Standardisation de la vitamine D

STANDARDISATION DE LA VITAMINE D :
LA FIN DU PROBLÈME ?
DR PATRICIA PANAÏA-FERRARI, CHU DE NICE
FORUM IMMUNOANALYSE SIEMENS
PARIS, 30 MAI 2013
ETAT DES LIEUX…
Il est largement connu que la 25-OHD est un analyte “difficile“,
à cause de :
sa nature hydrophobe
ses différentes formes moléculaires,
sa liaison étroite à sa protéine porteuse, la vitamin D-binding
protein (VDBP)
Et l’absence de matériel de référence, et/ou d’une méthode
de référence qui permettrait aux autres techniques de s’y
comparer…
LA VITAMINE D EST HAUTEMENT
HYDROPHOBE
Oxygène
Hydrogène
Carbone
CHOLÉCALCIFÉROL…
ET ERGOCALCIFÉROL !
LA VITAMINE D EST ENCAPSULÉE ET
ÉTROITEMENT LIÉE A LA VDBP
25(OH)D3
Sillon hydrophobe
OH en C25
* Interprétation artistique basée sur Verboven et al. Nat Struc Biol. 2002;9(2):131-6
MAIS QU’EST-CE QUE LE 3-ÉPI-25(OH)D3 ?
Jusqu’à 61 % de la VitD totale
de 100 % des enfants < 1 an
(moyenne = 11,1–27,8 %)a, b, c
Jusqu’à 20 % de la VitD totale de Jusqu’à 17 % de la VitD totale
100 % des enfants < 18 ans
de 100 % des adultes
(moyenne = 6,2 %)b
(moyenne = 3,5 %)b, c, d
3-épi-25(OH) vitamine D3
a. Singh, et al. J Clin Endo Metab. 2006;91:3005-61.
b. Van den Ouweland, et al. Clin chem. 2011;57(11):1618-9.
c. Stepman, et al. Clin ChemLab Med. 2011; 49(2):253-6.
d. Lensmeyer, et al. J Clin Endo Metab. 2012;97(1):163-8.
UN PEU D’HISTOIRE…
4 types de méthodes sont couramment utilisées pour mesurer la
25-OHD. 2 sont immunologiques…
La pionnière, en 1970, par compétition dans laquelle la VDBP
sert d’agent de capture après extraction par un solvant
organique…
Haddad JG, Chyu KJ. Competitive protein-binding radioassay for 25hydroxycholecalciferol. J Clin Endocrinol Metab 1971;33:554–7.
En 1985, par compétition dans laquelle un anticorps
spécifique anti 25-OHD sert d’agent de capture (RIA, puis EIA et
CLIA)
UN PEU D’HISTOIRE…
…2 sont des méthodes physiques :
 L’HPLC (high pressure liquid chromatography)
 En 2004, la LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass
spectrometry)
2 procédures de mesure en LC-MS/MS ont été reconnues
récemment comme technique de référence par le Joint
Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM)
 Tai SS, Bedner M, Phinney KW. Development of a candidate reference
measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitamin D3 and 25hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry.
Anal Chem 2010;82:1942– 8.
 Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate reference
measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin
D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrome- try.
Clin Chem 2011;57:441–8.
LA RMP…
Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate reference
measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by
using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Clin Chem 2011;57:441–8.
MAIS… AVANTAGES ET
INCONVÉNIENTS
Les techniques automatisées qui ont forcément abandonné la
phase d’extraction par solvant organique ou la précipitation des
protéines pour libérer la 25 OH D de la VDBP sont :
 Largement utilisées (LIAISON…)
 Techniquement faciles
Mais
Plus sensibles aux variations de concentration de la VDBP…
Plus sensibles à l’effet matrice
Réactions croisées avec les métabolites ?
• Le 3-épi-25-OHD3 ou la 24,25-(OH)2D (> 12 nmol/l !)
