DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES

Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
Administration des Laboratoires
MET-LFSAL-003
DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES
BRUTES
(Aliments des animaux – crème glacée (non accrédité))
Version
Date d’application
10
2012-06-27
Rédaction par :
Marianne Aubry, Responsable technique
Révision par :
Responsable qualité LFSAL ; 2012-06-27
Autorisation de publication par :
Patrick Genot Manager LFSAL ; 2012-06-28
Gestion et localisation de la
version valide :
Responsable qualité LFSAL; Serveur du LFSAL
Destinataires :
Collaborateurs de la section Chimie humide
Mots clefs :
Aliments des animaux, Protéines, PBT, qualité
substantielle, crème glacée
LAB23 I-MET003–Protéine brute-v09 05/08/2011
DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES
Aperçu des modifications*
Révision
par/date*
EVRARD M /
Motif de la révision
Partie du
texte/portée de
la révision
Adaptation à la méthode Kjeltec
Tout
Adaptation du programme Kjeldhal 1 et nv template
Tout
Ajout de remarque et correction de la valeur de
recouvrement du contrôle
Veille normative
Mise à jour de la méthode
Adaptation suite à publication d’un nouveau dossier de
validation
§10 et 11
15/06/2006
Aubry
/03/02/2009
Aubry /
03/03/2010
MA/
04/08/2011
MA/
04/08/2011
*
L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge.
LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 2/8
DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES
TABLE DES MATIERES
1
OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2
CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................. 4
3
DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS ........................................................................ 4
4
DEFINITIONS ET ABREVIATIONS ................................................................................... 4
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 4
6
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ................................................................. 4
7
CONSIGNES DE SECURITE ET MESURES SPECIFIQUES ........................................... 5
8
REACTIFS.......................................................................................................................... 5
9
APPAREILS ....................................................................................................................... 5
10 METHODE.......................................................................................................................... 5
10.1
PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON ................................................................................ 5
10.2
ETAPE D’ANALYSES..................................................................................................... 6
10.2.1 Prise d’essai ......................................................................................................... 6
10.2.2 Minéralisation ....................................................................................................... 6
10.2.3 Distillation et ti ration t .......................................................................................... 7
11 CONTROLE DE QUALITE ................................................................................................ 7
11.1
11.2
11.3
ERE
CONTROLE DE 1 LIGNE ............................................................................................ 7
EME
EME
CONTROLE DE 2 ET 3 LIGNE................................................................................. 7
CONTROLES SUPPLEMENTAIRE .................................................................................... 7
12 CALCUL ET RAPPORTAGE............................................................................................. 8
13 REFERENCE AUX PROCEDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES
OU LISTES Y AFFERENTS ...................................................................................................... 8
13.1
13.2
13.3
PROCEDURES............................................................................................................. 8
LISTE ......................................................................................................................... 8
FORMULAIRES ............................................................................................................ 8
LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 3/8
DETERMINATION DE LA TENEUR EN PROTEINES BRUTES
1
Objectif
Décrire la méthode de dosage de l’Azote selon la méthode de Kjeldahl en vue du calcul
conventionnel de la teneur en protéines brutes dans les aliments pour animaux.
2
Champ d’application
Cette procédure s’applique à toutes les analyses d’azote pour lesquelles il n’y a pas
nécessité de distinguer entre azote protéique et azote non protéique.
3
Documents légaux et normatifs
Méthode dérivées de :
Norme/Fil conducteur
Clauses
NBN EN ISO 5983-1 :2005 et -2 :2009 – Aliments des animaux Détermination en azote et calcul de la teneur en protéines brutes
ISO 1871 : 2009 - Ligne directrice pour la détermination de l’azote
par méthode Kjedhal
4
Norme
Définitions et abréviations
Terme
Pas d’application
Origine de la définition
Abréviation
PBT
5
Dérivé de la norme
Origine
-
Définition
Signification
Protéines Brutes
Principe
Minéralisation de la matière organique par l’acide sulfurique en présence d’un catalyseur,
alcalinisation des produits de la réaction, distillation et titrage de l’ammoniac libéré.
L’azote Kjeldahl de l’échantillon est d’abord transformé en ammoniaque par digestion acide
dans un batch de minéralisation. L’addition d’une base forte permet de libérer l’ammoniac qui
est alors entraîné par de la vapeur d’eau puis ensuite piégé dans une solution d’acide
borique. L’ammoniaque est alors dosé par une solution d’acide sulfurique de titre connu. Le
point d’équivalence est repéré par le changement de coloration d’un indicateur.
