Impact de la PCR en temps réel dans le diagnostic

Transcription

N°d’Ordre ...................../LABIOGENE
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
---------------
LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE
UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE
(LABIOGENE)
SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE
(UFR/SVT)
Mémoire Présenté
Par : Mr SAMPO Emmanuel Maitre ès Sciences Biologiques
Pour l’obtention du DEA
Diplôme d’Etudes Approfondies en Biochimie / Biologie Moléculaire
Appliquées de l’Université de Ouagadougou
SUR LE THEME
Impact de la PCR en temps réel dans le
diagnostic précoce des méningites
bactériennes aiguës au Burkina Faso
Soutenu et présenté publiquement le 31/07/2013
Devant le jury composé de :
Président : Pr. Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Université de Ouagadougou
Membres : Pr. Lassana SANGARE Professeur titulaire, Université de Ouagadougou
Pr. Nicolas BARRO, Professeur titulaire, Vice-président de l’Université de
Ouagadougou
i
TABLE DES MATIERES
DEDICACE ........................................................................................................................... IV
REMERCIEMENTS .............................................................................................................. V
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................... VI
LISTE DES TABLEAUX....................................................................................................VII
LISTE DES ABREVIATIONS ......................................................................................... VIII
RESUME ............................................................................................................................... IX
ABSTRACT............................................................................................................................. X
INTRODUCTION ...................................................................................................................1
OBJECTIFS .............................................................................................................................3
ENONCE DU PROBLEME....................................................................................................3
1-OBJECTIF GÉNÉRAL..............................................................................................................3
2-OBJECTIFS SPÉCIFIQUES .......................................................................................................3
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE .................................................4
1.1-DÉFINITION DES MÉNINGITES BACTÉRIENNES ...................................................................5
1.2-IMPORTANCE DES MÉNINGITES DANS LE MONDE ...............................................................5
1.3-AGENTS DES MÉNINGITES BACTÉRIENNES AIGUËS ............................................................6
1.3.1-Neisseria meningitidis ..............................................................................................6
1.3.1.1-Généralités.............................................................................................................6
1.3.1.2-Caractères bactériologiques..................................................................................7
1.3.1.3-Epidémiologie........................................................................................................9
1.3.2-Streptococcus pneumoniae .....................................................................................11
1.3.2.1-Généralités...........................................................................................................11
1.3.2.2-Caractères bactériologiques................................................................................11
1.3.2.3-Epidémiologie......................................................................................................13
1.3.3-Haemophilus inflenzae ...........................................................................................14
1.3.3.1-Généralités...........................................................................................................14
1.3.3.2-Caractères bactériologiques................................................................................14
1.3.3.3-Epidémiologie......................................................................................................17
1.4-DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE DES MÉNINGITES BACTÉRIENNES AIGUËS .......................18
1.4.1-Prélèvements (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)......................................................18
1.4.2-Transport et conservation des échantillons au laboratoire (WHO/IVB/11.12) .....18
1.4.3-Examen macroscopique des prélèvements de LCR ................................................19
1.4.4-Examens microscopiques........................................................................................19
1.4.4.1-Examen cytologique (Quantitatif et qualitatif)....................................................19
1.4.4.2-Recherche de bactéries après coloration au Gram .............................................20
1.4.5-Recherche d’antigènes bactériens solubles dans le LCR .......................................21
i
1.4.6-Diagnostic moléculaire...........................................................................................21
1.4.7-Culture (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR) ...............................................................23
1.4.8-Identification des agents de MBA ...........................................................................24
1.4.8.1-N. meningitidis (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR )...............................................24
1.4.8.2-S. pneumoniae......................................................................................................24
1.4.8.3-H. influenzae........................................................................................................24
1.4.9-Etude de la sensibilité des agents de MBA aux antibiotiques ................................24
1.4.10-Conservation des souches identifiées (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR) ..............26
DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE ...........................................................................27
1.1-CADRE D’ÉTUDE ..........................................................................................................28
1.1.1-ORIGINES GÉOGRAPHIQUES DES ÉCHANTILLONS ..........................................................28
1.1.2-SITE D’ANALYSE DES ÉCHANTILLONS ..........................................................................28
1.1.3-ECHANTILLONS REÇUS.................................................................................................28
1.2-PROCÉDURES GÉNÉRALES D’ANALYSE DES ÉCHANTILLONS. ...........................................28
1.3-RECHERCHE DES BACTÉRIES DANS LES FROTTIS COLORÉS PAR LE GRAM........................30
1.3.1-Principe ..................................................................................................................30
1.3.2-Réactifs. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram)...................................................30
1.3.3-Description de la technique. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram) ...................30
1.3.4-Résultats et interprétation. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram)......................31
1.4-RECHERCHE D’ANTIGÈNES BACTÉRIENS SOLUBLES DANS LE LCR ..................................31
1.4.1-Principe (PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD)...................................31
1.4.2-Contenu de la trousse PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD ...............31
1.4.3-Mode opératoire ( PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD) ...................31
1.4.4-Résultats (PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD)..................................32
1.5-ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES 3 PRINCIPAUX AGENTS DE MBA.............................32
1.5.1-Identification de N. meningitidis (méningocoque) .................................................33
1.5.2-Identification de S. pneumoniae (pneumocoque) ...................................................35
1.5.3-Identification d’Haemophilus influenzae................................................................36
1.6-IDENTIFICATION MOLÉCULAIRE PAR LA PCR EN TEMPS RÉEL .........................................37
1.6.1-Extraction de l’ADN bactérien ...............................................................................39
1.6.2-Préparation du Mix. ...............................................................................................40
1.6.3-Préparation de la plaque........................................................................................41
1.6.4-Amplification avec le Stratagene Mx3005P ...........................................................41
ii
1.6.5-Interprétation..........................................................................................................43
1.7-ANALYSES STATISTIQUES ...............................................................................................44
2-RESULTATS ......................................................................................................................45
2.1-RÉPARTITION DES ÉCHANTILLONS SELON LEUR PROVENANCE ........................................45
2.2-RÉPARTITION DES PATIENTS SELON LES ANTÉCÉDENTS D’ANTIBIOTHÉRAPIE ET DE
VACCINATION........................................................................................................................45
2.3-LES CAS POSITIFS DES AGENTS DE MBA SELON LES MÉTHODES UTILISÉES .....................46
2.3.1. La coloration de Gram...........................................................................................46
2.3.2-L’agglutination des particules solubles au latex....................................................47
2.3.3- la culture bacterienne............................................................................................48
2.3.4- la rt-PCR................................................................................................................48
2.3.5-Répartition selon origine géographique (district sanitaire) et les méthodes
détection...........................................................................................................................49
2.4-Comparaison entre la rt-PCR et les différentes méthodes de bactériologie classique
pour la détection des agents de MBA. .............................................................................49
2.4.1-Coloration et rt-PCR ..............................................................................................49
2.4.2-Latex et rt-PCR.......................................................................................................50
2.4.3-Culture et rt-PCR....................................................................................................50
2.4.4-Comparaison des taux de confirmation des tests de diagnostic. ............................50
2.4.5-Impact de la durée de l’acheminement du LCR sur la fréquence de détection par la
culture et la rt-PCR..........................................................................................................51
2.5-COMPARAISON DES PERFORMANCES DES MÉTHODES DE DÉTECTION DES AGENTS DE
MBA. ...................................................................................................................................51
3-DISCUSSION......................................................................................................................53
4. CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS................................................................57
4.1. CONCLUSION ...............................................................................................................57
ANNEXES ..............................................................................................................................59
BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................................62
iii
DEDICACE
Je dédie ce travail :
A mon père et à ma mère pour leur soutien moral.
A mon épouse et à notre enfant pour leur affection et leur confiance à mon égard.
iv
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé dans le Service de Bactériologie-Virologie du Centre Hospitalier Universitaire
Yalgado OUEDRAOGO (CHUYO). Nous exprimons notre profonde gratitude :
Au Professeur Jacques SIMPORE, Directeur de l’unité de Biologie Moléculaire Appliqué a
l’UFR/SVT de l’Université de Ouagadougou et du laboratoire de Biologie Moléculaire et de
Génétique (Labiogène), d’avoir permis notre inscription en DEA pour l’année académique 20112012 et d’avoir accepté présider notre jury.
Au Professeur Lassana SANGARE, Chef du Service de Bactériologie-Virologie du CHU-YO de
nous avoir permis de réaliser cette étude au sein de son Service. Nous le remercions de n’avoir
ménagé aucun effort pour diriger nos travaux de recherche en dépit de ses nombreuses occupations.
Au Professeur Nicolas BARRO, Vice-président de l’Université de Ouagadougou, pour la qualité
de son enseignement en virologie que nous avons reçu depuis le DEUG jusqu’en Maîtrise de
microbiologie et d’avoir accepté être membre de notre jury.
Le jury d’avoir jugé et évalué notre mémoire de DEA.
Au Docteur Malika CONGO, Responsable de l’Unité de biologie moléculaire, du Service de
Bactériologie-Virologie du CHU-YO, d’avoir accepté de codiriger ce travail pendant notre stage de
recherche et d’avoir contribué à la correction de notre mémoire de DEA.
Au doctorant Herman SOMLARE et au technologiste biomédical Kalifa OUATTARA pour
leurs conseils pratiques durant la période de stage de Janvier à juillet 2011.
A toute l’équipe du service de Bactériologie-Virologie du CHU-YO, pour son accueil, sa
disponibilité et ses précieux conseils.
A la Directrice du CMA Schiphra Marie Claire TRAORE pour nous avoir autorisé à mener ces
travaux de recherche à l’Université de Ouagadougou et dans le Service de Bactériologie-Virologie du
CHU-YO.
A toute l’équipe du laboratoire d’analyse médical du CMA Schiphra pour ses conseils et ses
soutiens multiformes.
A mes frères, sœurs, parents et amis pour leur soutien moral et pour leurs encouragements tout au
long de ces années.
A tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre ont contribué à l’aboutissement de ce travail.
v
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Bilan épidémiologique de la méningite bactérienne ......................................6
Figure 2 : Structure des gènes cibles de N. meningitidis ...............................................8
Figure 3: Ceinture africaine de la méningite................................................................10
Figure 5: les gènes ciblent de Haemophilus. ...............................................................16
Figure 6: Milieux de transport Trans-Isolate ...............................................................19
Figure 7: Morphologie des S. pneumoniae sur frottis coloré au Gram ........................20
Figure 8 : Morphologie des N. méningitidis sur frottis de LCR Coloré au Gram........20
Figure 9 : Morphologie des H. influenzae sur frottis de LCR Coloré au Gram...........21
Figure 10 : Photo de PASTOREX meningitidis kit ....................................................21
Figure 11 : Etapes de la PCR conventionnelle (BISCO, 2011) ...................................22
Figure 12 : Bandes de migration d’une électrophorèse (BISCO, 2011) ......................22
Figure 13: Chimie d'hydrolyse d'une sonde double-marquée......................................23
Figure 14 : étape des analyses......................................................................................29
Figure 15 : Photo des colonies suspectes de N. meningitidis ......................................32
Figure 16 : Photo des colonies suspectes de S. pneumonie sur GC+PVX...................33
Figure 17 : Photo du test d’oxydase de N.méningitidis ...............................................33
Figure 18 : Photo du test de catalase de N. méningitidis ...........................................33
Figure 20 : Photos du repiquage des Nm sur GC+PVX ..............................................34
Figure 22 : Photo du résultat du test de sérogroupage .................................................35
Figure 23: Photo du test à l’optochine S. pneumoniae.................................................35
Figure 24 : Photo du test de solubilité par la Bile du S. pneumoniae ..........................35
Figure 25 : Photo du test d’oxydase de H.influenzae...................................................36
Figure 26 : Photo du test de catalase de H.influenzae..................................................36
Figure 28 : Photo du test de l’exigence en facteurs X et V de H. influenzae b. ..........37
Figure 29 : Photo d’agglutination au latex de H.influenzae b......................................37
Figure 31 : Poste (PSM-II) d’extraction d’ADN bactérienne. .....................................40
Figure 32 : Préparation des amorces et sondes ............................................................40
Figure 33 : Photo du Stratagene Mx3005P™ et accessoires service de bactériologievirologie du CHU-YO..................................................................................................42
Figure 34 : Profil thermique de la PCR en temps réel. ................................................43
Figure 36 : Nombre d’échantillon par district..............................................................45
Figure 37 :Types de vaccins recus . .............................................................................46
Figure 38: Répartition des principales bactéries de la méningite selon le Gram.........47
Figure 39: Répartition des principales bactéries de la méningite au latex...................48
Figure 40 : Répartition des principales bactéries de la méningite à la culture. ...........48
Figure 41: Répartition des principales bactéries de la méningite à la PCR. ................49
Figure 42 : Répartition de méningite par district et selon les méthodes de détection. 49
Figure 43 : Comparaison entre les tests de diagnostic. ...............................................51
Figure 44 : Résultat de la PCR et culture en fonction de la durée de l’acheminement51
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Classification des différentes espèces d’Haemophilus ..........................15
Tableau II : Tableau synoptique d’antibiogramme .................................................25
Tableau III : Mode d’affichage des résultats d’amplification d’ADN des principales
bactéries de la méningite..........................................................................................44
Tableau IV: Situation vaccinal et thérapeutique des patients ..................................46
Tableau V : Croisement entre les résultats de la PCR et ceux du Gram..................49
Tableau VI : croisement entre les résultats de la PCR et ceux de Latex. ................50
Tableau VII : Croisement entre les résultats de la PCR et ceux la culture. .............50
Tableau VIII : Calcul des paramètres par la formule de Bayes ...............................52
Tableau IX : Valeurs de VP, VF, FN et VF des tests de diagnostic utilisés...........52
Tableau X: valeurs intrinsèques des tests de diagnostic utilisés..............................52
Tableau XI: Amorces et sondes utilisées pour la détection des principales bactéries
de la méningite.........................................................................................................61
vii
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN
: Acide désoxyribonucléique
CDC
: Center for Diseases control and Prevention
CHU-YO
: Centre Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo.
