TP9 PURIFICATION DU LYSOZYME

TP9 PURIFICATION DU LYSOZYME
Intérêt et stratégie de purification
Le lysozyme (mucopeptide N-acétylmuramyl hydrolase; EC 3.2.1.17), dont le nom usuel
recommandé est la muramidase, catalyse l'hydrolyse des liaisons p1-4 entre l'acide N-acétylmuramique
et les résidus de N-acétylglucosamine présents dans les mucopeptides (peptidoglycanes) des parois
bactériennes. Cette hydrolyse de la couche rigide de la paroi provoque la lyse des cellules en milieu
hypotonique.
Il est devenu un réactif courant au laboratoire de biologie moléculaire pour lyser les cellules
bactériennes dont on souhaite extraire l'ADN. Le lysozyme commercialisé est obtenu industriellement à
partir du blanc d’œuf.
Le lysozyme représente 7 à 8 % des protéines du blanc d’œuf. Son pHi, égal à 11, est nettement
supérieur à celui des autres protéines du blanc d’œuf, l'ovalbumine notamment. Une purification par
échange d'ions peut donner un résultat satisfaisant: c'est ce que l'on se propose de vérifier.
L'échangeur d'ions utilisé est la carboxyméthyl-cellulose (CM-cellulose), échangeur faible de
cations.
Le premier temps de ta séparation chromatographique est l'adsorption par interactions ioniques
du lysozyme encore chargé positivement à pH 10, pH non dénaturant.
Les autres protéines, non fixées parce que chargées négativement ou insuffisamment chargées
positivement sont éliminées par lavages.
Dans un second temps, la désorption du lysozyme fixé est réalisée par utilisation d'un tampon de
force ionique élevée: les ions Na+ de l'éluant vont se substituer par compétition au lysozyme fixé qui sera
élue.
Le suivi de la purification
La concentration d'activité catalytique est déterminée en mesurant au cours du temps la
diminution de la turbidité (mesurée par l'absorbance à 450 nm) , consécutive à la lyse, d'une suspension
de paroi bactérienne.
Une unité de lysosyme sera définie dans ce TP, comme la quantité d'enzyme qui provoque une
diminution de 0,001 unité d'absorbance à 450 nm, par minute, à pH 6,2 , à la température de 25°C, dans
les conditions opératoires du protocole fourni, et en utilisant comme substrat une suspension de paroi de
Micrococcus lysodeikticus.
Les protéines seront dosées par la méthode de Foli-Lowry.
Enrichissement et rendement de purification seront déterminés localiser les pertes d'enzyme au
cours des différentes étapes.
1. ORGANIGRAMME DE LA PURIFICATION
Étape 1 : Adsorption de l'enzyme cible
A
10mL de fraction FO (blanc d’œuf dilué en Tp10 et filtré)+ 1g de CM cellulose agitation - repos
15 mn - centrifugation
surnageant = fraction F1
Lavages
L1
culot + 20 mLdeTp10 agitation - repos 10 mn - centrifugation
surnageant = fraction F2
L2
culot + 20 mL de Tp10 agitation - repos 10 mn - centrifugation
surnageant = fraction F3
L3
culot + 10 mL de Tp 10 agitation - repos 10 mn - centrifugation
surnageant = fraction F4
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Étape 2 : Désorption de l'enzyme cible
D1
culot + 10 mL de Tp10-NaCl agitation - repos 5 mn - centrifugation
surnageant = fraction F5
D2
culot + 10 mL de Tp10-NaCI agitation - repos 5 mn - centrifugation
surnageant = fraction F6 (récupération et régénération de la CM cellulose)
2. REACTIFS
Tp10
tampon glycine-NaOH pH 10; 0,1 mol/L
2L
Tp10-NaCI
Tp10 +NaCI 0,5 mol/L
1L
ne pas confondre les 2 tampons sinon la purification se soldera par un échec !
Tp 6,2
tampon phosphate pH 6,2; 0,1 mol/l
2L
Micrococcus
suspension de paroi Micrococcus lysodeikticus
500mL
Solution
cuproalcaline
de Folin-Lowry
A: carbonate de Na 20 g/L dans la soude à 0,1 mol/L
B: solution cuivrique (1 g/L) dans le tartrate double de sodium potassium 2g/L
Réactif de Folin dilué au 1/2 (consulter FDS)
SAB
sérum albumine bovine à 0,2 mg/mL
CM-cellulose
100mL
20g
Solution étalon de lysozyme à 0.2 mg/mL gamme de 4 à 20 µg/mL
50mL
3. Protocole
3.1. Préparation de la fraction F0 (en partie déjà réalisée)
Casser un œuf et récupérer dans un bêcher le blanc bien séparé du jaune. Le diluer en Tp10
jusqu'à un volume final de 200 mL. Homogénéiser doucement en évitant le plus possible l'introduction
d'air. Filtrer la solution obtenue sur laine de verre ou sur gaze (solution appelée BOP dilué)
Préparer 20 mL de dilution au 1/4 en Tp10 du filtrat obtenu : cette dilution constitue la fraction F0.
Conserver par sécurité le reste du filtrat dans la glace.)
3.2. Purification et son suivi
** Réaliser les différentes étapes indiquées dans l'organigramme. Les agitations seront effectuées
soigneusement par rotations manuelles ou/et à l'aide d'un agitateur de verre. Les centrifugations seront
réalisées à 1 500 g (3000 rpm) pendant 5 minutes à 4 °C.