La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de
la détermination de la teneur en azote par le facteur 6,25 dans le cas des aliments pour
animaux et 6,38 pour les produits laitiers.
6
Caractéristiques de performances
Voir données du dossier de validation
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7
-
8
Consignes de sécurité et mesures spécifiques
Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et
dans le log book de l'appareil.
Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte.
Réactifs
-
Eau déminéralisée (R144)
-
Sulfate de sodium anhydre (R025)
-
Acide borique 1 % avec indicateur (R442)
-
Acide sulfurique concentré (H2SO4, 95 %, (R001)
-
Acide sulfurique 0.5 N (R122)
-
Hydroxyde de sodium 40 % (R460)
-
Hydroxyde de sodium 32 % (R431)
-
Catalyseur : Kjeltabs Cx R007 (5.0 g K2SO4 + 0.5g CuSO4.5H2O )
-
Saccharose (R006)
-
Anti-mousse siliconé (R414)
-
Bleu de bromothymol (R074)
-
Tryptophane à minimum 98.5 %(R461)
-
Sulfate d’ammonium, pureté > 99.5 % (R030)
9
Appareils
-
Kjeltec 2400 FOSS : unité de distillation et de titration munie d’un passeur automatique
-
Balance analytique à 10 g
-
Unité de minéralisation FOSS avec programmateur
-
Tubes de minéralisation de 250 ml et portoirs
-
Distributeur d’acide sulfurique réglé sur 12 ml
-4
10 Méthode
10.1 Préparation de l’échantillon
L’échantillon est préparé suivant les directives de la procédure « LAB23 P011 Préparation
des échantillons »
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10.2 Etape d’analyses
10.2.1 PRISE D’ESSAI
Remarque : Prévoir un tube vide en début de rack pour effectuer les rinçages
Dans des tubes à minéralisation, introduire une prise d’essai d’environ exactement 1g (pour
les échantillons à haute teneur en protéines (>30% prendre une prise d’essai de 0,5g), deux
pastilles de catalyseur Kjeltabs et 12,5 ml d’acide sulfurique concentré (R001) en
commençant par le blanc (réactif sans échantillon).
Placer les tubes dans un rack et compléter celui-ci à l’aide de tubes à minéralisation vide.
10.2.2 MINÉRALISATION
Allumer le bloc de minéralisation et l’ascenseur associé
Vérifier la validité des solutions du scrubber :
Le flacon de gauche est remplit à son niveau minimum d’eau distillée ; le flacon de droite
est rempli avec un mélange 50/50 NaOH 32% (R431) / Eau distillée sans dépasser le
niveau maximum ; quelques gouttes de bleu de bromothymol (R074) (bleu) indiquent que
le pH de la solution est basique (remplacer la solution si l’indicateur a viré au jaune).
Retirer le support de protection des calottes d’aspiration.
Placer le réflecteur sur la partie avant du rack et déposer celui-ci sur les bras latéraux de
l’ascenseur au-dessus du bloc de minéralisation.
Vérifier à l’aide du bouton poussoir de l’ascenseur que les tubes rentrent sans frottement
dans les encoches prévues à cet effet. Relever les tubes.
Vérifier le programme sur le contrôleur :
N° programme
Temps
Température
1
1 min
30°C
2
1h10
420°C (Montée en T°)
3
1h00
420°C (Attaque)
4
0h00
10°C (mode STOP)
Mettre la minéralisation en route en actionnant la fonction RUN du contrôleur. Le scrubber se
mettra automatiquement en fonctionnement.
La minéralisation terminée, laissé reposer au moins 45 minutes avant de distiller.
Replacer le support de protection des calottes d’aspiration.
Remarque
-
S’il y a des particules noires dans le minéralisateur ou sur les parois du tube, stopper la
minéralisation, laisser refroidir et avec une pissette d’eau distillée, faire tomber les
particules dans l’acide puis redémarrer la distillation en déduisant le temps écoulé. Si
ces particules sont constatées la minéralisation terminée, reminéraliser le ou les tubes
en question.
-
S’il y a présence d’éclaboussure ou de mousse, utiliser 3 à 4 gouttes d’anti-mousse
(R414) ou diminuer la prise d’essai.