MAIS… AVANTAGES ET
INCONVÉNIENTS
Heijboer A. et al, Clinical Chem 58:3,543-548 (2012)
MAIS… AVANTAGES ET
INCONVÉNIENTS
DiaSorin LIAISON Vitamine D Totale
Equimolarité et réactions croisées du test
ADVIA Centaur® Vitamin D Total (VitD)
MAIS… AVANTAGES ET
INCONVÉNIENTS
Les techniques physiques qui ont une phase d’extraction,
peuvent :
 Etre semi ou complètement automatisées
 Séparer 25 OH D2 et 25 OH D3
Mais
Équipement et équipe hyper spécialisés…
Techniquement plus longues
Réaction croisée avec le 3-épi-25-OHD3 sauf si étape
préalable… mais encore plus long et plus lourd
!
Résultats des DEQAS 404 et 405
(405 = 404 + 3-épi-25OHD3)
Source : DEQAS REVIEW 2012
Vitamin D External Quality Assessment Scheme (DEQAS).
Chromatogramme de la VD et analogues
Shah et al. Chemistry Central Journal 2012, 6:112
ENFIN…
• Les habitudes de prescription sont très différentes d’un
continent à l’autre, d’un pays à l’autre :
• Aux Etats-Unis, seule la 25 OH VD 2 est prescrite
• Alors qu'en Allemagne, c’est uniquement de la 25 OH VD3
• Et en France, on a les 2 !
• Donc que faut-il doser et comment ?
LE NIST…
LE NIST…
• Le National Institutes of Health Office of Dietary Supplements
(ODS) et le Department of Commerce National Institute of
Standards and Technology (NIST) annonce la disponibilité d’un
standard de référence pour le dosage de la vitamine D, le
SRM 972 et le SRM 2972
• 4 pools de sérums humains (niveaux 1 à 4) avec des taux
variables de 25(OH)D
• Le SRM 972 certifie des valeurs pour la 25(OH)D2, la 25(OH)D3
et le 3-épi-25(OH)D3
LE SRM 972…
• Niveau 1 : sérum humain “normal”, non dénaturé
• Niveau 2 : obtenu en diluant le Niveau 1 avec… du sérum de
cheval pour obtenir une concentration basse en 25(OH)D
• Niveau 3 : sérum humain “normal”, surchargé avec de la 25OH D2
• Et le Niveau 4 : sérum humain “normal”, surchargé avec du 3épi-25-hydroxyvitamine D3
LE SRM 2972… LE CALIBRANT
Validation of two candidate reference measurement procedures based on liquid chromatography-tandem mass
spectrometry for separate measurement of 25- hydroxyvitamin D and D in human serum.
3
2
An VANDERROOST ,Master of Industrial Pharmacy
Promoter: Prof. Dr. L. Thienpont
LE SRM 972
Validation of two candidate reference measurement procedures based on liquid chromatography-tandem mass
spectrometry for separate measurement of 25- hydroxyvitamin D and D in human serum.
3
2
An VANDERROOST ,Master of Industrial Pharmacy
Promoter: Prof. Dr. L. Thienpont
LE SRM 972… OUPS !
• 3 sur 4 SRM 972 sont, soit surchargés en substances exogènes, soit
dilués avec du sérum équin, donc non utilisables comme standards
de référence par la plupart des techniques immunologiques
automatisées :
• Effet matrice…
• Pas de dosage du 3-épi-25-OH D3 pour la plupart…
• Nivaux de valeurs… ?
=> ce n’est pas un vrai étalon au regard des critères de l’OMS
MAIS AUSSI…
2 procédures de mesure en LC-MS/MS ont été reconnues
récemment comme technique de référence par le Joint
Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM)
 Tai SS, Bedner M, Phinney KW. Development of a candidate reference
measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitamin D3
and 25-hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid
chromatography-tandem mass spectrometry.
Anal Chem 2010;82:1942– 8.
 Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate
reference measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3
and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid
chromatography-tandem mass spectrometry.
Clin Chem 2011;57:441–8.
MAIS… LE VDSP ARRIVE !
