assayed 3 days later (‘wash’: note the different scale). Results are
mean SEM (n = 3). ***p < 0.00005. Similar results were obtained
with bepridil and ML218.
We also verified that the highest dose of ZD7288 did not
significantly affect cell viability (Figure S1).
On the basis of the notion that amphibian and mammalian
photoreceptors preferentially express channels of the HCN1
subtype (Demontis et al. 2002; Knop et al. 2008; Barrow
and Wu 2009), we investigated whether the development and
localization of HCN1 in the chicken retina would be
compatible with a role in rhodopsin gene expression. As
illustrated in Fig. 7a, development of HCN1 mRNA levels
was biphasic, with a first plateau between E11 and E17 and a
second one after E19. HCN1 protein became faintly detectable on western blot at E14 and its concentration steadily
increased to give a strong monospecific signal at one day
post-hatch (P1) (Fig. 7b). Immunohistochemistry of HCN1
channels at P1 gave a strong signal in the upper half of the
outer plexiform layer (Fig. 7c), where the synaptic spherules
of rods and the synaptic pedicles of double cones are
normally found (Morris and Shorey 1967). A fainter
92
M. Bernard et al.
(b)
(a)
(c)
(d)
(a)
(e)
Fig. 5 Calcium oscillations in E13 retinal precursors
cultured for 2 days in control conditions and loaded
with Fluo-8. Fluorescence was monitored every 2 s,
during 20 min (a–c) or 10 min (d–f). Panel (a) shows
an image of the fluorescent cells. Panels (b and c)
show examples of spike-like (b) and wave-like (c)
fluorescence oscillations in isolated cells. Panels
(d–f) show the recording of an E13 retinal precursor
transfected with pDsRed-pRhodo1.6 kb. (d) DsRed
fluorescence (red); (e). Fluo-8 fluorescence (green),
the DsRed-expressing cell is shown by an arrow; (f).
Spike-like Ca2+ oscillations in the DsRed cell.
Magnification bars 20 lm.
(f)
(b)
(c)
Fig. 6 Rhodopsin promoter activity and mRNA levels are inhibited by
the hyperpolarization-activated channels (HCN) blocker ZD7288. (a)
E13 cells were cultured for 4 days and treated with ZD7288 [or
dimethyl sulfoxide (DMSO)] for the last 2 days. Rhodopsin mRNA
levels (real-time RT-PCR) were normalized to glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (GAPDH) and expressed as percent of
control (mean SEM, n = 4). (b) E13 cells were treated with ZD7288
(or DMSO) and transfected with pRho1.6 kb and with pRL-TK (for
normalization). Results are firefly/Renilla luciferase ratios measured
24 h post-transfection and expressed as percent of control
(mean SEM, n = 3). (c) Transfected cells treated with ZD7288 (or
DMSO) were assayed for luciferase activities at 24 h post-transfection/
treatment or transferred to fresh control medium and assayed 3 days
later (‘wash’: note the different scale). Results are mean SEM
(n = 3). ***p < 0.0001.
labelling was also observed in the inner plexiform layer
(Fig. 7c). At higher magnification, HCN1 immunolabeling in
photoreceptors appeared concentrated in a round-shaped
area, directly under the nucleus, that closely matched the
description of rod synaptic spherules (Morris and Shorey
1967). The frequency of labeled synaptic terminals was
around 25 per 100 lm (Fig. 7c).
Discussion
This study provides evidence that spontaneous activation of
rhodopsin gene transcription in cultured precursor cells of the
chicken retina is driven by a Ca2+-dependent mechanism that
involves CREB, CaMKII, voltage-gated Ca2+ channels, and
HCN channels. Ca2+ spikes and waves could be observed in
(a)
Fig. 7 Developmental expression of hyperpolarization-activated channels (HCN)1 mRNA
and protein in the chicken retina. (a) HCN1 mRNA
levels in chicken retina at indicated developmental
stages (real-time RT-PCR, mean SEM, n = 3).
(b) HCN1 immunodetection on western blots of
membrane proteins from chicken retina at indicated
developmental stages (Cy3-coupled secondary
antibody). Specific HCN1 signal indicated by
arrow. Non-specific bands were also detected with
the secondary antibody alone (not illustrated). (c, d)
HCN1 immunodetection on sections of P1 chick
retina (biotinylated secondary antibody, vectastain
kit). (c) Low magnification image of the whole retina.
(d), Higher magnification of photoreceptors with
labeling in rod spherules. OLM, outer limiting
membrane; OPL, outer plexiform layer; INL, inner
nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; GCL,
ganglion cell layer; N, nuclei; IS, inner segments.
Magnification bars: 50 lm in C; 10 lm in (d).
(b)
(c)
a small proportion of cultured precursors, although a causal
link between these Ca2+ transients and rhodopsin gene
activation could not be established. This Ca2+-dependent
component in rhodopsin gene activation had not been
detected before and its discovery raises questions as to the
exact mechanism involved and its physiological relevance to
the in vivo situation.
Many studies aimed at understanding the molecular basis
of photoreceptor differentiation have led to the identification
of transcription factors and diffusible signals that govern
different steps of this developmental process, including
precursor proliferation, commitment to the photoreceptor cell
fate, and expression of the opsins (Levine et al. 2000;
Swaroop et al. 2010). All these informations are valuable,
because they open new possibilities of retinal therapy
(Forrest and Swaroop 2012; Montana et al. 2013). By
focusing on the spontaneous expression of the rhodopsin
gene in retinal precursors isolated from E13 chicken
embryos, we have identified a role for Ca2+ signaling at a
late stage of rod differentiation. In a previous study we had
observed that retinal precursors isolated at E8 did not
spontaneously activate rhodopsin gene transcription in
culture, but could be instructed to do so by treatments that
caused membrane depolarization and/or elevation of cAMP
levels (Voisin and Bernard 2009). We therefore hypothesized
that this mechanism might be involved in the spontaneous
activation of rhodopsin gene transcription observed in retinal
precursors isolated at E13. This hypothesis was also based on
the notion that terminal differentiation of ganglion cells in the
retina is regulated by waves of depolarization that induce a
Ca2+/Calmodulin-dependent activation of adenylate cyclase
93
(d)
(Torborg and Feller 2005; Dunn et al. 2006; Nicol et al.
2006, 2007). Our results show that rhodopsin promoter
activation requires CREB phosphorylation, because it is
strongly inhibited by dominant-negative CREB133. However, rhodopsin gene activation appears to rely on Ca2+ but
not on cAMP, because it is inhibited by CaMKII inhibitors,
but not by PKA inhibitors. The signaling pathway involves
an influx of extracellular Ca2+, because rhodopsin gene
expression is strongly inhibited by general blockers of
voltage-gated Ca2+ channels (cadmium, bepridil). A contribution of Ca2+-induced Ca2+ release could be ruled out,
because ryanodine (50 lM) clearly had no effect on
rhodopsin promoter activation (data not shown). As to a
possible contribution of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)induced Ca2+ release, the results of six independent experiments mostly argue against it, because the inhibitor 2-APB
(40–100 lM, Maruyama et al. 1997) caused a 50% decrease
in one experiment, a 100% increase in another experiment,
and had no significant effect in the other 4 experiments (data
not shown). However, this may be for want of a reliable
inhibitor, because 2-APB was reported to be an ‘inconsistent
inhibitor of IP3-induced Ca2+ release’ and is also known to
have other effects (Bootman et al. 2002; Hu et al. 2004).
The finding that CaMKII participates to the transcriptional
activation of the rhodopsin gene in cultured embryonic
retinal cells raises the question of the molecular mechanisms
that are activated downstream of this kinase. Our results
indicated that phospho-CREB is involved in the activation of
the rhodopsin gene promoter, and they also showed that
CaMKII phosphorylates this transcription factor in cultured
retinal cells. However, since the rhodopsin gene is activated
94
M. Bernard et al.
selectively in rods, its transcription cannot rely only on
CREB, which is ubiquitously expressed. CREB could
possibly act by binding to one of three ‘CRE-like’ sequences
detected in the rhodopsin gene promoter (Voisin and Bernard
2009) and thereby facilitate the binding of rod-specific
transcription factors to nearby cis-regulatory elements.
CREB might also act more indirectly, by increasing the
expression and/or transcriptional activity of rod-specific
transcription factors. A detailed analysis of the rhodopsin
gene promoter will be required to address these different
questions.
Our results showing the dependence of rhodopsin gene
expression on voltage-gated Ca2+ channels prompted us to
identify more precisely the channel subtype that might be
involved. Because dihydropyridine-sensitive L-type channels
have been described in cultured embryonic chicken photoreceptors (Gleason et al. 1992; Uchida and Iuvone 1999; Ko
et al. 2007), we repeatedly tested the effects of nifedipine and
cilnidipine on rhodopsin gene transcription and consistently
obtained negative results. In contrast, rhodopsin gene transcription was efficiently inhibited by T-type channel blockers.
The reason for this apparent discrepancy may be that previous
studies describing L-type channels had been performed on
cones, identified by the presence of a lipid droplet (Gleason
et al. 1992; Uchida and Iuvone 1999; Ko et al. 2007).
