Évaluation de l`activité antioxydante et antimicrobienne des feuilles

Phytothérapie (2014) 12:15-24
© Springer-Verlag France 2014
DOI 10.1007/s10298-014-0832-z
Article original
Pharmacognosie
Évaluation de l’activité antioxydante et antimicrobienne des feuilles
et des sommités fleuries de Marrubium vulgare L.
N. Ghedadba1, H. Bousselsela2, L. Hambaba1, S. Benbia2, Y. Mouloud2
1
Laboratoire de chimie des matériaux et des vivants : activité et réactivité, département des sciences de la nature et de la vie, faculté des sciences, université
El-Hadj-Lakhdar, 05000 Batna, Algérie
2
Laboratoire de biotechnologie des molécules bioactive et de la physiopathologie cellulaire, département des sciences de la nature et de la vie, faculté des
sciences, université El-Hadj-Lakhdar, 05000 Batna, Algérie
Correspondance : [email protected]
Résumé : Dans cette étude in vitro, des activités antioxydante
et antimicrobienne des extraits organiques et de l’extrait
aqueux des feuilles et des sommités fleuries du Marrubium vulgare ont été étudiées. L’activité antioxydante a été
évaluée par la méthode de radical-balayage du diphényl1-picrylhydrazyl (DPPH) et le test de blanchiment du βcarotène. L’activité antimicrobienne a été évaluée par la
méthode de diffusion en milieu gélosé. L’analyse qualitative
des extraits par la chromatographie sur couche mince (CCM)
a indiqué la présence de l’acide gallique, de la quercétine et
l’absence d’atropine. D’ailleurs, l’identification préliminaire
de l’activité antiradicalaire envers le DPPH par CCM indique
que l’activité est concentrée dans l’extrait méthanolique brut
(EMeOH). La quantification des phénols totaux par la
méthode de Folin-Ciocalteu et des flavonoïdes par la
méthode AlCl3 a donné des valeurs plus élevées avec
l’EMeOH, où la valeur la plus élevée est estimée par mesures
au spectrophotomètre : 3,42 ± 0,85 mg EAG/g d’extrait ; 18,0
± 0,75 mg EQ/g d’extrait. Marrubium vulgare n’a eu aucune
activité contre les micro-organismes examinés (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 et Escherichia coli ATCC 25922). La méthode de βcarotène a attiré l’attention sur l’existence de trois temps :
« temps de repos, temps de génération et temps d’épuisement » dans lequel l’EMeOH a été caractérisé par une activité
antioxydante très élevée (63,77 %). L’évaluation quantitative
de l’activité antiradicalaire a prouvé que l’EMeOH est le plus
actif (IC50 = 1,5 μg/ml) ; cependant, la quercétine (utilisée
comme témoin) a montré une activité approximativement
équivalente (IC50 = 0,81 μg/ml), ce qui indique la présence
de composés efficaces dans la composition biochimique de
la plante qui ont une capacité élevée dans la réduction du
DPPH. Ces composés sont caractérisés par une polarité élevée
et sont identifiés par chromatographie liquide sous haute
pression (HPLC) dans l’EMeOH de la plante ; ces composés
s’appellent les « phénylpropanoïdes glycosides ».
Mots clés : Marrubium vulgare – Extraits organiques –
Flavonoïdes – Activité antimicrobienne – Activité
antioxydante
Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial
Activities of the Leaves and Flowered Tops
of Marrubium vulgare L.
Abstract: In the current in vitro study, antioxidant and antimicrobial activities of the organic solvents and aqueous extracts of
the leaves and flowered tops of Marrubium vulgare were investigated. Antioxidant activity was evaluated by 2,2’diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity
and β-carotene bleaching method, and the antimicrobial activity was evaluated by disc diffusion method. Qualitative analysis of the extracts by thin layer chromatography (TLC) revealed
the presence of gallic acid, quercetin and the absence of atropin. Moreover, preliminary identification of the radicalscavenging activity toward DPPH by TLC indicated that the
activity is concentrated in the crude methanol extract
(MeOHE). Quantification of total phenols by Folin-Ciocalteu
method and flavonoids by AlCl3 method gave higher values
with the MeOHE, where the highest value estimated by spectrophotometer measurement: (3.42 ± 0.85 mg GAE/g of
extract; 18.0 ± 0.75 mg QE/g of extract). Marrubium vulgare
had no activity against tested microorganisms (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, and
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). The β-carotene
method focused on the existence of three times: “rest time,
generation time, and exhaustion time” with which the MeOHE
was characterized by a very high antioxidant activity (63.77%).
The quantitative evaluation of the antiradical activity showed
that the MeOHE is the most active (IC50 = 1.5 μg/ml);
however, quercetin (used as standard) showed approximately
equivalent scavenger activity (IC50 = 0.81 μg/ml), indicating
the presence of compounds effective in the biochemical
16
composition of the plant which have a high capacity in the
reduction of DPPH. These compounds are characterized by a
high polarity and are identified by HPLC in the MeOHE of the
plant; these compounds are called “phenylpropanoids
glycosides”.