-
S’il y a présence de cristallisation dans le tube, cela est du à une perte d’acide due à un
système d’extraction trop performant ; réduire alors le débit de l’extracteur (scrubber)
jusqu’à disparition des fumées blanches
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-
Lorsqu’un échantillon a une structure grasse, il peut-être nécessaire d’effectuer un
dégraissage avant d’extraire l’azote afin de faciliter la phase de minéralisation de celuici.
10.2.3 DISTILLATION ET TI RATION T
Pour l’utilisation correcte du kjeltec, se référer à sa SOP et au manuel de l’utilisateur.
Vérifier les niveaux des réactifs et des waste avant de débuter l’essai.
Insérer le ou les racks de minéralisation dans le passeur (attention à la position A, B ou C).
Encoder les données relatives aux échantillons dans la séquence d’analyse en utilisant le
programme " Kjeldalh 1 " :
- 30 ml d’acide borique
- 60 ml d’eau
- 50 ml de soude
- mode « délai »
- temps : 2 sec
- distillation : « volume »
- vidange : « oui »
Effectuer des rinçages manuels en utilisant le tube vide, et laisser agir la "vapeur active" 10
minutes environ afin que le système se mette à température.
Remarque
Si le système indique à l’écran la mention " générateur de vapeur trop faible ", introduire
maximum 0,5 g de sulfate de sodium (R025) dans le bidon de réserve d’eau
déminéralisée.
Terminer chaque séquence par 3 rinçages automatiques.
11 Contrôle de qualité
11.1 Contrôle de 1
ère
ligne
L’analyse est suivie par une carte de contrôle de type Shewhart. Tout écart de la carte doit
être signalé au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera des actions
correctives à prendre.
11.2 Contrôle de 2
ème
et 3
ème
ligne
Ces contrôles sont exécutés suivant les directives de la procédure LAB23 P020 Gestion des
controle qualité
11.3 Contrôles supplémentaires
Minéralisation
Au minimum six fois par an en cas d’écart par rapport à la carte de contrôle, il est nécessaire
de vérifier la performance de minéralisation, pour cela, analyser 0,5g de tryptophane
(préalablement séché à environ 103°C pendant une heure) dans les même conditions que
l’analyse décrite ci-dessus. Le résultat en azote doit correspondre à 13,51 % 0,30 %. En
cas d’écart observé, le signaler au responsable technique ou à son remplaçant qui décidera
des actions correctives à prendre.
LAB 23 I-MET 003 Détermination de la PBT v10 - 2012-06-27 - 7/8
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Distillation
En cas de soupçon d’anomalie concernant la partie distillation (sans la minéralisation) de
l’analyse, une vérification peut-être effectuée en dosant dans les conditions de l’analyse, une
quantité connue de sulfate d’ammonium. Le rendement en azote doit-être compris entre 99 et
101 %
12 Calcul et rapportage
H 2SO4 + 2NH 3
(NH 4 ) 2 SO4
La teneur en azote ammoniacal se calcul comme suit (Calcul effectuer par l’appareil)
N (%)
(V1 V0 ) * T * 0,014 *100
m
où
V0 : volume d’acide versé pour le blanc
V1 : volume d’acide versé pour l’échantillon
T : titre de l’acide sulfurique (0,5 Mol/l)
m : prise d’essai de l’échantillon
Dans le cas d’un échantillon préséché, tenir compte de la perte d’humidité
N (%)telquel
N*
msec
mhum
où
msec : masse de l’échantillon après séchage
Mhum : masse de l’échantillon avant séchage
La teneur en protéines brutes du produit est obtenue en multipliant la valeur obtenue lors de
la détermination de la teneur en azote par le facteur conventionnel 6,25 pour les aliments
pour animaux et (6,38 pour les produits laitiers).
L’incertitude de mesure sur l’analyse est reprise dans la liste L010-01 : Liste des incertitudes
de mesure section Chimie humide –Aliment
13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou
listes y afférents
13.1 Procédures
LAB23 P018 : Création et suivi des cartes de contrôle qualité
LAB23 P020 : Gestion des contrôles qualité
LAB23 P011 Préparation des échantillons
13.2 Liste
LAB L010-01 : Liste des incertitudes de mesure section Chimie humide - Aliment
13.3 Formulaires
LAB23 F543-CH01 Feuille de travail chimie humide
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