(Microsoft PowerPoint - Fiches bact. version 2.ppt [Mode de

Détection de Ralstonia solanacearum
dans l’environnement et études
épidémiologiques
Anne-Claire Le Roux-Nio
1,2
[email protected]
Emilie Huchet1,2
FN3PT, 4343-45 rue de Naples, 75008 Paris, France
[email protected]
Objectifs
Ralstonia solanacearum est l’agent responsable de la pourriture brune sur pomme de terre et du flétrissement bactérien sur
plus de 250 espèces végétales. A côté de sa large gamme d’hôtes, cette bactérie, classée sur la liste des parasites de
quarantaine en Europe, présente une très grande diversité génétique et un fort pouvoir d’adaptation. Afin d’éviter son
introduction et sa dissémination dans l’environnement, il est nécessaire d’avoir des outils de caractérisation et de détection
performants ainsi que de bonnes connaissances de la biologie et de l’épidémiologie de cet agent pathogène.
Mise au point et optimisation des méthodes de détection (CASDAR 7124, 2008-2011)
Les outils et méthodes utilisées doivent être sensibles, spécifiques et reproductibles ;
Une évaluation des réactifs sérologiques et moléculaires a été menée dans le cadre du projet CASDAR 7124 ;
Des méthodes de détection de R. solanacearum au sein de différentes matrices ont également été évaluées et optimisées.
Evaluation de réactifs
Seuils de détection des méthodes dans les matrices
Spécificité des sérums
Performances des amorces
complexes
Y2-OLI1
98
100
88
Sur Eau :
100
96
94
88
88
80
Méthodes testées
Efficacité
Isolement
sur SMSA
100%
1,5.10
60
IF
CTAB
Easy DNA
Dneasy Kit
Kit
E + PCR
Concordance (%)
80
40
fliCR-fliCF
759-760
4
1,5.10
6
1,5.10
5
1,5.10
4
1,5.10
5
1,5.10
3
1,5.10
3
20
60
67%
0
-
-
-
-
-
40
Sur Plante :
20
RS1F-RS1R
Z2-OLI1
0
564
296
456
Souches de Rs
PRI
Sérums
7445
7454
Seuil de détection
Spécificité
Souches autres
Sensibilité
Amorces
IF
100%
8.10
67%
Les réactifs sérologiques présentent une très bonne spécificité en IF.
Les amorces Z2-OLI1, RS1F-RS1R et Y2-OLI1 constituent de bons outils
pour la détection par PCR des souches européennes de R. solanacearum.
Méthodes testées
Efficacité
-
CTAB
3
8.10
3
8.10
2
Easy DNA
Kit
8.10
Dneasy Kit
2
-
QIamp
E + PCR
8.10
3
8.10
3
8.10
8.10
2
8.10
2
-
1
La bio PCR (E+PCR) est une méthode sensible pour la
détection de RS dans l’eau et les plantes.
Evaluation du risque lié à l’arrosage de pomme de terre par une eau contaminée
Essais conduits en conditions contrôlées (serre S2) dans du terreau stérilisé à la vapeur.
Arrosages (1 à 3) de plantes de pomme de terre par 100 ml d’une eau artificiellement contaminée ; le 1er arrosage contaminant est fait
au stade émergence et les suivants à 15 jours d’intervalle.
% de plantes saines et malades par modalité
2 concentrations bactériennes : 1.104 et 1.106 cfu/Litre.
1.106 cfu/L
IF
40 plantes
PCR
0
100%
0
12,5
12,5
12,5
15
80%
60%
1à3
arrosages
87,5
87,5
72,5
40%
20%
Récolte pied par pied
et notation
Préparation de
macérats
Analyses
0%
I
II
Des concentrations bactériennes de l’ordre de
cfu/L d’eau sont contaminantes et ce dès
un arrosage. Seule 1 plante a donné une descendance infectée par la bactérie après arrosage
avec une eau contaminée à 1.104 cfu/Litre.
80 % des tubercules fils infectés présentaient des symptômes. Les autres étaient
apparemment sains mais ont été détectés positifs (contaminations latentes).
Aucune différence significative de rendement n’a été observée sur la récolte. La bactérie a
impacté la descendance en qualité mais pas en quantité dans ces conditions expérimentales.
III
1.104 cfu/L
1.106
100%
0
0
0
2,5
0
100
97,5
100
80%
60%
40%
20%
0%
I
II
Récolte « saine »
III
Récolte malade
Récolte détectée malade
Perspectives
Détection de R. solanacearum dans les boues et autres déchets verts ;
Evaluation des outils PCR temps réel pour quantifier l’inoculum ;
Evaluation du risque lié à l’arrosage avec une eau contaminée en utilisant du sol naturel et une fréquence d’arrosage de 1/semaine ;
Travaux de recherche sur les techniques de traitements des eaux.
Septembre 2012
INRA, UMR 1349 IGEPP,F 35653 Le Rheu, France - équipe « Résistance et Adaptation »