Matériel et méthodes
Keywords: Marrubium vulgare – Organic extracts –
Flavonoids – Antimicrobial activity – Antioxidant activity
L’échantillon de la plante de Marrubium vulgare a été rassemblé pendant le mois d’avril 2011 dans la région de Touffana à 52 km de Batna dans le nord-est de l’Algérie. La
plante a été identifiée par M. Hamchi au département de
biologie de la faculté des sciences de Batna, et séchée dans
une salle foncée pour empêcher la photo-oxydation, puis
écrasée en une poudre fine.
Introduction
La résistance aux antibiotiques atteignant le point de crise
dans beaucoup d’hôpitaux autour du monde, il y a des
besoins urgents de compléter le niveau de notre arsenal
d’agents anti-infectieux [6]. De plus, les effets nuisibles du
stress oxydant sur la santé des personnes sont devenus un
problème grave. Les antioxydants synthétiques, tels que
l’hydroxytoluène butylé (BHT), ont été employés couramment comme antioxydants dans l’industrie alimentaire et
peuvent être responsables des dommages du foie et de la
carcinogenèse [8]. Pour cette raison, l’intérêt d’utilisation
des antioxydants et antimicrobiens d’origine naturelle a
considérablement augmenté. Dans diverses plantes médicinales, différentes molécules bioactives, telles que les flavonoïdes, les acides phénoliques, les tanins, les caroténoïdes,
les stérols et les terpénoïdes, ont été identifiées [4].
Marrubium vulgare L. (Lamiaceae), généralement connue
sous le nom « Horehound », riche essentiellement en composés phénoliques, est employée couramment dans la médecine traditionnelle pour guérir certaines maladies [4,10,15].
Marrubium vulgare possède des effets hypoglycémiants et
hypolipidémiants [10] (par une stimulation de sécrétion
d’insuline par les cellules β-pancréatique), vasorelaxant et
antihypertensif [9], anticholinestérase contre l’acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase [14], antioxydant et antimicrobien [15], antispasmodique, anti-inflammatoire, analgésique [15,20]. Il possède les activités tonique, aromatique,
stimulante, expectorante, diaphorétique et diurétique [1].
C’est également un ingrédient des pastilles contre la toux,
par exemple, Ricola® [15]. Il a été très employé dans les
affections hépatiques [1]. Le principe actif principal de cette
plante a été identifié en tant que marrubiine, un diterpène
labdane furanique [20]. D’autres composés sont présents
dans la plante, parmi lesquels on peut citer l’acide caffeoylL-malique, l’actéoside, l’arénarioside, le forsythoside B et le
ballotétroside [16], le vulgarol, le β-sitostérol [1], le lupéol,
l’apigénol et la ladanéine [13,15].
L’objectif principal de notre étude est d’élucider in vitro
l’activité antimicrobienne du Marrubium vulgare (des feuilles et des sommités fleuries) contre quelques bactéries Gram
positives et Gram négatives. Le deuxième but de cette étude
est de déterminer son activité antioxydante au moyen de
deux tests différents : le balayage des radicaux libres de
DPPH (2,2′-diphényl-1-picrylhydrazyl) et la méthode de
blanchiment du β-carotène.
Matériel végétal
Chémicals et réagents
Les solvants suivants ont été employés pour l’extraction :
méthanol, éther de pétrole, dichlorométhane. Solvants utilisés pour la chromatographie préparatoire et l’activité antioxydante : chloroforme, acétate éthylique, n-butanol. Des
standards des acides phénoliques (acide gallique) et des flavonoïdes (quercétine) ont été obtenus à partir de « Sigma
Aldrich ». Le réactif des phénols de Folin-Ciocalteu et le
chlorure d’aluminium (AlCl3) ont été achetés de « Fluka
Chemie ». Les réactifs suivants ont été employés dans les
expériences d’activité antioxydante : tween 60, β-carotène,
acide linoléique (pureté CA 99 %), 2,2′-diphényl-1picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich Chemie). Le
α-tocophérol a été obtenu à partir de l’alcool de laboratoire
pharmaceutique API.
Préparation des extraits organiques
Selon Stanković [19], la poudre sèche broyée est d’abord
mise en contact avec l’éther de pétrole à raison de 100 ml
de solvant pour 10 g de poudre dans un récipient qui est
enrobé par la suite par un papier d’aluminium, afin de préserver l’obscurité, en conservant au maximum les métabolites contre les effets de l’oxydation par les photons. Une agitation manuelle simple a été effectuée au début pour assurer
que toute la surface de la poudre est imprégnée par le solvant, puis une agitation mécanique a été effectuée pour accélérer le processus d’extraction. Après une période d’incubation de 24 heures à température ambiante, le mélange
hétérogène est filtré sur filtre de papier plissé, et le résidu
de l’extraction précédente (retentât) a été repris par 100 ml
de dichlorométhane et laissé reposé (sous une agitation
manuelle + mécanique) pendant 24 heures, le résidu est à
nouveau extrait par 100 ml de méthanol pendant 24 heures
dans les mêmes conditions. À la fin de l’extraction, les
extraits organiques (EEp, EDCM, extrait méthanolique brut
[EMeOH]) sont évaporés au moyen d’un évaporateur rotatif
(Heidolph Rotavapor) aux températures 40, 35 et 50 °C
respectivement.
