Préparation des échantillons congelés en OCT pour coupe cryostat

Protocole : PREPARATION DE TISSUS
CONGELES EN OCT POUR COUPE
CRYOSTAT
Référence : PRMH/PO/010/4b
Rédigé par : M. FAVIER
Création/Mise à jour : 21/10/2014 Approuvé par : M. FAVIER
Version : 3
Rédacteur
Vérificateur
Approbateur
Nb de pages : 1/2
Fonction
Responsable plate-forme
Ingénieur Qualité
Responsable plate-forme
Nom
Signature
M. FAVIER
Y. LOTTIN
M. FAVIER
Révisions
Version
1
2
3
4
Description
Création
Mise à jour
Mise à jour (logo
nomenclature à part)
Maj gomme adragante
et
Auteur
nouveau
doc
M. Favier
M. Favier
M. Favier
Date
15/01/2011
13/09/12
07/01/2013
M. Favier
21/10/2014
1. Objet et domaine d’application
Ce protocole est utilisé pour la préparation de tissus congelés inclus en moule + OCT pour
coupe Cryostat. Il s’agit d’un protocole classique pour la majorité des tissus. Les tissus sont
déposés dans l’OCT selon l’orientation souhaitée à la coupe.
2. Matériel
-
OCT (que l’on peut fournir). Il s’agit d’une « colle », liquide et transparente à
température ambiante et blanche et dure à partir de -20°C. C’est un cryoconservateur, qui
préserve le tissu des congélations/décongélations intempestives, qui protège le tissu de
tout contact, qui évite la formation de cristaux dans le tissu conservé à -80°C.
-
Moule de congélation en plastique pour congélation (cryomold) (que l’on peut
fournir), de 1,5cm x 1,5cm.
-
Isopentane (que l’on peut fournir)
3. Documents associés
- Fiche de demande de coupes cryostat.
4. Description
Remarque préalable : Afin d’obtenir de belles coupes histologiques, les échantillons que
vous nous donnez sont les PLUS BEAUX (pas de coups de pince, pas de déchirure, pas
trop petits…).
À préparer avant tout prélèvement :
Les tissus prélevés seront congelés, inclus dans de l’OCT, dans un moule plastique, dans de
l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Ils seront préservés dans la carboglace avant d’être
placés à -80°C jusqu’à leur utilisation.
- Préparer et annoter les moules plastiques, en remplir le fond d’OCT
Préparation de tissus congelés pour coupe cryostat
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Réf : PRMH/PO/010/2
- Préparer et annoter des feuilles d’aluminium pour entourer le moule après congélation.
- Faire refroidir un bécher d’isopentane dans un fond d’azote liquide. La température idéale de
l’isopentane pour la congélation des tissus est atteinte (entre -80 et -100°C) lorsqu’il se forme
une couronne blanche au fond du bécher d’isopentane qui ne disparaît pas à l’agitation.
Les prélèvements peuvent commencer :
1- Prélever rapidement les organes. La bonne conservation d’un tissu n’excédant pas 10
minutes. Travailler sur aluminium et sans lumière directe pour éviter le dessèchement du
tissu.
2- L’échantillon ne dépassera pas plus 1cm x 1cm d’envergure (pour rentrer dans le moule).
3- Déposer le tissu à l’aide d’une pince dans le moule contenant de l’OCT et recouvrir de
nouveau d’OCT jusqu’au bord du moule.
ATTENTION : Une fois le tissu déposé dans l’OCT, éviter de trop le manipuler avec
la pince pour éviter la formation de bulles ou rayures dans l’OCT.
4- À l’aide d’une pince solide, attraper le complexe « moule/OCT/tissu » et plonger dans
l’isopentane à bonne température, en tournoyant doucement pendant quelques secondes et
laisser congeler une minute.
5- Mettre les tissus montés dans l’aluminium et conserver dans la carboglace le temps des
prélèvements.
6- Stocker à -80°C jusqu’à utilisation.
Lorsque vous nous amenez les prélèvements :
Lorsque vous amenez vos échantillons à la plate-forme, les transporter en CARBOGLACE
UNIQUEMENT et accompagnés de la fiche « Demande de coupes cryostat » dûment remplie
et que vous nous aurez également envoyée par mail.