Le Vitamin D Standardization Program (VDSP) novembre 2010 :
•Sous l’égide de l’US Office of Dietary Supplements, du National Institutes of Health
(NIH) en collaboration avec les US Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le
National Center for Environmental Health (NCEH), l’US National Institute of Standards
and Technology (NIST) et la Belgian Laboratory for Analytical Chemistry, Faculty of
Pharmaceutical Sciences, Ghent university
•11502 Federal Register/Vol. 76, No. 41/Wednesday, March 2, 2011/Notices
•Sont inclus dans cette enquête : le Canada, l’Australie, les USA, le
Mexique, l’Allemagne, l’Irlande, la Corée du Sud et le Royaume-Uni
•Les sociétés DiaSorin, IDS et des LC-MS/MS
•Le CAP (College of American Pathologist) et le DEQAS
•LA RMP = isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass
spectrometry (L. Thienpont, Clin Chem 2011;57:441–8)
MAIS… LE VDSP ARRIVE !
• Standardiser le dosage de la 25(OH)D à partir d’enquêtes de
santé publique en utilisant la nouvelle technique de référence
développée par le NIST et l’Université de Gand et évaluer les
différences obtenues
• Associer à ces enquêtes les fabricants de réactifs, les
cliniciens et les chercheurs
• Promouvoir la standardisation et le dosage des nouveaux
métabolites pour évaluer le statut en vitamine D
• Et donner la possibilité d’utiliser ces nouvelles valeurs de
référence pour la prise en charge des patients et les
programmes de santé publique
LE VDSP
2 étapes : calibration et validation/certification
• étape 1: 40 sera avec des valeurs établies
• Vérification de la corrélation et de la précision de la technique et
ajustement de la calibration si nécessaire
• étape 2 : la calibration établie est vérifiée par l’envoi de 10
échantillons de sérum en aveugle tous les 3 mois
• La comparaison de méthode et l’estimation du biais sont étudiées
selon les procédures décrites dans le CLSI EP9-A2 "Method
Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples."
• Le laboratoire est standardisé si le biais observé est de +/-5,0 % et
l’imprécision ≤10,0 %, après les 4 campagnes
• 15 participants
Des premiers résultats
• Evaluation of Vitamin D Standardization Program protocols for standardizing
serum 25-hydroxyvitamin D data: a case study of the program's potential
for national nutrition and health surveys.
Cashman et all, Am J Clin Nutr 2013 Jun;97(6):1235-42.
• The VDSP reference system and protocols were applied to ELISA-based
serum 25(OH)D data from the representative NANS sample (n = 1118).
• RESULTS:
• Year-round prevalence rates for serum 25(OH)D concentrations <30, <40, and <50
nmol/L were 6.5%, 21.9%, and 40.0%, respectively, via original ELISA measurements
and 11.4%, 25.3%, and 43.7%, respectively, when VDSP protocols were applied.
• Differences in estimates at <30- and <40-nmol/L thresholds, but not at the <50-nmol/L
threshold, were significant (P < 0.05).
• A reanalysis of all serums by using LC-tandem MS confirmed prevalence estimates
as 11.2%, 27.2%, and 45.0%, respectively.
• Prevalences of serum 25(OH)D concentrations >125 nmol/L were 1.2%, 0.3%, and
0.6% by means of ELISA, VDSP protocols, and LC-tandem MS, respectively.
