PREPARATION DE TISSUS CONGELES POUR COUPE CRYOSTAT

Protocole : PREPARATION DE TISSUS
CONGELES POUR COUPE
CRYOSTAT
Référence : PRMH/PO/010/3
Rédigé par : M. FAVIER
Création/Mise à jour : 07/01/2013 Approuvé par : M. FAVIER
Version : 3
Rédacteur
Vérificateur
Approbateur
Fonction
Responsable plate-forme
Ingénieur Qualité
Responsable plate-forme
Nb de pages : 1/2
Nom
Signature
M. FAVIER
Y. LOTTIN
M. FAVIER
Révisions
Version
1
2
3
Description
Création
Mise à jour
Mise à jour (logo
nomenclature à part)
et
Auteur
nouveau
doc
M. Favier
M. Favier
M. Favier
Date
15/01/2011
13/09/12
07/01/2013
1. Objet et domaine d’application
Ce protocole est utilisé pour la préparation de tissus congelés pour coupe Cryostat.
2. Matériel
- Bouchon en liège > VWR, Réf : 217-1017, 22x15x12mm :
À découper avec une lame de rasoir en rondelles de 3mm d’épaisseur environ.
- Gomme adragante > VWR, Réf : 24 437-260 (Prolabo) :
Gomme à préparer à 9%, soit 2,25g à diluer dans 25ml d’eau distillée dans un contenant type
pilulier.
Laisser à 37° ON en remuant à la spatule de temps en temps jusqu’à obtenir une pâte compacte
et homogène, de couleur brun clair.
La gomme adragante se conserve à -20°C jusqu’à utilisation puis se conserve à 4°C en vérifiant
que rien ne pousse dedans.
3. Documents associés
- Fiche de demande de coupes cryostat.
4. Description
Remarque préalable : Afin d’obtenir de belles coupes histologiques, les échantillons que
vous nous donnez sont les PLUS BEAUX (pas de coups de pince, pas de déchirure, pas
trop petits…).
À préparer avant tout prélèvement :
Les tissus prélevés seront congelés dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide puis montés
sur des bouchons en liège (FOURNI). Pour cela :
- Découper des rondelles de bouchon en liège (VWR, Réf : 217-1017, 22x15x12mm),
d’environ 3mm d’épaisseur, à l’aide d’une lame de rasoir, et les identifier sur un des côtés et
sur la tranche au STYLO BILLE (le feutre s’effacerait). L’avantage du liège est qu’il sert
Préparation de tissus congelés pour coupe cryostat
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Réf : PRMH/PO/010/2
d’isolant. Il minimise ainsi les problèmes de congélation / décongélation des tissus par
rapport à l’enrobage dans de l’O.C.T. seul.
- Maintenir le sachet ou tube de conservation des échantillons dans de la carboglace après avoir
pris soin d’indiquer les références nécessaires sur les récipients.
- Faire refroidir un bécher d’isopentane dans un fond d’azote liquide. La température idéale de
l’isopentane pour la congélation des tissus est atteinte (environ -70°C) lorsqu’il se forme une
couronne blanche au fond du bécher d’isopentane qui ne disparaît pas à l’agitation.
Les prélèvements peuvent commencer :
1- Prélever rapidement les organes. La bonne conservation d’un tissu n’excédant pas 10
minutes. Travailler sur aluminium et sans lumière directe pour éviter le dessèchement du
tissu.
2- L’échantillon ne dépassera pas plus de 1,5cm sur 1,5cm.
3- Le fixer sur le liège avec de la colle O.C.T. en appuyant légèrement dessus et dans
l’orientation de coupe souhaitée, à l’aide d’une petite pince.
Exemple : Coupe transversale de muscle : le muscle sera monté perpendiculairement à la
rondelle de liège, avec un dépassement de quelques millimètres. Attention, un montage
minutieux de votre part facilitera l’obtention de coupe correctement orientée.
Remarque : Pour les tissus mous ou assez petits et fins, utiliser la gomme adragante
(FOURNIE MAIS prévenir au moins 48h à l’avance), beaucoup plus compacte que
l’O.C.T., ce qui permettra un bon maintien du tissu.
4- À l’aide d’une pince solide, attraper la rondelle de liège et plonger dans l’isopentane à
bonne température, en tournoyant doucement pendant quelques secondes et laisser
congeler quelques minutes.
5- Mettre les tissus montés dans le récipient conservé dans la carboglace.
6- Stocker à -80°C jusqu’à utilisation.
Lorsque vous nous amenez les prélèvements :
Lorsque vous amenez vos échantillons à la plate-forme, les transporter en CARBOGLACE
UNIQUEMENT et accompagnés de la fiche « Demande de coupes cryostat » dûment remplie
et que vous nous aurez également envoyée par mail.