17
Préparation de l’extrait aqueux
Détermination des flavonoïdes totaux
L’extrait aqueux a été obtenu par la macération agitée pendant 24 heures de 10 g de l’échantillon de poudre en volume
de 100 ml d’eau distillée, la phase aqueuse du macérat a été
alors filtrée sur un papier-filtre et lyophilisée. L’extrait
obtenu a été maintenu dans les tubes stériles et stocké dans
un réfrigérateur à +4 °C [19].
Une quantité de 1 ml de chaque échantillon et de standard
(préparée dans le méthanol) est ajoutée à 1 ml de la solution
d’AlCl3 (2 % dissous au méthanol). Après dix minutes, l’absorbance a été mesurée par rapport au blanc préparé de
réactif au λmax = 430 nm. Les concentrations des flavonoïdes ont été déduites à partir de la gamme de la courbe d’étalonnage établie avec la quercétine (0–35 μg/ml). Les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents de
quercétine par gramme d’extrait (mg EQ/g d’extrait) [3].
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Les quatre extraits ont été analysés en utilisant la CCM en
tant qu’empreinte digitale. Plats du silica-gel (Merck) [60
GF254 de taille 20 × 20 cm], en utilisant : n-butanol/acide
acétique/eau (60:15:25 ; v/v/v) et : chloroforme/méthanol/
eau (65:35:5 ; v/v/v) en tant que systèmes de solvants pour
les extraits polaires, tandis que pour les extraits apolaires en
utilisant l’éther de pétrole/acétate éthylique (80:20 ; v/v) [7].
Trois témoins ont été employés : la quercétine, l’acide
gallique et un alcaloïde : l’atropine (Sigma-Aldrich). La
CCM a été observée après la pulvérisation du réactif : la
vanilline sulfurique. La détection des composés ayant un
balayage d’activité de DPPH est effectuée par pulvérisation
d’une solution méthanolique de DPPH (2 mg/ml), les taches
jaunes ont indiqué la présence des composés actifs. Le rapport frontal (Rf) des taches résultant de la séparation a été
calculé et comparé à ceux des témoins, permettant ainsi
l’identification des divers composés des extraits [7].
Activité antimicrobienne
Des plats d’agar nutritif stériles ont été préparés et incubés à
37 °C pendant 24 heures pour vérifier une éventuelle contamination. Des disques de papier-filtre stériles (Wathman
no 1) de 6 mm de diamètre, stérilisés avant avec l’étuve
(120 °C pendant 15 minutes) sont imbibés par les diverses
solutions (1 g/ml) dissoutes dans le DMSO (diméthylsulfoxyde) pour les extraits organiques. L’activité antibactérienne
in vitro des différents extraits de Marrubium vulgare a été
étudiée par la méthode de diffusion de disque contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, en utilisant la gélose de Mueller-Hinton. Les boîtes
de Pétri ont été incubées à 37 °C pour 24 heures et le diamètre de la zone de l’inhibition mesurée en millimètre [5].
Activité antioxydante
Analyse qualitative par chromatographie liquide
sous haute pression (HPLC)
L’analyse qualitative des flavonoïdes est réalisée par HPLC (VP
Shimadzu Liquid Chromatograph). Pour cela, 20 μl de chaque
extrait ont été injectés sur une colonne de type phase inverse
C18, de dimensions égales à 125 × 4,6 mm. La phase mobile
est constituée de trois éluants : l’eau distillée, le méthanol et
l’acide acétique (50:47:2,5 ; v/v/v). Le gradient d’élution appliqué
est de type isocratique étalé sur dix minutes. Le débit est de 1 ml/
min. La détection a été effectuée par un détecteur UV-Vis à une
longueur d’onde égale à 330 nm [2].
Dosage des polyphénols totaux
Les quatre extraits (200 μl) ont été mélangés à 1 ml de réactif
de Folin-Ciocalteu et à 2 ml d’H2O, et incubés à la température ambiante pendant quatre minutes. Après l’addition de
0,8 ml de bicarbonate de sodium de 7,5 % au mélange, les
polyphénols totaux étaient déterminés après deux heures
d’incubation à la température ambiante. L’absorbance de la
couleur bleue en résultant a été mesurée au λmax = 765 nm
avec un spectrophotomètre de Shimadzu UV-Vis. La quantification a été faite en ce qui concerne la courbe standard de
l’acide gallique. Les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents d’acide gallique (EAG) par gramme d’extrait (mg EAG/g d’extrait) [22].
Test de blanchiment du β-carotène
L’activité antioxydante des quatre extraits du Marrubium vulgare a été mesurée selon le protocole décrit par Kartal et al. [12] avec de légères modifications. L’émulsion de βcarotène/d’acide linoléique a été préparée par la solubilisation de 0,5 mg de β-carotène dans 1 ml de chloroforme, 25 μl
d’acide linoléique et 200 mg de tween 60 ont été ajoutés. Le
chloroforme a été complètement évaporé dans le rotavapor à
40 °C, ensuite 100 ml d’eau oxygénée ont été ajoutés, l’émulsion en résultant a été agitée vigoureusement. Cinq cents
microlitres de solution d’extrait ou d’antioxydant de la référence (α-tocophérol) [solubilisé dans le méthanol] ont été
ajoutés à 2,5 ml de l’émulsion précédente. L’absorbance a
été mesurée à 490 nm avant et après le traitement thermique
avec des intervalles de temps réguliers pendant 48 heures. L’analyse de blanchiment du β-carotène a été calculée comme suit :
AAR = [Abst:48h (sample)/Abst:48h (α-toco)] × 100 %.