Du nouveau avec le DEQAS…
• 1 200 participants dans 52 pays (en janvier 2013)
• A compter d’avril 2013 :
• Les valeurs de chaque échantillon sont obtenues après mesure
avec la NIST RPM
• En plus du résultat ‘Total 25-OHD’ (25-OHD3 + 25-OHD2) chaque
participant reçoit les valeurs du NIST pour chaque métabolite
séparément 25-OHD3, 25-OHD2 et 3-épi-25-OHD3
• Les échantillons sont des sera natifs non dénaturés et sans
surcharge afin de ne pas « léser » les méthodes automatisées
Messages clés
• La dispersion relevée entre les fabricants peut être due aux différences
dans la façon dont les systèmes des fabricants dosent la vitamine D,
tels que les différents procédés utilisés pour libérer la vitamine D de sa
protéine de transport ainsi que les interférences hétérophiles
• Puisqu’il n’existe pas de matériel reconnu au niveau international
comme un matériel de référence, des biais au niveau des pentes
peuvent être observés selon les différents fabricants et méthodes
• Le matériel du NIST n’est pas un "standard" et les utilisateurs de LCMS/MS peuvent s’y être standardisés de manière différente
• Le VDSP est une étape importante pour tenter d’harmoniser les
résultats de vitamine D quelque soit les fabricants et les méthodes
EN CONCLUSION
Un nouveau standard, une nouvelle technique de référence
mais :
•Doit on doser le 3-épi-25 OH D3 ?
• De 3 à 5 %, voire 50 %
• Importance en pédiatrie et chez l’adulte ?
• Rôle physiologique ?
•Nouvelles valeurs de référence ?
•Nouvelles pratiques thérapeutiques ?
Principales caractéristiques du test
ADVIA Centaur® Vitamin D Total (VitD)
• Dosage « total » (D2 + D3) et équimolaire
• Utilisation d’un Ac monoclonal « maison » anti-25(OH)D
• Dosage par compétition en 18 mn
• Sensibilité fonctionnelle à 3,33 ng/ml
• Standardisé sur une LC/MS/MS américaine, indépendante
• Corrélé à la RIA et au LIAISON (DiaSorin)
• Réajustement de la standardisation opéré en septembre 2012
• Impliqué dans le Vitamin D Standardization Program (VDSP) mené
par le CDC
Principales caractéristiques du test
ADVIA Centaur® Vitamin D Total (VitD)
Type d’échantillons
Sérum, plasma (héparine, EDTA)
Prise d’essai échantillon
20 µl
Domaine de mesure
3,7 – 150 ng/ml
Limite du blanc (LdB)
1,60 ng/ml
Sensibilité fonctionnelle
3,33 ng/ml
Durée du test
18 mn
Stabilité à bord
28 jours / 100 tests
Fréquence de calibration en 2 points
28 jours
Conditionnement
100 / 5 x 100 tests
Format du test
ADVIA Centaur® Vitamin D Total (VitD)
4,5 mn
2,75 min
6,5 mn
4,0 mn
20 µl d’échantillon +
200 µl d’agent de
relargage
Lavage
PMPαFITC
EA
+
C22 VD
25(OH) vitamine D2
25(OH) vitamine D3
C22 VD
Fl
Acide/Base
Résultat
DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D
RÉSULTATS DU DEQAS, AVRIL 2012
DEQAS April 2012
-
25OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups
90.0
25-Hydroxyvitamin D
nmol/L
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
Sample 411
Sample 412
Sample 413
Abbott (n=51)
60.3
29.2
49.4
Sample 414 (excluded)
Sample 415
56.9
DiaSorin Liaison (n=366)
58.3
25.2
47.3
55.8
DiaSorin RIA (n=24)
58.8
27.7
51.7
58.7
IDS auto EIA (n=95)
64.4
30.0
52.3
60.3
IDS EIA (n=118)
63.7
29.4
52.2
59.5
IDS iSYS (n=139)
72.1
28.4
60.7
63.8
IDS RIA (n=11)
69.2
34.8
60.7
69.4
Roche Total (n=81)
67.3
26.5
56.4
56.6
Siemens (n=57)
46.3
20.5
35.7
43.3
HPLC (n=30)
66.3
25.7
57.2
62.6
LC-MS (n=134)
67.1
27.1
56.8
63.7
ALTM (n=1119)
62.9
27.0
