CHIM-F317 : Compléments de chimie analytique Méthode de

Université Libre de Bruxelles
Ecole Interfacultaire de Bioingénieurs
Année académique 2010-2011
CHIM-F317 : Compléments de chimie analytique
Méthode de dosage des protéines dans le lait et autres
produits alimentaires
Baudoux Lewis
Marotte Milan
Polak Nicolas
Tarelkin Yegor
Van Leeckwyck Robin
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Introduction
Après la première manipulation, qui consistait en un dosage complexométrique du fer(III), la
deuxième manipulation était un peu plus inhabituelle. Une liste de manipulations possibles nous
était présentée, et chaque groupe d’étudiants devait choisir parmi cette liste celle qu’il désirait
effectuer. Nous avons donc opté pour un dosage de protéines dans plusieurs produits laitiers.
Comme aucun mode opératoire nous était fourni, la première partie de cette deuxième manipulation
fut la recherche du mode opératoire. Après quelques consultations sur le net, notre choix se porta
sur la méthode de Kjeldahl. Les assistants approuvèrent la méthode, et le dispositif requis pour la
manipulation fut mis en place.
Le dosage des protéines par cette méthode se fait en une série d’étapes. Tout d’abord, une certaine
masse de la substance dont on veut connaître le contenu en protéines est pesée et chauffée en
présence d’acide sulfurique et du sulfate de potassium. Ensuite, l’ajout progressif d’une base forte
fait virer le pH, et l’ammonium sous phase gazeuse qui s’échappe de la solution est refroidi et
récupéré sous phase liquide dans une solution d’acide borique qui sera titré. A l’aide de tableaux de
conversion, il est possible de connaître la quantité initiale en protéines.
Cependant, cette méthode connaît quelques inconvénients. La manipulation requiert une certaine
habitude avant d’obtenir des rendements de récupération d’ammonium élevés. De plus, le montage
du dispositif dans lequel a lieu la distillation est conséquent et donc peu maniable. Enfin, cette
méthode nécessite des acides forts et des bases fortes, ainsi que des températures élevées, ce qui
n’est pas sans risque.
Matériel et méthode
Plusieurs méthodes existent pour doser les protéines au sein d'un échantillon mais la méthode
utilisée au laboratoire sera celle de Kjeldahl (1). Il faut savoir que les protéines sont composées
d'acides aminés et que ces acides aminés sont eux-mêmes composés d'atomes. Ces atomes sont
surtout du carbone, de l'oxygène, de l'hydrogène et de l'azote (il y en a d'autres mais en plus petites
proportions). On peut définir la proportion de chaque atome au sein de chaque acide aminé et la
proportion de chaque acide aminé au sein d'une certaine protéine. De cette manière, en connaissant
le type de protéine présente dans le lait (ou autre produit organique), la proportion de tel ou tel
atome sera connue dans l'ensemble des protéines. Par souci de facilité, l'atome qui sera dosé dans
cette méthode est l'azote. Elle va être précisément décrite par la suite ce qui permettra d'énoncer
plus clairement le matériel adéquat. Cette méthode peut se diviser en trois parties : une première de
minéralisation, une seconde de distillation et enfin une troisième de dosage, par titrage, de la
solution.
1° Minéralisation de l'azote organique
Cette partie permet de transformer l'azote organique en azote minéral. A l'aide d'une pipette, une
certaine quantité de lait (ou autre produit organique) sera prélevée et ajoutée dans un ballon de
distillation (voir figure 1). On y ajoute ensuite 25ml d'acide sulfurique à haute concentration (H2SO4
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,18M). La réaction sera de transformer l'azote sous forme amine (NH2) en azote sous forme
d'ammonium (NH4+) car le milieu est fortement acide. Le milieu acide permet à l'azote de rester sous
forme d'ammonium (donc soluble) et non sous forme ammoniaque (NH3), qui s'échapperait sous
forme de gaz hors du ballon. A cette solution sera ajouté du sulfate de potassium (K2SO4). Ce réactif
permet une élévation de température conséquente durant la phase de chauffage. La proportion de
sulfate de potassium à ajouter est d'un gramme par ml d'acide sulfurique. Cette solution est ensuite
chauffée (entre une heure et demi et deux heures) par un bec bunzen pour permettre à tout l'azote
de se minéraliser. Il faudra veiller à ce que la solution reste bien liquide pendant le chauffage car
certains échantillons (comme le pâté) sont fort secs, l'azote minéralisé colle au paroi et le rendement
est alors moins bon. La solution, noire, deviendra plus translucide (tout en gardant cette coloration
noire-brune).