Because cones differentiate earlier than rods in this culture
system (Voisin et al. 2012) and because L-type Ca2+ channels
have also been reported to mediate neurotransmission in
mature rods (Akopian and Witkovsky 2002), we suggest that
the predominant contribution of T-type channels in rhodopsin
gene activation may reflect the immature state of rod
precursors in our cultures. This would be in keeping with
previous observations in different tissues and in some retinal
neurons, indicating that T-type channels are frequently
expressed before L-type during development (Yaari et al.
1987; Schmid and Guenther 1999; Bringmann et al. 2000;
Chemin et al. 2002; Levic et al. 2007) and are subsequently
down-regulated in adult cells (Gonoi and Hasegawa 1988;
McCobb et al. 1989; Gu and Spitzer 1993). Therefore, even
though T-type channels have not been clearly described in
mature photoreceptors, further studies would be required to
determine whether they are transiently expressed in rod
precursors. In agreement with this notion, T-type channels
have been described in the human Y-79 retinoblastoma cell
line, which bears characteristics of an immature retinal
precursor (Hirooka et al. 2002). Interestingly, T-type channels were expressed only when Y-79 cells were cultured in
suspension, a condition that favors the expression of photoreceptor markers in these cells (Albini et al. 1992; Bernard
et al. 1995, 1996). Although the pharmacological profile of
the Ca2+ channels involved in rhodopsin gene activation
corresponds to T-type, a contribution of R-type channels
cannot be completely ruled out. Indeed, the T-type blocker
mibefradil is also a potent inhibitor of R-type channels
(Randall and Tsien 1997) and to our knowledge, a possible
effect of ML218 on R-type voltage-gated Ca2+ channels has
not been evaluated (Xiang et al. 2011). In addition, although
the selective R-type blocker, SNX482, did not inhibit
rhodopsin promoter activity at 300 nM, it has also been
reported to be relatively inactive on R-type currents in some
rat central neurons (Newcomb et al. 1998).
Evidence for a role of voltage-gated Ca2+ channels in
rhodopsin gene activation prompted us to identify signals
that could cause membrane depolarization in rod precursors.
While acetylcholinergic and glutamatergic transmissions
have been shown to play a role in retinal waves of
depolarization (Catsicas et al. 1998; Wong et al. 1998; Firth
et al. 2005), their contribution to rhodopsin gene activation
could be ruled out by the absence of effect of selective
antagonists of nicotinic receptors and glutamate ionotropic
receptors. Naturally, a possible role of other neurotransmitters in rhodopsin gene activation would deserve further
analysis, especially with the notion that some receptors that
have hyperpolarizing effects in the adult may be depolarizing
in the embryo, because of an inverted gradient of chloride
ions in immature neurons (Blankenship and Feller 2010;
Cherubini et al. 2011). Nevertheless, our data positively
identified HCN channels as a likely cause of membrane
depolarization leading to rhodopsin gene activation, because
both rhodopsin promoter activity and rhodopsin mRNA
levels were strongly and reversibly inhibited by ZD7288.
HCN channels are members of the six-transmembranedomain superfamily and are activated upon hyperpolarization
(Biel et al. 2009). The depolarizing current they carry
destabilizes the resting membrane potential and is responsible for the repetitive activity of cardiac pacemaker cells
(DiFrancesco 2010). HCN channels play an essential role in
the functional differentiation of neonatal cardiomyocytes, (Er
et al. 2003). They also play an important role in the
functional maturation of neurons and in the establishment
of neuronal networks (Bender and Baram 2008). HCN
channels have been detected in the retina, particularly in
photoreceptors of salamander, mouse, rat and rabbit (Moosmang et al. 2001; Demontis et al. 2002; Knop et al. 2008;
Barrow and Wu 2009; Della Santina et al. 2010). In these
cells, the predominant HCN isoform is HCN1 (Demontis
et al. 2002; Knop et al. 2008; Barrow and Wu 2009). In
mature photoreceptors, HCN channels help shorten the
response to light (Knop et al. 2008; Barrow and Wu
2009). Our study provides the first description of HCN1 in
the chicken retina. The data presented here suggest that HCN
channels may play a role in rod photoreceptor differentiation,
long before the onset of photosensitivity, by initiating a
signaling pathway that activates rhodopsin gene transcription. HCN1 expression during development shows only
traces of HCN1 mRNA in the retina at E8, when retinal
precursors are not capable of spontaneously activating
rhodopsin gene transcription in culture (Voisin and Bernard
2009; Voisin et al. 2012). Then, HCN1 mRNA levels reach
a half-maximal plateau at E11, when retinal cells acquire the
ability to spontaneously express the rhodopsin gene in
culture (Voisin et al. 2012). At this stage, however, the
HCN1 protein must be very low because it is hardly
detectable on western blots and not at all by immunohistochemistry. Finally, a second rise in HCN1 mRNA levels,
accompanied by a rise in HCN1 protein levels on western
blots, can be observed after E17, when the burst of rhodopsin
mRNA expression occurs in vivo (Bruhn and Cepko 1996;
Voisin et al. 2012). At this stage, the HCN1 protein becomes
detectable by immunohistochemistry and appears mainly
concentrated in the upper half of the outer plexiform layer,
where synaptic terminals of rods and double-cones are found
(Morris and Shorey 1967). Localization and shape of HCN1
immunolabeling strongly argues for its presence in synaptic
spherules of rods, as they have been described by electron
microscopy (Morris and Shorey 1967). However, the
frequency of HCN1-labeled synaptic terminals (about 25
per 100 lm) is somewhat higher than the rod frequency we
observed in a previous study (about 14 per 100 lm: Voisin
et al. 2012), suggesting some of the labeled cells may be
double cones. Evidence that HCN1 channels are expressed in
rods raises the possibility that E13 retinal cells isolated in
culture might activate the rhodopsin gene in a cell-autonomous manner, even if a possible involvement of cell-contacts
cannot be ruled out, due to the relatively high density of our
cell cultures. Nevertheless, our results suggest that the long
time-lag between commitment of retinal precursors to a
photoreceptor fate (around E6) and onset of rhodopsin gene
expression (around E15–E16) may be because of the late
expression of HCN channels. Indeed, the limiting factor is
unlikely to be the expression of Ca2+ channels, because E8
retinal cells are able to activate rhodopsin gene transcription
in response to depolarizing treatments (Voisin and Bernard
2009). If the expression of HCN channels is the limiting
factor for rhodopsin gene activation, then forced expression
of cloned HCN1 in E8 embryonic retinal cells should be
sufficient to trigger rhodopsin transcription. Conversely,
knocking down HCN1 channels should block the spontaneous activation of rhodopsin transcription in cultured E13
retinal cells. This should be tested in future studies. It is
worth noting that the involvement of HCN channels in
rhodopsin gene activation offers another possible explanation
to the previously reported cAMP-dependent stimulation of
rhodopsin gene transcription (Voisin and Bernard 2009).
Indeed, cAMP can directly bind to HCN channels and
facilitate their opening (Biel et al. 2009), a mechanism by
which it might trigger the Ca2+-dependent activation of the
rhodopsin gene described herein. This mechanism might also
contribute to the paradoxical stimulation of rhodopsin gene
transcription by the PKA inhibitor Rp-8Br-cAMPS, because
this compound also acts as a direct activator of HCN
channels (Bois et al. 1997).
95
Evidence that both HCN and Ca2+ channels play a role in
the transcriptional activation of the rhodopsin gene raised the
possibility that these channels might generate Ca2+ transients
in rod precursors. This hypothesis appeared plausible,
because in chicken retina, Ca2+ waves have been observed
not only in amacrine and ganglion cells, but also in the
photoreceptor layer (Catsicas et al. 1998). In addition,
spontaneous Ca2+ oscillations have been reported in cultures
of dissociated chick pineal photoreceptors (D’Souza and
Dryer 1994). Since Ca2+ transients have previously been
shown to play a crucial role in the early differentiation of
Xenopus spinal cord neurons (Rosenberg and Spitzer 2011)
and in retinal ganglion cell maturation (Firth et al. 2005),
they might be involved in rhodopsin gene activation. In good
agreement with a previous study showing that spontaneous
Ca2+ transients could still be observed in cultures of
dissociated rat retinal cells (Firth and Feller 2006), we show
here that ~ 6% of the embryonic (E13) chicken retinal cells
isolated in culture display Ca2+ oscillations. The patterns and
kinetics of these oscillations are very similar to those
described in rat retinal cells. These spontaneous oscillations
had not been mentioned in a previous study of Ca2+
fluorescence in cultures of embryonic chicken retinal cells
(Uchida and Iuvone 1999). However, this may be because of
a number of technical differences, including (i) the age of
embryonic cells, (ii) cell-density in the cultures and, above
all, (iii) absence or presence of CO2 in the incubation
chamber (which we found was essential for oscillations to
occur). Our results indicate that Ca2+ spikes can actually
occur in rod precursors expressing the DsRed fluorescent
reporter, under control of the rhodopsin promoter. The
percentage of DsRed cells exhibiting Ca2+ oscillations (10%)
is close to that observed for the whole population of cultured
cells (6%). However, this also means that 90% of the DsRedpositive cells did not display Ca2+ oscillations, although they
activated the rhodopsin promoter. This result might be
interpreted in different ways. First, it may indicate that Ca2+
oscillations are simply not required for rhodopsin promoter
activation. Secondly, it may be that the amplitude and/or the
duration of the Ca2+ oscillations produced by 90% of the
precursors are too small to be detected with our experimental
setup. This may be the case if the rod precursors present in
our cultures are still ‘immature’ and express only T-type
Ca2+ channels. Indeed, studies on spinal neurons of Xenopus
embryo have shown that T-type Ca2+ channels must be
relayed by high-voltage-activated Ca2+ channels, for oscillations in Ca2+ fluorescence to be detectable (Holliday and
Spitzer 1990; Gu and Spitzer 1993). Third, it may be that
Ca2+ oscillations are only transiently required for rhodopsin
gene activation in the course of rod differentiation and that
90% of the DsRed-positive cells in our cultures were already
past this stage. Further studies dedicated to the pharmacological characterization of Ca2+ oscillations in identified rod
