Zoomsur les programmes bactéries - Bretagne
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Recherche Zoom sur les programmes bacté NOUS Détection des bactéries de quarantaine : des outils de plus en plus performants POURSUIVONS DANS CE NUMÉRO LA PRÉSENTATION DES ACTIONS DE RECHERCHE RÉALISÉES PAR LA Contexte Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus sont des bactéries pathogènes sur pomme de terre, respectivement responsables de la pourriture brune et de la pourriture annulaire. Ces deux bactéries sont classées dans la liste des parasites de quarantaine. Comme la tolérance vis-à-vis de ces organismes est nulle, il est nécessaire d’éviter leur introduction, notamment via les échanges internationaux, et leur dissémination sur le territoire. En l’absence de méthodes directes de lutte, la prévention repose essentiellement sur des méthodes prophylactiques dont notamment la détection précoce de la bactérie dans les différents milieux susceptibles de l’héberger (plantes, tubercules, eau, sol…). Ces dernières années ont montré la persistance d’un risque important en Europe et justifient de maintenir un effort conséquent de dépistage pour protéger les exploitations. Contenu Un programme de recherche sur ces maladies a démarré en 1995 suite aux différents cas de pourriture brune découverts en Europe et est conduit par Anne-Claire Le Roux-Nio, ingénieur d’études à la FNPPPT. La détection précoce de la bactérie dans les différents milieux nécessite la possession de réactifs sensibles, spécifiques et facilement utilisables en routine. L’Immunofluorescence étant la méthode officielle reconnue pour la détection des bactéries de quarantaine sur les lots de pomme de terre, le premier objectif de ce travail a consisté à produire des réactifs sérologiques performants pour les ana- Symptômes de flétrissement et de pourriture annulaire causés par Clavibacter michiganensis sepedonicus. FNPPPT ET LES lyses. En effet, les réactifs commerciaux disponibles à l’époque étaient relativement peu spécifiques, conduisant à de nombreuses réactions croisées nécessitant des confirmations par une 2e technique, comme l’indexage sur aubergine ou tomate, ce qui demandait près d’un mois de délai et entraînait une immobilisation prolongée des lots. Dans un deuxième temps, les techniques moléculaires telles que la PCR étant de plus en plus utilisées en phytopathologie, nous avons décidé de développer ce type d’outil pour la détection des deux bactéries de quarantaine.Tout un travail de méthodologie a été réalisé afin d’arriver à un test PCR spécifique et sensible qui a ensuite été transféré dans les laboratoires des EPR. La mise en place de cette technique PCR a permis de raccourcir considérablement les délais des tests de confirmation (2-3 jours) et d’améliorer leurs spécificité et sensibilité. Symptômes de flétrissement et de pourriture brune causés par Ralstonia solanacearum. 16 3 EPR. Recherche éries Observation de cellules bactériennes fluorescentes après application du test d’immunofluorescence (technique recommandée par l’Union Européenne). Les principaux résultats obtenus sur le développement et l’optimisation des outils de détection (moléculaires et sérologiques) sont présentés dans le tableau ci-dessous : Principaux résultats obtenus sur le développement et l’optimisation des outils de détection (moléculaire et sérologique) Optimisation recherchée Intérêts pour la filière Exemples de résultats Sensibilité - détection précoce de la contamination (bactérie à l’état latent) permettant d’éviter une dissémination importante du pathogène - étude de l’intérêt d’une phase d’enrichissement pour détecter Ralstonia solanacearum - comparaison et sélection d’amorces - amélioration de l’extraction de l’ADN (facteur 100) Spécificité - éviter les réactions croisées (faux positifs) - obtention et évaluation de sérums performants (Rs et Cms) - PCR : définition d’amorces plus spécifiques des souches présentes en Europe Rapidité de la technique - raccourcissement des délais des tests de confirmation - simplification des analyses - mise en place d’une confirmation rapide par PCR (2 jours au lieu d’un mois pour l’indexage) - mise au point d’une PCR multiplexe permettant de détecter en même temps les 2 bactéries Applications sur divers milieux - meilleure connaissance des sources d’inoculum potentielles - mise en place d’une technique d’extraction à partir des sols - optimisation de la détection des bactéries dans l’eau et les adventices par les techniques d’isolement et PCR. L’ensemble de ces programmes est conduit en étroite collaboration avec le Service de la Protection des Végétaux et l’INRA de Rennes et Toulouse, dans le cadre d’un réseau d’échanges et de partenariat notamment pour toutes les études portant sur les systèmes aquatiques ou les sols. Tous ces travaux de mise en place, d’optimisation et de comparaison des techniques de détection permettent de disposer en France d’outils performants et de pouvoir garantir des résultats fiables à la filière. Une veille technologique est constamment assurée afin de se tenir au courant des nouvelles techniques susceptibles de contribuer à améliorer la détection de ces bactéries (en terme de sensibilité, spécificité et rapidité d’exécution) comme par exemple ceux permettant une quantification des bactéries ou une simplification des lectures. Anne-Claire Le Roux-Nio, ingénieur d’études à la FNPPPT, conduit le programme de recherche sur les bactéries. En conclusion La France occupe une position privilégiée en matière sanitaire et la mise en place de programmes conséquents de surveillance et de moyens de détection fiables sur les plants certifiés y contribue fortement. Technique PCR multiplexe qui permet de détecter simultanément les bactéries Ralstonia (Rs) et Clavibacter (Cms) en une seule PCR (gain de temps). Perspectives 1 : Marqueur de taille 2 : Échantillon contaminé par RS 3 : Échantillon contaminé par RS et CMS 4 : Échantillon contaminé par CMS 5 : Échantillon sain À côté de leur rôle de protection du territoire par la détection précoce des bactéries dans les divers milieux, ces différents outils sont également utilisés pour mener des études épidémiologiques. Ces dernières ont débuté récemment (en 2002) et ont pour but d’essayer de mieux comprendre les conditions de manifestation des maladies causées par Ralstonia solanacearum et Clavibacter michiganensis sepedonicus. Elles seront présentées lors d’un prochain article. 17