** Pour chacune des fractions, déterminer le volume (par mesure ou par évaluation) , la concentration en
protéines et l'activité catalytique volumique. (Conserver un aliquot des fractions F0, F1, F2, F5, dans la
glace, en tube à hémolyse, pour un contrôle ultérieur de purification par SDS PAGE , placer au
congélateur en fin de TP)
3.3. Détermination de l'activité catalytique volumique
A 25 °C en cuve de spectrophotomètre :
2,9 mL de Micrococcus préincubé 5 minutes environ à température de mesure + 0,1 mL de
préparation enzymatique (éventuellement diluée en Tp 6,2)
Recouvrir de parafilm, homogénéiser rapidement par retournements, et placer dans le
spectrophotomètre dont le zéro optique aura auparavant été réglé (une fois en début de manipulation)
sur de l'eau déminéralisée.
Mesurer la diminution du trouble (absorbance à 450 nm) du milieu réactionnel toutes les 10
secondes pendant 1 minute. (Effectuer toutes les mesures sur le même spectrophotomètre). Imprimer
une ou deux courbes caractéristiques sinon se contenter de relever les ΔA/min.
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Remarque 1: La détermination des activités catalytiques volumiques dans les différentes fraction peut être "lourde"
par méthode cinétique selon le nombre de spectre-photomètres disponibles. II est possible de procéder par
méthode "cinétique non linéaire en temps fixé" après détermination préalable des temps de mesure (exemple 30
sec et 1 min 30).
Remarque 2 : il est inutile de travailler stérilement cependant la pipette a usage unique utilisée pour préleva la
suspension de paroi de Micrococcus (voire la cuve de milieu réactionnel) pourront être jetés dans l'eau de Javel.
Les dilutions conseillées, compte tenu des résultats prévisibles, sont indiquées à titre indicatif dans le
tableau ci-dessous; elles seront effectuées en Tp6,2, dans un tube à hémolyse.
Fraction
Dilution
conseillée
F0
F1
F2
F3
F4
F5
F6
1/10
Non
Non
Non
Non
1/5
1/2
3.4. Dosage des protéines
Mode opératoire :
Dans un tube à essais, introduire :
– x mL de solution protéique étalon ou de prise d'essai
– (1-x) mL d'eau physiologique
– 5 mL de solution cuproalcaline
Agiter. Attendre 5 minutes
- Ajouter 0,5 mL de réactif de Folin au 1/2
Agiter longuement au « vortex », rapidement après chaque ajout (Le réactif de Folin étant visqueux, le
mélange est difficile)
Attendre 30 minutes.
Lire l'absorbance à 700 nm contre un blanc-réactifs.
Gamme d'étalonnage :
Réaliser une gamme régulière de 0 à 200 µg de protéines par tube à l'aide de la solution de SAB à 0,2
mg/mL. Tracer la courbe A700nm = f (µg de protéines par tube).
Dosage des protéines : dans les différentes fractions, il sera réalisé dans les mêmes conditions que la
gamme.
Les prises d'essai à utiliser sont indiquées à titre indicatif dans le tableau ci-dessous.
Fraction
F0
F1
F2
F3
F4
F5
F6
prise d'essai conseillée en µL 20
20 100 200 300 500 1000
4. Exploitation des résultats
4.1. Présentation des résultats
Présenter tous les résultats sous forme d'un grand tableau clair (en mode paysage) dans lequel doivent
figurer pour chaque fraction :
- le volume de la fraction en mL
- le dosage des protéines :
* prise d'essai en µL
* absorbance obtenue
* quantité de protéine par tube de dosage, en mg
* concentration en mg/mL de fraction
* la quantité totale de protéines par fraction en mg
- la détermination de l'activité volumique :
* dilution effectuée
* variation d'abs. en millième d'unité d'absorbance par minute
* activité en unités/mL de fraction
* nombre d'unités total de lysozyme par fraction (activité totale)
- l'activité spécifique en unités de lysozyme/mg de protéines X
Indiquer, en annexe de ce tableau, le mode de calcul de l'activité catalytiaue volumique, le mode de
détermination de la concentration en protéines et le mode de calcul de l'activité spécifique (avec un
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exemple d'application numérique).
4.2. Analyse de la purification
Calculer le taux d'enrichissement et le rendement de purification
– pour F5 par rapport à F0
– pour F6 par rapport à F0
Peut on regrouper les fractions F5, F6? Quelle sera l'influence sur le taux d'enrichissement et le
rendement ?
Retrouve-t-on dans l'ensemble des étapes de lavage et de désorption la totalité des protéines et de
l'enzyme mises en contact avec la C.M.Cellulose? Quel est alors le rendement de la
chromatographie ? La perte d'enzyme lors des lavages est-elle importante ? La quantifier en
pourcentage.
Dans un but d'amélioration ou de simplification de la manipulation, est-il raisonnable de supprimer ou de
rajouter une étape de lavage ou de désorption?
5. COMPLEMENTS
5.1. Aspects techniques et organisation
Le nombre important de centrifugations nécessite de prévoir une organisation horaire rigoureuse de
l'utilisation de la (des) centrifugeuse(s).
5.2. Variantes et prolongements possibles
** L'enzyme cristallise en 3 à 4 jours à 4°C dans une solution à pH 10,5 avec une concentration en NaCI
égale à 0,3 mol/L, ce qui constitue une étape de purification supplémentaire.
** L'homogénéité de l'enzyme purifié peut être contrôlée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en
présence de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS-PAGE).
** L'activité Lysozyme peut être comparée à celles d'une gamme de solutions étalonnées, de lysozyme
de BOP, pur, 6 fois cristallisé. Les résultats pourront alors être exprimés en µg de lysozyme par fraction
ou par mg de protéines.
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