Effet radical-balayage de DPPH
Afin d’étudier l’activité antiradicalaire des différents extraits
de feuilles et de sommités fleuries de Marrubium vulgare,
nous avons utilisé la méthode fondée sur le DPPH (1,1diphényl-2-picrylhydrazyl) comme un radical relativement
stable, selon le protocole décrit par Sanchez-Moreno [17].
Brièvement, la solution de DPPH a été préparée par la
18
solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100 ml de méthanol.
Cinquante microlitres des solutions des extraits du Marrubium vulgare ou du standard (quercétine) ont été ajoutés à
1,95 ml de DPPH, les mélanges ont été incubés dans l’obscurité
pendant 30 minutes, et la décoloration comparée au contrôle
négatif contenant seulement la solution de DPPH mesurée à
517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV/visible type Biotech Engineering Management CO. LTD. (UK). L’activité de
radical-balayage de DPPH a été calculée comme suit : %(AA)
= [(A517 control – A517 échantillon)/A517 control] × 100.
Là où le control A517 est l’absorbance de la réaction de
control (contenant tous les réactifs, excepté l’échantillon
d’essai), et l’échantillon A517 est l’absorbance des extraits
ou de la référence.
Analyse statistique
Toutes les mesures expérimentales ont été effectuées en triple et sont exprimées en tant que moyenne d’écart-type ± de
trois analyses (moyen (SE) ± d’écart-type). L’analyse statistique a été exécutée en utilisant l’analyse de la variance à
sens unique (Anova). Si la p-valeur globale s’avérait statistiquement significative (p < 0,05). Toute l’analyse statistique
et l’importance de la corrélation entre les variables ont été
exécutées en utilisant le logiciel (Graph Pad Prism V 5.00).
Résultats et discussion
Criblage phytochimique
Le criblage phytochimique des extraits indique la présence
des polyphénols, des flavonoïdes et des tanins dans les
extraits polaires, des stérols et/ou des terpénoïdes dans l’EEp
et des saponines dans l’extrait aqueux (EAQ).
CCM
La CCM a montré la probabilité de la présence de l’acide
gallique (Rf = 0,80) et de la quercétine (Rf = 0,84) dans
l’EMeOH et l’absence de l’atropine dans tous les extraits,
ce qui peut être expliqué par l’effet que l’atropine n’ait pas
migré dans différents éluants utilisés, ou que l’atropine ait
migré ; cependant, leur révélation nécessite un révélateur
spécifique caractéristique des alcaloïdes comme le réactif
de Dragendorff [7]. Avec la connaissance des auteurs, l’acide
gallique est identifié pour la première fois comme nouveau
composé de Marrubium vulgare.
L’EMeOH a montré l’activité préliminaire antiradicalaire
(tache jaune) après la révélation par une solution méthanolique de DPPH à 2 mg/ml, qui ont indiqué que les composés
antioxydants inclus par l’extrait ont la capacité de réduire le
radical de DPPH.
Analyse qualitative par HPLC
Le chromatogramme de HPLC (Bruker 300 UltraShield™)
(Fig. 1) de l’extrait méthanolique de Marrubium vulgare
peut être commodément divisé en deux parts différentes :
la première de 20,00 à 26,50 minutes est celle où le verbascoside et ses dérivés complexes de sucre s’éluent, tandis que
les flavonoïdes glycosides apparaissent dans la gamme entre
26,51 et 42,50 minutes.
La comparaison des temps de rétention des standards
(Tableau 1) avec ceux enregistrés dans le chromatogramme
(Fig. 1) permet l’identification probable de différents composés dans l’extrait méthanolique de Marrubium vulgare.
Les résultats montrent la présence de l’acide gallique
(14,5 minutes) qui a été identifié pour la première fois
comme nouveau composé des feuilles de Marrubium vulgare, la quercétine (35 minutes) et quatre phénylpropanoïdes glycosides : le forsythoside B (20,5 minutes), le ballotétroside (22 minutes), l’arénarioside (23 minutes) et le
verbascoside (24,5 minutes).
Dosage des polyphénols et des flavonoïdes
Tout le contenu phénolique dans les extraits examinés de la
plante utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu est exprimé en
termes d’équivalent d’acide gallique (l’équation standard de
courbe : y = 0,0115 x ; r2 = 0,9989). Les valeurs obtenues
pour la concentration des phénols totaux sont exprimées
en mg EAG/g d’extrait (Tableau 2). Tout le contenu phénolique dans les extraits examinés s’est étendu de 1,2 à 3,42 mg
EAG/g d’extrait.
La concentration la plus élevée des phénols a été mesurée
dans l’extrait méthanolique et aqueux. Tout le contenu phénolique dans les extraits du Marrubium vulgare dépend du
type d’extrait, c’est-à-dire de la polarité du solvant utilisé
dans l’extraction. La solubilité élevée des phénols dans les
solvants polaires donne la concentration élevée de ces composés dans les extraits obtenus en utilisant les solvants polaires pour l’extraction [19].