52.0
58.6
DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D
RÉSULTATS DU DEQAS, OCTOBRE 2012
DEQAS October 2012
-
25OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups
100.0
25-Hydroxyvitamin D
nmol/L
120.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
Sample 421
Sample 422
Sample 423
Sample 424
Sample 425
Abbott Architect (n=73)
52.2
33.6
77.3
45.3
44.7
DiaSorin Liaison (n=340)
50.0
32.9
72.5
43.0
44.1
DiaSorin RIA (n=18)
52.9
37.9
76.1
45.7
49.2
IDS auto EIA (n=61)
57.8
38.9
80.7
50.7
50.7
IDS EIA (n=97)
56.2
38.7
78.9
49.9
49.5
IDS iSYS (n=145)
63.5
38.4
95.9
52.1
49.2
IDS RIA (n=8)
70.0
44.2
99.2
56.8
71.1
Roche Total (n=110)
56.1
35.0
83.4
46.0
46.8
Siemens (n=55)
51.9
37.9
79.2
48.3
41.6
HPLC (n=28)
59.7
38.9
87.7
50.3
50.8
LC-MS/MS (n=141)
59.9
39.4
89.8
49.0
49.1
ALTM (n=1086)
55.4
36.2
81.2
47.1
46.9
DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D
RÉSULTATS DU DEQAS, JANVIER 2013
DEQAS January 2013
-
25OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups
100.0
25-Hydroxyvitamin D
nmol/L
120.0
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
Sample 426
Sample 427
Sample 428
Sample 429
Sample 430
Abbott Architect (n=75)
32.3
70.2
51.1
57.6
28.7
DiaSorin Liaison (n=332)
29.0
62.4
45.9
54.7
31.8
DiaSorin RIA (n=17)
34.1
73.0
54.5
56.3
35.9
IDS Auto EIA (n=58)
36.8
72.8
54.4
63.8
39.2
IDS EIA (n=83)
37.2
70.9
53.9
62.7
39.4
IDS iSYS (n=136)
32.2
82.7
55.0
66.4
33.8
IDS RIA (n=8)
40.3
88.0
66.5
72.8
36.3
Roche Total (n=117)
27.6
82.4
55.5
52.1
29.1
Siemens (n=56)
35.6
67.2
52.6
57.5
50.1
HPLC (n=30)
36.2
82.9
57.0
61.7
38.8
LC-MS/MS (n=139)
35.4
80.4
55.3
60.5
43.9
ALTM 9n=1064)
32.1
72.5
51.8
58.5
35.1
Evaluating the ADVIA Centaur Vitamin D Total
Assay Traceable to the 25(OH)Vitamin D RMP*
Study Design:
200 remnant serum samples collected from Hôpital Saint Roch,
Nice, France in March 2013. Samples contained DiaSorin LIAISON
values
Samples were sent to Siemens Healthcare Diagnostics (Tarrytown,
New York, USA) for measurement on ADVIA Centaur Vitamin D
Total assay with the current standardization and the traceability to
the 25(OH)vitamin D Reference Method Procedure (RMP)*
*Traceable to the ID-LC/MS/MS Reference Method Procedure (RMP). The ID-LC/MS/MS is traceable to the NIST SRM 2972
This assay is in development and not available for sale.
Sempos CT, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 32–40
Thienpont L, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 41–49
Comparison of Current Standardization and 25(OH)Vitamin
D RMP* Traceability Versus DiaSorin LIAISON
R=0.94
R=0.92
*This assay is in development and not available for sale.
25(OH)Vitamin D RMP*
Non-Linear Standardization Decreases Values at
Low & High Ends
*This assay is in development and not available for sale.
ADVIA Centaur Vitamin D Total
Traceable to 25(OH)vitamin D RMP
ADVIA Centaur Vitamin D Total
Traceable to 25(OH)Vitamin D RMP
R=0.96
*Traceable to the ID-LC/MS/MS Reference Method
Procedure (RMP). The ID-LC/MS/MS is traceable to
the NIST SRM 2972
*This assay is in development and not available for
sale.
Sempos CT, et al. Scandinavian Journal of Clinical &
Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 32–40
ID-LC/MS/MS 25(OH)vitamin D RMP (NIST SRM 2972)
Thienpont L, et al. Scandinavian Journal of Clinical &
Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 41–49
Merci de votre attention !