Ct
: Cycle Threshold
DPV
: Direction de la prévention par la vaccination
FRET
: Fluorescence resonance energy transfer
GC+PVX
: Gelose chocolat + polyvitex
HHV6
: Human Herpes Virus 6
Hib
: Haemophilus influenzae b
HSV2
: Herpes Simplex Virus 2
IL
: Interleukine
LCR
: Liquide céphalorachidien
γGT
: gamma glutamyl transférase
MBA
: Méningites bactériennes aiguës
NAD
: Nicotinamide adenine dinucléotide
Nm
: Neisseria meningitidis
NTC
: Negative control
ONPG
: β-Galactosidase perméase
ORL
: Oto-rhino-laryngologie.
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PME
: Protéine membranaire classe 1 ou porines A
rpm
: Rotation par minute
Ref
: Colorant de référence
rt-PCR
: real time–Polymerase Chain Reaction
Sp
TDR
T-I
TNF-α
VIH
VPN
VPP
WHO/OMS
: Streptococcus pneumoniae
: Test de diagnostic rapide
: milieu Trans-Isolate
: Tumor Necrosis factor α (Facteur de nécrose tumorale α)
: Virus de l’Immunodéficience Humaine
: Valeur prédictive négative
: Valeur prédictive positive
: World Health Organization/Organisation Mondiale de la Santé
viii
RESUME
Au Burkina-Faso, les méningites bactériennes aiguës (MBA) constituent un problème
de santé publique. Un diagnostic rapide et précis permet une prise en charge adéquate. La
présente étude comparative est réalisée dans le Service de bactériologie-virologie du Centre
Hospitalier Universitaire Yalgado Ouédraogo (CHU-YO) de Janvier à Juillet 2011. Le but de
cette étude était de comparer les performances des techniques classiques de diagnostic
bactériologique des méningites bactériennes aiguës (Gram, latex et culture) à celles de la
PCR en temps réel (rt-PCR) récemment introduite dans la surveillance des MBA.
Deux-cent (200) échantillons distincts de LCR provenant de 17 districts sanitaires du Burkina
Faso ont été analysés par les méthodes classiques (coloration de Gram, agglutination aux
particules de latex sensibilisé et culture) et par rt-PCR. Sur ces 200 échantillons 98 (49%)
étaient positifs au Gram, 89 (44,5%) positifs au latex, 56 (28%) positifs par la culture et
137(68,5%) positifs à la rt-PCR.
Les résultats obtenus ont montré une meilleure performance de la rt-PCR par rapport à
chacune des méthodes classiques utilisées (p=0,001).
L’utilisation de la rt-PCR dans la confirmation des cas suspects de MBA et plus largement
dans la surveillance épidémiologique des MBA mériterait d’être élargie aux laboratoires de
niveau intermédiaires, au regard du volume des analyses annuellement réalisées au Burkina
Faso.
Mots clés : Burkina Faso, Impact de la PCR en temps réel, diagnostic des méningites
bactériennes aigues.
ix
Abstract
In Burkina-Faso, acute bacterial meningitides (MBA) constitute public health problems. A
fast and accurate diagnosis allows an adequate care procedure. The present comparative study
was carried out in bacteriology-virology Service/molecular biology section of University
hospital Yalgado Ouédraogo (CHU-YO) from January to July 2011 year. The goal of this
study was to assess the performances of the traditional technics of bacteriological diagnosis
of acute bacterial meningitis (Gram staining, latex and culture) with those of PCR in realtime (rt-PCR) recently introduced into MBA monitoring.
Two hundred (200) cerebrospinal fluid (CSF) collected in 17 health districts of Burkina Faso
were analyzed by traditional methods (Gram staining, agglutination to the sensitized latex
particles and culture) and by rt-PCR. On these 200 samples 98 (49%) were positive in Gram,
89 (44, 5%) positive with latex, 56 (28%) positive by the culture and 137 (68, 5%) positive
with the rt-PCR.
The results were showed a better performance of rt-PCR compared to each traditional method
used (p=0,001).
The use of the rt-PCR in the confirmation of the suspect cases of MBA and more largely in
the epidemiologic monitoring of MBA would deserve to be extended to intermediate level
laboratories, taking into consideration all annual volume of analyzes carried out in Burkina
Faso.
Key words: Burkina Faso, Impact of real-time PCR, acute bacterial meningitis diagnosis.
x
INTRODUCTION
Les méningites bactériennes aiguës (MBA) sont redoutables de par leurs taux de
morbidité et de mortalité élevés dans le monde entier. En 2000, l’Organisation mondiale de la
santé (OMS) estimait qu’en dehors des épidémies, au moins 1,2 millions de cas de méningites
bactériennes survenaient chaque année dans le monde avec environ 135 000 cas de décès
(WHO, 2000). L'incidence des MBA dans les pays industrialisés se situe entre 2,5 et 10 pour
100 000 habitants alors qu'elle est dix fois plus élevée dans les pays en voie de
développement (Wangou, 2009). L’incidence est élevée dans les pays en voix de
développement malgré les progrès dans l’antibiothérapie et la vaccination publique (Williams
et Nadel; 2001). En 2010, sur un total de 6435 cas suspects notifiés au Burkina Faso, 909
décès dus aux méningites ont été reportés (Kafando, 2011).
En 2002, Perrocheau et al. Avaient noté en France que les principaux agents incriminés dans
les MBA étaient S.pneumoniae (46%), N.meningitidis (32%) et H.influenzae b (5%).
S.pneumoniae et N.meningitidis représentaient respectivement des incidences de 0,81 et 0,55
pour 100 000 habitants.
En 2005, Parent du Chatelet et al. Avaient rapporté au Burkina Faso que la fréquence des
principaux germes des MBA était : N.meningitidis (44%), S.pneumoniae (40%) et
H.influenzae b (17%). Cependant, avec les multiples campagnes d’immunisation utilisant des
vaccins polysaccharidiques contre les méningocoques des sérogroupes A et W135 et plus
récemment l’utilisation du vaccin conjugué MenAfriVac, la prévalence des méningites à
N.meningitidis a baissé significativement au détriment de S.pneumoniae au Burkina
(Kafando, 2011).
Les méningites à pneumocoques ont un pronostic vital plus sombre puisque leur taux de
mortalité est de 19 à 37% contre 3 à 13% pour les méningites méningococciques et 3 à 4%
pour les MBA à H.influenzae b (Van de Beek et al., 2006).
L’évolution des méningites à pneumocoque est très rapide : un diagnostic rapide et précis
permet une prise en charge plus adéquate. Les méthodes classiques de diagnostic de la
méningite utilisées dans le système de surveillance du Burkina Faso sont l’examen
microscopique des frottis de LCR après coloration au Gram, la détection rapide des antigènes
capsulaires solubles à l’aide de tests d’agglutination par les particules de latex sensibilisées,
la mise en culture du liquide céphalorachidien et l’identification notamment par des tests
biochimiques et antigéniques.
1
La charge bactérienne dans le LCR influence grandement les résultats de la microscopie (La
Scolea et Dryja, 1984).
Les résultats de la culture sont seulement disponibles entre 24 à 48 heures, voire plus
notamment quand le nombre de bactéries viables est faible. Le diagnostic bactériologique par
la mise en culture du LCR omettrait au moins 13% des cas positifs (Durand et al., 1993). La
coloration de Gram met en évidence des bactéries dans 50 à 80% des cas et la culture est
positive dans au mieux 80% des LCR. Cependant, en cas de traitement précoce, la sensibilité
de ces deux tests devient inférieure à 50% (Carbonnelle et al., 2009).
La technique d’agglutination avec les particules de latex sensibilisés présente une sensibilité
voisine de 80 % pour le pneumocoque et ne détecte pas les souches non capsulées. Cette
méthode de diagnostic peut présenter des résultats très variables et des réactions croisées avec
d’autres germes, comme certains streptocoques alpha hémolytiques (Gray et al., 1992).
L’augmentation de la morbidité et la forte létalité des méningites pneumococciques
constituent actuellement une préoccupation de santé publique au Burkina Faso. (DLM, 2011).
Les méthodes classiques utilisées pour le diagnostic de la méningite apparaissent parfois
désavantageuses en termes de rapidité et de sensibilité par rapport à d’autres méthodes plus
récentes, compte tenu de l’urgence requise dans la prise en charge des patients. Par exemple
lorsque l’antibiothérapie est mise en route avant la ponction lombaire, la capacité de
diagnostic des méthodes classiques seraient réduite de 30% (Dalton et Allison, 1968). Ainsi
les sensibilités de l’examen microscopique, l’agglutination aux particules de latex sensibilisé
et la culture du LCR restent limitées.
Depuis 2011, le système de surveillance épidémiologique des MBA dispose de nouveaux
outils de détections des trois agents les plus fréquents. Il s’agit notamment de la PCR en
temps réel (rt-PCR : real time Polymerase Chain Reaction). Cette technique est pratiquée
dans les trois laboratoires de référence de niveau central : le CHU Pédiatrique Charles De
Gaulle (CHU-PCDG) qui abrite le Laboratoire national de référence (LNR) des méningites,
le CHU-YO et le CHU Souro Sanon (CHUSS).
2
OBJECTIFS
1-Objectif général
Contribuer à l’évaluation des outils de diagnostic rapide des MBA au Burkina Faso.
2-Objectifs spécifiques
-Détecter les principaux germes (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae) responsables MBA par les méthodes classiques de diagnostic dans
les prélèvements de LCR.
-Détecter ces agents de MBA dans les mêmes prélèvements de LCR par la PCR en temps réel
(rt-PCR).
-Comparer la rt-PCR aux méthodes classiques pour la détection des trois principales espèces
bactériennes dans les MBA au Burkina Faso.
ENONCE DU PROBLEME
Le diagnostic classique des MBA est souvent entravé par les antécédents thérapeutiques, la
mauvaise conservation, le faible inoculum et par le délai d’acheminement de LCR long.
La rt-PCR trouve son intérêt dans sa rapidité d’obtention des résultats, sa sensibilité très
élevée (notamment dans les circonstances où les bactéries ne sont plus cultivables ou sont de
culture lente et/ou difficile, dans les cas de faible charge bactérienne et les cas
d’antibiothérapie instaurée) et sa grande spécificité.
La présente étude comparative est réalisée pour évaluer l’importance de la rt-PCR dans le
diagnostic rapide et spécifique des MBA dans la perspective d’une prise en charge réactive
(immunisation et traitement curative) efficace au Burkina Faso.
3
PREMIERE PARTIE : REVUE DE LA LITTERATURE
4
1.1-Définition des méningites bactériennes
Les méninges sont formées de feuillets qui protègent le cerveau et la moelle épinière.
Elles contiennent un liquide appelé liquide céphalorachidien(LCR), normalement stérile. Le
terme méningite désigne une infection des méninges et conséquemment du liquide céphalorachidien : l’étiologie peut être bactérienne, virale, fungique ou rarement parasitaire (Mancini
et al., 2009). Cette infection a pour conséquence une inflammation du parenchyme cérébral,
des méninges et du liquide céphalo-rachidien avec afflux de leucocytes, à prédominance de
polynucléaires en cas de multiplication bactérienne (Mancini et al., 2009). La multiplication
des bactéries dans le parenchyme cérébral entraîne une nécrose irréversible de celui-ci et un
œdème péri-lésionnel, réversible avec des séquelles tels que la surdité, le retard mental, etc.
(Mancini et al., 2009).La triade classique (maux de tête, vomissement et fièvre) est la
manifestation clinique la plus commune de toutes les formes de méningite.
1.2-Importance des méningites dans le monde
Selon les estimations de l’OMS, en dehors des périodes d’épidémies, au moins 1,2 million de
cas de méningites bactériennes étaient rapportés chaque année dans le monde dont environ
135 000 cas de décès (WHO, 2000). La méningite reste une préoccupation mondiale à cause
des taux de mortalités très élevés qu’elle engendre chaque année. Elle requiert une
surveillance accrue pour la riposte et pour son contrôle. Deux seuils épidémiologiques sont à
considérer dans la surveillance des MBA: le seuil d'alerte et le seuil épidémique. Ces seuils
sont définis par le nombre de cas ou par l'incidence hebdomadaire de la méningite en fonction
de la taille de la population et du risque épidémique (Lewis et al., 2001).
Le seuil d’alerte et d’intervention actuelle a été élaboré pour les pays situés dans la ceinture
africaine de la méningite par le bureau régional Afrique de l’Organisation mondiale de la
santé (OMS-Afro) (figure 1). Ce seuil épidémique dans la ceinture de la méningite en
pratique est de 10 cas pour 100.000 habitants par semaine (WHO, 2005).
Le seuil d’alerte au Burkina Faso est de 5 cas de méningite pour 100.000 habitants par
semaine (DLM, 2011).
La saison épidémique de la méningite 2003-2004 a été relativement calme avec un total de 23
districts déclarés en épidémie dans plusieurs pays (Burkina Faso, Éthiopie, Ghana,
5
Mali, Niger, Tchad, Côte d'Ivoire, et la République Démocratique du Congo (RDC)). Ainsi,
27 355 cas de MBA et 3443 décès de méningite ont été enregistrés dans une zone
géographique plus étendue (figure 1) (WHO, 2005).
Durant la saison, le nombre de districts en alerte ou en épidémie dans la ceinture de la
méningite a été évalué. La plus forte concentration de ces districts se trouve au RDC
(17districts), au Burkina Faso (13 districts) et au Niger (7 districts) (WHO, 2005).
Figure 1: Bilan épidémiologique de la méningite bactérienne
(WHO/CDS/CSR/ARO/2005.5 ; consulté le 30/04/2011)
1.3-Agents des méningites bactériennes aiguës
1.3.1-Neisseria meningitidis
1.3.1.1-Généralités
Neisseria meningitidis appartient au genre Neisseria et à la famille des Neisseriaceae. La
bactérie est un diplocoque à Gram négatif, réniforme et capsulée en général.
En 1887, Weichselbaum. A, un médecin viennois, était le premier à rapporter l'isolement du
méningocoque dans le LCR des patients atteints de méningite.
Depuis cette découverte, N. meningitidis a été identifié dans le monde entier comme cause de
la méningite épidémique méningococcique encore appelée méningite cérébrospinale (Sejvar
et al., 2005).