precursors will be required to evaluate these different
96
M. Bernard et al.
possibilities. This should also help determine whether these
Ca2+ oscillations may rely on an interplay between HCN
channels and T-type Ca2+ channels, similar to the mechanism
described in cells of the sinoatrial node (Robinson and
Siegelbaum 2003).
The observations made in the present study raise new
questions as to the physiological role of HCN channels and
voltage-gated Ca2+ channels in retinal development. To date,
photoreceptor differentiation has not been analyzed in detail
in mice bearing targeted mutations in HCN or T-type Ca2+
channel genes, but the structure and functionality of their
mature retinas were close enough to normality to suggest that
rod differentiation was not deeply affected (Knop et al.
2008; Alnawaiseh et al. 2011; Della Santina et al. 2012),
and the same observation was made in R-type Ca2+ channeldeficient mice (Alnawaiseh et al. 2011). However, as in
many other instances, the impact of a single gene inactivation
on photoreceptor development may be compensated by the
upregulation of other genes with related functions (Weiergr€aber et al. 2005). Therefore, our observations call for
further experiments to determine (i) whether the role of HCN
channels and T-type Ca2+ channels in rhodopsin gene
expression can be extended to the mouse retina, (ii) whether
retinas of mice bearing mutations in HCN channels, T-type
or R-type Ca2+ channels show a delay in the timing of
photoreceptor differentiation, (iii) whether selective blockers
of HCN channels and T-type or R-type Ca2+ channels can
impair photoreceptor development when injected in the
embryonic eye. By disclosing the role of HCN channels,
voltage-gated Ca2+ channels, CaMKII and phospho-CREB in
rhodopsin gene activation, the present study may contribute
to a better understanding of rod photoreceptor differentiation
and help unify this process with similar mechanisms of
neuronal maturation in other regions of the central nervous
system (Rosenberg and Spitzer 2011). If the regulation
pathway described herein can be extended to the human
retina, it may help improve therapies against retinal degenerations, for example by providing new ways of promoting
photoreceptor differentiation from stem cells, in a context of
cell-replacement strategies.
Acknowledgements and Conflict of interest
disclosure
This study was supported by the CNRS (FRE 3511). It has benefited
from the facilities and expertise of ImageUP platform (University of
Poitiers).We thank Ms L. Cousin for her technical help at multiple steps
of this work. We also thank Dr L. Favot for her generous gift of the
pDsRed2-1 plasmid. The authors have no conflicts of interest to declare.
Supporting information
Additional supporting information may be found in the online
version of this article at the publisher's web-site:
Figure S1. Viability of the cultured embryonic retinal precursors
in the presence of pharmacological agents.
Figure S2. Effect of KN-62 on CREB phosphorylation.
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Conclusions et perspectives
Cette étude a été en
entreprise pour déterminer si l’activation
on spontanée de la
transcription du gène de la rhodopsine, in vitro, reflétait une répons
nse à un signal ou
l’exécution d’un programmee de
d différenciation. La réponse à cette question
on pouvait également
apporter un début d’explication
tion au délai de 8 jours observé in vivo, entre la détermination des
photorécepteurs et l’expression
ion des gènes d’opsines.
Au début de cette étud
tude, l’hypothèse la plus probable semblait être
êtr celle d’un signal
utilisant comme second messa
ssager, l’AMPc (Voisin et Bernard 2009). Tout
outefois, les premiers
résultats nous ont réorientés ve
vers une voie de signalisation impliquant la CaM-kinase
Ca
(et donc
le calcium), plutôt que la PK
PKA (cible de l’AMPc). Ces deux voies de signalisation étant
fortement interconnectées ett pouvant
p
converger au niveau de la phospho
horylation de CREB,
ceci ne remettait pas fondamen
entalement en question l’hypothèse de départ.
Par contre, la mise enn évidence d’un rôle des canaux HCN (bloqué
qués par le ZD7288),
capables de générer une insta
stabilité du potentiel de membrane et un rythm
thme d’ouverture des
canaux calciques (Biel et al. 2009),
2
suggérait que la différenciation des bâtonnets
bâ
pourrait se
mettre en place de façon auton
onome dès lors que les canaux HCN sont exprim
primés à la membrane
(figure 14).
ascade de signalisation responsable de la tran
ranscription du gène
Figure 14 : Modèle de la casc
de la rhodopsine in vitro (Ber
ernard et al. 2014)
A la membrane des précurseu
seurs de bâtonnets, les canaux HCN1 seraien
ent à l’origine d’une
dépolarisation activant des ccanaux calciques voltage-dépendants de type-T.
ty
L’influx de
calcium permettrait d’activer
er la CaMKII responsable de la phosphoryla
ylation du facteur de
transcription CREB, impliqué
ué dans la transcription du gène de la rhodopsin
sine.
122
La corrélation observée au chapitre 1, entre le développement de l’expression du canal
HCN1 et l’évolution de la compétence des précurseurs de bâtonnets, semble s’accorder avec
cette hypothèse :
- Dans un premier temps, les précurseurs isolés à E8 n’ont pas la capacité d’induire
l’activation transcriptionnelle du gène RH1. A cette période, l’ARNm HCN1 est présent à
l’état de trace (environ 2 500 copies/106 GAPDH).
- Dans un second temps, les précurseurs isolés à E13 activent spontanément la
transcription du gène RH1 en culture. Parallèlement, l’expression de l’ARNm HCN1 atteint
un premier plateau d’expression entre E11 et E17 (environ 15 000 copies/106 GAPDH).
- Enfin, les précurseurs de bâtonnets expriment significativement le gène RH1 in vivo
autour de E17. Entre E17 et P4, le taux d’ARNm HCN1 augmente pour atteindre un plateau
d’expression maximale (environ 45 000 copies/106 GAPDH).
Ainsi, l’activation du gène de la rhodopsine in vitro pourrait bien refléter l’exécution
d’un programme de différenciation dont l’étape limitante serait l’expression du canal HCN1.
Il est permis de supposer que cette étape pourrait être responsable du délai de 8 jours observé
in vivo entre la détermination des photorécepteurs et l’expression des gènes d’opsines. Ces
résultats ouvrent une perspective majeure au plan expérimental, qui consiste à déterminer si
l’expression forcée du canal HCN1 peut induire l’activation transcriptionnelle du gène de la
rhodopsine. Cette question sera abordée dans le chapitre suivant.
123
Chapitre 2. Expression forcée du canal HCN1 dans des précurseurs rétiniens in vitro et
conséquences sur l’activation du promoteur du gène de la rhodopsine
Introduction
Les protéines HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated) constituent
les sous-unités d’un canal ionique, activé en réponse à une hyperpolarisation membranaire et
sensible aux nucléotides cycliques (Biel et al. 2009). Le canal est formé de quatre sous-unités
qui possèdent six hélices alpha transmembranaires (S1-S6), dont la boucle entre les hélices S5
et S6 détermine la sélectivité ionique et l’hélice S4, chargée positivement, est sensible au
potentiel de membrane (Biel et al. 2009). Les canaux HCN sont perméables aux ions sodium
et potassium et leur ouverture entraine une dépolarisation membranaire (Biel et al. 2009). Ce
courant, activé en hyperpolarisation à partir de -65 mV, est nommé courant Ih ou funny
current If. Il intervient notamment dans le rythme de contraction des cardiomyocytes (canaux
HCN4 et HCN2, Er et al. 2003, DiFranscesco 2010) et dans l’excitabilité neuronale (Biel et
al. 2009). L’hyperpolarisation membranaire est nécessaire et suffisante pour activer le canal
HCN et les nucléotides cycliques sont des co-activateurs modulant sa cinétique d’ouverture
(Bois et al. 1997). L’interaction directe, de l’AMPc et du GMPc, se fait au niveau d’un site de
liaison situé dans la partie C-terminale du canal (Biel et al. 2009). L’isoforme HCN1 a une
cinétique d’activation rapide et n’est pas très sensible à la régulation par l’AMPc (Biel et al.
2009).