La concentration des flavonoïdes dans divers extraits du
Marrubium vulgare L. était déterminée en suivant la
méthode spectrophotométrique avec du chlorure d’aluminium. Le contenu des flavonoïdes a été exprimé en termes
de mg EQ/g d’extrait, l’équation standard de courbe : y =
0,066 x = 0,04 ; r2 = 0,9988 (Tableau 3). La concentration
des flavonoïdes dans les extraits de Marrubium vulgare s’est
échelonnée de 0,70 à 18,0 mg EQ/g d’extrait : l’extrait
méthanolique contenant la concentration de flavonoïde la
plus élevée. La concentration des flavonoïdes dans l’extrait
de méthanol était 18,0 ± 0,75 mg EQ/g d’extrait : la plus
basse concentration de flavonoïdes a été mesurée dans l’EEp
(0,70 ± 0,05 mg EQ/g d’extrait). La concentration des flavonoïdes dans les extraits de la plante dépend de la polarité des
solvants utilisés dans la préparation d’extrait [19]. Le type de
standard utilisé peut également changer les résultats [8].
19
Fig. 1. Chromatogramme de chromatographie liquide sous haute pression d’extrait méthanolique de Marrubium vulgare, visualisé à λ = 330 nm (les pics 4–9 sont des esters de phénylpropanoïdes)
Tableau 1. Temps de rétention des différents composés
standards.
Tableau 3. Contenu total de flavonoïdes dans les extraits
de Marrubium vulgare.
Temps de rétention (min)
Standards
Extraits
Flavonoïdes totauxa
14,5
35
20,5
22
23
24,5
Acide gallique
Quercétine
Forsythoside B
Ballotétroside
Arénarioside
Verbascoside
Éther de pétrole
Dichlorométhane
Méthanol
Eau (EAQ)
0,70 ± 0,05
0,94 ± 0,14
18,0 ± 0,75b
4,34 ± 0,78
a
b
Équivalent quercétine (mg EQ/g d’extrait).
Valeur hautement significative (p < 0,0001).
Activité antimicrobienne
Tableau 2. Contenu phénolique
de Marrubium vulgare.
total
dans
les
extraits
Extraits
Polyphénols totauxa
Éther de pétrole
Dichlorométhane
Méthanol
Eau (EAQ)
1,2 ± 0,52
1,27 ± 0,94
3,42 ± 0,85b
3,07 ± 0,76
a
b
Équivalent acide gallique (mg EAG/g d’extrait).
Valeur significative (p < 0,05).
Les résultats de l’activité antimicrobienne des sommités
fleuries et des feuilles du Marrubium vulgare obtenus sont
négatifs. Aucun extrait n’a eu d’effet contre les bactéries examinées (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli ATCC
25922). Les résultats ont indiqué que plusieurs paramètres
peuvent influer la détermination de l’activité antimicrobienne comme : le type des micro-organismes ciblés, la
méthode d’évaluation de l’activité antimicrobienne, la
concentration, le type de l’extrait et particulièrement la
nature et la structure moléculaire des molécules bioactives
des métabolites secondaires [6].
20
La paroi de Pseudomonas aeruginosa et d’Escherichia coli
(bactéries Gram négatives) est très riche en lipopolysaccharides (LPS) [lipide A, noyau oligosaccharidique et antigène
O], qui empêchent les molécules comme les terpènes hydrophobes d’adhérer à lui. D’ailleurs, ces micro-organismes
sont mobiles, il est probablement possible à ces bactéries
d’être déplacées profondément dans l’agar nutritif de gélose,
et par conséquent d’échapper ainsi à l’action des métabolites
contenus dans les extraits du Marrubium vulgare. La plus
grande résistance du Gram (+) de Staphylococcus aureus
vers les extraits peut être expliquée par la structure de paroi
hétérogène de la bactérie : la présence de l’exopolysaccharide contenant une couche externe (glycocalyxe), la présence de certains composants comme l’acide techoique et
quelques liens entre les divers composants donnent au polymère fortement réticulé de parois une structure tertiaire
inconnue [18].
Test de blanchiment du β-carotène
Les activités inhibitrices de peroxydation des lipides par les
polyphénols et les flavonoïdes ont été évaluées par l’essai du
blanchiment du β-carotène qui est fondé sur la perte de la
couleur jaune de β-carotène due à sa réaction aux radicaux
qui sont constitués par oxydation d’acide linoléique dans
une émulsion. La présence de différents antioxydants peut
gêner l’ampleur du blanchiment du β-carotène en neutralisant le radical libre de linoléate et d’autres radicaux libres
formés dans le système [11].
Cette méthode est employée couramment parce que le
β-carotène montre une activité biologique forte et est un
composé physiologique important [11]. En outre, le
β-carotène est employé comme agent de coloration en boissons, et sa décoloration réduirait nettement la qualité de ces
produits [11]. De ce fait, il est employé dans l’évaluation de
l’activité antioxydante des extraits de Marrubium vulgare.
La cinétique de blanchiment du β-carotène selon la présence
ou l’absence dans les extraits du Marrubium vulgare, de
l’antioxydant standard (α-tocophérol) est montrée dans la
Figure 2.