Les premières épidémies de méningite méningococcique en Afrique Subsaharienne datent
approximativement de 100 ans (Sejvar et al., 2005). Des manifestations épidémiques
massives ont étés notées en Afrique Subsaharienne dans les années 1990. L'apparition depuis
1995 des sérogroupes Y, W135 et X et la manifestation prolongée de la maladie
6
méningococcique du sérogroupe B en Nouvelle Zélande pendant la dernière décennie nous
rappellent le danger potentiel du méningocoque causant une morbidité et une mortalité
globales (Sejvar, et al., 2005).
1.3.1.2-Caractères bactériologiques
-Classification
Neisseria appartient à la famille des Neisseriaceae. Ce genre comporte plusieurs espèces
dont deux sont pathogènes spécifiques à l’homme à savoir Neisseria meningitidis et N.
gonorrhoeae ou gonocoque. Il existe d’autres Neisseria pathogènes occasionnellement (N.
lactamica, N. mucosa, N. flava etc.) (Towa Djeungoue, 2008).
-Caractéristiques génétiques de N.meningitidis
Le génome du N. meningitidis est un acide nucléique (ADN) formé de deux brins
complémentaires enroulés autour du même axe. L’ensemble forme une structure hélicoïdale
et bicaténaire. L’ADN du méningocoque possède plusieurs gènes.
Dans la détection de N. meningitidis par la PCR, les gènes ctrA et sodC permettent de
détecter l’espèce (figure 2). Le gène ctrA permet de détecter toutes les souches de
méningocoques, qu’elles soient groupables ou non. Le gène sodC code pour son superoxyde
dismutase Lors du sérogroupage.Dans les essais de diagnostic moléculaire ce sont les gènes
sacB (spécifique de N. meningitidis du sérogroupe A), siaD/synD (N. meningitidis du
sérogroupe B), siaD/synE (N. meningitidis du sérogroupe C) synF (N. meningitidis du
sérogroupe Y), synG (N. meningitidis du sérogroupe W135), xcbD (N. meningitidis du
sérogroupe X) qui sont détectés (Mothershed et al., 2004). Ils codent pour la synthèse de la
capsule qui est le support de spécificité antigénique de groupe.
7
Figure 2 : Structure des gènes cibles de N. meningitidis (WHO/IVB/11.12., Consulté le
01 /11/2012)
-Caractères culturaux (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)
Le méningocoque cultive sur gélose chocolat enrichie au Polyvitex, sur gélose au sang à 5%
de sang de mouton
et sur gélose de Mueller Hinton en subculture (réalisation de
l’antibiogramme sur MH). Il est aérobie et croit à 35 -37°C, en atmosphère humide enrichie à
10% en CO2.
Les colonies apparaissent au bout de 18-24h en général et non sont pas hémolytiques.
-Sur gélose chocolat les colonies sont lisses, grisâtres, à bord régulier avec une surface lisse
et brillante et 1mm de diamètre.
-Sur gélose au sang, les colonies apparaissent lisses, humides, luisantes, bombées à bord net.
-Sur gélose Mueller Hinton en subculture, les colonies sont lisses et transparentes.
-Caractères biochimiques
Le méningocoque possède une Cytochrome oxydase (oxydase positive), une catalase
(catalase+) et un gamma glutamyl transférase (γGT+), oxyde le glucose et le maltose
(Glucose+, maltose+) contrairement au lactose et au saccharose : il est ONPG. Il se distingue
du gonocoque qui n’oxyde pas le maltose et qui ne possède pas de gamma GT
(WHO_IVB_11.09).
8
-Caractères antigéniques
Le méningocoque possède de nombreux antigènes dont les plus importants pour son
indentification sont les propriétés antigéniques permettant de subdiviser l’espèce en douze
sérogroupes: A, B, C, W135, X, Y, Z, Z’ (29E), H, I, K et L. Chacun étant divisé en
sérotypes, Sous-types et clones. Près de 90% des infections sont provoquées par les
sérogroupes (A, B, C, W135 et X) qui sont connus également pour provoquer des épidémies.
Le sérogroupe D a été abandonné (WHO/CDS/CSR/EDC/99.7).
Les protéines de la membrane externe sont au nombre de 5 ou 6 individualisées sur la base de
leur poids moléculaire. Deux d’entre elles sont importantes pour le sérotypase du
méningocoque à savoir :
-la PME classe 1 ou porines A qui a la base de la classification en sous types ;
-la PME classe 2 et 3 ou porines B sont à la base de la classification en sérotypes.
-Vitalité
Le méningocoque est une bactérie fragile. Il est sensible au froid, aux températures élevées
supérieures 37°C, à la lumière, à la dessiccation et aux variations de pH.
1.3.1.3-Epidémiologie
-Transmission
Le méningocoque est un germe strictement humain commensal des muqueuses du
rhinopharynx. La méningite bactérienne est une maladie contagieuse. Sa transmission est
directe, notamment à travers les gouttelettes de Pflügge des sujets infectés (Faure, 2001).
La période d'incubation se situe entre 2 et 10 jours et est en moyenne de 4 jours (Towa
Djeungoue, 2008).
Par leur contagiosité élevée, les méningocoques peuvent être à l'origine de septicémies et
d'épidémies de méningites cérébrospinales dans le monde entier.
-Répartition géographiques, populations, tranches d’âge
En Afrique, les épidémies de méningite surviennent principalement dans la « ceinture
méningitidique » (Lapaysonnie, 1963) dont les limites ont été actualisées par (Greehwood,
1987) : elle s’étend de l’Ethiopie à l’Est au Sénégal à l’Ouest (figure 3). Dans cette zone, une
9
augmentation de nombre de cas est observée le plus souvent pendant les mois d’avril à mars
de chaque année.
Figure 3: Ceinture africaine de la méningite.
Source: Control of epidemic meningococcal disease, WHO practical guidelines, World
Health Organization, 1998, 2nd edition, WHO/EMC/BAC/98.3 (consulté le 24/06/2012).
Tous les êtres humains sont réceptifs aux méningocoques, mais le risque de maladie est
plus élevé chez les personnes splénectomisées, ou atteintes d'une déficience du
complément. Le risque de maladie invasive est plus élevé chez les enfants et décroît avec
l'âge (Reyet et al., 1995).
-Fréquence au Burkina Faso
Neisseria meningitidis (méningocoque) est l’une des plus importantes causes de
méningite bactérienne contagieuse au Burkina Faso et dans la ceinture de méningite
(Kafando, 2011). Cependant après la campagne de vaccination préventive de masse contre la
méningite à méningocoque A avec le MenAfriVac en 2010 dont la validité de l’immunité est
de 10 ans, on note une diminution du nombre de cas annuel en 2011 du au méningocoque A
habituellement responsable du plus grand nombre de cas en période d’épidémie (WHO,
2005).
Toutefois, en raison de la circulation d’autres sérogroupes tels que les NmX, Y et W135 on
pourrait s’attendre à la survenue de foyers épidémiques dus à ces germes (WHO, 2005).
10
En effet, les méningocoques X et W135 ont été déjà responsables d’épidémies de méningite
au Burkina Faso (2002 et 2003 pour le méningocoque W135 et 2010 pour le méningocoque
X) (WHO, 2005). On note toujours la circulation de ces germes pouvant être responsables
d’épidémie dans certains districts sanitaires en 2012, car la vaccination avec le vaccin
conjugué contre la méningite à méningocoque A (MenAfriVac) n’aura pas d’effet sur
l’évolution de ces germes (WHO, 2005).
-Facteurs favorisants
Les facteurs favorisants sont :
-les porteurs asymptomatiques ;
-la promiscuité dans les collectivités ;
-les conditions atmosphériques ;
-la sécheresse et le traumatisme de rhinopharynx ;
-la mise en commun des couverts ou des verres favorisent la propagation de la maladie ;
-les pèlerinages favorisent aussi la diffusion du méningocoque.
1.3.2-Streptococcus pneumoniae
Découvert en 1881 par Pasteur, S. pneumoniae est commensal du tractus respiratoire
supérieur de l’homme (Berthe, 1979).
Les infections à pneumocoque comprennent l’ensemble des infections invasives (méningite,
pneumonie bactériémique et bactériémie) et non invasives (otite, sinusite et bronchite) liées à
la bactérie.
-Classification
Streptococcus pneumoniae est un diplocoque à Gram positif en flamme de bougie pouvant
se présenter en courte chainette. Il est généralement capsulé. Il appartient à la famille des
Streptococcaceae et au genre Streptococcus. L’espèce comporte 92 sérotypes qui ont été
décrits (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
11
-Caractéristiques génétiques de Streptococcus pneumoniae
L’ADN génomique de S. pneumoniae L’ADN du pneumocoque possède plusieurs gènes
(figure 4).
Dans les essais de détection du Streptococcus pneumoniae par la PCR, ce sont les gènes lytA
codant Streptococcus autolysine et possédant 957 nucléotides qui sont détectés. Les Gènes
cps opéron sont non liés à la capsule (Carvalho et al., 2007).
.Si l’essaie est positif pour le Streptococcus pneumoniae, un essaie de sérotypage peut ensuite
être fait pour déterminer les sérotypes spécifiques de cette bactérie.
lytA
Cps operon
Figure 4 : Structure du gène cible du S .pneumoniae (Carvalho et al. 2007)
-Caractères culturaux (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)
Le pneumocoque se cultive sur gélose chocolat enrichie, sur gélose au sang à 5% de sang de
mouton. C’est une bactérie anaérobie dont la température d’incubation est de 35 à 37°C sous
une atmosphère enrichie à 10% de CO2.
Le Ph optimum de croissance =7,8.Les colonies apparaissent au bout de 24 à 48 heures.
Sur gélose chocolat les colonies sont grisâtres à bord régulier avec une surface lisse.
Sur gélose au sang, les colonies sont transparentes et entourées d’une zone verdâtre
d’hémolyse alpha.
Streptococcus pneumoniae est catalase négative, oxydase négative. Il est lysé par la bile et il
est sensible à l’optochine (éthylhydrocupreine). Il est glucose positif, lactose positif et
raffinose positif (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
12
L’antigène capsulaire est de nature polysaccharidique permettant de distinguer plus de 90
sérotypes mais, la plupart des maladies graves ne sont dues qu'à un nombre limité de ceux-ci
(1, 5, 6, 3, 23, 12, 2, 14). (OMS, 2010).
On note prés de 380 antigènes capsulaires qui regroupent les antigènes O somatiques, les
antigènes R, les antigènes T et les antigènes M.
Les substances élaborées sont :
-La pneumolysine a une activité cytotoxique des cellules respiratoires des cellules
endothéliales et effet pro inflammatoire (Saidani, 2010) ;
-La neurami-nidase joue un rôle particulier dans la diffusion méningée du pneumocoque en
clivant les acides sialiques des glycoprotéines et glycolipides à la surface des muqueuses et
des liquides biologiques (Saidani, 2010) ;
- La hyaluromidase contribue à la propagation du germe dans le tissu en dépolymérisant
l’acide hyaluronique, composant important de la matrice extracellulaire (SAidani, 2010) ;
-La leucocidine pneumococcique contribue ainsi à la propagation du germe dans les tissus en
lysant les leucocytes (Saidani, 2010).
-Vitalité
Streptococcus pneumoniae est fragile et survit peu dans le milieu extérieur.
-Transmission
Streptococcus pneumoniae est une bactérie commensale des voies respiratoires supérieures
(rhinopharynx). Germe essentiellement humain, il est très rarement isolé chez les animaux. Il
se transmet par voie aérienne et toujours par des gouttelettes de pflugge (Saidani, 2010).
-Répartition géographique, populations, tranches d’âges
De par la gravité de l'atteinte méningée et l'émergence des souches de sensibilité diminuée à
la pénicilline, le pneumocoque revêt un intérêt particulier dans le profil épidémiologique de la
méningite au Maroc (OMS, 2010). La méningite à pneumocoque (S.p) a une incidence
annuelle de
1 à 2 pour 100.000 habitants dans la plupart des pays développés. Les pays en
développement ont un taux d'incidence plus élevé, jusqu'à 20 pour 100.000 (OMS, 1995).
13
Un grand nombre de pays africains, particulièrement en Afrique équatoriale et centrale, le
pneumocoque est le premier agent de la méningite bactérienne (Mar et al., 1979).
Le taux de létalité de la méningite à pneumocoque est plusieurs fois plus élevé que ceux des
méningites à méningocoque et à Hib (OMS, 1995).
La méningite due à Streptococcus pneumoniae est généralement plus fréquente chez les
patients très jeunes et chez les patients très vieux, avec un taux d'incidence de 17 cas pour
100.000 habitants (O'Brien et al. 2009).
Plusieurs études ont montré que Streptococcus pneumoniae, reste l’une des principales cause
d’infections invasives en terme de morbidité et de mortalité dans les pays surtout chez les
personnes plus jeunes et les plus âgées(Kafando, 2011).
Les facteurs favorisants sont :
Les porteurs asymptomatiques ;
La promiscuité dans les collectivités ;
Les conditions atmosphériques ;
La sécheresse et le traumatisme de rhinopharynx.
1.3.3-Haemophilus inflenzae
Il a été découvert par Pfeiffer comme petit bacille à Gram négatif dans les expectorations d'un
grippé en 1892.
-Classification (WHO/IVB/11.12)
H. influenzae est une espèce classée dans :
Famille : Pasteurellaceae ;
Genre : Haemophilu ;
Espèces : H. influenzae.
14
Le genre Haemophilus comprend d’autres espèces (tableau I). Leur classification repose sur
les exigences en facteurs de croissance et sur des caractères biochimiques.
Tableau I : Classification des différentes espèces d’Haemophilus
Espèces
H. influenzae
H. haemolyticus
H. parainfluenzae
H. paraphrophilus
H. segnis
H. aphrophilus
H. haemoglobinophilus
H. ducreyi
Besoin
facteur
X
+
+
+
+
+
en Oxydase
V
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
Catalase
Uréase
Indole
+
+
V
+
(+)
-
(+)
(+)
(- )
-
(+)
V
+
-
(WHO/IVB/11.12., Consulté le 01 /11/2012)
V : caractère variable; + ou - : caractère positif ou négatif chez toutes les souches; (+) ou (-) :
caractère positif ou négatif chez la majorité des souches.