Chez les mammifères, les quatre isoformes HCN1-4 sont principalement exprimés
dans la rétine, le cerveau, le système nerveux périphérique et le cœur (Biel et al. 2009). Dans
le système nerveux central, les canaux HCN participent à la maturation fonctionnelle des
neurones et la mise en place de réseaux neuronaux (Bender et Baram 2008). En particulier
dans les neurones thalamiques, l’activité en mode burst pourrait résulter de l’interaction entre
un courant calcique à bas seuil (IT) et un courant Ih (Biel et al. 2009). Ce modèle n’est pas
sans rappeler les observations que nous avons faites ci-dessus concernant l’activation du gène
de la rhodopsine (figure 14). Dans la rétine l’isoforme prédominante est HCN1, décrit dans
les photorécepteurs de salamandre, souris, rat et lapin (Moosmang et al. 2001, Demontis et al.
2002, Knop et al. 2008, Barrow et Wu 2009, Della Santina et al. 2010).
L’induction de la transcription du gène de la rhodopsine par dépolarisation de
précurseurs E8 laisse supposer que les canaux calciques de type-T sont déjà exprimés à ce
stade du développement embryonnaire. Ainsi, ce serait l’expression des canaux HCN qui
constituerait l’élément limitant pour l’activation spontanée du gène de la rhodopsine.
L’objectif des travaux présentés est de déterminer si l’expression forcée du canal HCN1 peut
124
induire la transcription du gène de la rhodopsine. Nous avons choisi de transfecter
transitoirement des précurseurs rétiniens avec une construction plasmidique dans laquelle la
séquence codante du canal HCN1 de poule est sous le contrôle d’un promoteur fort.
L’expression du canal HCN1 a été vérifiée par immunofluorescence et son effet sur l’activité
du promoteur rhodopsine a été mesuré grâce à une construction promoteur-rapporteur
luciférase.
125
Stratégie de clonage de la séquence codante du gène HCN1 de poule Gallus domesticus
L’objectif est de cloner la séquence codante du canal HCN1 de poule (Gallus domesticus),
d’une taille de 2541 pb, dans le plasmide pcDNA3 (Invitrogen), sous le promoteur fort de
cytomegalovirus (CMV). La séquence prédite de l’ARNm HCN1 est disponible dans la
banque de données GenBank pour Gallus gallus (NCBI Reference Sequence: XM_429145.4,
figure 15). Devant l’impossibilité d’amplifier la séquence entière en une seule réaction, quatre
fragments ont été amplifiés. Le fragment #1 de 927 pb contient un site de restriction PfoI. Le
fragment #2 de 379 pb contient des sites de restriction PfoI et BglII. Le fragment #3 de 838 pb
contient les sites de restriction BglII et FseI. Le fragment #4 de 491 pb contient un site de
restriction FseI. Les amorces PCR utilisées pour amplifier ces quatre fragments ont été
dessinées autour de ces sites de restriction (voir figure 15 et tableau 4) : les amorces S907 et
AS926 au niveau du site PfoI, les amorces S1264 et AS1285 au niveau du site BglII et les
amorces S2051 et AS2101 autour du site FseI.
Réaction de rétrotranscription (RT)
A partir d’ARN total extrait de rétine de poule P4, des ADNc sont rétrotranscrits avec une
amorce spécifique de l’ARNm HCN1 : 5’-TTCTCGCAGTCACCAGGGATCA-3’. Pour
chaque demi-réaction de RT (10 µL), l’hybridation des amorces (1 µL d’une solution stock à
15 DO/mL) sur 1 µg d’ARN total (4 µL des échantillons ARN concentrés à 0,25 µg/µL) est
réalisée à 65°C pendant 5 min, suivi d’un arrêt brutal sur glace. La réaction de RT a lieu en
présence de 2 µL de Tampon MMLV 5X (Moloney Murine Leukemia Virus, Promega,
Charbonnières, France), de 2,5 µL d’un mélange de dNTP 2 mM (dATP, dTTP, dCTP et
dGTP, Promega), de 0,5 µL d’enzyme reverse-transcriptase RT-MMLV (Promega). La
réaction de RT est réalisée pendant 2 h à 37°C puis arrêtée sur glace et par dilution au 1/5
avec de l’eau bidistillée.
126
Tableau 4 : Amorces utilisées au cours du clonage de la séquence codante HCN1
Nom de
l’amorce
Séquence de l’amorce (5’-3’)
Taille-Tm
START
(sens)
atggagggcgggaagcgcag
20pb-68°C
AS926
(antisens)
ggtgggaaatcctggagtaac
21pb-64°C
S907
(sens)
ttactccaggatttcccaccag
22pb-66°C
AS1285
(antisens)
cctcatcgaagatcttgccttg
22pb-66°C
S1264
(sens)
caaggcaagatcttcgatgagg
22pb-66°C
AS2101
(antisens)
catactggaaagttcggccgg
21pb-66°C
S2051
(sens)
tctgcagcccaccagtacag
20pb-64°C
STOP
(antisens)
tcataagtttgacgcgaaccgtg
23pb-68°C
Fragment
amplifié
#1
927pb
#2
379pb
#3
838pb
#4
491pb
Sites de restriction présents
PfoI (t/ccagga)
5’t.....3’
3’aggtcc5’
PfoI (t/ccagga)
5’ccagga3’
3’.....t5’
BglII (a/gatct)
5’a.....3’
3’tctag.5’
BglII(a/gatct)
5’.gatct3’
3’.....a5’
FseI(ggccgg/cc)
5’ggccgg..3’
3’cc......5’
FseI(ggccgg/cc)
5’......cc3’
3’..ggccgg5’
Amplification de la séquence codante du canal HCN1 de poule par PCR
Les différentes séquences composant la séquence codante du canal HCN1 sont amplifiées
avec le kit de qPCR LightCycler® Roche (Roche Applied Science, Meylan, France) : 4 µL de
réaction de RT sont mis en présence de 2 µL de solution 5X SYBR-Green, 1 µL de mélange
d’amorces sens et antisens à 5 µM et 2 µL d’eau bidistillée. Après activation de l’enzyme
polymérase, 10 min à 95°C, le programme d’amplification est composé de 45 cycles de PCR :
dénaturation à 95°C pendant 20 sec, hybridation des amorces à 65°C pendant 10 sec,
élongation à 72°C pendant 1 min. La présence d’un seul produit de PCR, de taille attendue,
est vérifiée sur gel d’agarose 1,2% avant de purifier cet ADN grâce au kit de purification
d’ADN QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen). Chaque séquence est à nouveau amplifiée
par PCR classique avec l’enzyme Go Taq DNA polymerase (Promega). Les produits PCR de
taille attendue sont purifiés sur gel d’agarose 1,2% grâce au kit QIAquick afin d’obtenir des
solutions d’ADN concentrées à 75 ng/µL. La séquence de ces produits est déterminée par
séquençage.
127
Figure 15 : Annotation de la séquence codante de l’ARNm HCN1 de G. gallus
(XM_429145.4)
La séquence a été numérotée à partir du codon START (ATG), jusqu’au codon STOP (TGA).
La position des amorces de PCR et des sites de restriction utilisés sont rapportées sur la
séquence ci-dessous. Les séquences des amorces sens sont soulignées. Les séquences des
amorces antisens sont soulignées et en italique. Les sites de restriction sont caractères gras.