Figure 1 : Ballon de distillation (2)
2° Distillation
Une fois tout l'azote minéralisé, le ballon de distillation est ajouté au montage de distillation. Le
principe est alors bien simple. Une photo aurait du être ajoutée au rapport mais un incident nous
obligea à ranger le matériel plus tôt que prévu sans avoir pu faire de photos. La figure 2 illustre le
montage permettant la distillation. Il faut dans un premier temps veiller à ce que le montage soit
étanche pour optimiser le rendement (le gaz produit ne doit pas s'échapper). Du côté gauche, un
ballon rempli d'eau sera maintenu en ébullition pendant toute l'opération. L'eau évaporée poussera
alors le gaz formé dans le ballon du milieu vers le côté droit et non vers le haut de la colonne
centrale. Encore une fois, cela permet de récolter tout l'azote libéré sous forme d'ammoniaque.
3
Figure 2 : Montage de distillation (3)
Au centre se trouve le ballon dans lequel se trouve l'azote minéralisé. Tout en haut de cette colonne
centrale, nous pouvons observer un réservoir contenant de l'hydroxyde de sodium (NaOH) fort
concentré (dilué à 50%, donc 500g par litre d'eau). Une fois l'eau entré en ébullition, ce petit
réservoir peut être ouvert au goutte à goutte. Le NaOH tombe alors dans la solution d'acide
sulfurique. Le pH de cette solution va peu à peu augmenter. Cette augmentation de pH permet la
transformation du NH4+ en NH3 gazeux qui va se diriger vers la droite du montage. On ajoute la NaOH
goutte à goutte car la réaction acide fort - base forte est fort réactive. Il faut le rajouter en excès pour
être sûr de transformer tout l'ammonium en ammoniaque. Une précaution devra être prise. En effet,
il faut veiller à laisser un fond de NaOH dans le réservoir car si celui-ci se vide, le montage n'est plus
étanche et le NH3 peut s'échapper par ce petit trou.
A droite du montage se trouve un erlenmeyer contenant une solution d'acide borique à 4% (donc
40g par litre d'eau). Cet acide est donc présent en excès. Le conduit menant le gaz dans l'erlenmeyer
est à double paroi, de l'eau passant entre la première et la deuxième paroi pour refroidir le gaz dans
ce conduit et donc permettre sa condensation. L'erlenmeyer ne contient que 50ml de cette solution
ainsi que quelque gouttes d'indicateur coloré (judicieusement choisi en fonction de sa zone de
virage). Le tube conduisant le NH3 plonge dans cet erlenmeyer et une réaction se passe :
NH3 + H3BO3 --> NH4+ + H2BO3Le bout doit bien plonger dans la solution sous peine de perdre du NH3 dans l'air ambiant. Cette
équation permet de lier le nombre de moles d'ammoniaque au nombre de moles d'acide borique.
Petit à petit, l'indicateur coloré va virer vers une autre couleur. Le pouvoir tampon de l'acide borique
n'est pas très fort.
3° Titrage
Une fois la distillation terminée, un titrage est fait au chlorure d'hydrogène (HCl, 0,1M). On ajoute
alors un certain volume de cette solution. Ce volume correspond au volume d'acide nécessaire pour
que la solution reprenne sa couleur initiale.
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Par calcul stoechiométrique, on peut dire que le nombre de moles ajouté pour que la solution
reprenne sa coloration initiale est égal au nombre de moles de NH3 piégé dans cette solution. Ce
nombre de moles de NH3 étant lui-même égal au nombre de moles de NH2 présent dans la solution
initiale.
Le matériel requis est donc le suivant :







pipette
erlenmeyer
matras
montage de distillation
bec bunzen
burette
balance
Résultats
Une première manipulation a été faite avec de l'urée (CO(NH2)2) afin de nous habituer à cette
méthode (qui peut s'avérer dangereuse). La quantité d'urée prélevée est de 15ml provenant d'une
solution où 4g d'urée a été diluée dans un litre d'eau. La masse molaire de l'urée est de
60,0553g/mol. En utilisant les formules : n(mole)=m(kg)/M(g/mol), on obtient un nombre de moles
d'urée de 0,00199 moles. Le volume d'HCl (0,1M) nécessaire pour le titrage est de 22,9ml ce qui, par
la formule C(mol/L)=n(mole)/V(L), donne un nombre de mole de NH3 équivalent à 0,00229mole. On
sait que deux moles de NH3 proviennent d'une mole d'urée. On obtient donc, d'après notre méthode,
que le nombre initial de moles d'urée est de (0,00229/2)=0,001145moles.
En comparant les deux résultats, nous obtenons un rendement de 57,54% (0,001145/0,00199), ce
qui n'est vraiment pas mauvais pour une première expérimentation. Il est à noter que l'urée est bien
plus facile à décomposer en NH4+ que d'extraire l'azote contenu dans les protéines de produits
alimentaires.
Des analyses ont ensuite été faites sur du lait normal et du lait de soja. Leur contenu en protéines est
respectivement de 33g par litre et de 30g par litre.