-Caractéristiques génétiques de H .influenzae
H. influenzae est un bacille à Gram négatif, très court. Dans les produits pathologiques, il est
polymorphe le plus souvent apparait sous formes de coccobacilles, de bacilles courts et
allongés. Il est immobile, non sporulé et parfois capsulé (WHO/CDS/CSR/EDC/99.7).
Dans les frottis de cultures et sur certains frottis de LCR colorés par le Gram, ce bacille
apparait souvent isolé ou groupé en amas ou en banc de poisson, avec parfois une coloration
bipolaire, coloré et observé à l’objectif x 100.
Les gènes d’intérêt diagnostic dans le génome de Hib (figure5) sont : les gènes hpD dont
acsB, bcsB, ccsD, dcsE, ecsH et bexD codant l’Haemophilus protéine D. Le gène cible hpd
est composé de 1095 nucléotides. Le
cap locus est un gène non liées à la capsule
(WHO/IVB/11.12.).
Si l’essai est positif pour Haemophilus influenzae, un essaie de sérotypage peut ensuite être
fait pour déterminer les sérotypes spécifiques de cette bactérie.
15
Figure 5: les gènes ciblent de Haemophilus WHO/IVB/11.12. (Consulté le 01 /11/2012).
-Caractères culturaux
H. influenzae est une bactérie anaérobie exigeante en facteurs X (hémine) et en facteur
V(NAD). Il cultive sur gélose enrichie en facteurs X et V contenus notamment le
polyvitexTM, sous une atmosphère enrichie à 10% en CO2, entre 35 et 37°C, pendant 18-24h.
Les colonies sont grandes, plates, opaques, incolore
et lisse sur gélose chocolat plus
polyvitex (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
H. influenzae b est oxydase+ et catalase+. Il fermente le glucose, le maltose, le ribose, la
xylose mais pas le saccharose ni le lactose et il est ONPG négatif. Il est aussi indole+,
uréase+, ODC+ et nitrate réductase + (WHO_IVB_11.09).
Haemophilus influenzae b possède un antigène capsulaire polysaccharidique qui est du
polyribosyl-ribitol phosphate (PRP). Il permet de distinguer six serotypes: à, b, c, d, e, et f.
Cet antigène est détectable par agglutination indirecte ou par immunochromatographie. La
capsule de H. influenzae est immunisante. (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
16
-Vitalité
H. influenzae est un germe fragile qui ne résiste pas à la chaleur. Ses exigences de croissance
font qu’il n’est pas retrouvé dans la nature.
-Transmission
Haemophilus influenzae fait partie de la flore normale des muqueuses des voies respiratoires
supérieures, de la cavité buccale de l’homme et de nombreuses espèces animales. Il est plus
fréquemment rencontré au niveau du rhinopharynx et ne se rencontre jamais dans la nature
(Djeungoue, 2008).
La transmission est interhumaine et se fait par inhalation des gouttelettes de salive d’un
porteur asymptomatique ou d’un malade. La transmission est accrue quand de nombreux
enfants passent ensemble des périodes prolongées, dans des environnements tels que les
garderies ou les crèches (OMS, 2000).
-Répartition géographiques. (WHO/EMC/BAC/98.3)
Jusqu'à l'avènement des vaccins conjugués, H. influenzae type b (Hib) a été considéré comme
la cause la plus fréquente dans le monde de méningite bactérienne du jeune enfant, en dehors
des épidémies (Berthe, 1979). Dans plusieurs pays où la vaccination de routine contre Hi a
été appliquée aux jeunes enfants, la méningite à Hib a été pratiquement éliminée. Sans
vaccination, l'incidence annuelle générale de la méningite à Hib est autour de 1 à 3 pour
100.000. Cependant, le taux d'incidence spécifique de l'âge chez les enfants de moins de 5
ans est beaucoup plus élevé, entre 20 et 60 cas annuels pour 100.000 habitants. Quatre-vingtdix pour cent (90%) des patients atteints de méningite à Hib sont âgés de moins de 5 ans, le
groupe d'âge le plus affecté étant celui de 6 à 11 mois. Le taux de létalité est
approximativement de 5 à 20%. Des séquelles sont observées dans une proportion de 10 à
30%, la plus fréquente étant la surdité.
Au CHU-YO, l’incidence annuelle des méningites à Hib est passée de 61 cas pour 100.000
habitants en 2005 à 5 cas pour 100.000 habitants en 2011. A partir du 12eme mois après
17
l’introduction du vaccin, Hib est passé ainsi du premier germe pourvoyeur de méningites
bactériennes chez les enfants au troisième (Ouedraogo, 2012).
L’infection à Hi survient chez l’hôte à la faveur de facteurs divers dont :
-le portage asymptomatique ;
-la promiscuité dans les collectivités ;
-les conditions atmosphériques ;
-les collectivités (crèche, école) ;
-les infections respiratoires virales (grippe, …).
1.4-Diagnostic au laboratoire des méningites bactériennes aiguës
1.4.1-Prélèvements (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)
Le LCR est recueilli par ponction lombaire surtout, sur tubes secs stériles, dans des
conditions d’asepsie et d’antisepsie rigoureuses. Cette ponction est faite de préférence avant
toute antibiothérapie. Le prélèvement doit être collecté. Les procédures opératoires standards
appliquées actuellement au Burkina Faso recommandent le recueil du LCR dans les
suspicions de MBA selon les modalités suivantes :
-3 à 4 ml dans un tube sec stérile mini d’un bouchon à vis ;
-0,5 à 1 ml inoculé dans le milieu Trans-Isolate (Figure 6) ;
-1 à 1,5 ml dans un cryotube.
Tout prélèvement de LCR doit être étiqueté aux identifiants du malade et être acheminé
rapidement au laboratoire, accompagné d’un bulletin et/ou une fiche de notification.
1.4.2-Transport et conservation des échantillons au laboratoire (WHO/IVB/11.12)
Le LCR prélevé en tube sec stérile, le milieu Trans-Isolate inoculé (figure 6) et/ou le
cryotube doivent être acheminés rapidement au laboratoire. A défaut, ils seront conservés
dans les conditions suivantes :
-le tube de LCR sera gardé à la température ambiante, en évitant de l’exposer à la chaleur
excessive ;
-le milieu T-I inoculé sera ventilé au moyen d’une grosse aiguille stérile cotonnée et gardé à
35°C à l’abri de la lumière. L’aiguille sera retirée au moment de l’expédition ;
18
- le cryotube sera conservé a -20°C.
Le transport du milieu T-I inoculé et du LCR sur tube sec est fait à température ambiante.
Celui du cryotube se fait dans le respect de la chaine de froid.
WHO/IVB/11.12. (Consulté le 01 /11/2012)
Figure 6: Milieux de transport Trans-Isolate
1.4.3-Examen macroscopique des prélèvements de LCR
Le LCR normal est clair et limpide « eau de roche ». En cas de méningite bactérienne,
l’aspect peut être louche, trouble, purulent, hémorragique, xanthochromatique (OMS, 1999).
1.4.4-Examens microscopiques
Ils comprennent l’examen cytologique et la recherche d’agents pathogènes en cause, en
l’occurrence les bactéries après coloration de Gram.
1.4.4.1-Examen cytologique (Quantitatif et qualitatif)
La cytologie quantitative est réalisé sur le LCR total
homogénéisé, en utilisant un
hématimètre ou cellule de numération, du type Nageotte ou Malassez. Les résultats de la
numération leucocytes et les hématies sont exprimés en nombre de cellules/mm 3. Le LCR
normal contient <5-10 leucocytes/mm3. En cas de méningite bactérienne ces résultats peuvent
être >1000 leucocytes/mm3.
La formule leucocytaire est déterminée lorsque le nombre de cellules est >50/mm 3.
Le LCR trouble est utilisé directement sans centrifugation préalable pour la confection du
frottis qui est coloré au May-Grünwald-Giemsa (MGG), contrairement au LCR clair qui doit
être centrifugé à 5000 tours/mn pendant 10mn. Le frottis est alors réalisé sur le culot de
centrifugation avant d’être coloré au MGG. Dans les méningites purulentes, la formule
leucocytaire est à prédominance polynucléaire neutrophile, alors que la prédominance est
19
lymphocytaire dans les méningites à mycobactérie, les méningites virales ou fongiques
(WHO/IVB/11.12).
1.4.4.2-Recherche de bactéries après coloration au Gram
Les frottis de LCR purulents ou ceux des culots de centrifugation de LCR clairs sont colorés
par le Gram et examinés au microscope pour la recherche des bactéries.
-Sur un frottis de LCR coloré par le Gram Streptococcus pneumoniae se présente sous forme
de diplocoques à Gram positif encapsulés (indiqués par les flèches sur la (figure 7) avec des
polynucléaires.
Figure 7: Morphologie des S. pneumoniae sur frottis coloré au Gram (WHO/IVB/11.12;
consulté le 01 /11/2012).
- Sur un frottis de LCR coloré par le Gram on peut observer des diplocoques à Gram négatif
évoquant des N. méningitidis associé aux polynucléaires.
Figure 8 : Morphologie des N. méningitidis sur frottis de LCR Coloré au Gram
(WHO/IVB/11.12; consulté le 01 /11/2012)
-Sur un frottis de LCR coloré par le Gram on peut observer des bacilles à Gram négatif
polymorphes évoquant H. influenzae.
20
Figure 9 : Morphologie des H. influenzae sur frottis de LCR Coloré au Gram
(WHO/IVB/11.12; consulté le 01 /11/2012).
1.4.5-Recherche d’antigènes bactériens solubles dans le LCR
L’échantillon doit être traité le plus rapidement possible après le prélèvement si non stoker
entre + 2 à 8 °C ou au plus longtemps a 20°C. Utiliser le surnageant de LCR centrifugé et
chauffer à 100°C pendant 5 mn pour la recherche des antigènes solubles des bactéries
(WHO/IVB/11.12).
Déposer une goutte de surnagent du LCR (40-50 µl) dans chaque cercle de la carte jetable du
pastorex méningitidis et ajouter une goutte de chaque réactif au latex suivant la répartition
indiquée : R9, R6, R7, R1, R2, R8, R3, R4 etR5 (figure10).
Apres une rotation de 10 mn faire la lecture à l’œil nu :
-Résultat positif=il y’a apparition d’agglutination des particules ;
-Résultat négatif= les particules restent en suspension homogène.
Figure 10 : Photo de PASTOREX meningitidis kit
1.4.6-Diagnostic moléculaire
Il est réalisé par deux types de réaction en chaine par la polymérase principalement : la PCR
conventionnelle et la PCR en temps réel.
21
-La PCR conventionnelle est une réaction en chaine de la polymérase (PCR).
La PCR conventionnelle est une technique qui est utilisée pour amplifier un acide
désoxyribonucléique. Elle utilise de l’ADN polymérase d’une bactérie aquatique thermophile
pour sa réaction (synthèse des amplicons). Cette réaction comporte trois étapes qui
constituent un cycle au cours duquel la quantité d’ADN cible à amplifier est doublée (figure
11):

dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C ;

hybridation avec une amorce, appariement primé, annealing à 64°C ;

extension de l’amorce à 70-72°C par la Taq polymérase.
Figure 11 : Etapes de la PCR conventionnelle (BISCO, 2011)
Apres l’amplification, la détection des amplicons se fait après une migration sur gèle
d’agarose (figure 12).
Figure 12 : Bandes de migration d’une électrophorèse (BISCO, 2011)
-La PCR en temps réel (rt-PCR) combine l’amplification et la détection simultanée des
produits amplifiés. Le principe de cette technique est fondé sur la détection et la mesure d’un
signal fluorescent émise lors de l’hydrolyse de la sonde Taqman (figure 13) par l’enzyme Taq
polymérase qui catalyse la prolongation des amorces. Quand l’enzyme atteint la région où la
22
sonde est liée, l'activité de l'exo nucléase 5’ de la polymérase d'ADN fend la sonde et libère le
donneur de l’accepteur ainsi il se produit une émission de fluorescence. L’intensité
d’émission est proportionnelle à la quantité de produit formé pendant la PCR (Bogard et al.,
2008).
D o nneur
A ccep teur
S o n d e lib r e e n s o lu tio n
L u m iè re
C h a le u r (p a s d e s ig n a l flu o re s c e n t )
T ra n s fe rt
d ’ é n e rg ie
S o n d e e t a m o r c e s ’h yb r id e n t à la c ib le , m a is le
d o n n e u r e t l’a c c e p te u r s o n t p r o c h e : le s ig n a l
n ’e s t p a s g é n é r é
T aq
L
t E
Eig
mhis
sm
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n s io
d en
L u m iè re
T aq
lu m iè re (s ig n a l flu o re s c e n t )
P o lym é r a s e fa it l’é lo n g a tio n e t
h yd r o lys e la s o n d e , le d o n n e u r é m e t
flu o r e s c e n c e --> s ig n a l
Figure 13: Chimie d'hydrolyse d'une sonde double-marquée (WHO/IVB/11.12;
consulté le 1 /01/2012).
1.4.7-Culture (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)
La mise en culture sera effectuée en premier avant l’examen microscopique et de la façon
suivante :
Les milieux de culture utilisés sont : Gélose chocolat + PVX ;
Sécher les milieux dans l’étuve pendant 30 mn ;
Inscrire le numéro de l’échantillon sur la boite du milieu à ensemencer ;
Déposer une à deux gouttes de LCR non centrifugé provenant du tube stérile ou du Trans
Isolate à la surface de chacun des milieux à ensemencer ;
Ensemencer en cadrant à l’aide d’une anse stérile ;
Placer les boites ensemencées dans une jarre à CO2 ;
Incuber le tout à 37°C pendant 18 à 24 heures ;
Apres 18 à 24 heures observer les boites ensemencées pour identifier les colonies suspectes
des agents de MBA.
23
1.4.8-Identification des agents de MBA
1.4.8.1-N. meningitidis (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR )
La culture est positive sur la gélose chocolat et sur la gélose au sang après 24 heures
d’incubation.
-Sur gélose au sang, les colonies de Neisseria meningitidis sont rondes, humides, luisantes et
bombées.
-Sur gélose chocolat les colonies sont lisses, grisâtre à bord régulier avec une surface lisse et
brillante avec 1mm de diamètre.
La coloration de Gram des colonies suspectes montre des diplocoques à Gram négatif.
Le test à l’oxydase est positif et la catalase est positive.