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101
2161
2221
2281
2341
2401
2461
2521
atggagggcg
ttcccaggca
aaggagcatg
gtgggcttcg
acctccatgc
gcggtggaga
agcgacttca
attataccag
aatgtggcat
gttaatgaag
aaaagctggt
gtagaaaaag
tttacaaaaa
caccagtggg
tttaatctaa
gtaccgttac
gattcctggg
attggttatg
atgattgtgg
tctctggatt
tcgttccaca
tatcaaggca
gaggagatcg
gcagacccaa
ggtgattata
gttgctggtg
ggagagattt
tgtcgcctct
atgagaaggg
tccatcctct
aatgagatcc
gtgagcttgc
gtcaggacac
tccccctcac
accactgccg
gcctcaccca
ccaccaggca
aacctgagtc
tccaccctga
ccggcccctg
ctcttccgac
gcccccttgc
cggttcgcgt
ggaagcgcag
agcaggcaac
gcaactcagt
aagatgccga
tgcagccggg
aggagcagga
gattttactg
ttggaatcac
cagacactgt
acagctctga
ttgtggttga
gaatggactc
tcctcagcct
aagagatttt
ttggaatgat
tccaggattt
ggaaacaata
gagcccgtgc
gggctacatg
cttcacggcg
aattacctgc
agatcttcga
tcaacttcaa
actttgtgac
ttatccgaga
ttatcaccaa
gcctcttgac
attccctctc
cctttgaaac
tgcagaagtt
tgaagcagat
agcagatgcc
agtcccctcc
ccagcacgca
tctgcagccc
cagcctcaca
ctgcacccaa
gggaggtgcg
tcgccaggcc
gcaccagcgt
agatgtcctc
caagggattc
caaacttatg
ctcctctccc
cccggtggag
gtgcttcaaa
gggaccccgg
ggtcaacaaa
aagggttaaa
ggatttaatc
attcttcaca
ttttctattg
aataatactg
cttcatctca
agaggtttac
gttacgctta
ccacatgaca
gctgctgctt
cccaccagat
ctcatatgcg
ccctgtcagc
ttatgccatg
acaatatcaa
tgaaatgcgc
tgaggaaaac
ttgtcggaag
tgccatgcta
aggtgctgtg
atccaacaaa
caagggccgt
ggtggacaac
agtggcaatt
ccagaaggac
tgtcaagcat
cgcgctgaac
tgtttacacc
gacaccccag
accagtacag
gctctctctc
gaatgaggtt
gcccctctct
tcaccccacc
gcctccagcc
gggagccatc
ttctgcagtc
a
ggcagccggg
aaagcccaaa
gtggacggcg
cggcagtacg
ttctccctcc
actgcggggt
atgctcatca
gagcaaacaa
gacttgataa
gaccctaaag
tcaataccag
aagacagcaa
ttacgccttt
tatgatctgg
tgccattggg
tgctgggtgt
ctcttcaaag
atgtctgatc
tttgttggtc
gaaaagtaca
cagaagatcc
attctcaatg
ctggttgcta
agcaaactgc
ggtaaaaaga
gagctgaagc
cgaactgcca
ttcaatgagg
gatagacttg
ctcaacactg
gacagggaga
tccagcagct
gctggcagcc
caagccgtta
agccccctgg
atgcagcagc
cacaagagca
gcctcccagc
gtgggggagt
agccgggcca
cccccaaacc
ttaagcacag
128
acgagggcag
gcagccccgg
gcggggccga
gcttcatgca
gcatgttcgg
tctggatcat
tgatggttgg
caacaccatg
tgaatttcag
tcattaagat
tggattatat
gagcacttcg
caagactgat
ccagtgctgt
atggctgtct
ccctaaacgg
ccatgagcca
tctggataac
atgccactgc
aacaagtaga
atgattacta
agctcaatga
caatgcctct
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gtgtacgagc
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acaggatagg
gggtgttcaa
tggtgcagac
ccaccacctc
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tcctctcgcc
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agcctcaggc
cccaggccct
cctccctgcc
ccctggcctc
ccgtgccaca
ggggggccgt
agcctgaggg
cgcgaacgcc
tggcggcgcg
ggagcccgtg
gcggcagttc
cagccagaag
ccacccctac
aaaccttgtc
gattattttc
aactgggact
gaattattta
ctttctcatt
tatcgtgaga
tagatacata
ggtgagaatc
tcagttttta
tatggttaat
tatgctgtgc
catgttgagt
cctcattcaa
acagtacatg
tgagcaccgc
tcctcttcgg
ttttgctaat
gttccaacct
tcagcatggt
ctcttacttt
agacacatac
gtatcccatg
gaagaagaac
caaccaagag
catcgcccca
ctcgtcgcgc
aaacctgcac
ctgctcctac
tttccagtat
accccagctg
ccacaacacc
tcacgagatt
ccttccgcag
gcgggtctct
gccgcccgca
agacaagcca
START
S742
S907/AS926 PfoI
S1264/AS1285 BglII
S2051 FseI AS2101
AS2198
STOP
Séquençage
La réaction de séquençage (Sanger et al. 1977) est réalisée dans un volume de 10 µL, en
présence d’une amorce 3 µM, 5µL (500 ng) d’ADN, 2 µL de tampon 5X et 0,5 µL de réactif
du kit de séquençage Big-DyeTM Terminator cycle sequencing (Applied Biosystems). Le
programme de la réaction de PCR comporte 30 cycles de dénaturation (97°C, 45 sec),
hybridation (50°C, 45 sec) et élongation (60°C, 4 min). La réaction de séquençage est diluée
dans un volume d’eau distillée et le produit de la réaction est précipité par ajout de 80 µL
d’éthanol 76%. Le culot est récupéré par centrifugation (15 000 g, 15 min) et lavé avec 250
µL d’éthanol 70%. Le culot séché est repris dans 15 µL de formamide désionisé. Enfin,
l’ADN est dénaturé à 95°C pendant 5 min et refroidi brutalement sur glace avant d’être
analysé par le service commun de séquençage du Pole Biologie-Santé de Poitiers.
Ligation des séquences HCN1 amplifiées par PCR dans pGEMT-easy
Le vecteur de clonage pGEMT-easy (figure 16, Promega) permet de cloner des produits de
PCR possédant des extrémités A-3’. Les quatre fragments de la séquence codante du canal
HCN1, obtenus par PCR, sont clonés séparément dans le plasmide pGEMT-easy : 1 µL de
vecteur (50 ng), 2 µL d’insert (150 ng), 5 µL de tampon 2X et 1 µL d’enzyme T4 ligase
(Promega). Les ligations sont réalisées pendant 2 h à température ambiante puis la nuit à 4°C
dans un volume final de 10 µL. Ces constructions sont introduites dans des bactéries
Escherichia coli TG1.
Figure 16 : Carte du vecteur de clonage pGEMT-easy (Promega)
Séquence de l’amorce T7 de pGEMT-easy : 5’-ATACGACTCACTATAGGGCGA-3’
Séquence de l’amorce SP6 de pGEMT-easy : 5’-AAATCCACTGTGATATCTTATGAG-3’
129
Transformation de bactéries par choc thermique
Une aliquote de 75 µL de bactéries compétentes est mis en présence de 2 µL de réaction de
ligation pendant 30 min sur glace, 2 min à 42°C, puis retour sur glace. Après addition de 1
mL de milieu de culture LB (Luria Bertani : extrait autolytique de levure 5 g/L, tryptone 10
g/L, NaCl 10 g/L) les bactéries sont incubées à 37°C sous agitation pendant 2 h. Un volume
de 200 µL de suspension bactérienne est étalé sur une boite de milieu solide LB. Les bactéries
sont incubées une nuit à 37°C.
Sélection des bactéries transformées avec la ligation des produits de PCR HCN1 dans
pGEMT-easy
Les bactéries TG1, transformées avec la ligation des produits de PCR HCN1 dans le vecteur
pGEMT-easy, sont sélectionnées en présence d’antibiotique ampicilline 100 µg/mL (LBAmp), d’IPTG 0,1 mM et de X-gal 40 µg/mL. L’orientation des inserts dans les plasmides
recombinants (clones bactériens blancs) est déterminée par PCR avec l’amorce T7 de
pGEMT-easy et l’amorce antisens utilisée dans la PCR du fragment HCN1 considérée. Les
constructions orientées avec T7 en 5’ du fragment HCN1 sont retenues pour réaliser des
minipréparations de plasmide dans les bactéries TG1.
Minipréparation d’ADN plasmidique
Les clones d’intérêt sont cultivés une nuit dans 10 mL de LB-Amp à 37°C sous agitation. Le
culot bactérien est récupéré par centrifugation (3000 g, 20 min) puis l’ADN plasmidique est
préparé suivant les instructions du kit Wizzard® (Promega). La concentration de l’ADN
plasmidique est déterminée par le mesure de DO (densité optique) à 260 nm (1 DO260nm = 50
µg/mL) et la contamination protéique est déterminée par le ratio DO260nm/DO280nm (proche de
2).
Digestion enzymatique des séquences HCN1 clonées dans pGEMT-easy
Les enzymes de restriction PfoI et FseI, choisies pour isoler les fragments de séquence HCN1,
sont sensibles aux méthylations de l’ADN. Les plasmides préparés à partir de bactéries TG1
sont donc introduits dans les bactéries E. coli K12 (ER2925, New England BioLabs), qui ne
possède pas d’enzymes DNA-méthyltransférase Dam et Dcm responsables de la méthylation
des résidus adénine et cytosine.
Après amplification dans les bactéries K12, 3 µg de plasmides exempts de méthylation de
l’ADN sont digérés avec les enzymes appropriées et les séquences d’intérêt sont purifiées
avec le kit QIAquick après électrophorèse sur gel d’agarose 1,2% :
130
- digestion pGEMTeasy-fragment #1 par PfoI et SalI : purification de l’insert de 3892 pb.
- digestion pGEMTeasy-fragment #2 par PfoI et BglII : purification de l’insert de 364 pb.
- digestion pGEMTeasy-fragment #3 par BglII et FseI : purification de l’insert de 813 pb.
- digestion pGEMTeasy-fragment #4 par FseI et SalI : purification de l’insert de 492 pb.
Ligation de la séquence codante du canal HCN1 dans pGEMT-easy
La totalité de la séquence codante HCN1 est reconstituée dans le vecteur de clonage pGEMTeasy de la façon suivante. Le vecteur pGEMT-easy contenant le fragment # 1 est digéré par
PfoI et SalI puis déphosphorylé pour générer le « plasmide accepteur ». Les autres fragments
sont ligaturés dans ce « plasmide accepteur » : 25 ng de « plasmide accepteur », 10 ng de
chaque fragment, 5 µL de tampon 2X et 1 µL d’enzyme T4 ligase. La construction a été
introduite dans les bactéries TG1.