Comme l’indique la Figure 2, les courbes ont la même
allure, ce qui implique la même interprétation :
– au temps (t0) : la densité optique de tous les extraits, le standard et le contrôle (–), étant presque la même et présentant
un seuil d’absorbance d’environ 2. Cela est expliqué par le
fait qu’à ce moment-là il n’y a aucun RL qui a été formé dans
le milieu réactionnel, par conséquent le β-carotène reste
hautement insaturé, la couleur jaune confère alors une
absorbance maximale, ce temps peut être nommé « temps
de repos » ;
– au temps (t :2h) : l’absorbance commence à diminuer progressivement pour tous les extraits, le standard et le contrôle
(–), ce qui indique sans doute le début de la formation des
RLs dans le milieu réactionnel généré par l’acide linoléique
suite à la rupture des doubles liaisons par le tween 60, on
préfère nommer ce temps « temps de génération » ;
– après ce temps (2h < t ≤ 48h) : l’étude de cinétique de blanchiment du β-carotène montre que celui-ci diminue graduellement avec le temps, pour atteindre un état stationnaire
au bout de 48 heures, étant donné que le nombre de RLs
devient important. Après ce temps-là, il reste constant, ce
qui montre que toutes les doubles liaisons présentes dans le
β-carotène sont dégradées, ce qui s’achève à l’épuisement
irréversible de la coloration jaune par la transformation en
une couleur blanche, c’est donc le blanchiment total du
β-carotène, ce temps est dit « temps d’épuisement ».
Par ailleurs, d’après la Figure 2, on remarque que la
courbe qui correspond au contrôle (–) diminue d’une façon
rapide, car il n’y a aucun antioxydant qui puisse inhiber ou
diminuer l’oxydation du β-carotène, ce qui facilite l’action
des RLs.
Les résultats de blanchiment du β-carotène (Fig. 3) ont
indiqué que l’activité la plus élevée (dans le système de
modèle à l’acide linoléique) a été montrée par l’extrait au
Fig. 2. Cinétique de blanchiment du β-carotène (0,5 mg) à 490 nm des extraits de la partie aérienne du Marrubium vulgare (500 μl) et de l’α-tocophérol. Chaque valeur est la moyenne de trois analyses
21
Effet scavenger du radical DPPH
Fig. 3. Activité antioxydante relative (AAR) des extraits de Marrubium vulgare et de l’α-tocophérol
dans le système acide linoléique/β-carotène
méthanol du Marrubium vulgare (AAR = 63,77 %) et par
l’extrait aqueux (AAR = 56,63 %). L’éther de pétrole et le
dichlorométhane ont présenté des activités inférieures.
Nos résultats sont en accord avec ceux de Pukalskas et al.
[15] qui ont indiqué que le coefficient le plus élevé de l’activité antioxydante du Marrubium vulgare dans le système de
blanchiment du β-carotène est apporté par l’extrait méthanol–eau du marrube. L’analyse statistique montre la présence d’une corrélation linéaire significative entre la teneur
de ces extraits en polyphénols totaux, en flavonoïdes et le
pourcentage d’inhibition de l’oxydation de l’acide linoléique
(r = 0,85 ; r = 0,80, respectivement), ce qui indique la contribution de ces composés qui sont les antioxydants dominants
dans ces extraits (pouvoir antioxydant de la plante).
Ces résultats sont en accord avec les résultats de plusieurs
groupes de recherche, qui ont rapporté une corrélation positive entre tout le contenu phénolique et l’activité antioxydante [15]. L’activité antioxydante dépend de plusieurs facteurs, par exemple : la concentration des extraits, la méthode
d’évaluation, la sensibilité des antioxydants à la température
de l’essai et la nature hydrosoluble ou liposoluble de l’antioxydant [11,15].
L’activité antiradicalaire des différents extraits a été évaluée
par leur activité inhibitrice sur une solution méthanolique
de DPPH, mesurée à 517 nm. Les standards utilisés étaient
la quercétine et l’acide ascorbique (vitamine C). L’activité
antiradicalaire des différents extraits de Marrubium vulgare,
ainsi que les standards, a été illustrée sur la Figure 4.
D’après la Figure 4, on constate que les extraits de Marrubium vulgare possédant une activité antiradicalaire dosedépendante, les IC50 de chacun des différents extraits ont été
déterminés. Selon Kadri et al. [11], une valeur plus faible de
l’IC50 (la concentration du substrat qui cause une inhibition
de 50 % de l’activité de DPPH) indique une activité antioxydante plus élevée.
L’EMeOH a donc présenté l’activité antiradicalaire la plus
élevée (IC50 = 1,5 μg/ml ; APR = 15), en confirmant le résultat du CCM de criblage, suivi par l’EAQ avec une IC50 de
l’ordre de 125 μg/ml et un APR de 0,076 ± 0,90. Par contre,
l’activité antiradicalaire la plus faible a été exprimée par
l’EDCM et l’EEp (IC50 = 500 μg/ml, 720,1 μg/ml et APR
de 0,019 ± 0,22 et 0,012 ± 0,66 respectivement), ce qui
ne présente pas une différence significative de leur activité
(p < 0,05).
Nos résultats sont en accord avec ceux de Pukalskas et al.
[15] qui ont prouvé que l’extrait méthanolique de Marrubium vulgare de Pologne s’est avéré pour montrer l’activité
antioxydante remarquable dans le balayage de radical DPPH
(IC50 = 1,15 μg/ml).