1.4.8.2-S. pneumoniae
La culture est positive sur gélose au sang et sur gélose chocolat + PVX après 24 heures
d’incubation.
Les colonies de S. pneumoniae se présentent sur gélose au sang en gouttes de rosée, à bord
régulier et surface bombée, muqueuses entourées d’une zone verdâtre d’hémolyse alpha,
grisâtres.
La coloration au Gram de ces colonies suspectes montre des diplococoques Gram positif.
Le test de lyse par la bile est positif (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
S. pneumoniae possède une enzyme auto-catalytique qui lyse ses propres cellules au cours de
la division. L’addition de sels biliaires (désoxycholate de Na) active cette enzyme et accélère
la lyse cellulaire. Alors la bile devient soluble. Les autres streptocoques Alpha hémolytiques
(Streptococcus mitis) ne possèdent pas cette enzyme capable de s’autolyser.
S. pneumoniae est sensible à l’optochine (diamètre ≥14 mm).
1.4.8.3-H. influenzae
La culture est positive sur la gélose chocolat plus polyvitex.
Les colonies d’H. influenzae sont grandes, plates, incolores ou grisâtres, opaques, sans
changement de coloration du milieu de culture (gélose chocolat +PVX).
La coloration au Gram de ces colonies suspectes montre des coccobacilles à Gram négatif.
Le test à l’oxydase est positif et la catalase est positive (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR).
1.4.9-Etude de la sensibilité des agents de MBA aux antibiotiques
La technique de diffusion en milieu gélosé selon la CASFM version 2009 est la plus utilisée.
La technique de détermination des CMI par E-test est utilisée en cas de résistance ou de
sensibilité diminué à l’oxacilline.
24
Tableau II : Tableau synoptique d’antibiogramme
Germes
N. méningitidis
S. pneumoniae
Milieux de culture
Méthode
d’ensemencement
MH ou Gélose au 0,5
Ecouvillonnage
sang de mouton 5% McFarland
en tampon
phosphate
MH ou Gélose au 0,5
Ecouvillonnage
sang de mouton 5% McFarland
en solution
saline 0,9%
Gélose
chocolat+polyvitex
H. influenzae b
Inoculum
0,5
Ecouvillonnage
McFarland
après dilution 1/10
en solution
saline 0,9%
Condition
d’incubation
Antibiotiques(ATB) à tester
35-37°C CO2 Oxaciline 5µg et Chloramphénicol. Les
(5%) 18-20h
souches sensibles à l’oxaciline 5µg
(diamètre≥18 mm, sont aussi sensibles a la
Peni G, l’Amoxicilline, la ceftriaxone et a la
cefotaxime. En cas de sensibilité<18 mm
confirmer par la détermination des CMI de ces
mêmes ATB
35-37°C CO2 Oxa 5µg et Chloramphénicol. Les souches
(5%) 18-24h
sensibles à l’oxaciline 5µg (diamètre>21 mm),
sont aussi sensibles a la Peni G, l’Ampicilline
et au cefotaxime.En cas de sensibilité<18 mm
confirmer par la détermination des CMI de ces
mêmes ATB
35-37°C CO2 Chloramphénicol.
(5%) 18-24h
Le test de céfinase positif confère à une
résistance à l’ampicilline, Amoxicilline,
caboxypenicilline et à l’ureido péniciline.
L’activité de ces β lactamases est restaur ée
lors de l’association avec un inhibiteur de la
βlactamases (Ampicilline 2 µg)
25
1.4.10-Conservation des souches identifiées (WHO/CDS/CSR/EDC/99/7/FR)
Pour confirmer l’identification et tester la sensibilité aux antibiotiques des germes de la
méningite, la nécessité de la conservation des souches s’impose. N. méningitidis, S.
pneumoniae et H .influenzae b sont des germes fragiles dont leur conservation et leur
transport requièrent beaucoup de précautions. La technique utilisée dépend de la durée de
conservation.
-Pour la conservation d’une semaine est à courte durée.
Sur gélose chocolat inclinée la viabilité du Streptococcus pneumoniae et Haemophilus
influenzae est optimale après ensemencement incubation une nuit à 35°C, puis conservée à
4°C.
-Pour conserver le Neisseria méningitidis on utilisera des tubes de gélose chocolat inclinée
avec des bouchons vissés à membrane perméable qui permettent un échange gazeux .
Il existe deux techniques de conservation à longue durée généralement utilisées :
la technique de lyophilisation qui assure des durées importantes de conservation et la
congélation ;
la congélation peut être à -70°C dans un bouillon glycériné (15 à 20 %), dans du lait écrémé
ou dans du sang (mouton, cheval, lapin) défibriné. Elle peut être à -20°C dans l’azote liquide.
26
DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE
27
1. METHODOLOGIE
1.1-CADRE D’ÉTUDE
1.1.1-Origines géographiques des échantillons
Les échantillons de notre étude provenaient de 17 districts sanitaires du Burkina Faso et
CHUYO .Les districts étaient : Bogandé, Djibo, Dori, Fada N’Gourma, Gayeri, Gourcy,
Kaya, Koudougou, Kongoussi, Mani, Nanoro, Nongr-Massom, Ouahigouya, Réo, Séguenega,
Sig-Nonghin et Titao.
1.1.2-Site d’analyse des échantillons
Les examens bactériologiques classiques et les analyses moléculaires ont été réalisés dans le
Service de Bactériologie-Virologie du CHU-YO. Le service comprend 4 unités: l’unité de
bactériologie, d’immunologie, de suivi biologique des personnes vivant avec le VIH/Sida
(PvVIH/Sida) et de biologie moléculaire. Le responsable de service de bactériologievirologie a sous coupe 4 chefs d’unités.
1.1.3-Echantillons reçus
Les échantillons analysés étaient les prélèvements de LCR sur tubes secs stériles, les milieux
T-I inoculés et les cryotubes de LCR reçus dans les Service de bactériologie-virologie du
CHUYO pour le diagnostic étiologique de méningite bactérienne aiguë.
A la réception, les échantillons ont été enregistrés aux références mentionnées sur le bulletin
d’examen ou la fiche de notification associés.
Les LCR sur tubes secs ont été soumis aux examens cytobactériologiques, immédiatement. A
défaut ils ont été conservés à 37°C jusqu’au moment de leur analyse.
Les milieux T-I inoculés ont aérés et incubés à 37°C avant leur subculture sur milieux gélosés
pour l’isolement des bactéries cultivées.
Les cryotubes ont été conservés à –20°C jusqu’au moment de la réalisation de l’analyse
moléculaire des échantillons.
1.2-Procédures générales d’analyse des échantillons.
Les échantillons reçus (LCR sur tubes secs, milieux T-I inoculés et cryotubes de LCR) ont été
analysées selon les étapes illustrées dans la figure 14.
Dans le présent document, l’accent sera mis sur la description des examens d’intérêt pour les
besoins de comparaison de techniques faisant l’objet du travail de mémoire: la recherche des
antigènes bactériens solubles dans le LCR, la culture pour l’identification des agents de MBA
et leur détection par la PCR en temps réel.
28
LCR
Trans-Isolate
Cryotube
Jour1.
Agglutination
des
particules
sur
de
Examen
macroscopique :
latex sensibilise (lcr
clair, trouble, citrin,
purulents)
louche,
purulent,
Hématique…
Examen
microscopique :
Cytologie
quantitative
(Cytologie
qualitative)
Coloration de Gram
Culture (GS,
Extraction
(kit
GSC, GC+PVX)
QIAamp DNA mini) et
incubation sous
1ère PCR (Stratagène
co2 en
Mx3005P) :
atmosphère
détermination d’espèce
humide.
Jour2.
Identification d’espèce sur la base des caractères
morphologiques, culturaux, biochimiques,
2ème PCR (Stratagène
Mx3005P) :
antigéniques .
détermination du
sérogroupage
Antibiogramme :
Ceftriaxone,
Jour
Ampicilline,
Chloramphénicol,
Amoxicilline+ac,
Cotrimoxazol,
Gentamycine
LECTURE DE L’ANTIBIOGRAMME, SAISIE ET REMISE DES RESULTATS
29
Figure 14 : étape des analyses
1.3-Recherche des bactéries dans les frottis colorés par le Gram.
1.3.1-Principe
Le principe de la coloration au Gram est basé sur la mise en évidence des propriétés de
la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son
avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou
un milieu tant sur le type que sur la forme. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram).
1.3.2-Réactifs. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram)
Les réactifs sont :
-flacon de violet de gentiane ou cristal violet ;
-flacon de lugol (solution d’iode iodo-iodurée) ;
-flacon d’alcool éthylique 95%.
1.3.3-Description de la technique. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram)
Le diagnostic présomptif de méningite bactérienne à S. pneumoniae N. meningitidis ou H.
influenzae peut être fait de la façon suivante grâce à une coloration de Gram :
(a) Centrifuger le LCR pendant 20 minutes à 2000 tours par minute ;
(b) Préparer un frottis avec 1 ou 2 gouttes de culot déposées sur une lame, préalablement
rincée à l’alcool et séchée. Laisser la goutte s’étaler seule sans faire de frottis et ne pas utiliser
un sédiment trop concentré ;
(c) Sécher la lame à l’air, dans une enceinte de sécurité biologique, si possible ;
(d) Passer rapidement la lame à la flamme à trois reprises pour fixer le frottis. Mais ne pas
l’exposer à la flamme avant qu’elle soit sèche. On peut aussi fixer par le méthanol (95%100%) ;
(e) Recouvrir le frottis avec la solution violet cristal-oxalate d’ammonium pendant 1 minute ;
(f) Rincer délicatement à l’eau du robinet. Faire égoutter pour enlever l’excès d’eau ;
(g) Recouvrir le frottis avec la solution de Lugol pendant 1 minute ;
(h) Rincer délicatement à l’eau du robinet et égoutter ;
(i) Différencier à l’alcool éthylique à 95% (5 à 10 secondes suffisent parfois) ;
j) Colorer le fond à la safranine pendant 20-30 secondes ou à la fuchsine phéniquée pendant
10-15 secondes ;
(k) Rincer la lame sous le robinet, et sécher au buvard ;
30
(l) Examiner le frottis au microscope à l’objectif à immersion, en utilisant un condenseur
donnant une bonne luminosité.
1.3.4-Résultats et interprétation. (BIO-MERIEUX, Coloration de Gram)
Au microscope a l’objectif X100, les principaux germe des MBA se présentent comme suit :
- N. meningitidis a l’aspect de diplocoque à Gram négatif en grains de café, intra ou
extracellulaires ;
-S. pneumoniae se présente comme des diplocoques à Gram positif lancéolés, souvent en
chaînettes ;
.H. influenzae forme de petits bacilles ou des coccobacilles à Gram négatif polymorphes.
1.4-Recherche d’antigènes bactériens solubles dans le LCR
1.4.1-Principe (PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD)
L'antigène présent dans l'échantillon testé est identifié à l'aide de particules de latex
recouvertes d'anticorps spécifiques. Ces particules s'agglutinent fortement en présence de
l'antigène homologue alors qu'elles restent en suspension homogène en l'absence de celui-ci.
1.4.2-Contenu de la trousse PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD
La trousse contient :
-des cartes jetables ;
-des bagues jetables ;
-des réactifs suivant :
R1 :N.méningitidis B/E. coli K1,
R2 :N.méningitidis control négatif ,
R3 :H.influenzae de type b,
R4 :S.pneumoniae ,
R5 : Streptococcus groupe B,
R6 :N.meningitidis A,
R7 : N.meningitidis C,
R8 : N.meningitidis Y/W135,
R9 : Control polyvalent négatif,
R10 : control polyvalent positif.
1.4.3-Mode opératoire ( PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD)
Le test d’agglutination aux particules de latex du LCR se réalise comme suit :
(a) Chauffer le surnageant du LCR à l’eau bouillante pendant 5 minutes ;
(b) Bien homogénéiser la suspension de particules de latex ;
31
(c) Déposer une goutte de chacune des suspensions à l’intérieur des cercles prévus d’une carte
jetable ;
(d) Ajouter 30-50 µl de LCR à chacune des suspensions ;
(e) Imprimer à la carte un léger mouvement de rotation pendant 2-10 minutes, à la main de
préférence ou avec un agitateur mécanique (100 rotations par minute).
1.4.4-Résultats (PASTOREXTM MENINGITIS 25 tests BIO-RAD)
La lecture des résultats est faite par appréciation visuelle.
Réaction négative : la suspension reste homogène et légèrement opales.
Réaction positive : apparition d’une agglutination (ou d’une agrégation) des particules de
latex en moins de 2 minutes.
1.5-Isolement et identification des 3 principaux agents de MBA
Les LCR reçus sur tubes secs stériles et les phases liquides des milieux T-I dans lesquels une
croissance bactérienne observée et ceux n’ayant montré aucune croissance bactérienne au
bout de 7 jours ont tous été mis en culture sur gélose chocolat additionnée de Polyvitex TM. Les
géloses ensemencées ont été incubées à 37°C, en atmosphère humide enrichie à 5-10% en
CO2, pendant 18-24h.
Les cultures suspectes de N. meningitidis et de H. influenzae sont apparues sous formes de
colonies lisses, brillante à bord régulier avec un diamètre de 1mm (Figure 15).
Figure 15 : Photo des colonies suspectes de N. meningitidis et de H. influenzae sur
GC+PVX
32
Sur gélose chocolat + PVX les colonies suspectes de Streptococcus pneumoniae colonies
sont grisâtres à bord régulier avec une surface lisse (figure 16).
Figure 16 : Photo des colonies suspectes de S. pneumonie sur GC+PVX.
1.5.1-Identification de N. meningitidis (méningocoque)
-Les frottis des colonies suspectes N. meningitidis colorés au Gram et lus au microscope
optique à l’objectif x 100 révèlent des diplocoques Gram négatif, réniforme ou en grain de
café.
-La recherche de l’oxydase sur papier filtre imprégné du réactif de Kovac était positive. La
réaction positive était marquée par une coloration violette du papier oxydase (figure 17).
Figure 17 : Photo du test d’oxydase de N.méningitidis
-La recherche de la catalase était positive pour N. méningitidis (figure 18) et s’était traduite
par la production de bulles d’air lorsqu’une goutte d’eau oxygénée (H2O2) se mélange aux
colonies de ce germe.