Sélection des bactéries transformées avec la ligation HCN1 dans pGEMT-easy
Les bactéries TG1, sont sélectionnées en présence d’antibiotique ampicilline 100 µg/mL (LBAmp). L’orientation des inserts dans les plasmides recombinants est déterminée par PCR avec
les couples d’amorces S2051/SP6 de pGEMT-easy et S907/AS1285. Deux clones sont retenus
pour vérifier la séquence de l’insert HCN1.
Ligation de la séquence HCN1 dans le vecteur d’expression pcDNA3
Le plasmide pcDNA3 est un vecteur d’expression dans lequel la séquence clonée se retrouve
sous le contrôle du promoteur fort CMV cytomegalovirus (figure 17, Invitrogen). La totalité
de la séquence codante HCN1 est sortie du plasmide pGEMT-easy par NotI et ligaturée dans
le vecteur d’expression pcDNA3 préalablement (digéré par Not1 et déphosphorylé) : 100 ng
de pcDNA3, 75 ng d’insert HCN1, 5 µL de tampon 2X et 1 µL d’enzyme T4 ligase. La
construction pcDNA3-HCN1 est introduite dans les bactéries TG1.
131
Figure 17 : Vecteur d’expression pcDNA3 (Invitrogen)
Séquence de l’amorce SP6 de pcDNA3 : 5’-CTAGCATTTAGGTGACACTATA-3’
Sélection des bactéries transformées avec la ligation HCN1 dans pcDNA3
Les bactéries TG1, sont sélectionnées en présence d’antibiotique ampicilline 100 µg/mL (LBAmp). L’orientation des inserts dans les plasmides recombinants est déterminée par PCR avec
le couple d’amorces S2051/SP6 de pcDNA3.
Animaux
Des œufs de poule (Gallus domesticus) fertilisés provenant de l’élevage Anjou-Accouvage
(Le-Louroux-Béconnais, France) sont incubés sur des plateaux basculants dans une couveuse
dont la température est maintenue à 37°C sous 70% d’humidité pour permettre le
développement des embryons. Après le temps d’incubation souhaité, les embryons sont
sacrifiés par décapitation.
Dissection de la rétine neurale
Les yeux sont placés dans du milieu HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution, Gibco, Life
Technologies 14060-040), additionné d’antibiotiques pénicilline/streptomycine à 100 U/mL
(Sigma-Aldrich). L’œil est pelé par l’arrière afin de retirer les muscles, la sclérotique et
l’épithélium pigmentaire. Enfin la marge ciliaire est éliminée et la rétine neurale est détachée
de la vitrée. Les rétines neurales sont découpées en fragments dans du milieu CMF (HBSS
Calcium Magnesium Free, Gibco, Life Technologies 14180-046), additionné de
pénicilline/streptomycine 100 U/mL.
132
Culture primaire de précurseurs rétiniens embryonnaires
Les rétines neurales disséquées à partir d’embryons aux stades E8 ou E10 sont dissociées par
digestion enzymatique pendant 30 min à 37°C dans 5 mL de trypsine 0,25%, DNAse 10
µg/mL. L’action de la trypsine est stoppée par ajout de milieu BME (Basal Eagle Medium,
Gibco, 41010-026) supplémenté d’albumine sérique bovine BSA à 1% (Bovine Serum
Albumine, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France). Les cellules sont ensuite
dissociées mécaniquement par 20 pipetages successifs à travers une pipette de 10 mL dans du
milieu M199 seul (Sigma, M-0650), additionné de pénicilline/streptomycine à 100 U/mL et
de glutamine 2 mmol/L (Sigma-Aldrich). Le volume de la suspension cellulaire est ajusté afin
d’obtenir une concentration de 8.106 cellules/mL, vérifiée par comptage sur cellule de
Malassez. Les cellules sont ensemencées à haute densité (1,25.106 cellules par cm2) dans des
boites en plastique 24 puits (2 cm2) ou dans des lames 4 puits (2 cm2) coatées avec de la polyL-ornithine (20 µg/cm2). Les cellules sont cultivées dans 600 µL de milieu M199
supplémenté de 10% de sérum de veau nouveau-né NCS (Newborn Calf Serum, Life
technologies, Saint-Aubin, France), 0,1% de BSA, 100 U/mL pénicilline/streptomycine et de
glutamine 2 mmol/L. Les cellules sont cultivées pendant 48 à 72 h, à 37°C, sous 5% de CO2
et dans l’obscurité constante.
Transfection transitoire des précurseurs rétiniens par un précipité d’ADN plasmidique
phosphate de calcium
Les précurseurs rétiniens (2,5.106 par puits dans un volume final de 600 µL) sont transfectés
avec un volume de 30 µL d’ADN plasmidique précipité dans une solution de phosphate de
calcium, suivant la méthode précédemment décrite (Voisin et Bernard, 2009).
Les plasmides suivants sont utilisés au cours des expériences de transfections :
- le plasmide pGL3-Basic (Promega) porte le gène rapporteur luciférase de luciole firefly, sans
promoteur
- le plasmide pGL3-pRh1.6 porte le gène luciférase de luciole sous contrôle du promoteur 1,6
kb proximal du gène rhodopsine de poule (Voisin et Bernard 2009)
- le plasmide pRL-TK (Promega) contient le gène luciférase de Renilla sous contrôle du
promoteur de la thymidine kinase du virus herpes simplex
- le plasmide pcDNA3-vide ne possède pas d’insert dans son site multiple de clonage
- le plasmide pcDNA3-HCN1 contient la séquence codante du canal HCN1 de poule insérée
au site de clonage NotI, sous contrôle du promoteur CMV
133
•
Dans les expériences destinées à évaluer l’effet de l’expression de HCN1 sur l’activité
du promoteur du gène de la rhodopsine, les cellules sont co-transfectées avec les
combinaisons suivantes de plasmides :
- 1 µg de pGL3-Basic + 0,15 µg de pRL-TK : dans ces conditions l’activité luciférase de
luciole représente la fuite transcriptionnelle (sans promoteur), normalisée par l’activité
luciférase de Renilla qui corrige l’efficacité de transfection
- 1 µg de pGL3-pRh1.6 + 1 µg de pcDNA3-vide + 0,15 µg de pRL-TK : dans ces conditions
l’activité luciférase de luciole représente l’activité transcriptionnelle du promoteur
rhodopsine, en absence d’expression forcée de HCN1, avec correction de l’efficacité de
transfection par la luciférase de Renilla
- 1 µg de pGL3-pRh1.6 + 1 µg de pcDNA3-HCN1 + 0,15 µg de pRL-TK: dans ces conditions
l’activité luciférase de luciole représente l’activité transcriptionnelle du promoteur
rhodopsine, en présence d’une expression forcée de HCN1, avec correction de l’efficacité de
transfection par la luciférase de Renilla
Les activités enzymatiques des luciférases firefly et de Renilla, sont quantifiées suivant les
instructions du kit Dual-GloTM luciferase assay system (Promega), par mesure de l’émission
de photons sur un luminomètre GloMaxTM20/20 (Promega). Les variations d’efficacité de
transfection entre les précipités d’ADN sont normalisées en faisant le rapport entre l’activité
enzymatique de la luciférase de luciole et celle de Renilla. Les résultats sont exprimés en
moyenne des rapports d’activité firefly/Renilla ( ̅ ± sem, n=3).
•
Dans les expériences destinées à vérifier l’expression du canal HCN1 par
immunofluorescence, les cellules sont transfectées avec 2 µg de plasmide pcDNA3HCN1 ou 2 µg de plasmide pcDNA3-vide pour les contrôles négatifs.
Immunofluorescence HCN1
Les puits des lames 4 puits sont rincés avec 1 mL de PBS (Phosphate Buffered Saline :
Na2HPO4 10 mM, NaCl 0,9%, pH 7 ,4). Les cellules sont fixées avec une solution de
paraformaldéhyde 4% (PFA 4% dans du NaPO4 0,1 M pH 7,4) pendant 15 min à température
ambiante. Les cellules sont ensuite perméabilisées et les sites non spécifiques sont bloqués en
présence d’une solution de PBS-Triton 0,3%-BSA 3% pendant 1 h. Le blocage se poursuit
pendant 30 min dans une solution PBS-Tween 20 0,05%-BSA 5% (PBS-Tween-BSA). Les
cellules sont incubées la nuit à 4°C soit en présence d’un anticorps monoclonal anti-HCN1
produit chez la souris (clone S70-28, Acris Antibodies, Herfort, Germany) et dirigé contre
l’extrémité C-terminale de l’HCN1 de rat (acides aminés 778-910) qui présente une forte
identité de séquence (>75%) avec celle du HCN1 de poule. Cet anticorps est dilué 1/1000
134
dans du PBS-Tween-BSA. Les contrôles négatifs sont réalisés avec un anticorps irrelevant
anti-digoxygénine produit chez la souris (Roche Applied Science) dilué 1/1000 dans du PBSTween-BSA. Les complexes antigène-anticorps sont révélés après 2 h d’incubation à
température ambiante en présence d’un anticorps secondaire goat-anti-mouse couplé à un
Alexa Fluor® 555 (#A-21422, Molecular Probes) dilué 1/500 dans du PBS-Tween-BSA.