D’après la Figure 4, on remarque aussi que les courbes ont
la même allure qui implique la même interprétation. Plus on
augmente la concentration, plus l’activité antiradicalaire
augmente jusqu’à atteindre un palier. Au-delà de ce maximum, l’activité reste constante.
Nous interprétons ce phénomène par le transfert de(s)
électron(s) célibataire(s) qui sont localisés dans l’orbitale
externe du DPPH, et après avoir atteint une concentration
Fig. 4. Activité antiradicalaire des extraits de Marrubium vulgare, la quercétine et l’acide ascorbique (chaque valeur représente la moyenne de trois essais ± ET)
22
donnée, l’antioxydant va réagir complètement avec le radical, et quand nous augmentons la concentration, l’activité
antioxydante reste constante puisque cela s’accompagne
par la saturation des couches électroniques du radical.
L’activité antiradicalaire de l’EEp (0,012 ± 0,66) pourrait
être expliquée par la présence des terpénoïdes ayant été
révélée auparavant dans les tests préliminaires avec le même
extrait (voir les tests de criblage phytochimique). Plusieurs
auteurs ont rapporté que l’activité antioxydante de Marrubium vulgare est due aux huiles essentielles qui ont une
capacité importante d’agir comme donateurs d’atomes d’hydrogènes ou d’électrons, d’où la transformation réductive de
DPPH • en DPPH-H, et par conséquent la formation de la
coloration jaune était attribuée à la présence de nombreuses
molécules bioactives telles que : les monoterpènes oxygénés,
le mélange de mono- et ses quiterpènes hydrocarbures, βcitronellol, thujones, camphre, β-bisabolène et l’eugénol
[11,14]. Ainsi, Kadri et al. [11] ont mentionné qu’une
concentration de 300 μg/ml de l’hydrodistillat de Marrubium vulgare donne une inhibition de 79,00 ± 3,00 % contre
DPPH.
Par ailleurs, d’après la Figure 4, on constate aussi que
l’EMeOH a un pouvoir antiradicalaire important (APR =
15 ± 0,00) et proche à celui de la quercétine (APR = 16,74
± 0,00), cela ne peut être expliqué que si on se réfère à la
composition biochimique de Marrubium vulgare où on
trouve que l’espèce renferme également des phénylpropanoïdes glycosylés (voir HPLC), qui sont des puissants antioxydants [4]. Les plus importants sont le forsythoside B (4)
le ballotétroside (5), l’arénarioside (7) et l’actéoside (verbascoside ou kusagénine) [8] (Fig. 5) [15,16,21].
Sahpaz et al. [16] ont pu isoler quatre phénylpropanoïdes
à partir de l’extrait méthanolique de Marrubium peregrinum
dont le forsythoside B, le ballotétroside et le verbascoside,
des flavones dont la cosmosiine (apigénine-7-glycoside) et
la ladanéine (5,6-dihydroxy-7,4’-diméthoxyflavone) puis
évaluer leur activité antiradicalaire sur une solution méthanolique de DPPH en utilisant le Trolox comme standard. Ils
ont remarqué que les flavones testées montrent une certaine
activité, mais insuffisante pour qu’une IC50 puisse être établie, en revanche tous les phénylpropanoïdes testés se sont
révélés très actifs [21].
Selon Sahpaz et al. et Wojdylo et al. [16,21], les groupements ortho-diphénoliques des phénylpropanoïdes (Fig. 5)
leur confèrent une activité antioxydante bien supérieure à
celle des flavones. Cela peut être dû à un transfert de radical
entre les deux OH de façon intramoléculaire, qui permet une
forte stabilisation et évite un transfert intermoléculaire [16].
En outre, Marrubium vulgare contient un autre phénylpropanoïde mais cette fois non glycosylé, il s’agit de : l’acide (+)
(E)-caffeoyl-L-malique qui peut participer dans l’activité antiradicalaire de la plante comme illustré sur la Figure 6 [16].
Conclusion
Les résultats de notre étude suggèrent l’importance de l’espèce du Marrubium vulgare d’Algérie pour l’usage dans la
pharmacie et la phytothérapie. Si l’on se fonde sur cette
information, on pourrait conclure que cette plante est l’une
des sources naturelles de substances antioxydantes d’importance élevée. L’analyse qualitative par la CCM et l’HPLC a
montré la présence de l’acide gallique qui a été identifié pour
la première fois comme nouveau composé des feuilles de
Marrubium vulgare. La concentration la plus élevée des
composés phénoliques a été obtenue en utilisant des solvants de polarité croissante. L’extrait méthanolique a donné
la plus grande valeur en composés phénoliques et en flavonoïdes. Le contenu élevé des composés phénoliques et la
corrélation linéaire significative entre les valeurs de la
concentration des composés phénoliques et l’activité antioxydante ont indiqué que ces composés contribuent à l’activité antioxydante. Les résultats obtenus pour l’activité antimicrobienne sont négatifs, ils pourraient être expliqués par
l’influence de plusieurs facteurs : structure des parois des
bactéries, leur mobilité dans l’agar nutritif de la gélose, la
concentration des extraits, la nature et la structure des substances actives dans les extraits, la méthode employée pour
l’évaluation et la matrice biologique (les parties de la plante)
qui font l’objet de l’étude.