Figure 18 : Photo du test de catalase de N. méningitidis
33
-Une galerie API NH (Bio-MERIEUX, France) a été réalisée avec une suspension des
colonies dans de l’eau physiologique stérile et d’opacité 4 MacFarland. Apres 18-24 heures
d’incubation, les souches identifiées N. meningitidis étaient glucose+, maltose+, lactose–,
saccharose–, ONPG– et gamma-GT+ (Figure 19).
Figure 19 : Photo de la Galerie API NH d’identification de Nm
Toutes les souches de N. meningitidis ont été réisolées sur gélose chocolat (GC) ou sur gélose
au sang frais en vue de la caractérisation antigénique.
Figure 20 : Photos du repiquage des Nm sur GC+PVX
-Pour l’identification antigénique de chaque souche de N. meningitidis, une suspension
laiteuse de solution saline formolée à 0.5% a été faite dans un tube. Dix (10) µl de cette
suspension bactérienne ont été déposé sur 10 µl de chaque antisérum spécifique (A, C, W135)
et de solution saline non formolée à 0.5% dans la partie supérieure d’une plaque de verre
propre. Des colonies de 24 heures issues du repiquage sur GC+PVX ont étés écrasés dans
l’antisérum et dans la goutte saline. Des antis sérums anti méningococciques (A, C, X, Y,
W135) ont été utilisés pour le sérogroupage.
Suspension laiteuse de solution saline formolée
Réalisation du serogroupage sur lame.
Figure 21: Photos du sérogroupage de N. meningitidis
34
Résultat positif Sérogroupe A a été positive (figure 22 godé 1) et se traduisait par
l’apparition d’une agglutination franche avec le seul antisérum A et pas avec la solution
saline.
Résultat négatif : pas d’agglutination avec aucun antisérum.
Figure 22 : Photo du résultat du test de sérogroupage
1.5.2-Identification de S. pneumoniae (pneumocoque)
-Les frottis des colonies suspectes S.pneumoniae colorés au Gram et lus au microscope
optique à l’objectif x 100 révèlent des diplocoques à Gram positif en flamme de bougie.
-Le test de sensibilité à l’optochine sur gélose chocolat enrichie (figure 23) a montré que : les
colonies de la bande 1 sont résistantes à l’optochine ne sont pas des pneumocoques. Les
colonies des bandes 2 ; 3 sont sensibles à l’optochine sont donc des pneumocoques. Le
diamètre d’inhibition était >14 mm
1
2
3
Figure 23: Photo du test à l’optochine S. pneumoniae
-Le test de lyse de Streptococcus pneumoniae par les sels biliaires est positif.
La réaction positive se traduit par l’éclaircissement de la suspension trouble par les sels
biliaires (tube 2 figure24). Dans le tube 1, la réaction est négative se traduisant par absence
d’éclaircissement dans la suspension trouble.
Figure 24 : Photo du test de solubilité par la Bile du S. pneumoniae
35
1.5.3-Identification d’Haemophilus influenzae
-Les frottis des colonies suspectes des H influenzae colorés au Gram et lus au microscope
optique à l’objectif x 100 révèlent des petits bacilles (coccobacilles) à Gram négatif
polymorphes.
-La recherche de l’oxydase sur papier filtre imprégné du réactif de Kovac était positive. La
réaction positive était marquée par une coloration violette du papier oxydase (Figure 25).
Figure 25 : Photo du test d’oxydase de H.influenzae
-La recherche de la catalase était positive pour H.influenzae (Figure26) et s’était traduite par
la production de bulles d’air lorsqu’une goutte d’eau oxygénée (H2O2) se mélange aux
colonies de ce germe.
Figure 26 : Photo du test de catalase de H.influenzae
-L’identification biochimique des colonies suspectes a été faite par la recherche de l’oxydase
qui était positive et sur la galerie API NH (Bio-MERIEUX).
La galerie a été réalisée avec une suspension des colonies dans de l’eau saline et d’opacité 4
MacFarland. Après 18-24 heures d’incubation, on obtient:
Glucose+, le Maltose+, le ribose+, la xylose+, lactose– ou le saccharose–, indole+, uréase+,
ODC+ et nitrate réductase + (figure 27).
Figure 27 : Photo de la Galerie API NH d’identification de H. influenzae.
-Les exigences en facteurs X et/ou V ont été déterminées sur gélose ordinaire en utilisant des
papiers filtres commerciaux chargés de facteurs X, V et XV. H. influenzae a été cultivé
uniquement autour des papiers imprégnés à la fois des facteurs X et V (figure 28).
36
Figure 28 : Photo du test de l’exigence en facteurs X et V de H. influenzae b.
-Pour l’identification du sérotype de Hi, les cultures ont été mises en suspension et testées par
le réactif Hib du kit PASTOREX Méningite kit. Un exemple de résultat positif est illustré par
la figure 29.
Figure 29 : Photo d’agglutination au latex de H.influenzae b
1.6-Identification moléculaire par la PCR en temps réel
Les identifications moléculaires des trois agents de MBA ont été réalisées par une technique
de PCR en temps réel (rt-PCR) selon le protocole (figure 30) suivant :
37
Diagnostic moléculaire
Temps
Cryotube(LCR)
Extraction Kit Quiagen
100µl d’extrait d’ADN pure
Préparation de la plaque
-Master Mix: 12, 5µl
-H2O
25µl
:4, 5 µl
-Primer Forwad: 2, 0 µl
-Primer Reverse: 2, 0 µl
-Probe
: 2, 0 µl
-Extra it d’AND pure 2, 0 µl
Amplification
Profil Thermique
-50°C pendant 2 min = Préchauffage
- 95°C pendant 10 min = Dénaturation
- 95°C pendant 15 s et 60°C pendant 1 min = Amplification pour (50 cycles)
Interprétation
-Limites de Ct de CDC
-Ct < 35 ,9 = Résultat positif
-Ct ≥ 41,0 = Résultat Négatif
- 36 ,0< Ct > 40,9 = résultat douteux
-Résultats douteux doivent être de nouveau testés après avoir fait une dilution au 1/4 et
au 1/10.
6 Heures
Sérogroupage,
Sérogroupage du Nm, serotypage de S.p
Serotypage
-Même profil thermie
-Sondes et amorce spécifiques (NmA, NmC, NmW135, NmX, NmY) et S.p
Identification
Nm (A, C, X, W135, Y);
Sp;
Hib
38
Figure 30 : Protocole du diagnostic moléculaire
1.6.1-Extraction de l’ADN bactérien
-Préparation de la solution d’extraction
-La solution d’extraction a été préparée (volume suffisant pour 8-9 échantillons+1 eau extrait
contrôle) :
TE avec 0,04 g/ml lysozyme et 75 U/ml mutanolysine ;
Ajouter 0,04 g TE de lysozyme par 1 ml tampon à un tube Eppendorf ;
Ajouter 19,0 µl de mutanolysine reconstituée par 1 ml tampon.
-La mutanolysine est lyophilisée et doit être reconstituée et aliquotée comme suit:
Ajouter 2,5 ml d’eau qualité PCR au flacon de mutanolysine a 10 000 UI ;
Distribuer 500 µl dans 5 tubes, chacun contiendra 4.000 unités/ml ;
Conserver le tube à utiliser à 4ºC. Conserver les autres tubes à -20ºC.
Le lysozyme et la mutanolysine doivent être ajoutés au tampon TE juste avant son utilisation.
-Purification de l’ADN avec le kit QIAamp DNA mini
La Procédure d’extraction utilisant le protocole QIAamp DNA mini :
-Pour chaque échantillon à extraire, mettre 100 µl du tampon TE-enzyme dans un tube
Eppendorf (1,5 ml) ;
-Ajouter 200 µl d’échantillon. Vortexer 15 secondes ;
-Incuber à 37oC dans un bain marie ou un bloc chauffant pour au moins 1 heure ;
-Ajouter 20 µl de Protéinase K à la suspension dans le tube Eppendorf 1,5 ml contenant
l’échantillon de l’étape A pour détruire les protéines. Vortexer brièvement. Incuber a 56°C
pendant 30 mn puis centrifuger a 8000 rotations par minutes (rpm) pendant 10 secondes ;
-Ajouter 200 µl Buffer «AL» et vortexer pendant 15 secondes. Fermer le bouchon et incuber
à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifugez brièvement (pour ajuster le pH);
-Ajouter 260 µl d’éthanol 96-100% de grade biologie moléculaire. Vortexer pendant 15
secondes et centrifugez brièvement. Il est possible qu’un précipité blanc se forme ;
-Transférer avec une pipette stérile le mélange (y compris le précipité) dans une colonne
QIAamp montée sur un tube 2 ml de collection. Eviter de mouiller le bord. Fermer le
bouchon et centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1 minute ;
-Mettre la colonne QIAamp de nouveau dans un tube 2 ml de collection. Jeter le tube de
collection contenant le filtrat ;
39
-Ouvrer soigneusement le tube de QIAamp et ajouter 500 µl de Tampon « AW1 », Eviter le
bord. Fermer le bouchon et centrifuger à 6000  g (8000 rpm) pendant 1 minute ;
-Mettre de nouveau la colonne QIAamp dans un tube 2 ml de collection. Jeter le tube de
collection contenant le filtrat ;
-Ouvrir soigneusement le tube de QIAamp et ajoutez 500 µl de Tampon «AW2», éviter le
bord. Fermer le bouchon et centrifuger à (20000 x g; 14000 rpm) pendant 3 minutes ;
-Recommandation: jeter le filtrat du tube de collection et replacer la colonne QIAamp dans ce
tube de collection. Centrifuger à vitesse maximale pour 1 minute pour supprimer l’éthanol ;
-Mettre la colonne QIAamp dans un tube Eppendorf 1,5 ml. Jeter le tube de collection
contenant le filtrat ;
-Ouvrir soigneusement la colonne QIAamp et ajouter 100 µl de Tampon «AE». Incuber à
température ambiante pendant 5 minutes, et centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1
minute ;
-Récupérer soigneusement l’éluât qui constitue l’extrait d’ADN pure et le conserver a -20°C.
Figure 31 : Poste (PSM-II) d’extraction d’ADN bactérienne.
1.6.2-Préparation du Mix.
Dans la salle propre, assembler les réactifs pour chaque essai/mix propre, selon la fiche
modèle. Le volume total de réaction est de 25 µ l. Il contient 2 µl de chacune des 2
amorces (sens et anti sens), 2 µ l de sonde, 12,5 µ l TaqMan Universal PCR Master Mix,
et 4,5 µ l d’eau qualité PCR.
S to c k c o n c e n tr é
(n o n d ilu é )
E x e m p le : 4 2 2
m
M
(t r o u v é s s u r l a f e u i ll e
d e c a lc u l)
D ilu t io n
« d e tr a v a il »
( d ilu é )
C o n c e n t ra t i o n
= 3 .7 5 m M
R é a c t io n
(2 5 u L )
S o d c
F 7 5 3 : 3 0 0
( t r o u v é s
s u r la fe u il le
c a lc u l )
n M
d e
Figure 32 : Préparation des amorces et sondes
40
(http://www.stratagene.com/onlineseminars/SeminarsAndTurorials.aspx?catid=8; consulté le
1/01/2012)
1.6.3-Préparation de la plaque
-Laisser les échantillons et les contrôles se décongeler complètement pour la préparation de la
plaque.
-Pour chaque essai à effectuer (pour chaque mix), les contrôles suivants doivent être faits:
Contrôles négatifs « NTC : No Template Control »: utiliser au moins un NTC dans la
salle propre (hotte pour l’assemblage de réaction) et un NTC dans la salle sale (hotte
pour l’addition d’DNA) pour chaque gène cible (Nm, Sp, Hib) lorsque plusieurs essais
sont effectués sur la même plaque ;
Tester le contrôle négatif d’eau extrait comme échantillon ;
Contrôles positifs : utiliser un pour chaque gène cible (Nm, Sp, Hib).
-Ajouter 23 µl (Mix) de chaque mélange dans les puits appropriés de la plaque de 96-puits,
selon la fiche modèle.
-Ajouter 2 µl d’eau stérile qualité PCR au puits de NTC dans la salle propre et fermer les puits
de cette colonne.
-Couvrir la plaque avec un film adhésif stérile et désinfecter les surfaces avec de l’eau de
javel 10% et puis 70% éthanol.
-Transporter la plaque à la salle sale et se vêtir de blouse et de gants propres.
-Enlever le film adhésif et ajouter 2 µl d’ADN de chaque échantillon à tester dans les puits
appropriés de la plaque de 96-puits selon la fiche modèle. Fermer les colonnes qu’on a finies.
-Ajouter l’eau stérile de la salle sale aux puits de NTC prévus et fermer la colonne des puits.
-Enfin, ajouter de l’ADN connu dans le contrôle positif pour chaque essai et fermer la colonne
des puits.
1.6.4-Amplification avec le Stratagene Mx3005P
-Transférer la plaque dans l’instrument de PCR (Stratagene Mx3005P™) (figure 33) et
s’assurer que la plaque est correctement placée sur le rail. Fermer la porte de machine.
-Ouvrir le logiciel MxPro sur l’ordinateur «New Expérimente Options»,
-Clique sur «Quantitative PCR (Multiple Standards)», puis sur « Turn lamp on for warm-up”
Choisirez «OK»: il faut environ 20 minutes pour que la lampe chauffe.
-Programmer la machine :
41
Choisir une colonne ;
Type de puits: Unknown, Positive/Négative control, ou NTC ;
Surveillez données de fluorescence:
ROX référence colorant pour tous les puits ;
FAM sodC pour le Neisseria meningitidis ;
Cy5 lytA pour le Streptococcus pneumoniae ;
HEX hpd pour. L’Haemophilus
influenzae.
Figure 33 : Photo du Stratagene Mx3005P™ et accessoires service de bactériologievirologie du CHU-YO
-Choisir «Next» pour créer le profil thermique (figure 34). Un profil thermique se crée en
déplaçant les barres et changez les temps. Le profil thermique peut être sauvegardé pour
utilisation dans des expériences futures.
42
Figure 34 : Profil thermique de la PCR en temps réel.