Après trois rinçages PBS-Tween, les lames sont montées dans du Mowiol® (Mowiol 4.88,
Calbiochem, St-Quentin-en-Yvelines, France). Le marquage est observé avec un microscope à
fluorescence (Leica DMI6000, Leica, Nanterre, France) équipé d’une caméra digitale (Leica
DFC350FX, logiciel LAS AF, Leica).
135
Résultats
1. Clonage de la séquence codante du canal HCN1 de poule dans un vecteur d’expression
Une autre équipe a déjà réalisé le clonage des séquences codantes des canaux HCN
humains, dans le vecteur d’expression pcDNA3, afin d’établir une lignée de cellules HEK293
transfectée de façon stable (Stieber et al. 2005). Nous avons cloné la séquence codante du
canal HCN1 de poule, dans ce même vecteur, afin de transfecter transitoirement des
précurseurs rétiniens d’embryon de poule.
Nous avons produit par RT-PCR quatre fragments chevauchants, aux extrémités
desquels se trouvent des sites de restriction complémentaires permettant de reconstituer la
séquence codante HCN1. Les produits de PCR obtenus à partir de l’ARNm codant le HCN1
de Gallus domesticus ont été séquencés directement (avant clonage) pour obtenir une
séquence représentative de l’espèce et pouvoir la comparer à la séquence HCN1 de G. gallus,
disponible dans GenBank. L’alignement des séquences montre que deux nucléotides sont
différents. En position 68 (à partir de l’ATG) la séquence de G. domesticus, contient un C au
lieu d’un G pour G. gallus. Ce qui se traduit par un codon GCG (Alanine), au lieu de GGG
(Glycine). En position 2292, la séquence de G. domesticus, contient un T au lieu d’un C pour
G. gallus. Ce qui se traduit par un codon ATT au lieu de ATC, codant tous les deux pour
l’acide aminé isoleucine.
Nous avons séquencé les produits de PCR clonés dans pGEMT-easy et retenu ceux
dont la séquence était identique à celle du HCN1 de G. domesticus. Puis nous avons contrôlé
la séquence codante complète du HCN1 cloné dans pcDNA3. Ces précautions nous
permettent de vérifier qu’aucune mutation n’a été introduite par l’enzyme Taq polymérase ou
par les bactéries K12.
2. Immunofluorescence HCN1 sur les précurseurs rétiniens transfectés
Afin de vérifier si la construction pcDNA3-HCN1 permet l’expression du canal HCN1
à la membrane, nous avons transfecté transitoirement des précurseurs en culture et réalisé une
immunofluorescence de la protéine HCN1. Les cellules ont été incubées avec des anticorps
produits chez la souris, soit un anticorps primaire anti-HCN1, soit un anticorps irrelevant
dirigé contre la digoxigénine (DIG, un stéroïde retrouvé exclusivement dans les plantes).
Aucun marquage fluorescent n’a été observé sur les cellules incubées avec l’anticorps antiDIG ce qui indique que l’anticorps secondaire fluorescent ne produit pas de bruit de fond par
liaison non spécifique sur les cellules de poule (résultat non illustré).
136
L’immunofluorescence HCN1 révèle un marquage identique sur les précurseurs isolés
à E8 ou E10 (figure 18). Le marquage HCN1 est en partie péri-nucléaire ce qui pourrait
correspondre à la protéine en cours de synthèse et d’adressage au niveau du réticulum
endoplasmique (figure 18 a.). Le marquage HCN1 est également membranaire, ce qui montre
que la transfection avec la construction pcDNA3-HCN1 permet d’exprimer le canal à la
membrane (figure 18). La fluorescence permet d’apprécier la morphologie des cellules
exprimant le canal HCN1. Les cellules possédant une morphologie allongée pourraient être
des précurseurs de photorécepteurs (figure 18 b.), tandis que les cellules présentant de
nombreux prolongements pourraient être des cellules amacrines (figure 18 c.). La
transcription du gène HCN1 se fait sous le contrôle du promoteur fort CMV. Les cellules
transfectées expriment donc le canal HCN1 indépendamment de leur type cellulaire.
Dans chaque puits de culture, nous avons compté le nombre de cellules révélées par
l’immunofluorescence du canal HCN1 pour estimer l’efficacité de la transfection. Nous avons
dénombré environ 80 cellules immuno-marquées par puits, contenant approximativement
4.106 cellules. Cela représente un pourcentage de transfection très faible de seulement 2
cellules pour 100 000. Ce résultat est étonnant car des expériences réalisées au laboratoire
avec un plasmide exprimant la β-galactosidase sous contrôle d’un promoteur SV40 (pSV-βgalatosidase control vector, Promega) avaient permis de mesurer une efficacité de
transfection de 1 à 2% (cité dans Bernard et al. 2014). Dans les cultures de précurseurs
rétiniens de poule, environ 30% des cellules sont des photorécepteurs (Xie et Adler 2000) et
15% des photorécepteurs sont des bâtonnets dans la rétine de poule (Voisin et al. 2012).
Ainsi, dans un puits de culture contenant 4.106 cellules, avec une efficacité de transfection de
2% nous pouvons nous attendre à transfecter environ 3 500 précurseurs de bâtonnets. Avec
une efficacité de transfection de 2 pour 100 000, seulement 3 ou 4 précurseurs de bâtonnets
seraient transfectés dans chaque puits. Ceci annihilerait tout espoir de détecter l’effet d’une
surexpression de HCN1 sur l’activité du promoteur rhodopsine.
Cependant, la technique d’immunofluorescence du canal HCN1 est peu sensible, il est
donc possible qu’une partie des cellules transfectées expriment la protéine HCN1 à un niveau
trop faible pour être détecté en immunofluorescence. En accord avec cette supposition, nous
avons précédemment observé ex vivo que la protéine est très faiblement détectable en western
blot entre E14 et E16, alors que le taux d’ARNm atteint déjà un tiers du maximum (Bernard et
al. 2014). Ce n’est qu’à partir de E18, lors d’un pic d’expression de l’ARNm, que la protéine
est nettement détectable en western blot. L’immunodétection sur des cellules fixées semble
encore moins sensible que le western blot, car il faut attendre le stade post-natal P1 pour
137
visualiser la protéine HCN1, concentrée au niveau des terminaisons synaptiques (Bernard et
al. 2014). Ainsi, l’immunofluorescence de HCN1 dans des cellules transfectées peut nous
donner une indication du succès de l’expression à la membrane, mais elle est sans doute trop
peu sensible pour estimer quantitativement l’efficacité de transfection.
Il est donc raisonnable de chercher à mesurer l’effet d’une surexpression de HCN1 sur
l’activité du promoteur de la rhodopsine par des expériences de co-transfection.
Figure 18 : Immunofluorescence du canal HCN1
Des précurseurs isolés à E8 ou E10 ont été transfectés avec 2 µg de plasmide pcDNA3HCN1. Après 48 h les cellules ont été fixées et la protéine HCN1 a été détectée en
immunofluorescence.
3. Effet de l’expression forcée du canal HCN1 sur l’activité du promoteur rhodopsine
Dans une première culture réalisée sur des précurseurs isolés à E8, l’activité du
promoteur rhodopsine a été augmentée significativement de 4,5 fois après 48 h de transfection
avec le plasmide pcDNA3-HCN1 (figure 19 A, culture 1). En revanche, aucune activation du
promoteur rhodopsine n’a été constatée après 72 h de transfection, ce qui peut être dû à la
toxicité du précipité ADN calcium-phosphate (résultat non illustré). Dans une seconde culture
de précurseurs E8, les mesures d’activité luciférase ont donc été réalisées après 48 h de
transfection. De plus, deux précipités d’ADN ont été préparés séparément. En présence du
premier précipité d’ADN, l’activité du promoteur rhodopsine montre une tendance à
l’augmentation (2,2 fois), mais de façon non significative (figure 19 A, culture 2, précipité 1).
En présence du second précipité d’ADN, aucune augmentation de l’activité transcriptionnelle
n’est observée (figure 19 A, culture 2, précipité 2).
Les résultats obtenus sur des cellules rétiniennes isolés à E8 étant de faible amplitude
et peu reproductibles, nous avons supposé que les précurseurs de bâtonnets étaient peut-être
138
trop immatures pour répondre correctement à l’expression forcée de HCN1. Par exemple, il
est permis de supposer que l’expression de LMaf/MafA, qui débute autour de E10 (Ochi et al.
2004, Lecoin et al. 2004) pouvait être trop faible encore pour permettre une activation robuste
du promoteur de la rhodopsine. En d’autres termes, l’expression de HCN1 serait nécessaire,
mais non-suffisante pour permettre l’activation du gène de la rhodopsine. Ce raisonnement
nous a conduits à tester l’effet de l’expression forcée de HCN1 dans des cellules rétiniennes
cultivées à E10, c'est-à-dire au tout début de leur compétence pour l’activation spontanée du
gène de la rhodopsine (Voisin et al. 2012).