Des études plus approfondies in vivo seraient nécessaires
dans les années à venir pour mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules bioactives, leur dose thérapeutique ainsi que leur site d’action au niveau de la cellule. Cela
permettrait de préparer des produits pharmaceutiques de
grand intérêt thérapeutique.
Fig. 5. Structure chimique des phénylpropanoïdes glycosides de Marrubium vulgare et leur activité antioxydante [15,16]
23
Fig. 6. Activité antiradicalaire de l’acide (+) (E)-caffeoyl-L-malique par piégeage du DPPH [16]
Conflit d’intérêt :
5. Choi YM, Noh DO, Cho SY, et al. (2006) Antioxidant and antimicrobial
activities of propolis from several regions of Korea. LWT 39: 756–61
les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêt.
6. Cushnie TPT, Lamb AJ (2011) Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids. Int J Antimicrob Agents 38: 99-107
Références
1. Ahmed B, Masoodi MH, Siddique AH, Khan S (2008) A new monoterpene acid from Marrubium vulgare with potential antihepatotoxic activity. Nat Prod Res 24: 1671–80
2. Athamena S, Chalghem I, Kassah-Laouar A, et al. (2010) Activité antioxydante et antimicrobienne d’extraits de Cuminum cyminum L. Lebanese Sci J 11: 69–81
3. Bahorun T, Gressier B, Trotin F, et al. (1996) Oxygen species scavenging activity of phenolic extract from Hawthorn fresh plant organs and
pharmaceutical preparation. Arznein Forsch/Drug Res 46: 1–6
4. Berrougui H, Maxim I, Cherki M, Khalil A (2006) Marrubium vulgare
extract inhibits human-LDL oxidation and enhances HDL-mediated cholesterol efflux in THP macrophage. Life Sciences 80: 105–12
7. Diallo D, Sanogo R, Yasambou H, et al. (2004) Étude des constituants
des feuilles de Ziziphus mauritiana Lam. (Rhamnaceae), utilisées traditionnellement dans le traitement du diabète au Mali. CR Chimie 7:
1073–80
8. Djeridane A, Yousfi M, Brunel JM, Stocker P (2010) Isolation and characterization of a new steroid derivative as a powerful antioxidant from
Cleome arabica in screening the in vitro antioxidant capacity of 18 Algerian medicinal plants. Food Chem Toxicol 48: 2599–606
9. El-Bardai S, Lyoussi B, Wibo M, Morel N (2004) Comparative study of
the antihypertensive activity of Marrubium vulgare and of the dihydropyridine calcium antagonist amlodipine in spontaneously hypertensive
rat. Clin Experiment Hypertension 26: 465–74
10. Elberry AA, Harraz FM, Ghareib SA, et al. (2011) Methanolic extract of
Marrubium vulgare ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia in
Streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Diabetes Mellit 11: 1877-8
24
11. Kadri A, Zarai A, Békir A, et al. (2011) Chemical composition and
antioxidant activity of Marrubium vulgare L. essential oil from Tunisia.
Afr J Biotechnol 10: 3908–14
12. Kartal N, Sokmen M, Tepe B, et al. (2007) Investigation of the antioxidant properties of Ferula orientalis L. using a suitable extraction procedure. Food Chem 100: 584–9
13. Nawwar MAM, El-Mousallamy AMD, Barakat HH, et al. (1989) Flavonoids lactates from leaves of Marrubium vulgare. Phytochemistry 28:
3201–6
14. Orhan IE, Belhattab R, Senol FS, et al. (2010) Profiling of cholinesterase
inhibitory and antioxidant activities of Artemisia absinthium,
Artemisia herba-alba, Artemisia fragrans, Marrubium vulgare, Marrubium astranicum, Origanum vulgare subsp. glandulossum and essential
oil analysis of two Artemisia species. Ind Crops Prod 32: 566–71
15. Pukalskas A, Venskutonis PR, Salido S, et al. (2012) Isolation,
identification and activity of natural antioxidants from horehound
(Marrubium vulgare L.) cultivated in Lithuania. Food Chem 130:
695–701
16. Sahpaz S, Garbacki N, Tits M, Bailleul F (2002) Isolation and pharmacological activity of phenylpropanoïds esters from Marrubium vulgare. J
Ethnopharmacol 79: 389–92
17. Sanchez-Moreno C (2002) Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods and biological systems. Int J Food Sci Technol
8: 121–37
18. Sharif S, Singh M, Kim SJ, Schaefer J (2009) Staphylococcus aureus
peptidoglycan tertiary structure from carbon-13 spin diffusion. J Am
Chem Soc 131: 7023–30
19. Stanković MS (2011) Total phenolic content, flavonoïd concentration
and antioxidant activity of Marrubium peregrinum L. extracts. Kragujevac J Sci 33: 63–72
20. Stulzer HK, Tagliari MP, Zampirolo JA, et al. (2006) Antioedematogenic
effect of marrubiin obtained from Marrubium vulgare. J Ethnopharmacol
108: 379–84
21. Wojdylo A, Oszmianski J, Czemerys R (2007) Antioxidant activity and
phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem 105: 940–9
22. Wong SP, Leong LP, William Koh JH (2006) Antioxidant activities of
extracts of selected plants. Food Chem 99: 775–83