(http://www.stratagene.com/onlineseminars/SeminarsAndTurorials.asxcatid=8; Consulté le
1 /01/2012)
-Pour commence cliquer sur « Save as : pour l’enregistrement» nommer le fichier « Run
Statuss » puis Chosir « Turn off lamp at end of run », «Start» (démarrer) pour commencer
l’amplification.
L’amplification dure 1 heure 56 mn et on obtient les courbes d’intensité de la fluorescence qui
sont exprimées en fonction du nombre de cycles (figure 35).
Après ajustement de la ligne de base on obtient le format des données suivant.
Figure 35: Graphique de l’amplification par la PCR en temps réel
(http://www.stratagene.com/onlineseminars/SeminarsAndTurorials.aspx?catid=8; consulté le
1/01/2012)
L’intensité de la fluorescence est exprimée en fonction du nombre de cycles. Chaque cycle est
proportionnel à la concentration d’amplicons. Le cycle seuil (Ct) représente le nombre de
cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est statistiquement et significativement
plus élevé de la ligne de base.
1.6.5-Interprétation
Les limites de Ct de CDC utilisées étaient les suivantes :
-Ct < 35 ,9 pour un résultat positif ;
-Ct ≥ 41,0 pour un résultat négatif ;
-36 ,0 < Ct > 40,9 pour un résultat douteux. Les résultats douteux peuvent être du à des petites
quantités d’ADN ou la présence d’inhibiteur dans les échantillons cliniques comme l’hème,
43
enzyme, nucléase. Les résultats douteux doivent être de nouveau testés après avoir fait une
dilution au 1/4 et au 1/10.La dilution permet de diluer l’ADN bactérien si il est trop concentré
et d’éliminer les inhibiteurs comme les DNases.
Tableau III : Mode d’affichage des résultats d’amplification d’ADN des principales
bactéries de la méningite.
(http://www.stratagene.com/onlineseminars/SeminarsAndTurorials.aspx?catid=8 (consulté le
1 /01/2012)
Après l’amplification de l’ADN des bactéries de la méningite, un sérogroupage de N.
meningitidis et un sérotypage de S. pneumoniae et ont été fait en utilisant le même profil
thermique mais avec des amorces et sondes spécifiques pour la détermination des différentes
espèces de ces germes.
1.7-Analyses Statistiques
Les données de recherche ont été saisies avec le logiciel Access 2007. Ils ont été analysés
avec le logiciel STATA 11.2 et le logiciel Excel 2007. Le seuil de la signification statistique a
été fixé à p<0,05.
44
2-RESULTATS
2.1-Répartition des échantillons selon leur provenance
Selon la répartition des échantillons en fonction de leur provenance, le nombre d’échantillons
par district varie. Ainsi, le district de Fada N’Gourma a enregistré plus 54 d’échantillon de
LCR soit (27%) par rapport aux 16 autres. Certains districts ont eu un nombre d’échantillons.
C’est le cas de Gayeri 21 (10,5%), Kaya 21 (10,5%), Kongoussi 19 (9,5%) et Koudougou 18
(9%), Séguenega 14 (7%).
Figure 36 : Nombre d’échantillon par district
2.2-Répartition des patients selon les antécédents d’antibiothérapie et de vaccination
Au moment du prélèvement du LCR certains patients étaient sous traitement
antibiotique, avec ou sans antécédents vaccinaux. Parmi les 200 patients étudiés, 40 avaient
déjà reçu de vaccins et un traitement en antibiotique, 18 avaient reçu uniquement de
traitement en antibiotique et 23 n’avaient reçu seulement que de vaccin. Cinquante (50)
patients avaient déjà reçu un traitement en antibiotique connu mais, leur statut vaccinal était
inconnu. Dix (10) autres avaient un profil vaccinal avec un profil therapeutique inconnu. A
ces nombres s’ajoutent 13 patients qui n’avaient aucun antécédent (vaccinal et en
45
antibiotique), 33 qui avaient un profil vaccinal et antibiotique inconnu. Un patient était non
vacciné et de statut en antibiotique inconnu et 12 patients étaient sans traitrement mais de
statut vaccinal inconnu.
Tableau IV: Situation vaccinal et thérapeutique des patients
Antécédents
Antécédents de vaccination
Total
d’antibiothérapie
Oui
Non
Non Précisé
Oui
40
18
50
108
Non
23
13
12
48
Non Précisé
10
01
33
44
Total
73
32
85
200
Parmi les 73 patients qui ont rapporté des antécédents de vaccination, 69 (94%) avaient été
immunisés avec le vaccin conjugué anti-méningocoque A (MenAfriVacTM), 2 (3%) avaient
reçu le vaccin conjugué AC et 2 (3%) autres le conjugué ACYW135. Aucun patient n’avait
reçu un vaccin contre S. pneumoniae ou H. influenzae b.
Figure 37 :Types de vaccins recus .
2.3-Les cas positifs des agents de MBA selon les méthodes utilisées
2.3.1. La coloration de Gram
La coloration au Gram des 200 LCR a révélé la présence des trois principales bactéries avec
une prédominance du pneumocoque. La coloration de Gram a montré 98 (49%) cas positifs
46
contre 102 (51%)
cas négatifs. Parmi les positifs, 71 (72%) des frottis avaient des
diplocoques à Gram positifs encapsulés, 25 (26%) des diplocoques à Gram négatif, en grain
de café et seulement 2 (2%) de bacilles à Gram négatif polymorphes.
DGp
DGn
BGn
2%
26%
72%
Figure 38: Répartition des principales bactéries de la méningite selon le Gram.
2.3.2-L’agglutination des particules solubles au latex
La recherche des antigènes solubles des 200 LCR a montré la présence des trois principales
bactéries avec une prédominance du pneumocoque. Le latex a révélé 89 (44,5%) cas positifs
contre 111 (55,5%) négatifs. Parmi les cas positifs, S. pneumoniae
a été détecté dans
67 (75%) échantillons, N. meningitidis dans 20 (22%) et H. influezae b dans seulement 2
(2%).
Strep pn
Nm
Hib
2%
22%
76%
47
Figure 39: Répartition des principales bactéries de la méningite au latex.
2.3.3- la culture bacterienne
La culture était positive pour 6 (28%) prélèvements de LCR contre 144 cas négatifs soit
(72%). L’identification des isolats a montré une prédominance du pneumocoque 38 (67%).
N. meningitidis a été identifié dans 16 (29%) cas et pour et H. influezae b dans 2 (3%) cas.
Strep pn
Nm
Hib
4%
29%
67%
Figure 40 : Répartition des principales bactéries de la méningite à la culture.
2.3.4- la rt-PCR
La PCR des 200 LCR révèle la présence des trois principales bactéries avec une
prédominance du pneumocoque. La PCR détecte 137 cas positifs soit (68,5%) contre 63
(31,5%) cas négatifs. En tenant compte des positifs la fréquence de ces bactéries en PCR est
de 95 (69%) pour Streptococcus pneumoniae, 37 (27%) pour Neisseria meningitidis et 5 (4%)
pour Haemophilus influezae b.
Strep pn
Nm
Hib
4%
27%
69%
48
Figure 41: Répartition des principales bactéries de la méningite à la PCR.
2.3.5-Répartition selon origine géographique (district sanitaire) et les méthodes
détection.
Le diagnostic des principaux germes des MBA par les méthodes de détection a monté plus de
cas positifs à Fada (Gram 20, le latex 20, la culture 15 et la rt-PCR 34 par rapport aux autres
districts. Le diagnostic était aussi significatif (nombre de cas positif) au district de
Koudougou, Gayeri, Kongoussi, Kaya, Bogandé et séguenega. Les 10 districts restants ont
moins de cas positifs.
Figure 42 : Répartition de la méningite par district et selon les méthodes de détection.
2.4-Comparaison entre la rt-PCR et les différentes méthodes de bactériologie classique
pour la détection des agents de MBA.
2.4.1-Coloration et rt-PCR
Le croisement entre les résultats de la rt-PCR et ceux du Gram donne un p=0,001. Cela
signifie qu’il existe une corrélation statistiquement significative entre ces résultats.
Tableau V : Croisement entre les résultats de la PCR et ceux du Gram.
Gram
rt-PCR
Cas négatifs
Cas positifs
Cas négatifs
58
44
Cas positifs
5
93
Nombre total
63
137
49
Nombre total
102
98
200
Test de Pearson chi2 (1) = 62,0577 Pr = 0,001 ; p =0,001.
2.4.2-Latex et rt-PCR
Le croisement entre les résultats de la rt-PCR et ceux de latex donne un p=0,001. Cela signifie
qu’il existe une corrélation statistiquement significative entre ces résultats.
Tableau VI : croisement entre les résultats de la PCR et ceux de Latex.
Latex
rt-PCR
Cas négatifs
Cas positifs
Nombre total
Cas négatifs
60
3
63
Cas positifs
51
86
137
Nombre total
111
89
200
Pearson chi 2(1) = 58,8046 ; Pr = 0,001 ; p=0,001.
2.4.3-Culture et rt-PCR
Le croisement entre les résultats de la rt-PCR et ceux de la culture donne un p=0,001. Cela
signifie qu’il existe une corrélation statistiquement significative entre les résultats de la PCR
et ceux de la cultive.
Tableau VII : Croisement entre les résultats de la PCR et ceux la culture.
Culture
rt-PCR
Cas négatifs
Cas positifs
Nombre total
Cas négatifs
62
1
63
Cas positifs
82
55
137
Nombre Total
144
56
200
Pearson chi2(1) = 31,8262 Pr = 0,001 ; p=0,001.
2.4.4-Comparaison des taux de confirmation des tests de diagnostic.
La comparaison entre les techniques de diagnostic montre que la rt-PCR a un taux de
confirmation 137 cas positifs soit (36%) plus élevé que les méthodes classiques. Parmi les
méthodes classiques utilisées, la microscopie et l’agglutination au latex ont une capacité de
confirmation respectivement 98 (25%) et 89 (24%) plus élevée que la culture 56 (15%).
50
Figure 43 : Comparaison entre les tests de diagnostic.
2.4.5-Impact de la durée de l’acheminement du LCR sur la fréquence de détection par la
culture et la rt-PCR.
Un délai de 10 jours, la sensibilité de la rt-PCR est supérieure à celle de la culture. Au-delà de
10 jours la capacité de la rt-PCR diminue mais, elle est toujours sensible. Par contre la
sensibilité de la culture disparait et laisse voir des cas d’isolement sporadiques.
Figure 44 : Résultat de la PCR et culture en fonction de la durée de l’acheminement
2.5-Comparaison des performances des méthodes de détection des agents de MBA.
La sensibilité représente la proportion des personnes vraiment atteintes de la maladie, dans la
population ciblée, qui sont identifiées par le test de diagnostic comme étant atteintes de la
méningite.
La spécificité représente la proportion des personnes sans la méningite qui a des résultats peu
élevés sur le test de dépistage.
VP (vrai positif) représente l’effectif des patients vraiment atteints de la méningite.
VN (vrais négatif) représente les patients n’ayant pas la méningite.
51
FP (faut positif) représente les patients déclarés positifs par un test de diagnostic alors qu’ils
ne sont pas atteints de la méningite.
FN (faut négatif) représente les patients déclarés négatifs par un test de diagnostic alors qu’ils
sont atteints de la méningite.
VPP (valeur prédictive positive) : probabilité que la maladie soit présente lorsque le
Test est positif.
VPN (valeur prédictive négative) : probabilité que la maladie ne soit pas présente
lorsque le test est négatif.
Tableau VIII : Calcul des paramètres par la formule de Bayes
La méthode de référence est la culture. Sa sensibilité était de 28% et sa spécificité de 72%.
Tableau IX : Valeurs de VP, VF, FN et VF des tests de diagnostic utilisés.
Tests
Vrai Positif
Faux Positif
Faux Négatif
Vrai Négatif
Nombre total
PCR
55
82
1
62
200
Latex
50
39
6
105
200
Gram
53
45
3
99
200
La formule de Bayes a été utilisée pour la détermination de la sensibilité, la spécificité, la
valeur prédictive positive et négative des techniques de diagnostic utilisées .En terme de
sensibilité, la rt-PCR est plus sensible 98,21% que l’agglutination au latex 89,29 %, le Gram
94,64% et la culture 28%. En termes de spécificité, l’agglutination au latex 72,92%, la culture
72% et le Gram 68,75% semblent être plus spécifiques que la rt-PCR 43,06%.
Le latex 56,18% et le Gram 54,08% semblent avoir une valeur prédictive positive plus grande
que la rt-PCR 40,15%. En fin, la rt-PCR 98,41% a une prédictive négative plus grande que le
Gram 97,06% et latex 94,59%.
Tableau X: valeurs intrinsèques des tests de diagnostic utilisés
Tests
sensibilité
spécificité
VPP
VPN
PCR
98,21
43,06
40,15
98,41
Latex
89,29
72,92
56,18
94,59
Gram
94,64
68,75
54,08
97,06
52
3-DISCUSSION
La répartition des échantillons selon leur provenance a montré 54 échantillons de LCR soit
(27%)
provenant de Fada N’Gourma. Ce nombre
d’échantillon provenant de Fada
N’Gourma est plus élevé par rapport a celui de Gayeri 21 (10,5%), Kaya 21 (10,5%),
Kongoussi 19 (9,5%) et koudougou 18 (9%), Séguenega 14 (7%).Les échantillons provenant
des districts restants sont en nombre très faible. La taille du nombre d’échantillon provenant
des districts susmentionnés explique que dans ces zones, le nombre des cas suspect de
méningite était élevé au cours la période d’étude (Janvier à Juillet 2011).
Treize (6,5%) des 200 échantillons analysés provenaient des patients sans antécédents de
vaccination ou d’antibiothérapie connus. Cependant chez 40 (20%) patients, les antécédents
de vaccination et/ou d’antibiothérapie en cours avaient été rapportés. Aucune précision
n’avait été fournie pour les 44 (22%) autres patients. Parmi les patients vaccinés 73 (36,5%),
69 (94%) avaient reçu le conjugué A, 2 (3%) le conjugué divalent AC et 2 (3%) le conjugué
tétravalent ACY/W135. Aucun patient n’avait reçu un vaccin contre S. pneumoniae.