Dans la culture réalisée à E10, l’expression forcée du canal HCN1 a multiplié très
significativement l’activité du promoteur rhodopsine par 1,7 après 48 h de transfection (figure
19 B). Cependant, après 72 h de transfection, l’augmentation de 2 fois de l’activité du
promoteur rhodopsine n’est pas significative (figure 19 B). Ainsi, l’effet même significatif de
HCN1, reste de très faible amplitude. Toutefois, il faut noter que l’activité spontanée du
promoteur rhodopsine (92 fois le niveau basal) est beaucoup plus élevée que ce que nous
avions précédemment observé dans des cellules E10 (6 fois le niveau basal, Bernard et al.
2014). Dans ces conditions, la surexpression de HCN1 a peu de chance d’augmenter
fortement l’activité du promoteur. Surtout si l’activité spontanée du promoteur rhodopsine
repose effectivement sur l’expression du HCN1 endogène. Etant donné le peu de contrôle que
nous avons sur l’activation spontanée du promoteur de la rhodopsine, la solution
expérimentale consistera à répéter cette étude sur de nombreux échantillons de cellules
rétiniennes, isolées entre E8 et E11, afin de trouver des conditions favorables à la mise en
évidence d’un effet de l’expression forcée du canal HCN1.
139
Figure 19 : Effet de l’express
ession forcée du canal HCN1 sur l’activité du promoteur
rhodopsine
Les précurseurs rétiniens isolé
olés à E8 ou E10 ont été co-transfectés transi
nsitoirement avec les
plasmides pGL3-Basic ou pGL
GL3-pRh1.6, pcDNA3-vide ou pcDNA3-HCN
CN1 et pRL-TK. Les
activités luciférases de luciole
iole et de Renilla ont été mesurées entre 244 h et 72 h après la
transfection. Les résultats son
ont exprimés comme l’augmentation par rappo
pport au niveau basal
(pGL3-Basic) des activités lu
luciole/Renilla ( ̅ ± sem, n = 3). Test-t dee Student
S
: N.S. non
significatif ; * p < 0,05 ; *** p < 0,001.
140
Conclusion et perspectives
Au cours du développement embryonnaire, l’expression du gène HCN1 dans la rétine,
est corrélée à l’activation transcriptionnelle du gène de la rhodopsine, ce qui nous a conduits à
envisager l’expression du canal HCN1 comme un élément limitant la compétence des
précurseurs de bâtonnets. Cependant, l’expression forcée du canal HCN1 dans des précurseurs
rétiniens ne s’est pas révélée suffisante pour induire l’activation du promoteur du gène de la
rhodopsine. Le plasmide pcDNA3-HCN1 permet bien d’exprimer HCN1 à la membrane,
toutefois nous n’avons pas vérifié la fonctionnalité du canal, généralement évaluée par la
technique de patch-clamp. La poursuite de ces travaux devra se concentrer sur la définition de
conditions expérimentales optimales : « âge » des précurseurs, composition des précipités
ADN co-transfectés et durée de la transfection.
De plus, nous avons envisagé la possibilité que l’expression du canal HCN1 soit
nécessaire mais non suffisante pour l’activation du promoteur rhodopsine. Dans cette
hypothèse, les effets attendus de l’expression d’HCN1 seraient moindres et la combinaison de
cette expression forcée avec d’autres signaux stimulateurs serait nécessaire pour obtenir des
effets synergiques de plus grande amplitude. Ainsi, la dépolarisation induite en présence du
canal HCN1 pourrait être potentialisée en présence d’IBMX car la transcription du gène de la
rhodopsine est fortement augmentée de façon synergique par les traitements IBMX 10-4 M,
augmentant le taux d’AMPc, et KCl 50 mM, dépolarisant les précurseurs isolés à E8 (x 25,
Voisin et Bernard 2009). De même, la co-transfection de précurseurs isolés à E8 avec des
constructions forçant l’expression du canal HCN1 et du facteur de transcription L-Maf/Maf-A
pourrait activer fortement le promoteur du gène de la rhodopsine.
Pour le moment, l’implication des canaux HCN sur l’activation transcriptionnelle du
gène de la rhodopsine repose sur le seul effet inhibiteur du ZD7288 (Bernard et al. 2014). Les
autres inhibiteurs pharmacologiques des canaux HCN que nous avons testés n’ont pas
confirmé ce résultat : la zatébradine n’empêche pas l’activation du promoteur rhodopsine, le
chlorure de césium 3 mM a inhibé de 36% l’activité du promoteur rhodopsine dans une
culture mais ce résultat n’a pas été reproductible (communication personnelle de Marianne
Bernard). Enfin, la société Servier ne nous autorise pas à utiliser l’ivabradine sur les
précurseurs rétiniens d’embryon de poule.
141
S’il s’avère difficile de démontrer l’implication des canaux HCN dans le modèle que
nous avons proposé, d’autres perspectives de recherche restent ouvertes pour préciser la
nature et le rôle des courants calciques (figure 14, Bernard et al. 2014). La propagation
spontanée d’oscillations calciques à travers les différentes couches cellulaires rétiniennes a
déjà été décrite dans des explants de rétine embryonnaire de poule (Catsicas et al. 1998). Ceci
nous amène à faire l’hypothèse que ces influx calciques pourraient également être générés
sous forme de courants calciques transitoires. Nous avons mesuré des oscillations calciques
dans des précurseurs rétiniens de poule in vitro, mais sans pouvoir établir de lien de causalité
entre leur présence et l’activation transcriptionnelle du gène de la rhodopsine. Une perspective
d’étude serait d’essayer d’interférer avec ces oscillations calciques dans des précurseurs de
bâtonnets. Des mesures du taux de calcium intracellulaire (Fluo-8, voir dans Bernard et al.
2014) pourrait être réalisées sur des précurseurs de bâtonnets (identifiés par l’expression de la
protéine fluorescente DsRed, voir dans Bernard et al. 2014), en présence de différents
traitements pharmacologiques : ZD7288, mibéfradil ou ML218. Finalement, notre modèle
basé sur la signalisation calcique se rapproche des mécanismes de maturation neuronale déjà
mis en évidence dans d’autres régions du système nerveux central (Rosenberg et Spitzer
2011).
142
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Partie 1 : Caractérisation des propriétés antiprolifératives d’une substance naturelle
La recherche d’agents anticancéreux exploite les propriétés anti-prolifératives de
molécules d’origine naturelle. La canthin-6-one est un alcaloïde d’origine végétale dont les
propriétés antipyrétique et antiparasitaire sont utilisées en médecine traditionnelle. Une
utilisation thérapeutique de cette molécule, fondée sur des bases scientifiques, nécessite une
meilleure connaissance de ses propriétés anti-prolifératives et de son mode d’action. Nous
avons observé une inhibition complète de la prolifération de lignées humaines cancéreuses
(PC-3, HT-29, Jurkat, HeLa) en présence de canthin-6-one (10 à 40 µM). La canthin-6-one
entraine une diminution de l’incorporation de BrdU dans l’ADN néo-synthétisé des cellules
cancéreuses et une baisse de la proportion de cellules en mitose. L’origine de ces effets antiprolifératifs est une accumulation des cellules dans la phase G2/M du cycle cellulaire. La
conservation phylogénétique des mécanismes du cycle cellulaire nous a permis d’utiliser la
levure Saccharomyces cerevisiae pour rechercher des gènes cibles de la canthin-6-one. Par
criblage d’une banque d’ADN génomique de levure, nous avons identifié deux gènes de
résistance correspondants respectivement à une pompe d’efflux (Flr1) et à une enzyme
impliquée dans le contrôle qualité de la réplication à la transition G2-M (Siz2).
Mots-clés: canthin-6-one, cancer, cycle cellulaire, levure, résistance
Partie 2 : Rôle de la signalisation calcique dans la différenciation des photorécepteurs
Une meilleure connaissance des mécanismes de différenciation des photorécepteurs de
type bâtonnet devrait permettre la mise au point de méthodes thérapeutiques ou
prophylactiques contre les dégénérescences rétiniennes. Chez l’embryon de poule, un délai
d’une semaine entre la détermination des précurseurs de photorécepteurs et l’activation
transcriptionnelle du gène de la rhodopsine, suggère l’attente d’un signal important pour cette
étape de la différenciation. Par une approche pharmacologique in vitro, nous avons pu
montrer que l’activation du promoteur du gène de la rhodopsine et l’accumulation de l’ARNm
correspondant, dépendent d’une voie de signalisation impliquant un canal activé en
hyperpolarisation (HCN), des canaux calciques de type T ou R et de l’activité de la kinase
calmoduline-dépendante. Le profil d’expression du canal HCN1 dans la rétine embryonnaire
suggère qu’il pourrait jouer un rôle limitant dans ce mécanisme. Cette hypothèse a été testée
par une expression forcée du canal HCN1 dans des précurseurs rétiniens.
Mots-clés: différenciation, photorécepteur, opsine, calcium, HCN
Doctorat de l’Université de Poitiers : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
ERL 7368 CNRS
Laboratoire Signalisation et Transports Ioniques Membranaires "STIM"
Université de Poitiers - Bât. B36 TSA 51106
1, rue Georges Bonnet 86073 Poitiers Cedex 9
159

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