Produit
Lait
Lait
Lait de soja
Lait de soja
Quantité
prélevée (ml)
10
10
10
10
Volume titrant
(ml)
6,4
12,9
12,6
13,8
Facteur
de Quantité de
conversion
protéine (g/L)
6,38
5,7
6,38
11,5
6,25
11,0
6,25
12,1
Rendement
(%)
17,7
34,8
36,66
40,3
Pour obtenir le nombre de moles de NH3 titré, nous utilisons la même formule que précédemment,
en multipliant le volume par la concentration d'HCl (0,1M). Pour obtenir la quantité d'azote contenu
initialement, on multiplie le nombre de moles par la masse molaire (qui est de 14g/mol). Ceci nous
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donne la quantité d'azote dans l'échantillon initiale. On multiplie cette valeur par 100 pour obtenir la
quantité d'azote dans un litre de lait et non 10ml.
Des moyennes ont été faites et il s'avère que la quantité d'azote au sein d'une protéine avoisine les
16% (d'où le facteur 6,25, inverse de 16%). (4)
Conclusion
Après plusieurs expériences, force est de constater que les rendements de nos expériences sont très
médiocres. En effet, il suffit de comparer le rendement d'extraction de l'urée à celui d'extraction des
produits alimentaires pour s'apercevoir que les rendements sont plus faibles. Il est donc important
de préciser qu’il n’est pas aisé d’extraire l’azote contenu dans les protéines de produits alimentaires.
La partie de la méthode qui n'est pas entièrement sous notre contrôle est celle de minéralisation. Il
n'est pas facile de voir si tout l'azote a été minéralisé. Malgré ces faibles rendements, il est à noter
qu'au fur et à mesure de l'avancée des expériences, nos rendements sont croissants. Certes, le
dernier rendement obtenu (de 40%) n'est pas un grand rendement, mais cela signifie que la
manipulation est de mieux en mieux maîtrisée par les étudiants. Il est donc certain que si un
malheureux accident n'avait pas interrompu notre manipulation, un rendement supérieur à 50%
n'aurait pas été impossible.
Il semble aussi important de signaler que cette méthode n'est pas la seule pour quantifier les
protéines au sein d'un échantillon. Car sans l'étiquette nous disant la réelle quantité de protéine, il
nous aurait été impossible de connaître le rendement de nos manipulations. En laboratoire, les
scientifiques doivent veiller à ce que chacune des trois étapes soit la plus optimale possible. Une
minéralisation complète doit être faite. Le montage de distillation doit être parfaitement étanche et
tout le NH4+ contenu dans le ballon doit être transformé en NH3 gazeux. Le titrage doit être des plus
précis possible. Une dernière chose est importante. Le facteur qui permet de convertir la quantité
d'azote à la quantité de protéine n'est qu'une approximation. L'idéal aurait été de qualifier chaque
protéine au sein de l'échantillon, de les quantifier et ainsi obtenir une quantité de protéinique la plus
proche de la réalité.
Néanmoins, cette expérience nous a permis de travailler presqu’entièrement par nous-mêmes. Une
seule question était posée, à nous d'y répondre en trouvant un protocole d'expérience et de
l'appliquer. La méthode de Kjeldahl nous est maintenant familière et le travail de chercheur a déjà
moins de secrets pour nous.
Discussion
Les sources d’erreurs potentielles étaient nombreuses et diverses. Le montage de distillation était
très difficile à manipuler et pouvait causer beaucoup de fuites ce qui faussait tout à fait notre
mesure. Il nous est aussi arrivé de vider le contenu de NaOH dans le ballon créant ainsi un trou par
lequel le NH3 pouvait s'échapper. Un peu en aval de l’expérience, on a vu également que tout NH4+
n’était pas transformé facilement en NH3 et qu’il fallait chauffer le mélange réactionnel tout en
prenant le risque que le récipient explose.
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L'accident, même si peu intéressant au niveau de ce rapport, nous a appris qu'il fallait être très
prudent vis-à-vis des manipulations faites en laboratoire. Le débit d'eau a été augmenté au sein du
tuyau de refroidissement, il s'est donc détaché du montage et a aspergé le ballon contenant l'acide
sulfurique. Pour éviter de salir notre table de travail, l'un de nous a essayé de récupérer ce tuyau.
Malheureusement, le contact entre l'eau froide et le ballon chaud a créé un choc thermique. Le
ballon s'est brisé et une partie de son contenu s’est répandu sur la main de l'étudiant, causant de
graves brûlures. Cet accident aurait pu être évité mais il semble que le ballon de distillation ait été
fragilisé lors d'une manipulation précédente. Nous ne savions pas que même si le ballon ne
présentait aucune marque d'usure, il fallait le jeter.
Bibliographie
(1) http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9thode_de_Kjeldahl
(2) http://www.verrerie-laboratoire.com/Ballons_Kjeldahl.asp
(2) http://witraze-katani.com/kjeldahl-distillation-assembly&page=6
(4) Mariotti F, Tomé D, Mirand PP. Converting nitrogen into protein--beyond 6.25 and Jones’ factors.
Crit Rev Food Sci Nutr. 2008, 48, 177-84.
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