Ces antécédents vaccinaux contribuent à la baisse de la morbidité des méningites
cérébrospinales dues aux sérogroupes vaccinaux au sein des populations. Au regard de la
taille des échantillons analysés, un tel nombre de sujets vaccinés pourraient avoir affecté les
taux de méningocoques détectés et par conséquent la hiérarchie des taux de détection
rapportés. Par ailleurs, l’immunisation de masse opérée en 2010 avec le vaccin conjugué A (
MenAfrivacTM) a certainement impacté la fréquence de détection du serogroupe A à grande
échelle.De même le vaccin contre l’H. influenzae b a infuencé la fréquence de H.influenzae b.
S. pneumoniae a été détecté dans 68%-75%, contre (23%-29%) N. meningitidis tous
sérogroupes confondus et (2%-4%) de H. influenzae. Ces taux de détection sont comparables
à ceux rapportés par Kafando en 2011 au Burkina. Il avait noté que le S. pneumoniae avait
une fréquence de 71,6% sur un total de 3252 cas suspects de méningites au cours des 37
premières semaines de l’année 2011.
La répartition des cas selon les districts sanitaires (origines géographiques des échantillons) a
montré que les taux les plus élevés des méningites bactériennes confirmées provenaient
principalement de 7 districts sanitaires: Fada-Ngourma, Kaya, Koudougou, Gayeri,
Kongoussi, Bogande et de Séguénéga. Malgré que certains districts ont eu plus de cas positifs
comme le cas de Fada-N’Gourma avec (20 cas au Gram, 20 cas au latex, 15 cas à la culture et
34 cas à la rt-PCR), seul Gayeri fut en situation d’alerte. Les données colligées par la
53
Direction de la Lutte contre la Maladie (DLM) avaient montré que Gayeri avait été en
situation d’alerte au cours de l’année 2011, contrairement aux autres districts.
La coloration au Gram permet de mettre en évidence les bactéries entières qu’elles soient
vivantes ou non. Le latex permet de détecter les antigènes capsulaires solubles des bactéries.
La viabilité de ces bactéries n’est pas indispensable pour leur détection. Seule la culture
requiert non seulement l’intégrité de la cellule bactérienne, mais aussi sa viabilité. Ces
exigences sont très influencées par les conditions environnementales de transport et de
conservation des échantillons. La rt-PCR récemment introduite dans le laboratoire du CHUYO requiert l’ADN bactérien de bonne qualité, qu’il provienne d’une bactérie vivante ou
morte. Ces différentes conditions de détection influencent les caractéristiques intrinsèques des
techniques utilisées, qu’elles soient celles de la bactériologie classique ou moléculaires.
Le taux global de confirmation par la rt-PCR était de 36% contre 25% par le Gram, 24% par
le latex et 15% par la culture. Les résultats obtenus avec la rt-PCR étaient significativement
supérieurs à ceux des techniques classiques considérées individuellement (p=0,001).
Des telles différences entre les techniques de bactériologies classiques et la PCR ont été
rapportées au Niger en 2006 par Chanteau et al., ils ont obtenu un taux global de confirmation
de 40.8% par la PCR et de 16% par la culture. Durand et al., en 1993 avaient démontré que le
diagnostic bactériologique par la mise en culture du LCR omettait au moins 13% des cas
positifs.
Le faible taux de confirmation des méthodes classiques est dû à la présence de nombre
important de faux négatifs, de contamination à la faible concentration de bactéries viables
dans le LCR mais aussi, aux antibiothérapies précoces appliquées avant la réalisation des
prélèvements. Dalton et Allison en 1968 avaient montré que lorsque l’antibiothérapie est mise
en route avant la ponction lombaire, du fait de l’urgence de l’antibiothérapie dans les
méningites, la capacité de diagnostic des méthodes classiques serait réduite de 30%.
Par ailleurs, lorsque la durée de l’acheminement est inférieure à 10 jours, la capacité de
diagnostique de la PCR est deux fois plus grande que celle de de la culture. En plus de 10
jours, cette capacité diminue pour la PCR, mais elle devient sporadique sinon disparait pour la
culture. Lorsque la durée de l’acheminement dépasse 24 jours, seule la PCR est toujours
positive. Cette influence du délai d’acheminement des échantilllons sur les capacités de
détection des agents de MBA a été rapportée par Towa Djeungoue en 2008 : il a noté qu’un
délai de plus de 24 heures d’acheminement des prélèvements des LCR au laboratoire peut
favoriser la mort des germes entrainant de culture négative, surtout si ces LCR après
prélèvement ne sont pas inoculés dans le milieu Trans-Isolate ou ne sont pas maintenus dans
54
des conditions de température favorables. La diminution et la disparition de la capacité de
détection de la culture est due à la mort progressive du nombre des bactéries viables dans le
LCR. Que les bactéries soient vivantes ou mortes, la persistance de la capacité de détection
par la rt-PCR demeure et met en exergue sa sensibilité dès lors que les ADN sont présents et
de bonne qualité. Les résultats obtenus dans la présente étude réalisée au CHU-Yalgado
Ouédraogo sont corroborés par ces différentes résultats et assertions.
Au Burkina Faso, à l’instar des pays subsahariens, l’isolement des germes par la culture reste
l’examen de référence. Les caractéristiques intrinsèques des techniques de détections utilisées
pour les confirmations de cas des MBA sont :
rt-PCR (Se : 98,2%; Sp : 43%) ;
Latex (Se : 89,2%; Sp : 72,9%) ;
Culture (Se : 28% ; Sp : 72%) ;
Gram (Se : 94,6%; Sp : 68,7%).
En termes de sensibilité, la rt-PCR est plus sensible 98,21% que l’agglutination aux latex
89,29 %, le Gram 94,64% et la culture 28%. Selon Sanou et al., en 2013, la rt-PCR avait
permis la détection et la caractérisation des bactéries responsables de la méningite purulente
des cultures CSF-souillées qui ne pourraient pas autrement être détectées.
Carbonnelle en 2009 avait noté qu’en cas de traitement précoce, la sensibilité de la culture et
la microscopie est inférieure à 50%. En 1995 Tunkel et Scheld avaient démontré que la
sensibilité des tests aux latex était très faible, variant de 0 à 25% et ne pouvait ainsi servir de
base pour une prise de décision clinique. Selon Bhisitkul et al., en 1994, plusieurs cliniciens
remettaient en cause l’utilisation des tests au latex en routine dans le diagnostic des
méningites bactériennes.
La rt-PCR 43,06% est plus spécifiques que l’agglutination au latex 72,92%, la culture 72% et
le Gram 68,75% du fait de la présence de beaucoup de faux négatifs engendrés par les
méthodes de routine. Aguillera et al., en 2005 avaient noté que la mise en culture est souvent
confrontée à des résultats faussement négatifs soit du fait du retard d’acheminement des
résultats, soit en raison des poly médications antérieures par des antibiotiques.
la rt-PCR 40,15% a une valeur prédictive positive plus grande que Le latex 56,18% et le
Gram 54,08% du fait de la présence des contaminants, des faux positifs.
En fin, la rt-PCR 98, 41% a une prédictive négative plus grande que le Gram 97,06% et latex
94,59%. Tim Schuurman et al., en 2004 aux Pays-Bas avaient montré de façon générale que
la PCR avait une sensibilité de 86%, une spécificité de 97%, une valeur prédictive positive de
80%, et une valeur prédictive négative de 98% comparé à la culture.
55
Par rapport à la rapidité, la rt-PCR dure 6 heures contre la culture qui dure 24 heures ou plus.
Massaoudi. Abdelhaq en
2011 avait noté que les résultats de cet examen ne sont pas
disponibles avant 24 à 48heures et parfois plus.
La rt-PCR a une bonne sensibilité irrévocable, bonne spécificité, une bonne valeur prédictive
positive, une bonne valeur prédictive négative et une bonne rapidité. Ces atouts montrent que
la PCR est une méthode de diagnostic précise et rapide dont on peut se servir de base pour
une bonne prise en charge des malades. Selon Sanou et al., en 2013, la PCR en temps réel a
amélioré non seulement la sensibilité et la spécificité du diagnostic des germes impliqués dans
les cas de méningites purulentes, mais aussi sa rapidité. Lansac avait démontré que les essais
de PCR se sont avérés spécifiques et ubiquitaires à 100% et ont été optimisés pour être
réalisés à partir de cultures ou de liquides céphalo-rachidiens. Ouedraogo en 2012 au Burkina
avait démontré que la PCR est une technique qui nous affranchit des contraintes suscitées et
se révèle être un excellent outil de veille biologique. Les résultats obtenus de la rt-PCR dans
l’étude confirment ces différentes notifications sur la détection moléculaire des agents de
MBA.
56
4. CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
4.1. CONCLUSION
Les tests utilisés ont permis de mettre en évidence les trois principales bactéries
de la méningite avec un taux de confirmation des cas plus élevé pour Streptococcus
pneumoniae en 2011. Parmi les techniques de détection utilisées, la PCR en temps
réel a prouvé sa supériorité de diagnostic des MBA par sa sensibilité, sa spécificité et
sa rapidité. Elle a amélioré significativement les taux de confirmation des cas par les
laboratoires agréés, montrant un taux de morbidité plus élevé qu’il n’est
habituellement rapporté par les techniques classiques. La rt -PCR s’impose alors
comme un outil nécessaire et surtout plus performant pour le diagnostic et pour la
confirmation des cas de méningites bactériennes par rapport aux méthodes de
routine.
De tels résultats font suggérer la mise à disposition de cette technologie dans tous
les laboratoires de niveau central pour améliorer le management des MBA au
laboratoire. Une telle perspective permettra d’améliorer non seulement la prise en
thérapeutique des MBA, mais aussi leur surveillance épidémiologique.
4.2. RECOMMANDATIONS
A Monsieur le Ministre de la Santé
-Doter tous les laboratoires centraux en infrastructures, équipements, matériel et
intrants pour la réalisation du diagnostic des MBA.
-Approvisionner régulièrement et suffisamment les laboratoires en intrants pour la
réalisation du diagnostic moléculaire des MBA.
-Disponibiliser le vaccin anti pneumococcique pour prévenir la méningi te liée à ce
germe
-Disponibiliser le vaccin anti méningite à W135 pour prévenir la méningite car le
conjugué A ou AC ne provoque pas une immunité contre ce germe.
Aux Responsables des laboratoires de diagnostic des MBA
-Assurer la formation continue du personnel des laboratoires au diagnostic
moléculaire des MBA.
-Contribuer à une meilleure confirmation et une meilleure notification des cas de
MBA.
57
5. PERSPECTIVES
-Diagnostiquer par sérotypage et par séquençage les nouveaux sérotypes du
pneumocoque existants au Burkina Faso pouvant causer des méningites bactériennes.
- Mettre en évidence l’existence des coïnfections méningites bactériennes et VIH
dans les prélèvements de LCR par diagnostic moléculaire à la PCR en temps réel.
58
ANNEXES
-Liste des équipements et matériels :
Salles séparées avec des hottes pour l’assemblage de réaction (« salle propre ») et l’addition
de DNA (« salle sale ») ;
- thermocycleur pour PCR en temps réel. (Stratagene Mx3005 P™ et accessoires) ;
-Bain marie ou bloc chauffant 37°C et 56°C ;
-Micro centrifugeuse (jusqu’à 14000 rpm) ;
-Congélateur -20°C ;
-Vortex pour Homogénéiser les préparations ;
-Portoirs ;
-Consommables :
-Le générateur de Co2 pour des besoins de condition d’incubation à Co2 10% ;
-Des milieux lyophilisés tel que la gélose Columbia et de l’hémoglobine utilisé pour la
préparation de la gélose chocolat ;
-Le Muller Hinton utilisé pour la préparation de la gélose MH ;
-Des cônes à filtre stériles de 10 µl ,100 µl ,200 µl et de 1000 µl ;
-Des tubes Eppendorf de1, 5 ml ;
-Lame porte objet et lamelle permettant de faire l’état frais et le frottis mince pour la
coloration au Gram de LCR ou les colonies suspectes issues de la culture de LCR ;
-Une série de micropipettes ;
-Eau de javel 10% et Ethanol 70% ;
-96-100% Ethanol.
Réactifs:
-deux amorces oligonucléotidique sens et anti sens monobrins complémentaires chacune
d’une des extrémités du fragment à amplifier (fragments d’ADN de 20-30 nucléotides) ;
- Tampon TE (10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) ;
-Tampon Tris (10mM Tris-HCl, pH 8.0) ;
-Lysozyme et Mutanolysine ;
-Eau qualité PCR (www.roche-applied-science.com, No 03 315 843 001) ;
59
-MgCl2 une solution donnant au milieu réactionnel un PH et une concentration saline
optimale pour le fonctionnement de l’enzyme ;
-Déoxynucléotides libres dATP, dCTP, dGTP, dTTP qui sont incorporables pour former le
brin d’ADN néosynthétisé ;
-Taq polymérase enzyme permettant la synthèse d’un néobrin à partir des amorces ; il s’agit
d’une ADN polymérase thermostable, par exemple la Taq DNA polymérase issue du microorganisme Thermus Aquaticus ;
-Des séquences d’ ADN connues de Streptococcus pneumoniae ;de Neisseria meningitidis
(A ,C,W135,Y,X) et de l’Haemophilus influenzae utilisées comme contrôle positif au cour
de l’ amplification de ces dites germes ;
- Qiagen QIAamp® DNA mini kit ;
-Kit Pastorex pour agglutination aux antigènes solubles ;
-Antisérum meningocoxique d’agglutination pour le sérogroupage de Neisseria meningitidis ;
-Les disques d’antibiotiques ;
-Disque d’optochine pour le test de discrimination de Streptocoques ;
-Le peroxyde d’hydrogène utilisé faire la catalase ;
-Le papier d’oxydase de Kovac utilisé pour le test d’oxydase ;
-Cristal violet, lugol, l’alcool (éthanol 95°C) et la fushine phéniqué utilisés pour la coloration
au Gram ;
-Le polyvetex(PVX) utilisé pour la culture des germes exigeant des facteurs de croissances.
60
Tableau XI: Amorces et sondes utilisées pour la détection des principales bactéries de la
méningite
WHO/IVB/11.12
61
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Impact de la PCR en temps réel dans le diagnostic

Transcription

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